СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МЕТАФАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ СО СЛАБОЙ КОНДЕНСАЦИЕЙ ХРОМОСОМ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и цитогенетике и касается приготовления хромосомных препаратов из клеток организма, прежде всего с низким митотическим индексом.

Хромосомные аберрации лежат в основе возникновения так называемых хромосомных патологий (болезнь Дауна, болезнь Шерешевского-Тернера и др.), а также обусловливают или сопровождают во многих случаях развитие онкологических заболеваний, прежде всего гемобластозов. В настоящее время базовым подходом к оценке кариотипа при хромосомных и онкогематологических патологиях является исследование метафазных и прометафазных хромосом с помощью световой микроскопии (Verma R.S. and Babu A. Human chromosomes. - 1989. - Pergamon Press, Inc., New York. - 240 p.). Успешность проведения такого исследования определяется главным образом митотическим индексом и качеством морфологии хромосом в приготовленном препарате. К важнейшему параметру качества относится длина, или растянутость, хромосом. Именно длина хромосом определяет важное для оценки кариотипа число поперечных полос (бэндов), выявляемых на хромосомах с помощью дифференциальной (G-, Q- или R-) окраски. При онкогематологических заболеваниях для адекватной оценки кариотипа исследуемых образцов необходим анализ не менее 20 метафазных пластинок со средней или низкой степенью конденсации (400-550 и более бэндов в гаплоидном наборе хромосом) хромосом. Низкое содержание метафазных пластинок с требуемой конденсацией хромосом в приготовленном препарате затрудняет, а порой делает невозможным адекватную оценку кариотипа исследуемого образца. Особенно часто такая ситуация встречается при исследованиях образцов (костного мозга, периферической крови, лимфоузлов) онкогематологических больных, прежде всего, на фоне проводимой терапии, которая, как правило, приводит к снижению уровня пролиферирующих клеток.

Известен способ приготовления хромосомных препаратов, включающий краткосрочное (18-24-48 час) без митогенов или долгосрочное (72-96-144 час и более) с митогенами культивирование без синхронизации и колцемидизацию (конечная концентрация колцемида 0,05 мкг/мл) за 3-5 час до начала фиксации (Methods in Molecular Biology, vol. 220: Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols Edited by: John Swansbury - Humana Press Inc., Totowa, NJ - 269 p.).

Недостатком данного способа приготовления хромосомных препаратов является нередко недостаточное для полноценного анализа количество метафаз вследствие низкого митотического индекса исследуемых лейкозных клеток.

Известен другой способ получения хромосомных препаратов, включающий краткосрочное (18-24-48 час) или долгосрочное (72-96-144 час и более с митогенами) культивирование без синхронизации, ингибирование конденсации хромосом благодаря добавлению бромистого этидия (1 мг/мл) за 1,5-2 час до начала фиксации и колцемидизацию (конечная концентрация колцемида 0,05 мкг/мл) за 1-1,5 час до начала фиксации (Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. Пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2006. 152 с.).

Недостатком указанного способа приготовления хромосомных препаратов является часто неадекватное для анализа количество метафаз вследствие низкого митотического индекса.

Известен еще один способ приготовления хромосомных препаратов, основанный на культивировании клеточных культур с синхронизацией. В соответствии с данным способом образцы гемопоэтических клеток онкогематологических больных культивирумого в течение 16-18 час в присутствии блокатора клеточного цикла 1) избытка тимидина (5×10^-7 М) или 2) 10^-7 М флуородеоксиуридина +4×10^-6 М уридина. В культурах с избытком тимидина за 4 час до начала фиксации осуществляется освобождение от блока добавлением дезоксицитидина в конечной концентрации 10^-7 М или заменой старой среды культивирования на теплую новую. В обоих случаях колцемидизация (конечная концентрация колцемида 0,1 мкг/мл) проводится также за 4 час до начала фиксации. При использовании же в качестве блокатора флуородеоксиуридина/уридина освобождение от блока достигается добавлением в инкубационную среду тимидина в конечной концентрации 4×10^-5 М и последующей реинкубацией в течение 4,5-5,5 час. За 1 час до начала фиксации добавляется колцемид в концентрации 0,05 мкг/мл (Methods in Molecular Biology, vol. 220: Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols Edited by: John Swansbury - Humana Press Inc., Totowa, NJ - 269 p.).

Недостаток данного способа получения хромосомных препаратов заключается в том, что продуцируется относительно малое количество митозов.

В качестве прототипа способа выбран способ получения хромосомных препаратов, включающий:

1) несихронизированное культивирование, краткосрочное (18-24-48 час) без митогена или долгосрочное (72-96-120 час и более) с митогеном (митогенами - phorbol 12-myristate 13-acetate (РМА), lipolysaccharides fgrom E.coli (LPS), pokeweed mitogen (PWM), фитогемагглютинин (ФГА) и др.),

2) колцемидизацию (концентрация колцемида 0,05 мкг/мл) за 16-18 час до начала фиксации (так называемая «ночная» колцемидизация),

3) гипотонизацию,

4) фиксацию,

5) нанесение клеточной взвеси на предметное стекло (Methods in Molecular Biology, vol. 220: Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols Edited by: John Swansbury - Humana Press Inc., Totowa, NJ - 269 p.).

Данный способ обеспечивает высокий митотический индекс хромосомного препарата.

К недостатку способа относится низкое содержание метафазных пластинок со слабо конденсированными хромосомами в хромосомном препарате, что вызывает значительные затраты времени на поиск указанных пластинок, а во многих случаях не позволяет проводить полноценный анализ кариотипа.

Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.

Технический результат заключается в ускорении и повышении точности анализа кариотипа гемопоэтических клеток.

Данный технический результат достигается тем, что предложен способ получения хромосомных препаратов, включающий:

1) культивирование в присутствии тимидина в концентрации 5×10^-7 М в течение 17-18 час после предварительной инкубации в культуральной среде в течение 5-6 час без митогена или в течение 54 час с митогеном (митогенами),

2) освобождение от блока 2-кратной отмывкой в среде культивирования,

3) реинкубацию в присутствии бромистого этидия с концентрацией 2 мкг/мл в течение 23-24 час,

4) колцемидизацию (0,02 мкг/мл) за 16-18 час до начала фиксации.

Этапы получения хромосомных препаратов, связанные с гипотонизацией, фиксацией и нанесением клеточной взвеси на предметное стекло, проводятся стандартно.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что удается повысить содержание метафазных пластинок со слабо конденсированными хромосомами в препаратах в 2-3 раза по сравнению с прототипом способа благодаря проведению культивирования клеток в присутствии избытка тимидина (5×10^-7 М) в течение 17-18 час и их последующей длительной инкубации при низких концентрациях бромистого этидия (2 мкг/мл) и колцемида (0,02 мкг/мл), добавляемых соответственно за 23-24 час и 16-18 час до начала фиксации. Применение низких концентраций бромистого этидия дает принципиальную возможность его использования при длительных культивированиях клеток благодаря минимизации цитостатического эффекта.

Способ осуществляют следующим образом.

I. Для приготовления хромосомных препаратов с применением краткосрочного безмитогенного культивирования образец костного мозга (периферической крови или лимфоузла) ставится на культивирование при 37°C в стерильной одноразовой пластиковой пробирке (объем 12-15 мл) в 5 мл культуральной смеси из расчета 1-2 млн. ядросодержащих клеток на 1 мл культуральной смеси. Культуральная смесь включает 4 мл среды RPMI-1640, 1 мл инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамин с конечной концентрацией 292 мкг/мл и антибиотики пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Спустя 5-6 час добавляется тимидин в конечной концентрации 5×10^-7 М и осуществляется реинкубация в течение 17-18 час. Далее проводится отмывка от тимидина с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин, удаления супернатанта и последующего добавления 10 мл нагретой до 37°C культуральной среды. Указанная отмывка повторяется дважды. После последней отмывки клетки суспендируются в 5 мл культуральной смеси, после чего добавляется бромистый этидий в конечной концентрации 2 мкг/мл, а спустя 4-6 час - колцемид в конечной концентрации 0,02 мкг/мл. После добавления колцемида клетки культивируются в течение 16-18 час. По окончании инкубации клетки осаждаются центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Удаляется супернатант, осадок тщательно разбивается встряхиванием в примерно 0,5 мл супернатанта и ресуспендируется в 7-10 мл нагретого до 37°C гипотонического (0,075 М) раствора KCl. Далее клетки инкубируются в течение 10 мин при 37°C.

Затем клетки центрифугируются при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляется, а осадок тщательно разбивается встряхиванием примерно в 0,5 мл супернатанта. Далее по каплям при осторожном перемешивании добавляется 7-10 мл фиксатора, выдерживается в течение 20 мин при комнатной температуре и проводится центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 мин. По окончании центрифугирования осадок вновь ресуспендируется в 5 мл фиксатора и выдерживается 7-10 мин при комнатной температуре. После этого проводится центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендирование клеток в фиксаторе с последующим их центрифугированием повторяется 4-6 раз в зависимости от качества полученных препаратов. Последний раз осадок клеток суспендируется в 0,5 мл свежего фиксатора. Затем на охлажденное, смоченное водой стекло наносится 1 капля суспензии.

II. Для приготовления хромосомных препаратов с применением долгосрочного культивирования с участием митогенов (PWM, РМА, LPS, ФГА и др.) образец периферической крови или лимфоузла ставится на культивирование при 37°C из расчета 1-2 млн. ядросодержащих клеток на 1 мл культуральной смеси при условиях, аналогичных для безмитогенного культивирования, с той лишь разницей, что в культуральную смесь дополнительно вводится тот или иной митоген (или коктейль митогенов) в соответствующих стандартных концентрациях. Спустя 54 час добавляется тимидин в конечной концентрации 5×10^-7 М и осуществляется реинкубация в течение 17-18 час. Все остальные процедуры такие же, как в случае с приготовлением хромосомных препаратов с краткосрочным безмитогенным культивированием.

Пример 1. Для оценки кариотипа больной К. был получен пунктат костного мозга объемом 3 мл. Исходная концентрация ядросодержащих клеток составила 5×10⁶/мл. Пунктат был разделен на 3 равные по объему части (I-III). Части I и II ставились на культивирование соответственно в течение 24 час и 48 час с ночной колцемидизацией за 18 час до начала фиксации. Часть III культивировалась в течение 5-6 час, после чего добавлялся тимидин в конечной концентрации 5×10^-7 М и осуществлялась реинкубация в течение 17-18 час. После отмывки клеток от тимидина за 23 час и 18 час до начала фиксации добавлялись бромистый этидий (2 мкг/мл) и колцемид (0,02 мкг/мл) в конечной концентрации соответственно 2 мкг/мл и 0,02 мкг/мл. После окончания культивирования обработка клеток проводилась стандартным способом. Полученные хромосомные препараты I-III были проанализированы после дифференциального G-окрашивания. В препаратах I и II было обнаружено соответственно 9 и 13 метафазных пластинок со слабо конденсированными (400-550 бэндов на гаплоидный набор хромосом) хромосомами, а в препарате III 42 метафазные пластинки. Затраты времени на поиск 9 адекватных для анализа метафаз в препаратах I и II были примерно в 2,5-3 раза больше, чем в препарате III. При анализе кариотипа клеток в препарате III было выявлено 2 цитогенетических клона: 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[3]/46,XX[40]. При исследовании же препаратов I и II был выявлен только один цитогенетический клон клеток, а именно, с нормальным кариотипом. Карио-типы препаратов I и II соответственно: 46,ХХ[9] и 46,ХХ[13].

Пример 2. Для оценки кариотипа больного М. был получена периферическая кровь объемом 10 мл. Исходная концентрация ядросодержащих клеток составила 50×10⁶ /мл. Одна порция была поставлена на культивирование в присутствии смеси митогенов РМА (50 нг/мл) и LPS (100 мкг/мл) в течение 96 час и с ночной колцемидизацией (0,02 мкг/мл) за 18 час до начала фиксации (культура I). Вторая порция крови объемом 200 мкл культивировалась в присутствии смеси митогенов РМА (50 нг/мл) и LPS (100 мкг/мл) в течение 54 час. Часть II культивировалась в течение 54 час, после чего добавлялся тимидин в конечной концентрации 5×10^-7 М и осуществлялась реинкубация в течение 17-18 час. После отмывки клеток от тимидина за 23 час и 18 час до начала фиксации добавлялись бромистый этидий (2 мкг/мл) и колцемид (0,02 мкг/мл) в конечной концентрации соответственно 2 мкг/мл и 0,02 мкг/мл. После окончания культивирования обработка клеток проводилась стандартным способом. Полученные хромосомные препараты I-II были проанализированы после дифференциального G-окрашивания. В препаратах I и II было обнаружено соответственно 15 и 38 метафазных пластинок со слабо конденсированными (400-550 бэндов на гаплоидный набор хромосом) хромосомами. Затрата времени на поиск 15 адекватных для анализа метафаз в препарате I была примерно в 2-3 раза больше, чем в препарате II. При анализе кариотипа клеток в препарате II было выявлено 2 цитогенетических клона: 47,XY+12[2]/46,XY[36]. При исследовании же препарата I был выявлен только один цитогенетический клон клеток, а именно, с кариотипом 46,XY[15].

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам исследования. Способ приготовления метафазных препаратов со слабой конденсацией хромосом заключается в том, что осуществляют несинхронизированное культивирование клеток, краткосрочное без митогена или долгосрочное с митогеном (митогенами), «ночную» колцемидизацию за 16-18 ч до начала фиксации, гипотонизацию, фиксацию и нанесение клеточной взвеси на предметное стекло. При этом блокирование клеточного цикла проводят избытком тимидина (5×10^-7 М) в течение 17-18 ч после предварительного культивирования клеток в культуральной среде в течение 5-6 ч без митогена или 54 ч с митогеном (митогенами). Освобождение от блокатора клеточного цикла осуществляют 2-кратной отмывкой в культуральной среде. Реинкубацию проводят в присутствии 2 мкг/мл бромистого этидия в течение 23-24 ч. Колцемидизацию проводят при концентрации колцемида 0,02 мкг/мл спустя 6-8 ч после начала инкубации в присутствии бромистого этидия. Использование способа позволяет ускорить и повысить точность анализа кариотипа.

Способ приготовления метафазных препаратов со слабо конденсированными хромосомами, заключающийся в том, что осуществляют несинхронизированное культивирование клеток, краткосрочное без митогена или долгосрочное с митогеном (митогенами), «ночную» колцемидизацию за 16-18 ч до начала фиксации, гипотонизацию, фиксацию и нанесение клеточной взвеси на предметное стекло, отличающийся тем, что проводят: 1) блокирование клеточного цикла избытком тимидина (5·10^-7 М) в течение 17-18 ч после предварительного культивирования клеток в культуральной среде в течение 5-6 ч без митогена или 54 ч с митогеном (митогенами), 2) освобождение от блокатора 2-кратной отмывкой в культуральной среде, 3) реинкубацию в присутствии бромистого этидия с концентрацией 2 мкг/мл в течение 23-24 ч, 4) колцемидизацию при концентрации колцемида 0,02 мкг/мл спустя 6-8 ч после начала инкубации в присутствии бромистого этидия.