СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 

Углеводородокисляющие микроорганизмы широко распространены в природе и являются естественным компонентом почвенной системы.

Учеными и практиками постоянно ведется работа по выделению наиболее эффективных штаммов, способных деструктировать нефть и ее соединения.

Во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов имеется достаточное количество углеводородокисляющих бактерий, однако, их оптимальный температурный показатель для условий России высок - от +20 до +30°С, т.е. биопрепараты на их основе активно деструктируют углеводороды лишь в теплый период времени. При понижении температуры воздуха эффективность биопрепаратов резко падает, восстановительные работы на этом прекращаются. Поэтому для центральных, особенно северных районов России выделение нефтеокисляющих микроорганизмов, их селекция должна вестись в направлении не только высокой деструктивной активности, но и адаптации к пониженным положительным температурам и различным фракциям нефти.

В последнее время в технологиях восстановления нефтезагрязненных земель получило широкое распространение использование культуральной жидкости, основой которой являются аборигенные высокоэффективные углеводородокисляющие микроорганизмы.

Определяющим в этом направлении является способ выделения.

Б.Е.Чижов, В.И.Вавер, В.А.Долингер и др. (Лекции по рекультивации нефтезагрязненных земель в Ханты-Мансийском Автономном округе. Тюменский Государственный университет. - 2000. -С.64-65) предлагают источником посевного материала использовать разливы нефти на влажных почвах или мелкие непроточные водоемы умеренного уровня загрязнения давностью более 3 лет, на которых активное развитие нефтеокисляющей микрофлоры произошло спонтанно или в порядке проведения рекультивационных работ. В лаборатории из проб грунта, воды, отобранных в качестве источника посевного материала, на минеральной среде с добавлением нефти и нефтепродуктов выделяют аборигенные комплексы углеводородокисляющих микроорганизмов.

Основной недостаток данного метода выделения состоит в том, что эффективные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов выделяют из образцов сроком замазученности более 3 лет, хотя рекультивационные работы необходимо проводить сразу после аварии.

Маркарова М.Ю. (Использование углеводородокисляющих бактерий для восстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера. Дисс. на соиск. уч. степени канд. биол.-хим. наук.- Сыктывкар, 1999. - с.44-45) предлагает выделение углеводородокисляющей микрофлоры проводить из загрязненной нефтью почвы путем пересева почвенной суспензии на свежую питательную среду. Навеску нефтезагрязненной почвы (100 г) помещают в 1-литровые колбы с 900 мл стерильной минеральной среды и инкубируют при t+10°C. Колбу периодически встряхивают. Через 40 суток производят пересев методом предельных разведений суспензии на питательную среду. Минеральную среду стерилизуют при 1 атм 1 час, разливают в чашки Петри и после застывания агара стерильным шпателем по поверхности растирают нефть по 1 мл на 1 чашку Петри. После прорастания на поверхности агара отдельных колоний микроорганизмов их рассеивают отдельно на чашки Петри на питательную среду.

Основной недостаток данного способа выделения нефтеусваивающих микроорганизмов - очень длительный срок инкубирования - 40 дней. Во-вторых, взят один температурный интервал - +10°С, хотя для условий северных регионов и для продолжения рекультивационных работ в условиях низких положительных температур, инкубирование желательно проводить при более низких температурах.

В качестве прототипа выбрано изобретение Власова С.А. и др. “Способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов” (патент РФ №2128703, С 12 N 1/26, В 09 С 1/10, 1999 г.). Из нефтезагрязненной почвы выделяют микроорганизмы, утилизирующие нефть, затем их нарабатывают в ферментерах и культуральной жидкостью обрабатывают место загрязнения.

Основной недостаток данного изобретения состоит в том, что выделение микроорганизмов начинается на твердой питательной среде, а стоимость МПА сейчас высокая, во-вторых, посев производят из разведений 10^-3 и 10^-4, в то время, как активные деструкторы могут остаться в первом и втором разведениях, в-третьих, не учитывается скорость появления колоний, в-четвертых, инкубирование проводилось при температуре 30°С, т.е. при понижении температуры воздуха данный биопрепарат будет терять свою активность.

Перечисленные недостатки были учтены в предлагаемом способе выделения эффективных деструкторов нефти.

Суть способа: производится отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, затем ведется селекция углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и наработка в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов. Селекция начинается на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведется при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней.

Ход выполнения работ: отобранные образцы просушиваются до воздушно-сухого состояния, выбираются мелкие камушки, растительные остатки. Готовится минеральная среда следующего состава: KNО₃ - 1 г, KH₂PO₄ - 1 г, К₂НРO₄ - 1 г, MgSO₄ - 0,2 г, CaCl₂ - 0,02 г, FeCl₃ - 0,002 г, водопроводная вода до 1 литра. Один грамм пробы переносится в стерильную фарфоровую ступку, слегка увлажняется солевой средой и растирается до пастообразного состояния. Содержимое переносится в колбу объемом 750-1000 мм (ступку и пестик сполоснуть солевой средой, перенося остаток в ту же колбу). Общий объем смеси доводится до 100 мл. В колбу вносится 1 мл сырой стерильной нефти с конкретного места загрязнения. Колбы инкубируются при различных температурах:

- при +5°С для выделения психотолерантных активных деструкторов, осуществляющих разложение нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах;

- при +15°С для выделения эффективных аборигенных групп бактерий, активно усваивающих нефть в данном диапазоне температур;

- при +25°С для выделения термофильных микроорганизмов;

- при +35°С для выделения групп бактерий, размножающихся при высоких температурах воздуха.

Колбы периодически встряхивают. На 5-е, 10-е, 15-е сутки фиксируют видимые изменения среды (помутнение, пигмент) слоя нефти (дегазация, расслоение, изменение цвета, появление продуктов омыления и др.). Результаты лабораторных наблюдений показали, что колонии микроорганизмов, появляющиеся на пятый день, обладают повышенной интенсивностью образования биомассы клеток, и, как правило, время культивирования таких штаммов значительно ниже. В то же время деструктивные их свойства не всегда бывают высокими и особенно к нефти, содержащей высокий процент тяжелых фракций. Использование биологического препарата, состоящего преимущественно из бактерий, появившихся на пятый день, вполне оправдано, так как невысокие деструктивные показатели компенсируются высокой интенсивностью роста бактерий.

Колонии микроорганизмов, появившиеся на десятый день, в зависимости от вида культуры, обладают средними урожайными показателями, в этой ассоциации присутствуют в основном активные представители нефтедеструкторов, хорошо утилизирующие как легкие, так и средние фракции нефти.

Группы бактерий, появившиеся на пятнадцатый день, обладают медленным темпом роста, свои отселектированные свойства проявляют на тяжелых фракциях нефти, трудно поддающихся биологическому разложению.

Из колб с верхнего слоя пипеткой отбирают 0,5 см³ смеси и переносят в пробирку с 4,5 см³ солевой среды. Делается 2-3 последовательных десятикратных разведения на той же среде. Из каждой пробирки в 2-х повторениях проводится высев по 0,1 см³ на чашки с плотной средой. Пробы растираются шпателем на поверхности агара. Чашки инкубируют 3-5 суток при температурах: для психрофилов 22±2°C; для мезофилов 28±2°C; для термофилов 37±2°C. Чашки с посевом просматривают ежедневно. Проводят подсчет и описание морфологии колонии. Все выделенные колонии изолируют на питательный агар методом “истощающего штриха”. Чистоту выделенных культур проверяют визуально. Оценивают культурные свойства, характер роста колоний, их однотипность визуально и с помощью микроскопирования. Чистые бактериальные культуры с чашек отвиваются в пробирки со скошенным агаром, инкубируются 3-5 суток при соответствующих температурах. Выделенным представителям бактерий присваивают регистрационный номер, вносят в журнал. Затем проводят изучение основных биологических свойств, определяют их деструктивную активность.

Наработку бактериального препарата осуществляют на ферментере МФ-20 с заданными для каждой культуры оптимальными параметрами.

Применение этого метода для наработки бактериального препарата, состоящего из наиболее эффективных деструкторов нефти и нефтепродуктов, как экономически, так и экологически оправдано. Затраты на производство бактериального препарата на основе аборигенных микроорганизмов невысоки, а использование адаптированных к источнику загрязнения, почвенным и погодным условиям бактерий, разрушающих токсические вещества, делают этот метод абсолютно экономичным.

Предлагаемый метод, используемый для выделения эффективных деструкторов нефти, является составной частью “Технологии рекультивации нефтезагрязняющих земель на аварийных участках и полигонах способом активизации аборигенной микрофлоры”, утвержденной Министерством Природных Ресурсов Российской Федерации 21 февраля 2002 года №35-01-2/108. Положительное заключение Государственной экологической экспертизы утверждено приказом министра МПР России от 13.02.2002 г. №70; “Технологии рекультивации нефтезагрязненных земель способом активизации аборигенных микроорганизмов на лицензионных участках OOO “ЛУКОЙЛ-Западная Сибирь”, утвержденной Министерством Природных Ресурсов Российской Федерации 2 сентября 2002 года №552. Положительное заключение Государственной экологической экспертизы от 19 июля 2002 г; “Технология рекультивации загрязненных нефтью земель в зимний период с использованием аборигенных микроорганизмов деструкторов нефти”, утвержденной Министерством Природных Ресурсов Российской Федерации 2 сентября 2002 года №551. Положительное заключение Государственной экологической экспертизы от 19 июля 2002 г., разработанных ЗАО НПС “Элита-комплекс”.

Способ прошел практическую апробацию с высоким экономическим эффектом на площади более 3000 га.

Пример осуществления:

С нефтезагрязненного участка ЛПДС “Торгили” Тюменского УМН Сибнефтепровода осенью 2001 года были отобраны почвенные образцы. В микробиологической лаборатории по вышеописанной схеме были выделены психрофильные, мезофильные и термофильные аборигенные нефтеусваивающие бактерии. В марте 2002 года приготовлены бакпрепараты. При наступлении положительных температур воздуха нефтезагрязненный участок был обработан препаратом на основе психотолерантных микроорганизмов, через две недели была проведена повторная обработка этим препаратом. Результаты представлены в таблице. Третье опрыскивание препаратом на основе психрофильных деструкторов нефти проведено 15 мая. Перед обработкой препаратом, состоящим из мезофильных микроорганизмов - 1 июня, были отобраны почвенные образцы на содержание нефти и нефтепродуктов. Использование психрофильных нефтеразлагающих бактерий позволило к этому времени разложить 85% нефти и нефтепродуктов, в то время как в контроле их количество снизилось незначительно - со 194,7 до 173,2 г/кг. Четвертая обработка нефтезагрязненного участка была проведена препаратом на основе мезофилов и к 1 июля участок был очищен на 93,8%. Проведения последующих обработок на основе термофилов не потребовалось, так как участок был готов к посеву трав.

Таким образом, использование психрофильных нефтеусваивающих микроорганизмов позволило начать рекультивационные работы в ранние весенние месяцы и за один вегетационный сезон очистить участок от нефтяного загрязнения.

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано при восстановлении нефтезагрязненных земель. Способ включает отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения при температурах инкубирования +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, отбор культур для пересева через 5, 10 и 15 дней, пересев полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов. Наработанными бактериальными препаратами на основе аборигенных микроорганизмов производят обработку нефтезагрязненного участка. Способ повышает вероятность поиска наиболее активных представителей углеводородокисляющей микрофлоры, утилизирующих углеводороды при низких положительных температурах, позволяет сократить затраты на производство биопрепарата. Использование данных биопрепаратов дает возможность начать обработку нефтезагрязненного участка рано весной и очистить участок от нефтяного загрязнения за один вегетационный сезон. 1 табл.

Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что селекцию начинают на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведут при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней.