Способ приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом Российский патент 2017 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к приготовлению цитологических препаратов метафазных хромосом, применяемых в научных и клинико-диагностических исследованиях. Хромосомные аберрации лежат в основе возникновения так называемых хромосомных патологий (болезнь Дауна, болезнь Шерешевского-Тернера и др.), а также обусловливают или сопровождают во многих случаях развитие онкологических заболеваний, прежде всего гемобластозов. В настоящее время базовым подходом к оценке кариотипа при хромосомных и онкогематологических патологиях является исследование метафазных хромосом с помощью световой микроскопии (Verma R.S., Babu A. Human chromosomes. Perga-mon Press, Inc., New York. 1989. 240 p.). Успешность проведения исследования с помощью указанного метода, как и метафазного FISH-анализа, во многом определяется качеством морфологии хромосом в приготовленном препарате. К числу важнейших параметров качества хромосомных препаратов относятся площадь разброса хромосом в отдельной метафазной пластинке, частоты наложения хромосом и разрушенных метафаз. Нестабильность в достижении оптимального разброса хромосом до сих пор остается главной проблемой метафазных FISH- и стандартных цитогенетических исследований (Barch MJ, Knusten T, Spurbeck JL. The AGT cytogenetics laboratory manual. 3rd ed. New York: Raven Press. 1997. P. 25-50).

Высокие уровни метафазных пластинок с избыточной компактностью, наложениями хромосом или разрушенными метафазами на цитологических препаратах затрудняют, а порой делают невозможным кариотипирование. В случае исследований образцов (костного мозга, периферической крови, лимфоузлов) онкогематологических больных ситуация усугубляется тем, что для оценки кариотипа опухолевых клеток необходим анализ не менее 20 метафазных пластинок с адекватными разбросами. Такого количества пригодных для анализа метафаз нередко не оказывается не только из-за высоких частот некачественных метафаз на цитологическом препарате, но и вследствие того, что цитогенетическое исследование выполняется на фоне проводимой терапии, которая, как правило, приводит к снижению уровня пролиферирующих клеток.

Известен способ приготовления цитологических препаратов хромосом, включающий равномерного нанесение 3-5 капель фиксированной (с помощью смеси метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1) клеточной суспензии на сухое предметное стекло, предварительно очищенное погружением в 100%-ный этанол с последующим вытиранием чистой безворсовой тканью и высушенное на воздухе (Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 730 Ed. by: Lynda J. Campbell L.J, Springer Science + Business Media, LLC 2011. P. 63-78).

Недостатком данного способа приготовления хромосомных препаратов является низкий уровень метафаз с пригодными для анализа разбросами хромосом в большинстве случаев.

Известен другой способ приготовления цитологических препаратов хромосом, включающий раскапывание 1 капли полученной клеточной суспензии на предметное стекло с водяной пленкой. После выдерживания «лицевой» стороны предметного стекла над водяным паром (75°C или более) в течение 1-3 с и появления зернистости в фиксаторе (клетки становятся видимыми) высушивают предметное стекло на металлической пластине с температурным градиентом вдоль одного из ее измерений. Степень разброса регулируется благодаря наличию возможности варьировать температуру предметного стекла с помощью нагретой пластины. Согласно имеющимся данным повышение температур способствует увеличению разброса хромосом. В тех же случаях, когда не удается достичь адекватных для анализа разбросов с помощью вышеуказанных технических приемов, авторы предлагают после раскапывания клеточной суспензии выдерживать предметное стекло кратковременно над паром, затем добавлять 4-6 капель ледяной уксусной кислоты. После распределения уксусной кислоты по поверхности предметного стекла проводится быстрое высушивание над паром в течение 3-5 с в горячей области металлического плата (65-75°C) или металлического блока (Henegariu O, Heerema N.A., Wright L.L. et al Improvements in Cytogenetic Slide Preparation: Controlled Chromosome Spreading, Chemical Aging and Gradual Denaturing // Cytometry. 2001. Vol. 43, P. 101-109).

Основным недостатком указанного способа приготовления цитологических препаратов хромосом является часто низкий уровень метафаз с адекватными для анализа разбросами хромосом. При этом следует отметить, что в случае дополнительного наслаивания ледяной уксусной кислоты на нанесенный материал в среднем наблюдается улучшение качества хромосомных разбросов. Но в то же время ухудшается качество дифференциальной окраски хромосом, что делает их малоинформативными либо вовсе непригодными для кариотипирования.

В качестве прототипа способа выбран стандартный способ приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом, включающий:

1) нанесение 1 капли суспензии фиксированных культивированных клеток, полученных из клинического образца (костный мозг, периферическая кровь) пациента, на центральную часть удерживаемого горизонтально предметного стекла с пленкой из деионизованной воды,

2) перемещение стекла на ровную поверхность с последующим удалением переместившейся к краям стекла воды с помощью фильтровальной бумаги,

3) высушивание стекла на воздухе при комнатной температуре (Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 220 Ed. by: J. Swansbury - Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003 - P. 73-83).

К недостатку способа относится нередко низкое содержание метафазных пластинок с пригодными для анализа разбросами хромосом в цитологическом препарате, что вызывает значительные затраты времени на поиск указанных пластинок, а во многих случаях не позволяет проводить полноценный анализ кариотипа.

Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.

Технический результат заключается в ускорении и повышении точности анализа кариотипа гемопоэтических клеток.

Данный технический результат достигается тем, что предложен способ приготовления хромосомных препаратов, включающий нанесение 1-2 капель суспензии фиксированных культивированных клеток, полученных из костного мозга или периферической крови пациента, на горизонтально удерживаемое предметное стекло с пленкой из 55% водного раствора уксусной кислоты. Этапы получения хромосомных препаратов, связанные с перемещением предметного стекла на ровную поверхность с последующими удалением переместившейся к краям стекла воды с помощью фильтровальной бумаги и высушиванием стекла на воздухе при комнатной температуре, проводятся стандартно.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что благодаря раскапыванию суспензии фиксированных клеток, полученных из костного мозга или периферической крови пациента, на предметное стекло с пленкой из 55% водного раствора уксусной кислоты удается повысить содержание метафазных пластинок с адекватными для анализа разбросами хромосом в цитологических препаратах не менее чем в 3 раза. Применение указанного раствора уксусной кислоты лабилизует клеточную мембрану, делая ее более чувствительной к разрывам. При этом данный подход без дополнительных технических приемов эффективен при широком спектре атмосферных условий (относительная влажность, температура) и приемлемом качества дифференциального окрашивания хромосом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для приготовления цитологических препаратов хромосом с применением, в частности, краткосрочного культивирования образец костного мозга (периферической крови или лимфоузла) ставится на культивирование при 37°C в течение 18-24 ч в стерильной одноразовой пластиковой пробирке (объем 15 мл) в 5 мл культуральной смеси из расчета 1-2 млн ядросодержащих клеток на 1 мл культуральной смеси. Культуральная смесь включает 4 мл среды RPMI-1640, 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамин с конечной концентрацией 292 мкг/мл, антибиотики пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), а также колцемид (конечная концентрация - 0,02 мкг/мл) для накопления метафазных клеток. После инкубации клетки осаждаются центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, удаляется супернатант, осадок суспендируется в 7-10 мл нагретого до 37°C гипотонического (0,075 М) раствора KCI, и клетки инкубируются в течение 10 мин при 37°C. Затем клетки центрифугируются при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляется, а осадок тщательно разбивается встряхиванием примерно в 0,5 мл супернатанта. Далее по каплям при осторожном перемешивании добавляется 7-10 мл фиксатора, суспензия выдерживается в течение 20 мин при комнатной температуре, и проводится центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 мин. После окончания центрифугирования осадок вновь ресуспендируется в 5 мл фиксатора, а суспензия выдерживается 7-10 мин при комнатной температуре. После этого проводится центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендирование клеток в фиксаторе с последующим их центрифугированием повторяется 4-6 раз в зависимости от качества полученных препаратов. После последнего центрифугирования осадок клеток суспендируется в 0,5 мл свежего фиксатора.

На заключительном этапе приготовления хромосомных препаратов одна или 2 капли (одна вблизи матового поля, другая у противоположного края стекла) клеточной суспензии наносятся на горизонтально удерживаемое предметное стекло с пленкой из 55% водного раствора уксусной кислоты. Сама пленка создается нанесением 6-8 капель указанного раствора с помощью пастеровской пипетки на предметное стекло и последующим распределением по всей поверхности последнего (за исключением матового поля) полирующими движениями пипетки. После аккуратного перемещения предметного стекла с нанесенной клеточной суспензией на горизонтальную поверхность проводится высушивание препарата на воздухе при комнатной температуре.

Пример. Для оценки кариотипа опухолевых клеток у больной Р. хроническим миелолейкозом, получающей терапию ингибитором тирозинкиназ иматинибом, 0,5 мл пунктата костного мозга с концентрацией ядросодержащих клеток 20×10⁶/мл было поставлено на культивирование в течение 24 ч с ночной колцемидизацией (конечная концентрация колцемида - 0,02 мкг/мл). После окончания культивирования обработка клеток проводилась стандартным способом. Полученная клеточная суспензия наносилась на горизонтально удерживаемые предметные стекла с пленками из деионизованной воды и 55% водного раствора уксусной кислоты. После высушивания предметных стекол хромосомные препараты подвергались «старению» (ночная инкубация в термостате при 60°C) с последующим дифференциальным G-окрашиванием и анализировались. В хромосомных препаратах, полученных с применением раскапывания суспензии фиксированных клеток на предметные стекла с пленками из воды и 55% водного раствора уксусной кислоты, было обнаружено соответственно 14 и 47 метафазных пластинок с пригодными для анализа разбросами. Затраты времени на поиск 14 адекватных для анализа метафаз в препарате, полученном с применением пленки из деионизованной воды, были примерно в 3 раза больше, чем в препарате, приготовленном с применением 55% водного раствора уксусной кислоты. При анализе кариотипа клеток в препарате, полученном с применением пленки из раствора уксусной кислоты, было выявлено 2 цитогенетических клона: 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[4]/46,XX[43]. При исследовании же препарата, приготовленного с применением водной пленки, был выявлен только один цитогенетический клон клеток с нормальным кариотипом: 46,ХХ[14].

Изобретение относится к области клинико-диагностических исследований и может применяться для приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом при проведении анализа кариотипа гемопоэтических клеток. Для этого 1-2 мл суспензии фиксированных клеток, полученных из костного мозга или периферической крови пациента, наносят на горизонтально удерживаемое предметное стекло с пленкой 55% водного раствора уксусной кислоты. В результате содержание метафазных пластинок с адекватными для анализа разбросами хромосом в цитологических препаратах повышается не менее чем в 3 раза. Изобретение обеспечивает быстрый и точный анализа кариотипа метафазных хромосом. 1 пр.

Способ приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом, заключающийся в том, что на поверхность горизонтально удерживаемого предметного стекла наносят одну или две капли суспензии культивированных фиксированных клеток, отличающийся тем, что на поверхности предметного стекла перед раскапыванием клеточной суспензии создается пленка из 55% водного раствора уксусной кислоты нанесением 6-8 капель указанного раствора с помощью пастеровской пипетки на предметное стекло и последующим распределением по всей поверхности последнего (за исключением его матового поля) полирующими движениями пипетки.