СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4CD25FOXP3T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo Российский патент 2011 года по МПК C12N5/71 

Описание патента на изобретение RU2437933C1

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, фармакологии и медицины и может быть использовано как в научных целях, так и в практической медицине - при лечении заболеваний, для которых характерно снижение количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. К таким заболеваниям относится ряд аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, псориаз и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), развивающаяся у ряда больных при неродственной пересадке костного мозга, и т.д.

Большинство Т-клеток, обладающих регуляторной активностью, принадлежат к субпопуляции CD4+ лимфоцитов. Характерным признаком CD4+ Трег является экспрессия на их поверхности α-цепи рецептора интерлейкина-2 (IL-2). CD25 может также экспрессироваться при активации лимфоцитов, однако при этом количество рецепторов на одной клетке невелико, и, следовательно, при обработке такой клетки антителами, с клеткой свяжется малое количество молекул флуоресцентного красителя; при флуоресцентном анализе это будет выражаться в относительно слабом свечении (флуоресценции) клетки. Такие клетки обычно называют CD25low или CD25dim. Если же на одной клетке находится много рецепторов, то при анализе такие клетки светятся ярко и их называют CD25hi или CD25bright; именно такими CD25hi клетками являются Трег. Для активации, развития и осуществления функции Трег необходима также инициация ядерного фактора транскрипции, связанного с Х-хромосомой (Foxp3), который считается уникальным цитоплазматическим маркером Т-регуляторов [1].

Трег экспрессируют также широкий спектр маркеров, характерных как для поздней стадии дифференцировки Т-клеток, так и для их активации. К таким маркерам относятся CD45RO (маркер клеток памяти), маркер активации CD69, GITR (глюкокортикоид-индуцированный рецептор фактора некроза опухоли), CD62L (L-селектин, маркер недавно активированных покоящихся клеток), цитотоксическая молекула CTLA-4 (CD 152), с помощью которой, возможно, осуществляются ингибиторные функции Трег [2].

Трег также отличаются выраженной функциональной активностью - способностью подавлять in vitro пролиферацию и функцию клеток-мишеней, к которым могут относиться CD4+, CD4+CD25- или CD8+ клетки, а также NK- и В-лимфоциты [3].

После культивирования в условиях ex vivo Трег могут быть введены больному для коррекции количественных и/или функциональных патологий Т-регуляторов [4].

Необходимо подчеркнуть, что наиболее актуальной является задача культивирования регуляторных Т-клеток самого пациента (аутологичных), а не донора (аллогенных), так как трансплантация аллогенных клеток может сопровождаться их быстрым отторжением и требует применения иммуносупрессивной терапии, что неприемлемо для больных с уже подавленным собственным иммунитетом. Кроме того, в настоящее время к донорским препаратам крови и других тканей установлены очень высокие требования по безопасности их использования.

Содержание CD4+CD25+Foxp3+Трег в периферической крови здорового донора в среднем составляет 3,8±1,3% от общего содержания Т-клеток. При ряде патологий, например при системной красной волчанке, наряду со снижением функциональной активности Трег их количество снижается (до 0,5-0,9%) [5]. В силу этого возможность увеличить количество Трег, выделяемых из небольшого количества биологического материала самого пациента, культивированием их в условиях ex vivo имеет большую практическую значимость.

Основной проблемой культивирования регуляторных Т-клеток с характеристиками CD4+CD25hiFoxp3+ является их анергичность, то есть неспособность отвечать пролиферацией на стимуляцию Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом для достижения поставленных целей необходимо преодолеть указанную анергичность, но при этом получаемые в результате клетки должны стабильно экспрессировать характерные для Трег маркеры и, кроме того, сохранять свою функциональную активность.

Задача изобретения - способ обогащения популяции Т-лимфоцитов регуляторными Т-клетками (Трег) со стабильными характеристиками.

Поставленная задача решается способом обогащения регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo, заключающимся в том, что из периферической крови пациента выделяют популяцию CD4+ Т-клеток и культивируют их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против CD28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-β1 на 1 мл ростовой среды с последующим концентрированием клеток центрифугированием и отмыванием физиологическим раствором.

Интерлейкин-2 (IL-2) отвечает за множество иммунологических функций, из которых наиболее известна его способность вызывать пролиферацию и созревание активированных Т-клеток. IL-2 активируется после связывания со сложным рецепторным комплексом, одним из компонентов которого является CD25 - рецептор α-цепи IL-2 CD25 [6].

Моноклональные антитела к CD3-рецептору (анти-СD3) связываются с CD3-рецептором, который является частью комплекса TCR - Т-клеточного рецептора, который экспрессирован на зрелых Т-клетках и тимоцитах. Связывание рецептора с антителами приводит к неспецифической активации и пролиферации CD3+ Т-клеток [7].

Моноклональные антитела к молекуле CD28 (анти-СЭ28) связываются с CD28-антигеном, который является костимуляторной молекулой при активации TCR. CD28 усиливает пролиферацию Т-клеток за счет увеличения транскрипции и стабильности мPHK IL-2 [8].

Трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) - это иммунорегуляторный цитокин, который участвует в поддержании Т-клеточного гомеостаза, задействован в функционировании регуляторных и эффекторных Т-клеток [9], кроме того, TGF-β1 модулирует экспрессию Трег белка Foxp3 [10].

Изобретение может быть использовано в полученной в соответствии с раскрытым выше способом обогащения регуляторными Т-клетками (Трег) популяции аутологичных лимфоцитов для лечения заболевания, характеризующегося выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. Такой способ предусматривает введение пациенту, у которого ранее были отобраны исходные CD4+ Т-лимфоциты, обогащенной Трег популяции лимфоцитов, полученной путем обработки исходных клеток раскрытой выше смесью цитокинов и антител. Заболевания, которые могут подвергаться лечению в соответствии с указанным способом в т.ч., включают в себя аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз, системная красная волчанка [11], ревматоидный артрит [12, 13], псориаз [14] и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [15, 16] и т.д.

Изобретательский уровень работы обеспечивается тем, что, используя известные цитокины и антитела в определенном диапазоне концентраций для обработки CD4+ Т-лимфоцитов ex vivo, автор добился высокой гомогенности (более 88%) получаемой популяции регуляторных Т-клеток, что позволит уменьшить необходимый объем забираемого у пациента исходного клеточного материала и при этом повысить эффективность лечения. Кроме того, как результат данного технического решения была достигнута высокая скорость пролиферации клеток, что позволило ограничить время культивирования клеток до 7-9 суток и избежать таким образом проблем, связанных с длительным культивированием клеток.

На фигуре 1 представлен пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток в суспензии мононуклеарных клетках здорового донора. (A) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD 152 (CTLA-4). (А) 12,6% CD4+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25+. При этом у 5,9% таких CD4+CD25+ клеток наблюдалось яркое свечение маркера CD25, позволившее обозначить клетки как CD4+CD25hi. Кроме того, 4,4% CD4+CD25+ Т-клеток коэкспрессируют также маркер Foxp3 (Б), а 5,1% - маркер CD152 (В).

На фигуре 2 представлен пример экспрессии маркеров Трег в популяции CD4+ Т-лимфоцитов. (A) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) 29,7% CD4+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25+, а 14,4% таких CD4+CD25+ клеток являются CD4+CD25hi. Кроме того, 6,9% CD4+CD25+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер Foxp3 (Б), а 7,2% - маркер CD152 (В).

На фигуре 3 представлен пример экспрессии маркеров Трег в клетках после культивирования в течение 7 суток. (A) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) После культивирования 99,9% CD4+ клеток коэкспрессирует CD25+, причем 99,7% из них являются CD4+CD25hi. После культивирования Foxp3 коэкспрессируется на 88,6% (Б), a CTLA-4 - на 94,4% (В) CD4+CD25+ клеток. Таким образом, полученные после культивирования клетки имеют характерный для Т-регуляторов фенотип.

На фигуре 4 показано изменение общего количества клеток (серые столбики диаграммы) и количества Трег (заштрихованные столбики диаграммы) в культуре в зависимости от срока культивирования. На 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивалось в 10,0±4,9 раза, количество Трег - в 41,2±37,4 раза. К 8 дню культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.

На фигуре 5 представлен пример цитометрического анализа функциональной активности Трег.(А) Пролиферация клеток-мишеней в отсутствие и (Б) в присутствии регуляторных Т-клеток.

На фигуре 6 представлен результат исследования супрессорной активности культивированных Трег. В случае использования в качестве клеток-мишеней CD4+ (А) нативные Трег подавляли пролиферацию на 76,3%, а культивированные - на 82,4%; в случае использования CD4+CD25- (Б) эти цифры составляли 87,9% и 86,7% соответственно.

Выделение и культивирование CD4+CD25+

Все процедуры проводили в ламинарных шкафах II класса биологической защиты, расположенных в стерильном блоке с подачей воздуха по регламенту GМP, с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов.

Периферическую кровь из локтевой вены пациента забирали в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт К2-ЭДТА, ЭДТА или раствор гепарина. Кровь также собирали в сухие пробирки, не содержащие активаторов свертывания, для получения аутологичной сыворотки крови пациента. Содержимое пробирок с кровью и антикоагулянтом тщательно перемешивали, аккуратно переворачивая пробирку пробкой вниз несколько раз.

Для получения сыворотки крови больного пробирки с кровью без антикоагулянта выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Пробирки центрифугировали при 580 g в течение 10 минут, надосадочную жидкость (сыворотку крови) собирали в стерильные пробирки и инкубировали в течение 40 минут на водяной бане при температуре 56°C для инактивации компонентов комплемента. Сыворотку разливали в криопробирки в объеме 1 мл и замораживали.

Выделение мононуклеарных клеток (MHK)

Кровь из пробирок с антикоагулянтом переносили в стерильную пробирку емкостью 50 мл. Кровь разводили в соотношении 1:1 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca2+Mg2+free, Gibco, Великобритания) и затем для выделения лимфоцитов наслаивали на градиентный раствор LimphoSep (d=1,077 g/ml, MP Biomedicals, США) в пробирках емкостью 50 мл.

Пробирки центрифугировали при 400 g в течение 30 мин при 20°C; в результате центрифугирования в градиенте фиколла эритроциты и гранулоциты опускались на дно пробирки, а фракция мононуклеарных клеток в виде плотного кольца концентрировалась между двумя слоями на поверхности градиента. Фракцию МНК отбирали пипеткой, разводили PBS и два раза отмывали центрифугированием в течение 10 минут (300 g, 20°C). Супернатант отбрасывали.

Осадок клеток разводили в 10 мл PBS, 0,5 мл клеток отбирали для подсчета количества выделенных МНК и проведения их цитометрического анализа.

Для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляли 20 мкл красителя Трипановый синий (Gibco, Великобритания). Подсчет клеток производили в гемоцитометре, процент живых клеток составлял не менее 95%.

Для оценки количества клеток CD4+CD25+, CD4+CD25hi, CD4+CD25+Foxp3+ в мононуклеарной фракции клеточную суспензию окрашивали соотвествующими антителами и процент указанных выше клеток в исходной клеточной взвеси определяли на приборе FACSCalibur (BD Bioscience).

Пример экспрессии характерных для Трег маркеров в МНК здорового донора представлен на фигуре 1.

Сепарация СD4+ из МНК на колонках в магнитном поле по методике MACS (Miltenyi Biotec, Германия)

Суспензию МНК осаждали центрифугированием (10 минут, 300 g, 20°C), после чего клетки отмывали 1 раз в течение 10 минут при 300 g и температуре 4°C, используя 10 мл буфера, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% антикоагулянтного раствора цитрата декстрозы в растворе PBS (буфер ACD-A).

Осадок клеток разводили ACD-A из расчета 0,08 мл буфера на 1×107 клеток. В полученную суспензию добавляли коллоидные парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с моноклональным мышиным антителом против рецептора CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 0,02 мл микрочастиц на 1×107 клеток. Полученную смесь инкубировали в течение 15 минут при 4°C.

После инкубации к суспензии клеток добавляли 10 мл ACD-A и центрифугировали 10 минут при 300 g и 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в ACD-A из расчета 0,5 мл буфера на 1×108 клеток и наносили на требуемую колонку для позитивной селекции, находившуюся в магнитном поле.

Колонку промывали соответствующим ей количеством ACD-A, выносили из магнитного поля и поршнем выдавливали позитивную фракцию, содержавшую CD4+ клетки, в стерильную пробирку. Часть клеток (0,1 мл) отбирали для подсчета количества выделенных позитивных клеток и определения чистоты клеточной суспензии.

Для оценки чистоты суспензии выделенных CD4+  клеток их окрашивали соответствующими антителами и анализировали методом проточной цитометрии. Степень чистоты CD4+  клеток составляла в среднем 94±4% (n=19).

На фигуре 2 на примере периферической крови донора показана экспрессия характерных для Трег маркеров в популяции выделенных CD4+ Т-клеток. Повышенные значения экспрессии каждого из маркеров по сравнению с таковыми, представленными на фигуре 1, объясняются тем, что на фигуре 1 процент экспрессии дан относительно всей популяции МНК, а на фигуре 2 - относительно популяции выделенных из них CD4+ клеток, которые, в среднем, составляют около 40% от МНК. Таким образом, если количество CD4+CD25+ клеток во фракции МНК составляет 12,6% (фигура 1А), то количество тех же клеток относительно фракции CD4+ составляет 29,7% (фигура 2А).

Получение ex vivo (генерация и экспансия) клеток CD4+CD25+

Жидкая культуральная система состояла из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 1-50 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 0,5-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,1-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).

Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см2 или 75 см2 в CO2-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO2. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 7-12 суток.

Фенотипические характеристики Т-регуляторных клеток после культивирования

В Таблице 1 представлены результаты цитометрического анализа CD4+ T-клеток до начала и через 7 суток культивирования.

Таблица 1 Фенотипические характеристики популяции CD4+ Т-клеток до начала и через 7 суток культивирования До культивирования После культивирования CD4+ 93,9±4,5 99,8±0,2 CD4+CD25+ 28,4±8,3 97,9±1,7 CD4+CD25hi 15,7±4,0 95,9±2,4 CD4+CD25+CD62L+ 18,8±9,0 54,6±3,8 CD4+CD25+Foxp3+ 6,1±4,8 89,6±3,2 CD4+CD25+CD152+ 5,4±2,7 93,8±3,0

Характерный пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток после 7 суток культивирования проиллюстрирован фигурой 3.

Экспансия Т-регуляторных клеток

По прошествии 6-8 суток культивирования общее количество клеток увеличивалось в среднем по группе в 14,2±9,9 раза, а количество CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-клеток - в 60,3±42,6 раза. На фигуре 4 показано увеличение общего количества (серые столбики диаграммы) и количества Трег (заштрихованные столбики диаграммы) в зависимости от срока культивирования. Так, если на 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивается в 10,0±4,9 раза, а количество Трег - в 41,2±37,4 раза, то на 8 сутки культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.

Оценка супрессорной активности регуляторных Т-клеток до и после культивирования

Функциональную активность нативных и культивированных Трег сравнивали по их способности ингибировать пролиферацию клеток-мишеней в смешанной культуре лимфоцитов. Для этого аутологичные клетки-мишени CD4+, CD4+CD25-, выделенные методом магнитной сепарации и окрашенные витальным красителем сукцидимидным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE, Fluka, США), инкубировали в отсутствие или в присутствии равного (1:1) количества нативных (свежевы деленных) или культивированных Трег. Стимуляцию пролиферации производили аллогенными антиген-презентирующими клетками (обработанными митомицином С мононуклеарными клетками с удаленными методом магнитной сепарации CD3+ Т-лимфоцитами) в присутствии 5 мкг/мл моноклональных антител против СD3-антигена. Инкубацию проводили в течение 5-6 суток в 96-луночных круглодонных стерильных планшетах в CO2-инкубаторе. По окончании инкубации клетки из лунок собирали, отмывали от среды, окрашивали антителами против антигенов CD25 и CD4 и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Характерные примеры пролиферации клеток-мишеней (CD4+CD25-) в отсутствие (А) и в присутствии (Б) регуляторных Т-клеток приведены на фигуре 5.

Вычисляли индекс пролиферации (ИП) клеток-мишеней в каждом из типов лунок. Для этого учитывали количество клеток в каждом поколении (M1-М6 на фигуре 5), а вычисление ИП производили делением суммы клеток во всех поколениях на сумму родительских клеток-предшественников. Количество родительских клеток-предшественников вычисляли делением количества клеток в данном поколении на 2х, где x - номер поколения. Чем индекс пролиферации выше, тем сильнее пролиферируют клетки.

На фигуре 6 представлены результаты исследования супрессорной активности регуляторных клеток до и после 7 суток культивирования. Показана пролиферация CD4+(А) и CD4+CD25- клеток (Б) в присутствии или в отсутствие культивированных или нативных Т-регуляторов. Видно, что пролиферация клеток-мишеней была сильно подавлена при культивировании их в присутствии Трег (серые столбики), причем супрессорная активность нативных и культивированных Трег практически не отличалась, а сами супрессорные клетки не пролиферировали.

Пример конкретного осуществления способа:

Культуральная система состоит из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляют трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 40 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 100 нг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,5 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).

Клетки культивируют во флаконах площадью 25 см2 или 75 см2 в CO2-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO2. Свежую среду и ростовые факторы добавляют каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 9 суток.

Способ изобретения позволяет повысить количество регуляторных Т-клеток в среднем в 60 раз.

Источники информации

1. Baratelli et al. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells. J. Immunol., 2005, 175 (3): 1483-90.

2. Cao et al. Hepatocellular carcinoma cell supernatants increase expansion and function of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. Lab. Invest., 2007, 87 (6):582-90.

3. Earle et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin. Immunol., 2005, 115(l):3-9.

4. Masteller et al. Antigen-specific regulatory T cells - Ex vivo expansion and therapeutic potential. Semin. Immunol., 2006, 18:103-10.

5. Lin et al. The quantitative analysis of peripheral blood FOXP3-expressing T cells in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis patients. Eur. J. Clin. Invest., 2007, 37 (12):987-96.

6. Nelson. IL-2, regulatory T cells, and tolerance. J. Immunol., 2004, 172 (7):3983-8.

7. Bluestone and Tang. Therapeutic vaccination using CD4+CD25+ antigen-specific regulatory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 Suppl 2:14622-6.

8. Pentcheva-Hoang et al. B7-1 and B7-2 selectively recruit CTLA-4 and CD28 to the immunological synapse. Immunity, 2004, 21(3):401-13.

9. Bommireddy and Doetschman. TGFbeta1 and T(reg) cells: alliance for tolerance. Trends Mol. Med., 2007, 13 (11):492-501.

10. Pyzik and Piccirillo. TGF-beta1 modulates Foxp3 expression and regulatory activity in distinct CD4+T cell subsets. J. Leukoc. Biol., 2007, 82 (2): 335-46.

11. Zheng et al. CD4+ and CD8+ regulatory T cells generated ex vivo with IL-2 and TGF-beta suppress a stimulatory graft-versus-host disease with a lupus-like syndrome. J Immunol, 2004, 172, 1531-9.

12. Morgan et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis Rheum, 2005, 52, 2212-21.

13. Nardelli et al. CD4(+) CD25(+) T cells prevent arthritis associated with Borrelia vaccination and infection. Clin Diagn Lab Immunol, 2005, 12, 786-92.

14. de Boer et al. Low numbers of FOXP3 positive regulatory T cells are present in all developmental stages of human atherosclerotic lesions. PLoS ONE, 2007, 2, e779.

15. Cohen et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graft-versus-host disease. J Exp Med, 2005, 196, 401-6.

16. Trenado et al. Ex vivo-expanded CD4+CD25+ immunoregulatory T cells prevent graft-versus-host-disease by inhibiting activation/differentiation of pathogenic T cells. J Immunol, 2006, 176, 1266-73.

Похожие патенты RU2437933C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ 2008
  • Быковская Светлана Нюневна
RU2391401C2
СПОСОБ ТЕРАПИИ РЕМИТТИРУЮЩЕГО РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА 2012
  • Завалишин Игорь Алексеевич
  • Елисеева Дарья Дмитриевна
  • Быковская Светлана Нюневна
RU2523058C2
Способ получения аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования ex vivo в присутствии хорионического гонадотропина 2022
  • Шардина Ксения Юрьевна
  • Заморина Светлана Анатольевна
  • Бочкова Мария Станиславовна
  • Тимганова Валерия Павловна
  • Раев Михаил Борисович
RU2791738C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ФОРМЫ БЕСПЛОДИЯ 2014
  • Черных Елена Рэмовна
  • Хонина Наталья Алексеевна
  • Тихонова Марина Александровна
  • Селедцова Наталья Владимировна
RU2553341C1
АУТОЛОГИЧНЫЕ КЛЕТКИ МОНОЦИТАРНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ИНДУЦИРУЮЩИЕ АУТОТОЛЕРАНТНОСТЬ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ 2004
  • Кремер Бернд Карл Фридрих
  • Фендрих Фред
  • Шульце Марен
RU2346041C2
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА ПОЧКИ ЧЕЛОВЕКА IBGVAT R 27 2014
  • Лысюк Елена Юрьевна
  • Лукашина Марина Игоревна
  • Кибардин Алексей Владимирович
  • Гнучев Николай Васильевич
  • Георгиев Георгий Павлович
  • Ткаченко Светлана Викторовна
  • Ольшанская Юлия Вячеславовна
  • Коновалов Дмитрий Михайлович
  • Ларин Сергей Сергеевич
RU2573938C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРУЮЩИХ ВОСПРИНИМАЕМОСТЬ ТРАНСПЛАНТАТА КЛЕТОК МОНОЦИТАРНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РЕАКЦИЙ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА, ИНДУЦИРУЮЩИЕ ВОСПРИНИМАЕМОСТЬ ТРАНСПЛАНТАТА КЛЕТКИ МОНОЦИТАРНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, КЛЕТОЧНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ВОСПРИНИМАЕМОСТИ ТРАНСПЛАНТАТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РЕАКЦИЙ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА, ПРИМЕНЕНИЕ ИНДУЦИРУЮЩИХ ВОСПРИНИМАЕМОСТЬ ТРАНСПЛАНТАТА КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И/ИЛИ РАЗМНОЖЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ, ГИБРИДОМНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ, АНТИТЕЛО И ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА 2003
  • Кремер Бернд Карл Фридрих
  • Фендрих Фред
  • Рунке Марен
RU2370535C2
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА ПОЧКИ ЧЕЛОВЕКА IBGVAT R 6 2014
  • Лысюк Елена Юрьевна
  • Лукашина Марина Игоревна
  • Кибардин Алексей Владимирович
  • Гнучев Николай Васильевич
  • Георгиев Георгий Павлович
  • Ткаченко Светлана Викторовна
  • Ольшанская Юлия Вячеславовна
  • Коновалов Дмитрий Михайлович
  • Ларин Сергей Сергеевич
RU2573940C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ АУТОЛОГИЧНЫХ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 2023
  • Заморина Светлана Анатольевна
  • Шардина Ксения Юрьевна
  • Тимганова Валерия Павловна
  • Бочкова Мария Станиславовна
  • Раев Михаил Борисович
RU2812053C1
КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КИШЕЧНИКА 2008
  • Фусса Арно
RU2495121C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 437 933 C1

Реферат патента 2011 года СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4CD25FOXP3T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ обогащения регуляторными CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo заключается в выделении из периферической крови пациента популяции CD4+ Т-клеток и культивировании их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против СБ28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-бета1 на 1 мл ростовой среды. Изобретение позволяет получить богатую регуляторными Т-клетками популяцию аутологичных лимфоцитов, пригодную для лечения заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. 6 ил., 1 табл.

Формула изобретения RU 2 437 933 C1

Способ обогащения регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo, заключающийся в том, что из периферической крови пациента выделяют популяцию CD4+ Т-клеток и культивируют их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против CD28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-β1 на 1 мл ростовой среды с последующим концентрированием клеток центрифугированием и отмыванием физиологическим раствором.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2437933C1

УСТРОЙСТВО ДЛЯ ФИЛЬТРАЦИИ ТАНГЕНЦИАЛЬНОГО ПОТОКА И СПОСОБЫ ОБОГАЩЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ 2003
  • Бош Марникс Л.
  • Хэррис Пол К.
  • Монахан Стивен Дж.
  • Тэрнер Аллен
  • Бойнтон Олтон Л.
  • Лодж Патришия А.
RU2328317C2
ELPEK K.G
et al
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Immunol., 2007, v
Вагонетка для движения по одной колее в обоих направлениях 1920
  • Бурковский Е.О.
SU179A1
WO 2007110785 A2, 04.10.2007
PALLANDRE J.R
et al
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1

RU 2 437 933 C1

Авторы

Быковская Светлана Нюневна

Караулов Александр Викторович

Лысюк Елена Юрьевна

Даты

2011-12-27Публикация

2010-07-29Подача