РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рYA11-39, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 4-Й И 9-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА В МЕТАФАЗНЫХ И ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ Российский патент 2008 года по МПК C12N15/63 C12N15/11 C12N15/10 

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 4-й и 9-й хромосом человека в норме и патологии, включая преимплантационную, пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, в том числе анеуплоидии при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека.

Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, 6, 11, 13, 18, 21 и Х человека (Гиндилис и др., 1985, №1203108; Юров и др., 1989, №1494724; Юров и др., 1993, №1792429; Юров и др., 1997, №2087533; Соловьев и др., 1997, №2087534, Юров и др., 2000, №2161199; Юров и др., 2005, №2265060). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в хромосомах 4 и 9 (Alexandrov et al., 1988; Product catalogue 2001-2002 "Innovative probe technology", Cytocell Limited, Oxfordshire, OX17 3SN, UK). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования хромосом 4 и 9 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосом 4 и 9, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерных районов данных хромосом. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосом 4 и 9. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркеров для центромерного района хромосом 4 и 9 человека, которые позволили бы проводить идентификацию центромерных районов в интерфазных и метафазных клетках.

Данная рекомбинантная плазмида для высокоспецифичного маркирования центромерных районов хромосом 4 и 9 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида pYA11-39 отличается от известных по литературе клонированных альфа-сателлитных ДНК по совокупности признаков: способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосом 4 и 9 человека. Предлагаемое техническое решение не имеет вышеперечисленных общих признаков ни с одним из приведенных аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерных районов хромосом 4 и 9 человека данное техническое решение разработано впервые.

Целью изобретения является создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 4-й и 9-й хромосом человека, а именно специфичного для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, который в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид обладал следующими преимуществами:

1. Строго маркировал околоцентромерные районы хромосом 4 и 9 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами;

2. Эффективно маркировал центромерные районы хромосом 4 и 9 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pUC19 (2700 пар нуклеотидов) по Pst1-сайтам фрагмент ДНК человека pYA11-39 размером 680 пар нуклеотидов, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 4-й и 9-й хромосом человека. Данный фрагмент имеет длину 680 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК зонда, опытов по блотгибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.

Новый ДНК зонд содержит альфоидную ДНК, ограниченную Pst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента, и отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар нуклеотидов. Кроме того, этот ДНК зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 8, 18 и 20. В специальных условиях повышенной жесткости с использованием стандартного солевого раствора с 55% раствором формамида, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизируется только с центромерными районами хромосом 4 и 9 человека.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. Источником выделения маркерного фрагмента pYA11-39 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидуума мужского пола) обрабатывают рестриктазой Pst1 до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в Pst1-сайт бактериального плазмидного вектора pUC19 (2700 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфоидной ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²Р) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена в основном альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дают позитивные рефлексы на радиоавтографах, в результате гибридизации отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 часов. За 1,5 часа до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3:1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂; 0,05 M дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 при концентрации 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10 импульсов в мин в расчете на 1 мкг ДНК.

Клонированные фрагменты альфоидной ДНК были картированы на хромосомах человека in situ с использованием стандартных условий гибридизации в растворе, содержащем стандартный солевой раствор (2×SSC), 50% формамид, 10% декстрансульфат-500. Все клоны гибридизировались с центромерными районами всех хромосом человека без видимой специфики для индивидуальных хромосом. Однако применение специальных условий гибридизации, повышенной жесткости гибридизации за счет повышения концентрации формамида в растворе до 55% позволило выявить рекомбинантную ДНК pYA11-39, которая принципиально отличается по хромосомной специфичности от остальных альфоидных ДНК.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 секунд в 0,07N NaOH с последующей промывкой по 10 минут в растворах 70° и 96,6° спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% раствор декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимзы в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении ×1000 или ×1125.

Образцы рекомбинантной ДНК pYA11-39 для гибридизации на хромосомах in situ можно метить и нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), уже описанным выше методом замещения. Для этого готовят реакционную смесь следующего состава: 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанола, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10U ДНК-полимеразы1 из E.coli, 5-10 мкг ДНК-азы I и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50 mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х - 18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина, (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI (4',6-Diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride), йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.

При микроскопии используют обычный флюоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующим набором светофильтров. Например, для одновременного анализа гибридизационных сигналов (зеленый цвет - FITC) и хромосом (красный цвет - йодистый пропидий) - фильтр 13, Leitz. Для хромосом и интерфазных ядер без гибридизационных сигналов - фильтр A, Leitz (DAPI - голубой цвет) или фильтр N 2.1, Leitz (йодистый пропидий - красный цвет).

При необходимости усиления гибридизационных сигналов (используя цитологические препараты низкого качества - плохая фиксация и т.п.) проводят дополнительную обработку гибридизационных сигналов - иммунологическую амплификацию.

Для этого препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 M Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20 в течение 5-15 мин; инкубируют с биотинилированными антителами к авидину (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл) 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С во влажной камере, накрывая пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Далее препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при температуре 37-45°С и повторно инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл), в течение 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С. Затем препараты опять промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при температуре 37-45°С и подготавливают для микроскопии. Процедуру амплификации слабого гибридизационного сигнала при необходимости можно проводить 2-3 раза.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYA11-39 локализован в прицентромерных районах 4-й и 9-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данных пар хромосом.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды pYA11-39 для идентификации хромосом 4 и 9 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным раствором декстрансульфата-500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4°С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (рН 8,0), 5 мМ MgCl₂, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCl, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при температуре 65°С не менее 1 часа до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ+1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ НВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 часов.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека клетки E.coli, несущие плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 37°С на качалке в течение 12 часов. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при температуре 65°С. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 часов инкубации при температуре 65°С проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (температура - 18°С, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1×SSC (1×SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при температуре 81°С в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1 М KCl + 20 мМ трис-HCl рН 7,1 при температуре 0°С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50° изопропилового или 70° этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 минут при температуре 0°С. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию в течение 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при температуре 0°С. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (температура - 18°С, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (рН 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 часов при температуре 37°С. Реакцию останавливают прогреванием пробы при температуре 70°С в течение 10 мин.

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры клеток E.coli HB 101, выращивают на качалке при температуре 37°С до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до температуры 0°С раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл раствора 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М раствора CaCl₂ с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при температуре 0°С по крайней мере в течение 30 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при температуре -80°С, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев. В дальнейшем при использовании к 200 мкл компетентной культуры бактерий при температуре 0°С добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (температура 42°С) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 часа при температуре 37°С. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением ампициллина, обусловливающих селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl₂. инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при температуре 70°С 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (рН 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²Р-дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 часа при температуре 37°С. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5×10⁸ имп/мин/мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при температуре 37°С. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой, дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (рН 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (рН 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2×SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при температуре 37°С. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 1-2 часов.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при температуре 68°С в растворе 2×SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон- 350 в течение 60-90 минут. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6×SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²Р-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5×10⁶ имп/мин. Гибридизацию проводят при температуре 68°С в течение 18-24 часов. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5×SSC с 0,5% SDS при температуре 68°С в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 часа экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой Pst1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой Pst1 и идентификации полосы AR1 340 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых получила название pYA11-39.

Препараты хромосом готовят из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco" США). Клетки культивируют в пенициллиновых флаконах или шприцах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 часов. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят как изотопной меткой, так и флюоресцентной метками методом замещения. В первом случае (изотопный метод), в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05M дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н³-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н³-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и 5 мкл ДНК (1 мкг) пробы pYA11-49. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 сек в 0,07н. NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70° и 96,6° этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при температуре 37°С, в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении ×1000 или ×1125.

Во втором случае, при мечении образцов рекомбинантной ДНК нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), готовят реакционную смесь следующего состава: 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанол, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10U ДНК-полимеразы 1 из E.coli, 5-10 мкг ДНК-азы I и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х-18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М КаН₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина, (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI (4',6-Diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride), йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.

Гибридизация in situ, как радиоактивная (изотопная), так и нерадиоактивная (флюоресцентная) на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYA11-39 локализуется только в прицентромерном районе 4-й и 9-й пар гомологичных хромосом человека и является, таким образом, молекулярным маркером данных пар хромосом, специфически маркирующим околоцентромерные районы.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 4-й и 9-й пар хромосом в тех случаях, когда эти хромосомы (один из гомологов) затронуты перестройкой, т.е. имеет потерю или добавление какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 4-й или 9-й хромосом и их форме.

Все процедуры по выделению образца ДНК pYA11-39 и его обработке с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора ребенка мужского пола (пробанда) с некоторыми клиническими проявлениями проксимальной делеции длинного плеча хромосомы 9 (9q). При цитогенетическом анализе клеток пробанда был обнаружен кариотип со сбалансированной перестройкой (транслокация 9/11), в которую была вовлечена хромосома 9, но без видимой потери хромосомного материала в околоцентромерном районе. Это должно было соответствовать нормальному фенотипу ребенка. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й и 9-й хромосом, точно установить изменения в кариотипе не составило труда, так как потеря хромосомного материала в околоцентромерном районе и части длинного плеча хромосомы 9 легко распознавалась непосредственно под микроскопом. В результате молекулярного исследования у пробанда обнаружена проксимальная делеция (потеря хромосомного материала в прицентромерном районе длинного плеча 9-й хромосомы) при транслокации хромосом 9 и 11, которую можно связать с характерными клиническими проявлениями, имеющимися у ребенка. Таким образом, с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 9-й хромосомы изменения в гомологичной хромосоме, затронутой перестройкой, распознаются легко при анализе под микроскопом.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й и 9-й пар хромосом является опыт по идентификации этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая хромосома X, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца хроматина X, образованного одной из двух хромосом Х в женском наборе, а также половая хромосома Y, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера pYA11-39, специфически маркирующего только 4-тые и 9-тые хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК pYA11-39 гибридизуется с ДНК околоцентромерных областей 4-й и 9-й пар хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в деспирализованном состоянии на стадии интерфазы. При этом в каждом интерфазном ядре можно видеть после гибридизации четыре скопления метки или сигнала, соответствующих двум парам хромосом 4-й и 9-й.

Все процедуры по выделению образца pYA11-39 и его обработки с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом клеток периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично процедурам, описанным в примере 1. При этом в каждом интерфазном ядре обнаруживаются четыре скопления гранул метки (четыре кластера) при изотопном мечении или 4 светящихся сигнала при нерадиоактивном мечении, соответствующих гомологичным хромосомам 4-й и 9-й пар. В разных ядрах расстояния между кластерами и сигналами различны. Итак, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.

Пример 4. Исключительно важной иллюстрацией практического использования молекулярного маркера pYA11-39 является опыт по определению присутствия 4-й и 9-й пар хромосом в клетках нативных препаратов ворсин хориона в пренатальной диагностике плода.

Все процедуры по выделению образца ДНК pYA11-39, его обработке с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит в том, что в примере 1 используются препараты метафазных хромосом, приготовленные из культуры лимфоцитов периферической крови здорового донора мужского пола, тогда как в примере 4 используются нативные препараты метафазных хромосом клеток ворсин хориона.

Нативные препараты из клеток ворсин хориона получают следующим образом: образцы ворсин хориона промывают в трех сменах изотонического раствора (0,9% раствор хлорида натрия) и помещают на 5-10 мин в 60% раствор уксусной кислоты при комнатной температуре, затем прикладывают («отпечатывают») образцы ворсин хориона к чистому предметному стеклу. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом помещают в термостат (температура 37°С) и используют в опытах уже через 1-2 часа после приготовления.

При цитогенетическом анализе препаратов клеток ворсин хориона у плода был обнаружен мужской кариотип с кольцевой хромосомой, предположительно кольцевой хромосомой 4 (r4). Следует отметить, что цитогенетический анализ метафазных хромосом на нативных препаратах клеток ворсин хориона часто затруднен из-за неудовлетворительного состояния метафазных пластинок. Однако этот метод используют в практике пренатальной диагностики, когда получить результат цитогенетического анализа необходимо в течение 3-4-х дней в первом триместре беременности. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались в данном случае малоэффективны. После проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й и 9-й хромосомы установлено происхождение кольцевой хромосомы в кариотипе, так как эти хромосомы легко распознавались непосредственно под микроскопом по наличию четырех сигналов. При анализе этих сигналов на гомологичных хромосомах были видны две нормальные гомологичные 9-тые хромосомы, одна нормальная 4-тая хромосома и кольцевая 4-тая хромосома. В результате молекулярного исследования у плода обнаружена кольцевая хромосома 4 (r4). Итак, с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й хромосомы установить присутствие хромосом 4-й пары в кариотипе плода при проведении пренатальной диагностики не представляет труда.

Таким образом, клонированная последовательность ДНК pYA11-39 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 4-тых и 9-тых хромосом как на стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосом человека, так и в случаях перестроенных 4-тых и 9-тых хромосом на различных стадиях клеточного цикла (метафазные и интерфазные ядра), а также на цитологических (без культивирования клеток) нативных препаратах клеток ворсин хориона. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 4-тых и 9-тых хромосом человека, а также при анализе анеуплоидий, особенно по хромосомам 9 и при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.

Изобретение относится к генетической инженерии. Рекомбинантная плазмидная ДНК pYA11-39 содержит: - Pst1-Pst1-фрагмент ДНК вектора pUC19 размером 2700 пар нуклеотидов, - Pst1-Pst1 - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерных районов 4-й и 9-й хромосом человека, размером 680 пар нуклеотидов. Последний получен из Pst1 рестриктов тотальной фракции альфоидной ДНК человека при гибридизации на хромосомах in situ в специальных условиях повышенной жесткости с использованием стандартного солевого раствора с 55% формамидом. Генетические маркеры -Ampr - ген устойчивости к ампициллину. Изобретение позволяет достоверно идентифицировать четвертую и девятую хромосомы человека в норме и патологии, включая преимплантационную, пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, в том числе анеуплоидии при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pYA11-39, предназначенная для маркирования 4-й и 9-й хромосом человека, содержащая: - Pst1-Pst1 - фрагмент ДНК вектора pUC19 размером 2700 пар нуклеотидов, - Pst1-Pst1 - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерных районов 4-й и 9-й хромосом человека, размером 680 пар нуклеотидов, полученный из Pst1 рестриктов тотальной фракции альфоидной ДНК человека при гибридизации на хромосомах in situ в специальных условиях повышенной жесткости с использованием стандартного солевого раствора с 55%-ным формамидом; генетические маркеры: Ampr - ген устойчивости к ампициллину.