Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива.

Из литературных источников известно, что иммунологическое микроокружение злокачественных опухолей неодинаково при различной локализации, гистологической характеристике (см. О.И. Кит, Е.Ю. Златник, Е.А. Никипелова, И.А. Новикова, Ю.А. Геворкян. Влияние гистологического строения и органного окружения на факторы локального иммунитета при раке желудка и толстой кишки // Международный журнал экспериментального образования. Медицинские науки. 2014. №1. С.76-79), стадии и плоидности опухоли при колоректальном раке (см. О.И. Кит, Е.Ю. Златник, Е.А. Никипелова, И.А. Новикова, А.В. Бахтин, О.Н. Селютина. Взаимоотношения плоидности и параметров локального иммунитета при опухолях толстой кишки. Молекулярная медицина. 2016. №1. С. 26-30; O.I. Kit, Е.А. Nikipelova, E. Yu. Zlatnik, A.V. Shaposhnikov, I.A. Novikova, R.E. Tolmakh. Local cell-mediated immunity in stage III and IV colon cancer // 2014 ASCO Annual Meeting May 30-June 3 2014 - published on Meeting Library (http://meetinglibrary.asco.org) e 22097), степени ее дифференцировки при раке пищевода (см. А.Ю. Максимов, Е.Ю. Златник, И.А. Новикова, Г.И. Закора, О.И. Кит, Е.Н., Колесников, B.C. Трифанов, О.Н. Селютина, А.Л. Базаев. Факторы локального иммунитета при раке пищевода разной степени дифференцировки. Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №6; URL: http://www.science-education.ru/128-22552) и других факторах, определяющих прогноз заболевания, что позволяет рассматривать особенности тканевого субпопуляционного состава лимфоцитов в прогностическом аспекте.

Так, при прогностически наиболее благоприятном люминальном А подтипе рака молочной железы описано максимальное количество NK-клеток в ткани опухоли по сравнению с опухолями других подтипов (см. И.А. Новикова, Ю.С. Шатова, Е.Ю. Златник, Ю.В. Пржедецкий, Е.П. Ульянова, Е.Н. Черникова. Пролиферативные и иммунологические характеристики молекулярно-биологических подтипов рака молочной железы // Международн. журн. прикл. и фундам. исслед. (РАЕ). 2014. №11 (часть 1). С. 116-119). Показана связь степени распространенности опухолевого процесса при раке молочной железы с уровнем тканевых CD8+ лимфоцитов, повышение которого чаще наблюдается у пациенток, не имеющих метастазов в регионарные лимфатические узлы, а снижение характерно для поздних стадий опухоли (см. С.С. Чистяков, О.П. Гребенникова, Д.А. Буров, И.К. Воротников, Ф.А. Шамилов, Л.В. Скотаренко. Перспективы исследования интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы// Оригинальная статья опубликована на сайте РМЖ (Русский медицинский журнал): http://www.rmj.ru/articles/onkologiya/Perspektivy_issledovaniya_intratumoralynyh_limfocitov_pri_rake_molochnoy_ghelezy/#ixzz4EkaIuqmh С. 56).

Известны данные литературы о том, что у больных раком вульвы, у которых первый этап лечения был хирургическим, а в дальнейшем после проведения химиолучевой терапии развилась длительная (более 2-х лет) или кратковременная (менее 2-х лет) ремиссия, первоначальный уровень основных субпопуляций Т-лимфоцитов в опухоли, определяемый методом ИГХ, был неодинаков. В первом случае количество CD8+ клеток в опухолях оказалось выше (55±6%), а содержание CD4+ лимфоцитов - ниже (44,5±6%), чем у больных с кратковременной ремиссией (27±5,5% и 73±5,5% соответственно), что авторы объясняют возможным превалированием в последнем случае Tregs (CD4+CD25+FoxP3+), являющихся иммуносупрессивными и проонкогенными (см. Неродо Г.А., Новикова И.А., Златник Е.Ю., Закора Г.И., Ульянова Е.П., Иванова В.А., Неродо Е.А. Экспрессия лимфоцитарно-макрофагальных маркеров в ткани плоскоклеточной карциномы вульвы. Материалы IX съезда онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии, 15-17.06.16, Минск, Республика Беларусь, 2016. С. 463).

Однако приведенные известные исследования факторов локального иммунитета, имеющих прогностическое значение при ряде злокачественных опухолей, не исследованы при саркомах мягких тканей (СМТ). Между тем, эти опухоли отличаются тяжелым течением, ранним и нередко многократным рецидивированием, слабой чувствительностью к принятым методам лечения, морфологической гетерогенностью. Инвалидизирующие операции, быстрая генерализация и в целом неблагоприятное течение СМТ делают особенно значимой разработку различных лабораторных тестов, направленных на улучшение диагностики, прогнозирования и возможной коррекции лечения. Развитие рецидива СМТ отягощает прогноз заболевания.

Известен способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей, включающий ИГХ-исследование ткани удаленной саркомы, отличающийся тем, что определяют наличие опухолевых клеток, экспрессирующих белки EGFR, CD34, bcl 6, bcl 2, при выявлении клеток с их гиперэкспрессией прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, а при выявлении клеток со слабой экспрессией этих маркеров прогнозируют благоприятный исход (см. патент RU 2532332 C1, опубл. 10.11.2014, Бюл. №31). Однако предлагаемый авторами способ не учитывает состояние локальных иммунологических механизмов, что может представлять важность при применении как химио- так и иммунотерапии СМТ.

Задачей предложенного изобретения является разработка простого эффективного способа прогнозирования сарком мягких тканей.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является улучшение прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей.

Технический результат достигается тем, что с помощью проточной цитофлюориметрии проводят определение процентного содержания Т-regs(CD3+CD4+CD25+CD127dim) лимфоцитов от количества CD3+CD4+ клеток в гомогенатах образцов опухолевой ткани и в ткани линии резекции после хирургического удаления опухоли и при значении этого показателя выше 11,1% в ткани опухоли и 7,1% в ткани линии резекции прогнозируют развитие рецидива саркомы.

Выбор данной лимфоцитарной субпопуляции обусловлен ее влиянием на развитие противоопухолевых иммунных реакций.

Известно, что Т-регуляторные клетки (Tregs), фенотипически являясь частью Т-хелперной субпопуляции (CD3+CD4+), обладают супрессорным действием, угнетая все звенья иммунной системы (антиген-презентирующее, антиген-распознающее, эффекторное (см. Chen W. Dendritic cells and (CD4+) CD25+ T regulatory cells: crosstalk between two professionals in immunity versus tolerance. Front. Biosci. 2006; 11: 1360-1370; Azuma Т., Takahashi Т., Kunisato A. et al. Human CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions. Cancer Res 2003; 63: 4516-4520; Lim H.W., Hillsamer P., Banham A.H. et al. Cutting edge: direct suppression of В cells by CD4+ CD25+ regulatory T cells. J Immunol 2005;175:4180-3; Trzonkowski P., Szmit E., Mysliwska J. et al. CD4+ CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction. Clin Immunol 2004; 112: 258-267).

Предлагаемый способ прогнозирования осуществляют следующим образом:

1. После хирургического удаления опухоли фрагмент нативной ткани опухоли и линии резекции гомогенизируют с помощью дезагрегирующего устройства BD Medimachine.

2. В гомогенатах определяют количественное содержание Т-регуляторных (T-regs) лимфоцитов (CD4+CD25+CD127dim) на проточном цитометре FACSCantoII (BD) по стандартной методике.

3. Результаты выражают в процентах от CD3+CD4+ клеток.

В табл. 1 представлены результаты исследования клеточных факторов локального иммунитета в образцах тканей опухоли и линии резекции у 10 больных СМТ наиболее часто встречающейся III стадии с благоприятным эффектом проведенного послеоперационного лечения и 7 больных с неэффективным результатом в виде развития рецидива.

Как видно из табл. 1, процентное содержание Tregs в тканевых образцах больных рецидивными СМТ статистически достоверно выше, чем при первичных опухолях; различия относятся как к опухолевой, так и к немалигнизированной ткани и свидетельствует о накоплении этих клеток в рецидивных опухолях, что, учитывая их вышеописанные свойства, отражает неблагоприятное течение СМТ. При обнаружении в ткани первичной опухоли и линии резекции показателей содержания Tregs, сходных с наблюдаемыми при рецидивной саркоме, прогнозируется развитие рецидива СМТ.

Подобных исследований при изучении прогнозирования сарком мягких тканей в доступной нам научно-медицинской и патентной литературе не встречалось, хотя методы иммунотерапии этой патологии активно разрабатываются (см. Балдуева И.А., Данилова А.Б., Новик А.В., Комаров Ю.И., Нехаева Т.Л., Проценко С.А., Семенова А.И., Пипиа Н.П., Воробейников Е.В., Карицкий А.П., Климашевский В.Ф., Имянитов Е.Н., Беляев A.M. Дендритные клетки, активированные раково-тестикулярными антигенами (РТА+), в лечении метастатических сарком мягких тканей // Вопросы онкологии, 2014. - N 6. - С. 700-706).

Сравнительный анализ известных способов прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей и предлагаемого нами способа позволяет выявить его новизну и отличия от известных. Новизна способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей заключается в определении процентного содержания Tregs (CD3+CD4+CD25+CD127dim) лимфоцитов от CD3+CD4+ клеток в образцах опухолевой ткани и линии резекции после хирургического удаления опухоли.

Приводим клинические примеры использования способа.

Пример №1. Больной Д.

Анамнез заболевания. В декабре 2014 года обратился в РНИОИ с жалобами на наличие изъязвленной, кровоточащей опухоли мягких тканей области правого плеча, размерами 6,0×4,0×3,0 см, подвижной относительно костных структур. Регионарные лимфоузлы не увеличены. Со слов больного опухоль заметил в июне 2014 года. Отмечает быстрый рост опухоли. На основании результатов клинического обследования (МРТ, УЗИ, СРКТ) поставлен предварительный диагноз: Саркома мягких тканей области правого плечевого сустава. По данным пункционной биопсии опухоли от 04.12.2014 - миксофибросаркома.

Проведенное лечение: 10.12.2014 выполнена операция - удаление опухоли мягких тканей области правого плеча с пластикой ротационным кожно-жировым лоскутом.

Гистологический анализ: №94011-15/14 - G3 Лейомиосаркома с некрозом и миксоматозом. Диагноз: Лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3pT2bNoMo, St III, состояние после хирургического лечения, клиническая группа 2.

10.12.2014: Результаты исследования показателей локального уровня CD3+CD4+CD25+CD127dim: первичная опухоль 15,3%; линия резекции 7,5%. На основании полученных результатов прогнозируется раннее рецидивирование и неблагоприятное течение заболевания.

По месту жительства проведен курс ПХТ: ИФОСФОМИД 2,5 г/м2 1-3 день + МЕСНА 100% с 1-4 день; ДАКАРБАЗИН 250 мг/м2 1-3 день; ДОКСОРУБИЦИН 20 мг/м2 1-3 день. На фоне химиотерапии развился рецидив опухоли. Провести второй курс АПХТ не удалось из-за тромбоцитопении и лейкопении.

В марте 2015 года обратился с жалобами на наличие опухоли мягких тканей в области послеоперационного рубца области правого плечевого сустава, прежних размеров, но плотно фиксирована с акромиальным отростком. Поставлен предварительный диагноз: Лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3pT2bNoMo, St III, состояние после комбинированного лечения, рецидив №1, клиническая группа 2. Проведенное лечение: 24.03.2015 - удаление рецидива опухоли мягких тканей области правого плечевого сустава с резекцией акромиального отростка и с пластикой аутодермотрансплантатом.

Гистологический анализ: №21239-42/15; 21243-46/15 - Недифференцированная опухоль мягких тканей с обширными очагами некроза, инфильтративным ростом, G3. В поперечно-полосатых мышцах крупные петрификаты. Диагноз: Лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3pT2bNoMo, St III, состояние после комбинированного лечения, рецидив №1, состояние после хирургического лечения, клиническая группа 2. В РНИОИ с 10.04 по 2.06.2015 проведены 3 курса XT 2-й линии (йонделис 2,5 мг на 500 мл NaCl 0,9% внутривенно капельно).

В июле 2015 года обратился в РНИОИ с жалобами на рецидив опухоли мягких тканей правого плеча. По данным МРТ от 21.07.2015 - Рецидив опухоли мягких тканей правой плечелопаточной области, локализующейся в подкожно-жировой клетчатке, тесно прилегающей к дельтовидной мышце, смешанной структуры, размерами 5,3х2,4 см в аксиальной плоскости, 4,2 см в коронарной плоскости. Костные структуры без признаков деструкции. По данным цитологического исследования - Саркома; обилие ангиоматозного компонента. Предварительный диагноз: Лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3pT2bNoMo, St III, состояние после комбинированного лечения, рецидив №2, клиническая группа 2.

Проведенное лечение: 28.07.2015 - удаление опухоли области правого плечевого сустава с пластикой ротационным лоскутом. Гистологический анализ: №60975-8/15 от 5.08.2015: G3 лейомиосаркома с некрозом и кровоизлияниями. По месту жительства проведено 4 курса АПХТ.

Диагноз: Лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3pT2bNoMo, St III, состояние после комбинированного лечения, рецидив №2, состояние после хирургического лечения, кл. гр. 2.

В декабре 2015 года обратился с жалобами на рецидив опухоли. При обследовании выявлены метастазы в легкие.

Пример №2. Больной Б.

Анамнез: Больной жалуется на опухоль, которая появилась в 2008 году после тупой травмы. Вначале опухоль была небольших размеров, затем прогрессивно увеличилась, по поводу чего больной и обратился в РНИОИ в апреле 2014 г.

На основании результатов клинического обследования (МРТ, УЗИ, СРКТ) поставлен предварительный диагноз: Саркома мягких тканей правой голени (без признаков вовлечения в процесс магистральных сосудов и костных структур, размеры 9.8×5.1×13.2 см) T2bN0M0, St II, клиническая группа 2. Проведенное лечение: 17.04.14 фасциально-футлярное удаление опухоли мягких тканей правой голени.

Гистологический анализ: №31355-362 - G3 полиморфная липосаркома. №31363-366- по линии резекции опухоли нет. Диагноз: Саркома мягких тканей правой голени T2bN0M0 (pG3T2bN0M0) st III, состояние после хирургического лечения, клиническая группа 2.

17.04.2014 Результаты исследования показателей локального уровня CD3+CD4+CD25+CD127dim: первичная опухоль 2,3%; линия резекции 1,2%. Прогнозируется отсутствие рецидивирования. В послеоперационном периоде (в мае 2014 г. ) проведены сеансы лучевой терапии СОД=50 Гр.

Диагноз: Саркома мягких тканей правой голени T2bN0M0 (pG3T2bN0M0) st III, состояние после комбинированного лечения, клиническая группа 3. На последнем обследовании в феврале 2016 г. рецидивов не выявлено.

Таким способом был рассчитан прогноз рецидива у 17 больных СМТ. Разработанный способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей является промышленно применимым. С помощью данных прогностических факторов можно прогнозировать исход заболевания и планировать лечебные мероприятия.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива. Для этого с помощью проточной цитофлюориметрии проводят определение процентного содержания T-regs(CD3+CD4+CD25+CD127dim) лимфоцитов от количества CD3+CD4+клеток в гомогенатах образцов опухолевой ткани и в ткани линии резекции после хирургического удаления опухоли. При значении этого показателя выше 11,1% в ткани опухоли и 7,1% в ткани линии резекции прогнозируют развитие рецидива саркомы. Использование данного способа позволяет прогнозировать возникновение рецидива при лечении сарком мягких тканей путем определения процентного содержания лимфоцитарной субпопуляции T-regs(CD3+CD4+CD25+CD127dim), поскольку данная популяция клеток влияет на развитие противоопухолевых иммунных реакций. 2 пр., 1 табл.

Способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей, включающий иммунофенотипирование клеток удаленной ткани, отличающийся тем, что с помощью проточной цитофлюориметрии проводят определение процентного содержания T-regs(CD3+CD4+CD25+CD127dim) лимфоцитов от количества CD3+CD4+ клеток в гомогенатах образцов опухолевой ткани и в ткани линии резекции после хирургического удаления опухоли и при значении этого показателя выше 11,1% в ткани опухоли и 7,1% в ткани линии резекции прогнозируют развитие рецидива саркомы.