СПОСОБ МАРКИРОВАНИЯ 7-Й ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА В МЕТАФАЗНЫХ И ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/68 G01N33/50 C12N15/85 

Изобретение относится к медицинской генетике, в частности к области медико-генетического консультирования и лабораторной диагностики хромосомных болезней, и может быть использовано для достоверной идентификации 7-ой хромосомы человека в норме и патологии, включая преимплантационную, пренатальную и постнатальную диагностику различных форм структурных хромосомных аномалий с вовлечением 7-ой хромосомы, анеуплоидии, кольцевых и добавочных маркерных хромосом с использованием культивируемых или некультивируемых клеток человека.

Целью изобретения является разработка эффективного способа маркирования 7-ой хромосомы человека в метафазных и интерфазных клетках с использованием оригинального молекулярно-генетического маркера, специфичного для центромерного района 7-ой хромосомы человека, включая гетерохроматин обоих плеч, который обладает следующими преимуществами для ускорения и повышения точности способа:

1. При применении специфических условий гибридизации in situ и пост-гибридизационной отмывки цитологических препаратов строго маркировал околоцентромерный район 7-ой хромосомы без перекрестной гибридизации с другими хромосомами.

2. Эффективно маркировал центромерный район 7-ой хромосомы в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.

Сущность изобретения заключается в том, что оригинальный клонированный фрагмент альфоидной ДНК, маркирующий центромерный район 7-ой хромосомы человека, используется в качестве ДНК-зонда для дифференциального выявления 7-ой хромосомы в специфических условиях проведения гибридизации in situ, позволяя быстро и надежно определять число хромосом 7 в интерфазных ядрах или метафазных клетках человека.

Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, 4, 6, 9, 11, 13, 18, 21 и X человека (Гиндилис и др., 1985, №1203108; Юров и др., 1989, №1494724; Юров и др., 1993, №1792429; Юров и др., 1997, №2087533; Соловьев и др., 1997, №2087534, Юров и др., 2000, №2161199; Юров и др., 2005, №2265060, Юров и др., 2008, №2325441). Остается актуальной задача получения ДНК зондов для эффективного, маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой для использования в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в 7-ой хромосоме (Product catalogue Vysis FISH probes "Abbott Molecular Diagnostics", www.abbottmolecular.com). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования 7-ой хромосомы человека в прикладных работах, в частности, для диагностики хромосомных аномалий в онкологии и медицинской генетике. При этом все описанные в литературе способы маркирования 7-ой хромосомы в метафазных и интерфазных клетках и использованием рекомбинантных плазмид, содержащих альфа-сателлитную ДНК, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерных районов хромосомы 7, и, следовательно, предназначены для лабораторных исследований, а не для диагностики хромосомный патологии при проведении медико-генетического консультирования. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствии аберраций 7-ой хромосомы. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики является разработка способов эффективного выявления хромосом и конструирование оригинальных маркеров для центромерного района 7-ой хромосомы человека, которые позволили бы проводить идентификацию центромерных районов в интерфазных и метафазных клетках.

Данный способ для высокоспецифичного маркирования центромерных районов 7-ой хромосомы человека с использованием оригинальной рекомбинантной плазмиды альфа R1-13 разработан впервые. Полученная рекомбинантная плазмида альфа R1-13 отличается от известных по литературе клонированных альфа-сателлитных ДНК по совокупности признаков: способу получения и по высокой специфичности для 7-ой хромосомы человека. В специальных условиях проведения гибридизации in situ с использованием стандартного солевого раствора с 55% формамидом в течение 4-18 часов при температуре 42°С и постгибридизационной отмывки в солевом растворе с 50% формамидом при температуре 42°С этот ДНК-зонд гибридизуется только с центромерными районами 7-ой хромосомы человека. Предлагаемый способ маркирования 7-ой хромосомы для диагностики хромосомной патологии не имеет вышеперечисленных общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерных районов 7-ой хромосомы человека данное техническое решение разработано впервые.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. Источником выделения маркерного фрагмента альфа R1-13 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидуума мужского пола) обрабатывают рестриктазой EcoRl до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты, размером 680 пар нуклеотидов, препаративно выделяют методом электрофореза в 0,8% агарозном геле и "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в EcoRl-сайт бактериального плазмидного вектора pBR325 (5966 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфоидной ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²Р) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дают позитивные рефлексы на радиоавтографах, в результате гибридизации отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 часов. За 1,5 часа до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3: 1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 M MgCl₂; 0,05 M дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³Н-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 при концентрации 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10 импульсов в мин в расчете на 1 мкг ДНК.

Клонированные фрагменты альфоидной ДНК были картированы на хромосомах человека in situ с использованием стандартных условий гибридизации в растворе, содержащем стандартный солевой раствор (2×SSC), 50% формамид, 10% декстрансульфат-500. Все клоны гибридизировались с центромерными районами всех хромосом человека без видимой специфики для индивидуальных хромосом. Однако применение специальных условий гибридизации, повышенной жесткости гибридизации за счет повышения концентрации формамида в растворе до 55% позволило выявить рекомбинантную ДНК альфа R1-13, которая принципиально отличается по хромосомной специфичности от остальных альфоидных ДНК.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 секунд в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 минут в растворах 70° и 96,6° спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% раствор декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимзы в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении × 1000 или × 1125.

Образцы рекомбинантной ДНК альфа R1-13 для гибридизации на хромосомах in situ можно метить и нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), уже описанным выше методом замещения. Для этого готовят реакционную смесь следующего состава: 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанола, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10U ДНК-полимеразы 1 из E.coli, 5-10 мкг ДНК-азыI и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50 mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х-18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2х SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1 М Na₂HPO₄ (рН 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI (4′,6-диамино-2-фенилиндол-дигидрохлорид), йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.

При микроскопии используют обычный флюоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующим набором светофильтров. Например, для одновременного анализа гибридизационных сигналов (зеленый цвет - FITC) и хромосом (красный цвет - йодистый пропидий) - фильтр I3, Leitz. Для хромосом и интерфазных ядер без гибридизационных сигналов - фильтр A, Leitz (DAPI - голубой цвет) или фильтр N 2.1, Leitz (йодистый пропидий - красный цвет).

При необходимости усиления гибридизационных сигналов (используя цитологические препараты низкого качества - плохая фиксация и т.п.) проводят дополнительную обработку гибридизационных сигналов - иммунологическую амплификацию.

Для этого препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20 в течение 5-15 мин; инкубируют с биотинилированными антителами к авидину (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл) 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С во влажной камере, накрывая пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Далее препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при темпрературе 37°-45°С, и повторно инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл), в течение 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С. Затем препараты опять промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (рН 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при температуре 37°-45°С и подготавливают для микроскопии. Процедуру амплификации слабого гибридизационного сигнала при необходимости можно проводить 2-3 раза.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-13 локализован в прицентромерных районах 7-ой пары гомологичных хромосом человека и является, таким образом, специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды альфа R1-13 для идентификации хромосомы 7 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным раствором декстрансульфата-500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4°С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (рН 8,0) 5 мМ MgCl₂, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450g, 10 мин).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCl, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при температуре 65°С не менее 1 часа до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ+1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ НВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 часов.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека клетки E.coli, несущие плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 37°С на качалке в течение 12 часов. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при температуре 65°С. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 часов инкубации при температуре 65°С проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (температура - 18°С, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1×SSC (1×SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при температуре 81°С в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1M KCl + 20 мМ трис-HCl рН 7,1 при температуре 0°С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50° изопропилового или 70° этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 минут при температуре 0°С. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию в течение 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при температуре 0°С. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (температура -18°С, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (рН 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктазы EcoR 1 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 часов при температуре 37°С. Реакцию останавливают прогреванием пробы при температуре 70°С в течение 10 мин.

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pBR325, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры клеток E.coli HB 101, выращивают на качалке при температуре 37°С до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до температуры 0°С раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл раствора 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М раствора CaCl₂ с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при температуре 0°С по крайней мере в течение 30 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при температуре -80°С, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев. В дальнейшем при использовании к 200 мкл компетентной культуры бактерий при температуре 0°С добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (температура 42°С) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 часа при температуре 37°С. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением ампициллина, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ СаС1₂, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при температуре 70°С 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (рН 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²Р- дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью ПО ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 часа при температуре 37°С. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5×10⁸ имп/мин/мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при температуре 37°С. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (рН 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (рН 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2×SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при температуре 37°С. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 1-2 часов.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при температуре 68°С в растворе 2×SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон - 350 в течение 60-90 минут. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6×SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²Р-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5×10⁶ имп/мин. Гибридизацию проводят при температуре 68°С в течение 18-24 часов. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5×SSC с 0,5% SDS при температуре 68°С в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 часа экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой EcoRl фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoRl и идентификации полосы размером 680 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых получила название альфа R1-13.

Препараты хромосом готовят из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco", США). Клетки культивируют в пенициллиновых флаконах или шприцах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 часов. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят как изотопной меткой, так и флюоресцентной метками методом замещения. В первом случае (изотопный метод), в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05 M дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н³-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н³-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и 5 мкл ДНК (1 мкг) пробы альфа R1-13. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 сек в 0,07Н NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70° и 96,6° этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при температуре 37°С, в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении ×1000 или ×1125.

Во втором случае, при мечении образцов рекомбинантной ДНК нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), готовят реакционную смесь следующего состава: 50mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанол, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10 единиц ДНК-полимеразы 1 из E.coli, 10 нг ДНК-азы I и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50 mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х-18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М NaH₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% DABCO в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI, йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.

Гибридизация in situ, как радиоактивная (изотопная), так и нерадиоактивная (флюоресцентная) на метафазных хромосомах человека, показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-13 локализуется только в прицентромерном районе 7-ой пары гомологичных хромосом человека и является, таким образом, молекулярным маркером данной пары хромосом, специфически маркирующим околоцентромерные районы.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера 7-ой пары хромосом в тех случаях, когда эти хромосомы (один из гомологов) затронуты перестройкой, т.е. имеет потерю или добавление какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 7-ой хромосомы и ее форме.

Все процедуры по выделению образца ДНК альфа R1-13 и его обработке с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора ребенка мужского пола (пробанда) со следующими клиническими проявлениями: умственной отсталостью, эктродактилией, брахидактилией, короткой шеей, характрными лицевыми аномалиями, поперечной бороздой на ладони, готическим небом и нерегулярным расположением зубов. При цитогенетическом анализе клеток пробанда был обнаружен кариотип с предположительно сбалансированной перестройкой (перицентрическая инверсия хромосомы 7), т.е. без видимой потери хромосомного материала в околоцентромерном районе. Это должно было соответствовать нормальному фенотипу ребенка. Подобная инверсия была обнаружена и у его фенотипически нормальной матери. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы, точно установить изменения в кариотипах пробанда и его матери не составило труда. В обоих случаях, одна из точек разрыва была локализована в перицентромерном гетерохроматине (альфоидной ДНК хромосомы 7) и легко распознавалась непосредственно под микроскопом. Тем не менее наблюдались определенные различия между носителями инверсии в данной семье. У матери инверсия образовала два отдельных блока альфоидной ДНК, тогда как у пробанда с фенотипическими аномалиями альфоидная ДНК гибридизовалась гомогенно с инвертированным участком. Известно, что гетерохроматин, сформированный альфоидной ДНК, представляет собой транскрипционно неактивную структуру хромосомы. Следовательно, инкорпорация альфоидного блока в последовательность генонасыщенных участков хромосомы может влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов соответствующего участка. Клинические отличия у пробанда и его матери, вероятнее всего можно объяснить эффектом положения генов в результате их необычного перемещения из-за инверсий и следовательно, изменению порядка располоржения генов в соответствующих хромосомных участках. Таким образом, с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы изменения в гомологичных хромосомах, затронутых перестройкой, распознаются легко при анализе под микроскопом.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой пары хромосом является опыт по идентификации этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая хромосома X, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца хроматина X, образованного одной из двух хромосом X в женском наборе, а также половая хромосома У, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера альфа R1-13, специфически маркирующего только 7-ые хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК альфа R1-13 гибридизуется с ДНК околоцентромерных областей 7-ой пары хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в деспирализованном состоянии на стадии интерфазы. При этом в каждом интерфазном ядре можно видеть после гибридизации два скопления метки или сигнала, соответствующих 7-ой паре хромосом.

Все процедуры по выделению образца альфа R1-13 и его обработки с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом клеток периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично процедурам, описанным в примере 1. При этом в каждом интерфазном ядре обнаруживаются два скопления гранул метки (два кластера) при изотопном мечении или 2 светящихся сигнала при нерадиоактивном мечении, соответствующих гомологичным хромосомам 7-ой пары. В разных ядрах расстояния между кластерами и сигналами различны. Итак, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.

Пример 4. Исключительно важной иллюстрацией практического использования молекулярного маркера альфа R1-13 является опыт по определению присутствия 7-ой пары хромосом в клетках нативных препаратов ворсин хориона в пренатальной диагностике плода.

Все процедуры по выделению образца ДНК альфа R1-13, его обработке с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит в том, что в примере 1 используются препараты метафазных хромосом, приготовленные из культуры лимфоцитов периферической крови здорового донора мужского пола, тогда как в примере 4 используются нативные препараты метафазных хромосом клеток ворсин хориона.

Нативные препараты из клеток ворсин хориона получают следующим образом: образцы ворсин хориона промывают в трех сменах изотонического раствора (0,9% раствор хлорида натрия) и помещают на 5-10 мин в 60% раствор уксусной кислоты при комнатной температуре, затем прикладывают («отпечатывают») образцы ворсин хориона к чистому предметному стеклу. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом помещают в термостат (температура 37°С) и используют в опытах уже через 1-2 часа после приготовления.

При цитогенетическом анализе препаратов клеток ворсин хориона у плода был обнаружен мужской кариотип с кольцевой хромосомой, предположительно кольцевой хромосомой 7 (r7). Следует отметить, что цитогенетический анализ метафазных хромосом на нативных препаратах клеток ворсин хориона часто затруднен из-за неудовлетворительного состояния метафазных пластинок. Однако этот метод используют в практике пренатальной диагностики, когда получить результат цитогенетического анализа необходимо в течение 3-4-х дней в первом триместре беременности. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались в данном случае малоэффективны. После проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы, установлено происхождение кольцевой хромосомы в кариотипе, так как эти хромосомы легко распознавались непосредственно под микроскопом по наличию двух сигналов. При анализе этих сигналов на гомологичных хромосомах были видны одна нормальная 7-ая хромосома и кольцевая 7-ая хромосома. В результате молекулярного исследования у плода обнаружена кольцевая хромосома 7 (r7). Итак, с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы установить присутствие хромосом 7-ой пары в кариотипе плода при проведении пренатальной диагностики не представляет труда.

Таким образом, разработанный способ маркирования 7-ой хромосомы с использованием клонированной последовательности альфа-сателлитной ДНК альфа R1-13 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 7-ой хромосомы как на стандартных препаратах нормальных хромосом человека (после культивирования клеток), так и в случаях перестроенных хромосом 7-ой пары на различных стадиях клеточного цикла (метафазные и интерфазные ядра), а также на цитологических нативных препаратах клеток ворсин хориона (без культивирования клеток). Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях структурных перестроек 7-ой хромосомы человека, маркерных хромосом, кольцевых хромосом, а также при анализе анеуплоидий, особенно по 7-ым хромосомам при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано в медицинской генетике. Предложен способ маркирования 7-ой хромосомы человека, предусматривающий гибридизацию in situ хромосом метафазных или интерфазных клеток тестируемого образца и ДНК-зонда, представленного маркерной плазмидой альфа R1-13, которая состоит из EcoRl-EcoRl-фрагмента ДНК вектора pBR 325 размером 5966 пар нуклеотидов и EcoRl-EcoRl-фрагмента альфоидной ДНК 7-ой хромосомы человека размером 680 пар нуклеотидов. Разработаны условия тестирования, в которых используемый ДНК-зонд специфически взаимодействует с центромерным районом хромосомы 7 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами человека, что существенно повышает эффективность идентификации данной хромосомы и обеспечивает возможность применения нового метода в медицинской диагностике.

Маркирование 7-й хромосомы человека, которое предусматривает гибридизацию in situ хромосом в метафазных и интерфазных клетках тестируемого образца и ДНК-зонда, представленного маркерной плазмидой, в условиях повышенной жесткости, отличающееся тем, что денатурацию хромосомной и плазмидной ДНК проводят одновременно в условиях in situ при температуре 75°С в течение 5 мин в гибридизационной смеси, состоящей из 55%-ного раствора формамида в стандартном солевом растворе 0,3М хлористого натрия и 0,03М цитрата натрия (2×SSC), с последующей гибридизацией в течение 4-18 ч при температуре 42°С; отмывают препараты в стандартном солевом растворе (2×SSC) с 50% формамидом при температуре 42°С в течение 3 мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин; детекцию результатов гибридизации ДНК-зонда с ДНК интерфазных или метафазных хромосом проводят с использованием флюоресцентной микроскопии, а в качестве маркерной плазмиды используют рекомбинантную плазмиду альфа R1-13, содержащую EcoRl-EcoRl-фрагмент ДНК вектора pBR 325 размером 5966 пар нуклеотидов и EcoRl-EcoRl-фрагмент альфоидной ДНК 7-й хромосомы человека размером 680 пар нуклеотидов.