Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, фармакологии и медицины и может быть использовано как в научных целях, так и в практической медицине - при лечении заболеваний, для которых характерно снижение количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. К таким заболеваниям относится ряд аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, псориаз и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), развивающаяся у ряда больных при неродственной пересадке костного мозга, и т.д.
Большинство Т-клеток, обладающих регуляторной активностью, принадлежат к субпопуляции CD4+ лимфоцитов. Характерным признаком CD4+ Трег является экспрессия на их поверхности α-цепи рецептора интерлейкина-2 (IL-2). CD25 может также экспрессироваться при активации лимфоцитов, однако при этом количество рецепторов на одной клетке невелико, и, следовательно, при обработке такой клетки антителами, с клеткой свяжется малое количество молекул флуоресцентного красителя; при флуоресцентном анализе это будет выражаться в относительно слабом свечении (флуоресценции) клетки. Такие клетки обычно называют CD25low или CD25dim. Если же на одной клетке находится много рецепторов, то при анализе такие клетки светятся ярко и их называют CD25hi или CD25bright; именно такими CD25hi клетками являются Трег. Для активации, развития и осуществления функции Трег необходима также инициация ядерного фактора транскрипции, связанного с Х-хромосомой (Foxp3), который считается уникальным цитоплазматическим маркером Т-регуляторов [1].
Трег экспрессируют также широкий спектр маркеров, характерных как для поздней стадии дифференцировки Т-клеток, так и для их активации. К таким маркерам относятся CD45RO (маркер клеток памяти), маркер активации CD69, GITR (глюкокортикоид-индуцированный рецептор фактора некроза опухоли), CD62L (L-селектин, маркер недавно активированных покоящихся клеток), цитотоксическая молекула CTLA-4 (CD 152), с помощью которой, возможно, осуществляются ингибиторные функции Трег [2].
Трег также отличаются выраженной функциональной активностью - способностью подавлять in vitro пролиферацию и функцию клеток-мишеней, к которым могут относиться CD4+, CD4+CD25- или CD8+ клетки, а также NK- и В-лимфоциты [3].
После культивирования в условиях ex vivo Трег могут быть введены больному для коррекции количественных и/или функциональных патологий Т-регуляторов [4].
Необходимо подчеркнуть, что наиболее актуальной является задача культивирования регуляторных Т-клеток самого пациента (аутологичных), а не донора (аллогенных), так как трансплантация аллогенных клеток может сопровождаться их быстрым отторжением и требует применения иммуносупрессивной терапии, что неприемлемо для больных с уже подавленным собственным иммунитетом. Кроме того, в настоящее время к донорским препаратам крови и других тканей установлены очень высокие требования по безопасности их использования.
Содержание CD4+CD25+Foxp3+Трег в периферической крови здорового донора в среднем составляет 3,8±1,3% от общего содержания Т-клеток. При ряде патологий, например при системной красной волчанке, наряду со снижением функциональной активности Трег их количество снижается (до 0,5-0,9%) [5]. В силу этого возможность увеличить количество Трег, выделяемых из небольшого количества биологического материала самого пациента, культивированием их в условиях ex vivo имеет большую практическую значимость.
Основной проблемой культивирования регуляторных Т-клеток с характеристиками CD4+CD25hiFoxp3+ является их анергичность, то есть неспособность отвечать пролиферацией на стимуляцию Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом для достижения поставленных целей необходимо преодолеть указанную анергичность, но при этом получаемые в результате клетки должны стабильно экспрессировать характерные для Трег маркеры и, кроме того, сохранять свою функциональную активность.
Задача изобретения - способ обогащения популяции Т-лимфоцитов регуляторными Т-клетками (Трег) со стабильными характеристиками.
Поставленная задача решается способом обогащения регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo, заключающимся в том, что из периферической крови пациента выделяют популяцию CD4+ Т-клеток и культивируют их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против CD28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-β1 на 1 мл ростовой среды с последующим концентрированием клеток центрифугированием и отмыванием физиологическим раствором.
Интерлейкин-2 (IL-2) отвечает за множество иммунологических функций, из которых наиболее известна его способность вызывать пролиферацию и созревание активированных Т-клеток. IL-2 активируется после связывания со сложным рецепторным комплексом, одним из компонентов которого является CD25 - рецептор α-цепи IL-2 CD25 [6].
Моноклональные антитела к CD3-рецептору (анти-СD3) связываются с CD3-рецептором, который является частью комплекса TCR - Т-клеточного рецептора, который экспрессирован на зрелых Т-клетках и тимоцитах. Связывание рецептора с антителами приводит к неспецифической активации и пролиферации CD3+ Т-клеток [7].
Моноклональные антитела к молекуле CD28 (анти-СЭ28) связываются с CD28-антигеном, который является костимуляторной молекулой при активации TCR. CD28 усиливает пролиферацию Т-клеток за счет увеличения транскрипции и стабильности мPHK IL-2 [8].
Трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) - это иммунорегуляторный цитокин, который участвует в поддержании Т-клеточного гомеостаза, задействован в функционировании регуляторных и эффекторных Т-клеток [9], кроме того, TGF-β1 модулирует экспрессию Трег белка Foxp3 [10].
Изобретение может быть использовано в полученной в соответствии с раскрытым выше способом обогащения регуляторными Т-клетками (Трег) популяции аутологичных лимфоцитов для лечения заболевания, характеризующегося выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. Такой способ предусматривает введение пациенту, у которого ранее были отобраны исходные CD4+ Т-лимфоциты, обогащенной Трег популяции лимфоцитов, полученной путем обработки исходных клеток раскрытой выше смесью цитокинов и антител. Заболевания, которые могут подвергаться лечению в соответствии с указанным способом в т.ч., включают в себя аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз, системная красная волчанка [11], ревматоидный артрит [12, 13], псориаз [14] и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [15, 16] и т.д.
Изобретательский уровень работы обеспечивается тем, что, используя известные цитокины и антитела в определенном диапазоне концентраций для обработки CD4+ Т-лимфоцитов ex vivo, автор добился высокой гомогенности (более 88%) получаемой популяции регуляторных Т-клеток, что позволит уменьшить необходимый объем забираемого у пациента исходного клеточного материала и при этом повысить эффективность лечения. Кроме того, как результат данного технического решения была достигнута высокая скорость пролиферации клеток, что позволило ограничить время культивирования клеток до 7-9 суток и избежать таким образом проблем, связанных с длительным культивированием клеток.
На фигуре 1 представлен пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток в суспензии мононуклеарных клетках здорового донора. (A) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD 152 (CTLA-4). (А) 12,6% CD4+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25+. При этом у 5,9% таких CD4+CD25+ клеток наблюдалось яркое свечение маркера CD25, позволившее обозначить клетки как CD4+CD25hi. Кроме того, 4,4% CD4+CD25+ Т-клеток коэкспрессируют также маркер Foxp3 (Б), а 5,1% - маркер CD152 (В).
На фигуре 2 представлен пример экспрессии маркеров Трег в популяции CD4+ Т-лимфоцитов. (A) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) 29,7% CD4+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25+, а 14,4% таких CD4+CD25+ клеток являются CD4+CD25hi. Кроме того, 6,9% CD4+CD25+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер Foxp3 (Б), а 7,2% - маркер CD152 (В).
На фигуре 3 представлен пример экспрессии маркеров Трег в клетках после культивирования в течение 7 суток. (A) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) После культивирования 99,9% CD4+ клеток коэкспрессирует CD25+, причем 99,7% из них являются CD4+CD25hi. После культивирования Foxp3 коэкспрессируется на 88,6% (Б), a CTLA-4 - на 94,4% (В) CD4+CD25+ клеток. Таким образом, полученные после культивирования клетки имеют характерный для Т-регуляторов фенотип.
На фигуре 4 показано изменение общего количества клеток (серые столбики диаграммы) и количества Трег (заштрихованные столбики диаграммы) в культуре в зависимости от срока культивирования. На 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивалось в 10,0±4,9 раза, количество Трег - в 41,2±37,4 раза. К 8 дню культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.
На фигуре 5 представлен пример цитометрического анализа функциональной активности Трег.(А) Пролиферация клеток-мишеней в отсутствие и (Б) в присутствии регуляторных Т-клеток.
На фигуре 6 представлен результат исследования супрессорной активности культивированных Трег. В случае использования в качестве клеток-мишеней CD4+ (А) нативные Трег подавляли пролиферацию на 76,3%, а культивированные - на 82,4%; в случае использования CD4+CD25- (Б) эти цифры составляли 87,9% и 86,7% соответственно.
Выделение и культивирование CD4+CD25+
Все процедуры проводили в ламинарных шкафах II класса биологической защиты, расположенных в стерильном блоке с подачей воздуха по регламенту GМP, с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов.
Периферическую кровь из локтевой вены пациента забирали в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт К2-ЭДТА, ЭДТА или раствор гепарина. Кровь также собирали в сухие пробирки, не содержащие активаторов свертывания, для получения аутологичной сыворотки крови пациента. Содержимое пробирок с кровью и антикоагулянтом тщательно перемешивали, аккуратно переворачивая пробирку пробкой вниз несколько раз.
Для получения сыворотки крови больного пробирки с кровью без антикоагулянта выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Пробирки центрифугировали при 580 g в течение 10 минут, надосадочную жидкость (сыворотку крови) собирали в стерильные пробирки и инкубировали в течение 40 минут на водяной бане при температуре 56°C для инактивации компонентов комплемента. Сыворотку разливали в криопробирки в объеме 1 мл и замораживали.
Выделение мононуклеарных клеток (MHK)
Кровь из пробирок с антикоагулянтом переносили в стерильную пробирку емкостью 50 мл. Кровь разводили в соотношении 1:1 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca2+Mg2+free, Gibco, Великобритания) и затем для выделения лимфоцитов наслаивали на градиентный раствор LimphoSep (d=1,077 g/ml, MP Biomedicals, США) в пробирках емкостью 50 мл.
Пробирки центрифугировали при 400 g в течение 30 мин при 20°C; в результате центрифугирования в градиенте фиколла эритроциты и гранулоциты опускались на дно пробирки, а фракция мононуклеарных клеток в виде плотного кольца концентрировалась между двумя слоями на поверхности градиента. Фракцию МНК отбирали пипеткой, разводили PBS и два раза отмывали центрифугированием в течение 10 минут (300 g, 20°C). Супернатант отбрасывали.
Осадок клеток разводили в 10 мл PBS, 0,5 мл клеток отбирали для подсчета количества выделенных МНК и проведения их цитометрического анализа.
Для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляли 20 мкл красителя Трипановый синий (Gibco, Великобритания). Подсчет клеток производили в гемоцитометре, процент живых клеток составлял не менее 95%.
Для оценки количества клеток CD4+CD25+, CD4+CD25hi, CD4+CD25+Foxp3+ в мононуклеарной фракции клеточную суспензию окрашивали соотвествующими антителами и процент указанных выше клеток в исходной клеточной взвеси определяли на приборе FACSCalibur (BD Bioscience).
Пример экспрессии характерных для Трег маркеров в МНК здорового донора представлен на фигуре 1.
Сепарация СD4+ из МНК на колонках в магнитном поле по методике MACS (Miltenyi Biotec, Германия)
Суспензию МНК осаждали центрифугированием (10 минут, 300 g, 20°C), после чего клетки отмывали 1 раз в течение 10 минут при 300 g и температуре 4°C, используя 10 мл буфера, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% антикоагулянтного раствора цитрата декстрозы в растворе PBS (буфер ACD-A).
Осадок клеток разводили ACD-A из расчета 0,08 мл буфера на 1×107 клеток. В полученную суспензию добавляли коллоидные парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с моноклональным мышиным антителом против рецептора CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 0,02 мл микрочастиц на 1×107 клеток. Полученную смесь инкубировали в течение 15 минут при 4°C.
После инкубации к суспензии клеток добавляли 10 мл ACD-A и центрифугировали 10 минут при 300 g и 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в ACD-A из расчета 0,5 мл буфера на 1×108 клеток и наносили на требуемую колонку для позитивной селекции, находившуюся в магнитном поле.
Колонку промывали соответствующим ей количеством ACD-A, выносили из магнитного поля и поршнем выдавливали позитивную фракцию, содержавшую CD4+ клетки, в стерильную пробирку. Часть клеток (0,1 мл) отбирали для подсчета количества выделенных позитивных клеток и определения чистоты клеточной суспензии.
Для оценки чистоты суспензии выделенных CD4+ клеток их окрашивали соответствующими антителами и анализировали методом проточной цитометрии. Степень чистоты CD4+ клеток составляла в среднем 94±4% (n=19).
На фигуре 2 на примере периферической крови донора показана экспрессия характерных для Трег маркеров в популяции выделенных CD4+ Т-клеток. Повышенные значения экспрессии каждого из маркеров по сравнению с таковыми, представленными на фигуре 1, объясняются тем, что на фигуре 1 процент экспрессии дан относительно всей популяции МНК, а на фигуре 2 - относительно популяции выделенных из них CD4+ клеток, которые, в среднем, составляют около 40% от МНК. Таким образом, если количество CD4+CD25+ клеток во фракции МНК составляет 12,6% (фигура 1А), то количество тех же клеток относительно фракции CD4+ составляет 29,7% (фигура 2А).
Получение ex vivo (генерация и экспансия) клеток CD4+CD25+
Жидкая культуральная система состояла из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 1-50 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 0,5-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,1-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).
Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см2 или 75 см2 в CO2-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO2. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 7-12 суток.
Фенотипические характеристики Т-регуляторных клеток после культивирования
В Таблице 1 представлены результаты цитометрического анализа CD4+ T-клеток до начала и через 7 суток культивирования.
Характерный пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток после 7 суток культивирования проиллюстрирован фигурой 3.
Экспансия Т-регуляторных клеток
По прошествии 6-8 суток культивирования общее количество клеток увеличивалось в среднем по группе в 14,2±9,9 раза, а количество CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-клеток - в 60,3±42,6 раза. На фигуре 4 показано увеличение общего количества (серые столбики диаграммы) и количества Трег (заштрихованные столбики диаграммы) в зависимости от срока культивирования. Так, если на 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивается в 10,0±4,9 раза, а количество Трег - в 41,2±37,4 раза, то на 8 сутки культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.
Оценка супрессорной активности регуляторных Т-клеток до и после культивирования
Функциональную активность нативных и культивированных Трег сравнивали по их способности ингибировать пролиферацию клеток-мишеней в смешанной культуре лимфоцитов. Для этого аутологичные клетки-мишени CD4+, CD4+CD25-, выделенные методом магнитной сепарации и окрашенные витальным красителем сукцидимидным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE, Fluka, США), инкубировали в отсутствие или в присутствии равного (1:1) количества нативных (свежевы деленных) или культивированных Трег. Стимуляцию пролиферации производили аллогенными антиген-презентирующими клетками (обработанными митомицином С мононуклеарными клетками с удаленными методом магнитной сепарации CD3+ Т-лимфоцитами) в присутствии 5 мкг/мл моноклональных антител против СD3-антигена. Инкубацию проводили в течение 5-6 суток в 96-луночных круглодонных стерильных планшетах в CO2-инкубаторе. По окончании инкубации клетки из лунок собирали, отмывали от среды, окрашивали антителами против антигенов CD25 и CD4 и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Характерные примеры пролиферации клеток-мишеней (CD4+CD25-) в отсутствие (А) и в присутствии (Б) регуляторных Т-клеток приведены на фигуре 5.
Вычисляли индекс пролиферации (ИП) клеток-мишеней в каждом из типов лунок. Для этого учитывали количество клеток в каждом поколении (M1-М6 на фигуре 5), а вычисление ИП производили делением суммы клеток во всех поколениях на сумму родительских клеток-предшественников. Количество родительских клеток-предшественников вычисляли делением количества клеток в данном поколении на 2х, где x - номер поколения. Чем индекс пролиферации выше, тем сильнее пролиферируют клетки.
На фигуре 6 представлены результаты исследования супрессорной активности регуляторных клеток до и после 7 суток культивирования. Показана пролиферация CD4+(А) и CD4+CD25- клеток (Б) в присутствии или в отсутствие культивированных или нативных Т-регуляторов. Видно, что пролиферация клеток-мишеней была сильно подавлена при культивировании их в присутствии Трег (серые столбики), причем супрессорная активность нативных и культивированных Трег практически не отличалась, а сами супрессорные клетки не пролиферировали.
Пример конкретного осуществления способа:
Культуральная система состоит из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляют трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 40 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 100 нг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,5 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).
Клетки культивируют во флаконах площадью 25 см2 или 75 см2 в CO2-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO2. Свежую среду и ростовые факторы добавляют каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 9 суток.
Способ изобретения позволяет повысить количество регуляторных Т-клеток в среднем в 60 раз.
Источники информации
1. Baratelli et al. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells. J. Immunol., 2005, 175 (3): 1483-90.
2. Cao et al. Hepatocellular carcinoma cell supernatants increase expansion and function of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. Lab. Invest., 2007, 87 (6):582-90.
3. Earle et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin. Immunol., 2005, 115(l):3-9.
4. Masteller et al. Antigen-specific regulatory T cells - Ex vivo expansion and therapeutic potential. Semin. Immunol., 2006, 18:103-10.
5. Lin et al. The quantitative analysis of peripheral blood FOXP3-expressing T cells in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis patients. Eur. J. Clin. Invest., 2007, 37 (12):987-96.
6. Nelson. IL-2, regulatory T cells, and tolerance. J. Immunol., 2004, 172 (7):3983-8.
7. Bluestone and Tang. Therapeutic vaccination using CD4+CD25+ antigen-specific regulatory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 Suppl 2:14622-6.
8. Pentcheva-Hoang et al. B7-1 and B7-2 selectively recruit CTLA-4 and CD28 to the immunological synapse. Immunity, 2004, 21(3):401-13.
9. Bommireddy and Doetschman. TGFbeta1 and T(reg) cells: alliance for tolerance. Trends Mol. Med., 2007, 13 (11):492-501.
10. Pyzik and Piccirillo. TGF-beta1 modulates Foxp3 expression and regulatory activity in distinct CD4+T cell subsets. J. Leukoc. Biol., 2007, 82 (2): 335-46.
11. Zheng et al. CD4+ and CD8+ regulatory T cells generated ex vivo with IL-2 and TGF-beta suppress a stimulatory graft-versus-host disease with a lupus-like syndrome. J Immunol, 2004, 172, 1531-9.
12. Morgan et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis Rheum, 2005, 52, 2212-21.
13. Nardelli et al. CD4(+) CD25(+) T cells prevent arthritis associated with Borrelia vaccination and infection. Clin Diagn Lab Immunol, 2005, 12, 786-92.
14. de Boer et al. Low numbers of FOXP3 positive regulatory T cells are present in all developmental stages of human atherosclerotic lesions. PLoS ONE, 2007, 2, e779.
15. Cohen et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graft-versus-host disease. J Exp Med, 2005, 196, 401-6.
16. Trenado et al. Ex vivo-expanded CD4+CD25+ immunoregulatory T cells prevent graft-versus-host-disease by inhibiting activation/differentiation of pathogenic T cells. J Immunol, 2006, 176, 1266-73.
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ обогащения регуляторными CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo заключается в выделении из периферической крови пациента популяции CD4+ Т-клеток и культивировании их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против СБ28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-бета1 на 1 мл ростовой среды. Изобретение позволяет получить богатую регуляторными Т-клетками популяцию аутологичных лимфоцитов, пригодную для лечения заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. 6 ил., 1 табл.
Способ обогащения регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo, заключающийся в том, что из периферической крови пациента выделяют популяцию CD4+ Т-клеток и культивируют их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против CD28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-β1 на 1 мл ростовой среды с последующим концентрированием клеток центрифугированием и отмыванием физиологическим раствором.
УСТРОЙСТВО ДЛЯ ФИЛЬТРАЦИИ ТАНГЕНЦИАЛЬНОГО ПОТОКА И СПОСОБЫ ОБОГАЩЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ | 2003 |
|
RU2328317C2 |
ELPEK K.G | |||
et al | |||
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды | 1921 |
|
SU4A1 |
Immunol., 2007, v | |||
Вагонетка для движения по одной колее в обоих направлениях | 1920 |
|
SU179A1 |
WO 2007110785 A2, 04.10.2007 | |||
PALLANDRE J.R | |||
et al | |||
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
Авторы
Даты
2011-12-27—Публикация
2010-07-29—Подача