Способ культивирования клеток дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки, содержащей каротиноид астаксантин Российский патент 2017 года по МПК C12N1/16 C12P23/00 A23K30/10 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения белковой добавки, содержащей высший каротиноид астаксантин.

Благодаря своей уникальной структуре астаксантин защищает мембраны клеток всех органов. В отличие от других бета-каротинов и витамина Е, астаксантин содержит две дополнительные группы молекул кислорода, которые наделяют его способностью не только нейтрализовать свободные радикалы, но и останавливать разрушительные цепные реакции, ведущие к повреждению клеток. Благодаря особой химической структуре астаксантин относится к числу уникальных каротиноидов - ксантофиллов, которые являются антиоксидантами уникальной силы. Астаксантин является настолько мощным антиоксидантом, что исследования показали, что он в 10 раз эффективнее бета-каротина и в 100 раз эффективнее витамина Е. Кроме того, астаксантин не только нейтрализует свободные радикалы, но и взаимодействует с другими антиоксидантами, такими, как витамины С и Е, повышая их эффективность.

Такие свойства астаксантина делают его незаменимым для получении полноценного сбалансированного питания для сельскохозяйственных животных, птиц, пушных зверей, аквакультур.

Из уровня техники известно, что при кормлении красной рыбы используется синтетический астаксантин (патент RU 2237072, 2000 г., патент USA 7247752, 2004 г.) или астаксантин, выделенный из панцирей ракообразных (криль, креветки, крабы и т.д.), растений и водорослей.

Недостаток синтетического астаксантина заключается в том, что усваивается только L-форма, а D-форма, содержащаяся в количестве 50%, как во всех рацематах, не обладает биологической активностью. В препарате, содержащем синтетический астаксантин, присутствуют различные изомеры и другие продукты синтеза.

Выделение астаксантина из панциря ракообразных чаще всего производится экстракцией ацетоном или толуолом (патент RU 2236441, 1999 г., патент RU 2179816, 1999 г.).

Известны способы экстрагирования каротиноидов (в том числе и астаксантина) из каротиноидсодержащего растительного материала, включающие стадии: смешивание растительного материала с водой; дробление смеси, отделение твердых веществ от жидкости с получением двух фаз, пульпы и сыворотки, при котором растворитель выбирают из группы, состоящей из этилацетата, изопропилового спирта, этанола и ацетона, их смесей (заявка RU 2004106151, 2001 г.), или н-гексана или петролейного эфира (патент RU 2436771, 2010), а также способ, включающий кипячение исходного сырья с электролитом, расслоение экстракта на фазы и их разделение, извлечение целевых продуктов (патент RU 2050388, 1989 г.).

Недостатками данных способов является наличие остатков экстрагента и астаксантина после термической обработки, т.е. со сниженной активностью, либо перешедший под действием температуры в другую менее активную структурную форму (например, фикоксантин). Для проявления антиоксидантных свойств такого препарата требуется в два-три раза больше, чем при применении L-астаксантина.

Известен ряд изобретений, в которых продуцирование каротиноидов: астаксантина, зеаксантина производится при культивировании бактерий, принадлежащих роду Paracoccus, в среде, содержащей биотин (заявка RU 2012143727, 2010 г., заявка RU 2012145469, 2010) в концентрации 0,001-50 мг/л.

Из уровня техники известно использование в качестве продуцента астаксантина морской водоросли Haematococcus pluvialis. Данное производство осуществляют в открытых водоемах с морской водой в районах с высокой среднесуточной температурой и большим количеством солнечных дней в году (заявка RU 2010133948, 2008 г., патент US 6022701, 2000 г.) или при круглосуточном освещении люминесцентными лампами дневного света и непрерывной продувке воздухом (патент RU 2541455, 2008 г.) с подачей питательной среды. При этом концентрация астаксантина в биомассе составляет 0,8-2,8% сухого вещества.

Недостатками получения астаксантина из водорослей Haematococcus pluvialis в открытых водоемах являются ведение процесса при отсутствии асептических условий (продуктом является не сам астаксантин, а биомасса микроводорослей Haematococcus pluvialis, из-за отсутствия асептики, содержащая большое количество посторонней микрофлоры), низкая скорость роста водорослей, а также затраты на электроэнергию, расходуемую на освещение культиваторов.

В заявке RU 2004126703, 2002 г., описан метод получения новых штаммов Xanthophyllomyces dendrorhous (X. dendrorhous), проявляющих повышенное продуцирование астаксантина, который заключается в том, что родительский штамм X. dendrorhous подвергают мутации, но данное изобретение не касается промышленного производства астаксантина.

Более перспективными для промышленного производства астаксантина является использование в качестве продуцента штаммы дрожжей Phaffla rhodozyma (патент US 6413736, 1993 г., патент KR 20100105193, 2009 г., патент CN 101985645, 2009 г., патент CN 103614444, 2013 г.).

Недостатками данных изобретений являются: высокие затраты электроэнергии на освещение, использование в качестве источника углерода в питательных средах технической глюкозы и глицерина (патент CN 101985645, 2009 г.), а в качестве ростового фактора - дорогостоящих дрожжевого экстракта и/или пептона (патент, US 6413736, 1993 г.), сложность технического оформления процесса в промышленных масштабах при использовании гамма-излучения, электронного луча или рентгеновского облучения (патент KR 20100105193, 2009 г.).

В патенте RU 2284992, 2002 г. представлен способ получения моно- или полиокисленного ксантофилла, заключающийся в окислении каротиноида в более низком состоянии окисления, чем подлежащий получению ксантофилл, системой из водного раствора пероксида водорода и органического растворителя в присутствии йодсодержащего соединения.

Недостатки - получение астаксантина и других каротиноидов путем химического доокисления пероксидом водорода с катализаторами является трудоемким процессом, так как пероксид водорода используется не в процессе ферментации как индуктор каротиногенеза. а как химический реагент, а ксантофилл выделяют после проведения ферментации и доокисляют его отдельно от ферментации.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) изобретения определен способ "Способ культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин" (патент RU2529715, 2011 г.), состоящий в том, что готовят культуру дрожжей на твердой агаризованной среде, выращивают посевной материал на качалке в колбах, посевной материал переносят в основную питательную среду, содержащую ростовой фактор, соли аммония, магния, натрия, калий фосфорнокислый, ведут процесс культивирования периодическим способом, выращивание культуры дрожжей на агаризованной среде, посевной и ферментационной среде ведут с циклическим освещением, где время цикла 2-5 ч и время освещения за один цикл 3-10 мин; источником углеводов является ферментолизат крахмала из некондиционного зерна в количестве 5-8% по глюкозе; ферментолизат крахмала получают дроблением некондиционного зерна гидромеханоакустическим способом с последующим разделением на фракции и двухступенчатым ферментолизом выделенной крахмальной фракции; в качестве ростового фактора используют кукурузный экстракт в количестве 5-8%; в качестве основного аппарата используют фотобиореактор с внутренним светоподводом.

Недостатком данного изобретения является необходимость применения световой энергии при проведении процесса культивирования дрожжей, что приводит к значительным затратам, особенно в промышленных масштабах.

Индуктором каротиногенеза у светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma является синглетный кислород - промежуточная высокоэнергонасыщенная форма между молекулярным и триплетным состоянием кислорода.

Во всех известных патентах синглетный кислород образуется под действием световой энергии.

Однако синглетный кислород в водных растворах можно получить под действием сильных окислителей органической и неорганической природы.

Задача, решаемая изобретением, направлена на получение биомассы дрожжей, содержащей астаксантин, в ходе культивирования светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma, при индукции каротиногенеза синглетным кислородом, образующимся в культуральной жидкости под действием сильных окислителей при отсутствии световой энергии на стадиях промышленного получения посевного материала (в ферментерах) и культивирования дрожжей в основном ферментере.

Технический результат, получаемый при реализации изобретения, заключается в возможности использования стандартного ферментационного оборудования, проведения процесса выращивания микроорганизмов в асептических условиях, реализации способа культивирования в промышленных масштабах, минимизации затрат на освещение, в получении белково-витаминной кормовой добавки, содержащей не менее 50% сырого протеина и не менее 0,5 мг/г сухой биомассы астаксантина и/или содержащей не менее 20% сырого протеина и не менее 50 мг/г сухой биомассы астаксантина.

Технический результат достигается тем, что в способе культивирования светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки, содержащей астаксантин, включающий получение посевного материала при постоянном освещении 50-600 лк, путем последовательного выращивания светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma на агаризованной среде, в посевных колбах на качалке на среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, после чего перенос полученного материала в ферментеры и основной ферментер с ферментационной средой, содержащей источники углерода, ростовых факторов, минерального питания, согласно изобретению способ культивирования в ферментерах проводят при отсутствии световой энергии, а для индукции каротиногенеза используют синглетный кислород, образующийся в культуральной жидкости под действием сильного окислителя органической или неорганической природы, причем подачу раствора сильного окислителя начинают на стадии получения посевного материала в ферментере и на стадии культивирования в основном ферментере по окончании лаг-фазы роста культуры, при этом продолжают в течение всей экспоненциальной фазы роста, поддерживая постоянную оптимальную для данного окислителя концентрацию, обеспечивающую образование синглетного кислорода и каротиногенез в клетках дрожжей Phaffia rhodozyma, при этом основной ферментер имеет 10-кратный увеличенный объем по сравнению с ферментером.

Для получения белково-витаминной кормовой добавки, содержащей не менее 20% сырого протеина и не менее 50 мг/г сухой биомассы астаксантина одновременно с подачей раствора сильного окислителя после лаг-фазы в основном ферментере дают подпитку ферментационной средой, представляющей собой ферментативный гидролизат некондиционного зерна с содержанием редуцирующих веществ не менее 40%, при этом подпитку осуществляют из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.

В данном изобретении для получения белково-витаминной добавки, содержащей астаксантин, в процессе культивирования могут быть использованы светозависимые штаммы (кроме генноинженерных) дрожжей Phaffia rhodozyma" ВКПМ Y-2228, ВКПМ Y-2229, ВКПМ Y-3105, ВКПМ Y-1651, ВКПМ Y-1652, ВКПМ Y-1654, ВКПМ Y-1655, ВКПМ Y-1656, ВКПМ Y-1657, ВКПМ Y-1658, ВКПМ Y-1659, ВКПМ Y-1660, ВКПМ Y-1661, ВКПМ Y-1662, ВКПМ Y-1663, ВКПМ Y-1664, ВКПМ Y-1665, ВКПМ Y-1666, ВКПМ Y-1667, ВКПМ Y-1668, ВКПМ Y-1669, ВКПМ Y-1670, ВКПМ Y-1671, ВКПМ Y-1672, ВКПМ Y-1673.

Предлагаемый способ культивирования светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) для получения белково-витаминной добавки, содержащей каротиноид астаксантин, реализуется следующим образом.

Культуру дрожжей Phaffia rhodozyma на твердой агаризованной среде и посевной материал дрожжей в колбах на качалке получают при постоянном освещении 50-600 лк. Культивирование посевного материала для ферментации в основном ферментере проводят при отсутствии световой энергии, последовательно в несколько этапов до получения необходимого объема посевного материала для засева основного ферментера, имеющего 10-кратный увеличенный объем по сравнению с ферментером, внося раствор сильного окислителя на каждом этапе получения посевного материала, начиная с 15-го часа роста до окончания соответствующей стадии выращивания посевного материала, обеспечивающий образование синглетного кислорода и каротиногенез.

Количество ферментеров для получения посевного материала зависит от объема производства, т.е. от объема основного ферментера. Каждый последующий ферментер для получения посевного материала имеет 10-кратный объем по сравнению с предыдущим.

В качестве сильного окислителя неорганической природы используют перманганат калия или пероксид водорода, в качестве сильного окислителя органической природы - органические красители, такие как пурпурный красный, метиленовый синий, метиловый оранжевый, бенгальский розовый, обладающие способностью генерировать энергетически и химически активные синглетный кислород и радикалы.

Количество неорганического сильного окислителя подают таким образом, чтобы в среде культивирования концентрация неорганического сильного окислителя составляла 5-12 μмоль/л, длительность процесса при этом составляет 50-55 часов, количество образующейся сухой биомассы 40-50 г/л с содержанием астаксантина свыше 0,5 мг/г сухой биомассы.

Для получения белково-витаминной добавки с содержанием астаксантина не менее 50 мг/г сухой биомассы и сырого протеина не менее 20%, подачу раствора сильного окислителя начинают на стадии получения посевного материала в ферментерах и на стадии культивирования в основном ферментере по окончании лаг-фазы роста культуры и продолжают в течение всей экспоненциальной фазы, причем процесс культивирования в основном ферментере ведется с подпиткой ферментационной средой, представляющей собой ферментативный гидролизат некондиционного зерна с содержанием редуцирующих веществ 40%, при этом подпитку осуществляют из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости. В процессе культивирования в основном ферментере на оптимальном уровне поддерживаются следующие параметры: концентрация неорганического сильного окислителя 3-8 μмоль/л, концентрация редуцирующих веществ - не более 10 г/л, время процесса составляет 5-7 суток.

При использовании сильного окислителя органической природы оптимальная концентрация окислителя в культуральной жидкости в обоих вариантах составляет 1-2 μмоль/л.

В результате совокупности существенных признаков получается белковый кормовой продукт - белково-витаминная добавка, содержащая астаксантин, на основе биомассы дрожжей Phaffia rhodozyma:

- с содержанием сырого протеина не менее 50%, астаксантина не менее 0,5 мг/г сухой биомассы, углеводов 40%, жира 10%, которая может использоваться в качестве профилактической добавки в корм сельскохозяйственным животным, птице;

- с высоким содержанием астаксантина не менее 50 мг/г АСБ, не менее 18% сырого протеина, 45% углеводов, имеет в своем составе около 30% жиров, которые представлены полиненасыщенными жирными кислотами и обладает как профилактическими, так и лекарственными функциями. Накопление биомассы при этом составляет 40-50 г/л и/или 70-80 г/л соответственно.

Сущность технологии подтверждается, но не исчерпывается приведенными примерами.

Пример 1

Проводили культивирование штамма дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 в основном ферментере рабочим объемом 30 л. Для образования синглетного кислорода использовали сильный окислитель неорганической природы - пероксид водорода (Hydrogenii peroxydum).

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 получали в 2 этапа: в лабораторных условиях, в ферментере рабочим объемом 3 л.

Посевной материал в лабораторных условиях получали при постоянном освещении 50-600 лк путем последовательного выращивания дрожжей на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение семи суток, после чего полученный материал переносили в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 20 Кукурузный экстракт 30 Аммоний сернокислый 1 Натрий хлористый 0,5 Магний сернокислый 7-водный 0,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5

и проводили культивирование в течение 44-48 часов при температуре 20°С.

Затем проводили выращивание посевного материала для засева основного ферментера в ферментере рабочим объемом 3 л при отсутствии световой энергии. Для этого полученный посевной материал из колб переносили в указанный ферментер, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 80 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса был 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

- время культивирования 38 часа;

- процесс периодический.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса вносили предварительно приготовленный раствор сильного окислителя - пероксида водорода, который обеспечивал образование синглетного кислорода и каротиногенез. Количество сильного окислителя - пероксида водорода - подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования концентрация данного окислителя составляла 8-12 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, также снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой аналогичного состава, в которой концентрация ферментолизата крахмала по глюкозе не менее 100 г/л.

После засева основного ферментера по окончании лаг-фазы начали подачу раствора сильного окислителя - пероксида водорода в ферментер и продолжали в течение всей экспоненциальной фазы роста для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез. Количество сильного окислителя подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования концентрация окислителя поддерживалась на уровне 8-12 μмоль/л. Длительность процесса составила 55 часов, количество образовавшейся сухой биомассы 47 г/л, сырой протеин- 55,5%, углеводы 35,3%, жиры 9,2%, содержание астаксантина 0,65 мг/г сухой биомассы.

Пример 2

Процесс культивирования проводили в основном ферментере рабочим объемом 30 л, в качестве сильного окислителя для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, использовали раствор перманганата калия (Kalii permanganas).

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 получали в 2 этапа: в лабораторных условиях, в ферментере рабочим объемом 3 л аналогично Примеру 1.

Параметры процесса культивирования посевного материала в ферментере рабочим объемом 3 л:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса был 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

- время культивирования 53 часа;

- процесс периодический, при отсутствии световой энергии.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса вносили предварительно приготовленный раствор сильного окислителя - перманганата калия. Количество данного окислителя подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования концентрация кислорода составляла 5-7 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, также снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой, описанной в Примере 1.

После засева основного ферментера по окончании лаг-фазы начали подачу раствора сильного окислителя - перманганата калия - в ферментер и продолжали в течение всей экспоненциальной фазы роста для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез. Количество данного окислителя подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования его концентрация находилась на уровне 5-7 μмоль/л. Длительность процесса составила 54 часа, количество образовавшейся сухой биомассы 45 г/л, сырой протеин 52,6%, углеводы 38,2%, жиры 9,2%, содержание астаксантина 0,56 мг/г сухой биомассы.

Пример 3.

Процесс культивирования проводили в основном ферментере рабочим объемом 30 л, в качестве сильного окислителя для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, использовали раствор пероксида водорода.

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 в лабораторных условиях получали при постоянном освещении 50-600 лк путем последовательного выращивания дрожжей на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение четырех суток, после чего полученный материал переносили в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 20 Кукурузный экстракт 30 Аммоний сернокислый 1 Натрий хлористый 0,5 Магний сернокислый 7-водный 0,5 Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5

и проводили процесс культивирования в течение 47 часов при температуре 20°С.

Посевной материал из колб переносили в ферментер рабочим объемом 3 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 30 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный- 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

- время культивирования 54 часа;

- процесс периодический, при отсутствии световой энергии.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса вносили предварительно приготовленный раствор сильного окислителя - пероксида водорода, который обеспечивал образование синглетного кислорода и каротиногенез. Количество данного окислителя - пероксида водорода - подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования его концентрация составляла 8-12 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой, описанной в Примере 1.

Подачу раствора сильного окислителя - пероксида водорода - в основной ферментер начали после лаг-фазы на экспоненциальной фазе роста и продолжали в течение всего процесса культивирования для создания концентрации окислителя в среде 6-8 μмоль/л. Одновременно давали подпитку ферментационной средой - ферментативным гидролизатом некондиционного зерна с содержанием редуцирующих веществ 40%. Подпитку давали из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.

Длительность процесса составила 6 суток, количество образовавшейся сухой биомассы 72 г/л, сырой протеин 19,8%, углеводы 49,7%, жиры 30,5%, содержание астаксантина 58,6 мг/г сухой биомассы.

Пример 4.

Процесс культивирования проводили в ферментере рабочим объемом 30 л, в качестве окислителя для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, использовали раствор перманганата калия.

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 для основного ферментера получали в 2 этапа аналогично Примеру 1, используя на втором этапе получения посевного материала в качестве окислителя раствор перманганата калия в концентрации 5-7 μмоль/л в культуральной жидкости.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой, описанной в Примере 1.

Подачу раствора окислителя - перманганата калия - в основной ферментер начали после лаг-фазы на экспоненциальной фазе роста и продолжали в течение всего процесса культивирования для создания концентрации окислителя в культуральной жидкости 3-5 μмоль/л. Одновременно давали подпитку дополнительной ферментационной средой - ферментативным гидролизатом крахмала с содержанием редуцирующих веществ 40%. Подпитку давали из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.

Длительность процесса составила 7 суток, количество образовавшейся сухой биомассы 69 г/л, сырой протеин 20,2%, углеводы 49,8%, жиры 30%, содержание астаксантина 67,5 мг/г сухой биомассы.

Пример 5.

Проводили процесс культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 в основном ферментере рабочим объемом 30 л, для образования синглетного кислорода использовали сильный окислитель органической природы - основной фенотиазиновый краситель - метиленовый синий (Methylenum coeruleum, 3,7-бисдиметиламинофенотиоцианит хлорид).

Посевной материал получали в 2 этапа аналогично Примеру 1.

На втором этапе получения посевного материала посевной материал из колб переносили в ферментер рабочим объемом 3 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 80 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса был 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

- время культивирования 38 часа;

- процесс периодический, проводился при отсутствии световой энергии.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса для обеспечения образования синглетного кислорода вносили предварительно приготовленный раствор сильного органического окислителя - метиленового синего в количестве, обеспечивающем концентрацию данного окислителя в культуральной жидкости 1-2 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, также снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой аналогичного состава, в которой концентрация ферментолизата крахмала по глюкозе не менее 100 г/л.

После засева основного ферментера по окончании лаг-фазы начали подачу раствора сильного окислителя - метиленового синего в основной ферментер и продолжали в течение всей экспоненциальной фазы роста для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации окислителя на уровне 1-2 μмоль/л.

Длительность процесса составила 54 часа, количество образовавшейся сухой биомассы 47,5 г/л, сырой протеин 55,0%, углеводы 34,7%, жиры 9,8%, содержание астаксантина 0,68 мг/г сухой биомассы.

Пример 6.

Процесс культивирования проводили в основном ферментере рабочим объемом 30 л, в качестве сильного окислителя органической природы для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, использовали фенотиазиновый краситель - раствор метиленового синего (Methylenum coeruleum, 3,7-бисдиметиламинофенотиоцианит хлорид).

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2228 в лабораторных условиях получали при постоянном освещении 50-600 лк путем последовательного выращивания дрожжей на агаризованной среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, при 20°С в течение четырех суток, после чего полученный материал переносили в посевные колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 20 Кукурузный экстракт 30 Аммоний сернокислый 1 Натрий хлористый 0,5 Магний сернокислый 7-водный 0,5 Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5

и проводили процесс культивирования в течение 47 часов при температуре 20°С.

Посевной материал из колб переносили в ферментер рабочим объемом 3 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой следующего состава (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 30 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г О₂/л*час.

- время культивирования 54 часа;

- процесс периодический.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса вносили предварительно приготовленный раствор сильного окислителя - метиленового синего, который обеспечивал образование синглетного кислорода и каротиногенез. Количество данного окислителя - метиленового синего - подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования его концентрация составляла 1-2 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой, описанной в Примере 1.

Подачу раствора сильного окислителя - метиленового синего - в основной ферментер начали после лаг-фазы на экспоненциальной фазе роста и продолжали в течение всего процесса культивирования для создания концентрации окислителя в среде 1-2 μмоль/л. Одновременно давали подпитку ферментационной средой - ферментативным гидролизатом некондиционного зерна с содержанием редуцирующих веществ 40%. Подпитку давали из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.

Длительность процесса составила 6 суток, количество образовавшейся сухой биомассы 71 г/л, сырой протеин 19,9%, углеводы 49,7%, жиры 30,4%, содержание астаксантина 59,9 мг/г сухой биомассы.

Пример 7.

Процесс культивирования проводили в основном ферментере рабочим объемом 30 л, в качестве сильного окислителя для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, использовали раствор перманганата калия.

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2229 для основного ферментера получали в 2 этапа аналогично Примеру 1, используя на втором этапе получения посевного материала в качестве окислителя раствор перманганата калия в концентрации 3-5 μмоль/л в культуральной жидкости.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой, описанной в Примере 1.

Подачу раствора сильного окислителя - перманганата калия - в основной ферментер начали после окончания лаг-фазы на экспоненциальной фазе роста и продолжали в течение всего процесса культивирования для создания концентрации данного окислителя в культуральной жидкости 3-5 μмоль/л. Одновременно давали подпитку ферментационной средой - ферментативным гидролизатом крахмала с содержанием редуцирующих веществ 40%. Подпитку давали из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.

Длительность процесса составила 6 суток, количество образовавшейся сухой биомассы 67 г/л, сырой протеин 19,3%, углеводы 48,6%, жиры 26%, содержание астаксантина 52,5 мг/г сухой биомассы.

Пример 8.

Проводили процесс культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-1663 в основном ферментере рабочим объемом 30 л, для образования синглетного кислорода использовали сильный окислитель органической природы - кислотно-основной индикатор, синтетический органический краситель из группы азокрасителей метиленовый оранжевый (метилоранж, Methyl orange, гелиантин, 4-(4-диметиламинофенилазо) бензолсульфонат натрия.

Посевной материал получали в 2 этапа аналогично Примеру 1.

На втором этапе получения посевного материала посевной материал из колб переносили в ферментер рабочим объемом 3 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой следующего состава(г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 80 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса был 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час;

- время культивирования 42 часа;

- процесс периодический.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса для обеспечения образования синглетного кислорода, вносили предварительно приготовленный раствор сильного органического окислителя - метиленового оранжевого в количестве, обеспечивающем концентрацию данного окислителя в культуральной жидкости 1-2 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, также снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой аналогичного состава, в которой концентрация ферментолизата крахмала по глюкозе не менее 100 г/л.

После засева основного ферментера по окончании лаг-фазы начали подачу раствора сильного окислителя - метиленового оранжевого в ферментер и продолжали в течение всей экспоненциальной фазы роста для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации окислителя на уровне 1-2 μмоль/л.

Длительность процесса составила 55 часов, количество образовавшейся сухой биомассы 45,7 г/л, сырой протеин 50,8,%, углеводы 35,2%, жиры 10,5%, содержание астаксантина 0,53 мг/г сухой биомассы.

Пример 9.

Проводили процесс культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-1657 в основном ферментере рабочим объемом 30 л, для образования синглетного кислорода использовали сильный окислитель органической природы - бенгальский розовый (rose Bengal).

Посевной материал получали в 2 этапа аналогично Примеру 1.

На втором этапе получения посевного материала посевной материал из колб переносили в ферментер рабочим объемом 3 л, снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой следующего состава(г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 80 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса был 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

- время культивирования 44 часа;

- процесс периодический.

С 15-го часа роста культуры дрожжей и до окончания процесса для обеспечения образования синглетного кислорода, вносили предварительно приготовленный раствор сильного органического окислителя - бенгальский розовый в количестве, обеспечивающем концентрацию данного окислителя в культуральной жидкости 1-2 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили в основной ферментер рабочим объемом 30 л, также снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой аналогичного состава, в которой концентрация ферментолизата крахмала по глюкозе не менее 100 г/л.

После засева основного ферментера по окончании лаг-фазы начали подачу раствора сильного окислителя - бенгальский розовый в ферментер и продолжали в течение всей экспоненциальной фазы роста для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации окислителя на уровне 1-2 μмоль/л.

Одновременно давали подпитку ферментационной средой ферментативным гидролизатом некондиционного зерна с содержанием редуцирующих веществ 40%. Подпитку давали из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.

Длительность процесса составила 7 суток, количество образовавшейся сухой биомассы 62 г/л, сырой протеин 19,0%, углеводы 44,2%, жиры 28%, содержание астаксантина 51,8 мг/г сухой биомассы.

Пример 10.

Культивирование дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2229 проводили в основном ферментере рабочим объемом 100 л, для образования синглетного кислорода использовали сильный окислитель неорганический природы - пероксид водорода.

Посевной материал дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2229 получали в лабораторных условиях аналогично Примеру 1.

Посевной материал дрожжей для засева основного ферментера получали путем последовательного выращивания дрожжей Phaffia rhodozyma штамм ВКПМ Y-2229 в ферментерах рабочим объемом 1 л и 10 л, снабженные системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода. Состав среды для выращивания посевного материала в ферментерах следующий (г/л):

Ферментолизат крахмала по глюкозе 25 Кукурузный экстракт 80 Аммоний сернокислый 16 Натрий хлористый 1 Магний сернокислый 7-водный 1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 Пеногаситель Пропинол Б-400 0,1

Процесс проводился при отсутствии световой энергии.

Параметры процесса культивирования в ферментере:

- температура 20°С;

- рН в начале процесса был 4,5-4,7;

- начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г O₂/л*час.

- процесс периодический.

Время культивирования составило 38 и 35 часов соответственно.

Процесс проводили при отсутствии световой энергии. С 15-го часа роста культуры дрожжей в ферментерах 1 и 10 литров и до окончания процесса вносили предварительно приготовленный раствор окислителя - пероксида водорода, который обеспечивал образование синглетного кислорода и каротиногенез. Количество окислителя - пероксида водорода - подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования концентрация окислителя составляла 7-12 μмоль/л.

По окончании процесса полученный посевной материал переносили из ферментера рабочим объемом 10 л в основной ферментер рабочим объемом 100 л, также снабженный системами регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления растворенного кислорода, предварительно заполненный стерильной питательной средой аналогичного состава, в которой концентрация ферментолизата крахмала по глюкозе не менее 100 г/л.

После засева основного ферментера по окончании лаг-фазы начали подачу раствора окислителя - пероксида водорода в основной ферментер и продолжали в течение всей экспоненциальной фазы роста для образования синглетного кислорода, индуцирующего каротиногенез. Количество окислителя подавалось таким образом, чтобы в среде культивирования концентрация окислителя поддерживалась на уровне 7-12 μмоль/л. Длительность процесса составила 53 часа, количество образовавшейся сухой биомассы 49 г/л, сырой протеин 56,4%, углеводы 39,3%, жиры 9,8%, содержание астаксантина 0,73 мг/г сухой биомассы.

Изобретение позволяет получить белковый кормовой продукт - белково-витаминную добавку на основе биомассы дрожжей Phaffia rhodozyma с содержанием сырого протеина не менее 50%, астаксантина не менее 0,5 мг/г сухой биомассы и/или с содержанием астаксантина не менее 50 мг/г АСБ, не менее 18% сырого протеина, которая может быть использована в качестве профилактической добавки в корм сельскохозяйственным животным, птице, при этом изобретение позволяет использовать стандартное ферментационное оборудование, проводить процесс в асептических условиях, реализовать процесс в промышленных масштабах, минимизировать затраты на освещение.

Данный процесс аналогов в Российской Федерации и мире не имеет.

Используемые источники информации

Патент RU 2237072, 2000 г.

Патент RU 2236441, 1999 г.

Патент RU 2179816, 1999 г.,

Патент RU 2436771, 2010 г.

Патент RU 2050388, 1989 г.

Патент RU 2541455, 2008 г.

Патент RU 2284992, 2002 г.

Патент RU 2529715, 2011 г.

Заявка RU 2004106151, 2001 г.

Заявка RU 2012143727, 2010 г.

Заявка RU 2012145469, 2010

Заявка RU 2010133948, 2008 г.

Заявка RU 2004126703, 2002 г

Патент US 6413736, 1993 г.

Патент US 7247752, 2004 г.

Патент US 6413736, 1993 г.

Патент US 6022701, 2000 г.

Патент CN 101985645, 2009 г.

Патент CN 103614444, 2013 г.

патент CN 101985645, 2009 г.

патент KR 20100105193, 2009 г.

патент KR 20100105193, 2009 г.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ культивирования штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки с астаксантином. Способ включает последовательное выращивание штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma на агаризованной среде и в посевных колбах на среде с ферментолизатом крахмала, кукурузным экстрактом и солями, перенос полученного материала в ферментеры. Культивирование в ферментерах проводят при отсутствии световой энергии, причём культивирование посевного материала проводят с 10-кратным увеличением объёмов ферментеров. Для индукции каротиногенеза используют синглетный кислород. Изобретение обеспечивает возможность использования стандартного ферментационного оборудования, проведения процесса в асептических условиях, реализовывать процесс в промышленных масштабах и минимизировать затраты на освещение. 1 з.п. ф-лы, 10 пр.

1. Способ культивирования светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки, содержащей астаксантин, включающий получение посевного материала при постоянном освещении 50-600 лк путем последовательного выращивания светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma на агаризованной среде, в посевных колбах на качалке на среде, содержащей ферментолизат крахмала, кукурузный экстракт и соли, после чего перенос полученного материала в ферментеры и в основной ферментер с ферментационной средой, содержащей источники углерода, ростовых факторов, минерального питания, отличающийся тем, что способ культивирования в ферментерах проводят при отсутствии световой энергии, а для индукции каротиногенеза используют синглетный кислород, образующийся в культуральной жидкости под действием сильного окислителя органической или неорганической природы, причем подачу раствора сильного окислителя начинают на стадии получения посевного материала в ферментере и на стадии культивирования в основном ферментере по окончании лаг-фазы роста культуры, при этом продолжают в течение всей экспоненциальной фазы роста, поддерживая постоянную оптимальную для данного окислителя концентрацию, обеспечивающую образование синглетного кислорода и каротиногенез в клетках светозависимых штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma, при этом культивирование посевного материала для ферментации его в основном ферментере проводят последовательно с 10-кратным увеличением объемов ферментеров.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает одновременную с подачей раствора сильного окислителя после лаг-фазы в основном ферментере подпитку ферментационной средой, представляющей собой ферментативный гидролизат некондиционного зерна с содержанием редуцирующих веществ не менее 40%, при этом подпитку осуществляют из расчета поддержания концентрации редуцирующих веществ не более 10% в культуральной жидкости.