ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Xanthophyllomyces dendrorhous - ПРОДУЦЕНТ АСТАКСАНТИНА Российский патент 2006 года по МПК C12P23/00 C12N1/16 C12R1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению каротиноидных пигментов, и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Астаксантин (3,3'-дигидрокси-бета, бета-каротин-4,4'-дион) - каротиноидный пигмент, относящийся к ксантофиллам, широко распространен в природе. Именно ему обязана желтая, оранжевая, красная пигментация ракообразных, красных пород рыб, яичных желтков и оперения птиц. Животные, однако, не синтезируют данный пигмент, накапливая его в тканях при поедании различных низших организмов, в частности фитопланктона. В настоящее время все возрастающая часть лососевых пород рыб, ракообразных производится искусственным разведением и астаксантин является одним из наиболее дорогостоящих компонентов их рациона. Помимо рыбоводства, птицеводства астаксантин находит применение в парфюмерной, пищевой промышленности и перспективен в медицинских целях. Показано, что он относится к одним из наиболее мощных антиоксидантов и препятствует развитию раковых и ряда других заболеваний [Johnson E.A., Schroeder W.A., 1995. Microbial carotenoids. Adv. Biochem. Engineer. Biotechnol. 53: 121-178].

Хотя многие грибы содержат каротиноиды, очень редкие из них синтезируют ксантофиллы и лишь единственный вид дрожжевых грибов, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) образует астаксантин. Природные изоляты этих дрожжей имеют, однако, низкое содержание астаксантина (100-300 мкг/г сухой биомассы), что делает нерентабельным его производство.

Известны мутантные штаммы Phaffia rhodozyma ATCC 74218-74221 - [Патент США N 6015684, кл. С 12 Р 23/00, C 12 N 1/16, 2000], образующие 40-60 г/л сухой биомассы с содержанием астаксантина свыше 3000 мкг/г сухой биомассы при двухстадийном периодическом культивировании на средах, содержащих дрожжевой экстракт, минеральные соли, витамины и микроэлементы, при этом на первой стадии в качестве источника углерода используют глюкозу, на второй - глицерин.

Основными недостатками известных штаммов-сверхпродуцентов остаются, судя по литературным данным, нестабильность полученных мутантов, низкая скорость роста и, следовательно, низкий выход биомассы дрожжей [[Johnson E.A., Schroeder W.A., 1995. Microbial carotenoids. Adv. Biochem. Engineer. Biotechnol. 53:121-178].

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является мутантный штамм Phaffia rhodozyma ATCC 74219, обеспечивающий при двустадийном периодическом культивировании (температура 20-22°С; рН 5; pO₂ - 20-70%, время культивирования - 136 час) на средах, содержащих дрожжевой экстракт, глюкозу (на второй стадии - глицерин), минеральные соли, витамины и микроэлементы, содержание астаксантина около 5000 мкг/г сухой биомассы [Патент США N 6015684, кл. С 12 Р 23/00, С 12 N 1/16, 2000].

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - расширение арсенала штаммов микроорганизмов - сверхпродуцентов астаксантина с высоким выходом биомассы и стабильных по содержанию его (астаксантина).

Сущность изобретения - новый специально селекционированный штамм Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D - продуцент астаксантина.

Штамм получен с помощью мутагенеза из выделенного нами природного изолята 23 (согласно 4-му изданию определителя дрожжей [Kurtzman C.P., Fell J.W. (eds.) 1998. The Yeasts. A Taxonomic Study. Elsevier Sci. B.V., Amsterdam] изолят 23 идентифицирован как Xanthophyllomyces dendrorhous Golubev) и отселекционированного на средах с ингибиторами каротиногенеза.

Мутагенез и селекция. Природный изолят 23 Xanthophyllomyces dendrorhous подвергают обработке УФ, метансульфонатом и нитрозогуанидином с последующим визуальным скринингом образовавшихся колоний на средах с дифениламином или бета-иононом. Ультрафиолет оказался мало эффективным по индукции более пигментированных колоний и в дальнейшем мутагенез проводился обработкой нитрозогуанидином и метансульфонатом. Возникшие более пигментированные колонии несколько раз пересевают на среды с ингибиторами каротиногенеза и отбирают наиболее пигментированные. Отобранные таким образом колонии выращивают в жидкой среде в колбах и оценивают выход биомассы, общее содержание каротиноидов и астаксантина [Sedmak J.J., Weerasinghe D.К., Jolly S.O., 1990. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. Biotechnol. Techniq. 4: 107-112]. Для последующей работы оставляют культуры с самым высоким содержанием пигментов. Стабильность полученных культур в отношении каротиногенеза проверяют путем их рассева и обследования гомогенности пигментации выросших колоний. На первом этапе обработки мутагенами с последующей селекцией получают штаммы с содержанием каротиноидов до 700 мкг/г. Наиболее продуктивные штаммы вновь подвергают выше описанным процедурам и после нескольких таких этапов был получен штамм 461-1b', способный накапливать в клетках до 4000 мкг каротиноидов /г сухой биомассы с содержанием астаксантина около 95%.

Штамм Xanthophyllomyces dendrorhous 461-1b' депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, 142290, г.Пущино, Московская обл., пр. Науки 5, под номером ВКМ Y-2912D.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические признаки.

В глюкозопептонной среде и температуре 20°С трехсуточная культура мутантного штамма Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D представлена одиночными или в цепочках почкующимися круглыми, овальными клетками, 4,2-7,7×5,1-10,2 мкм, с небольшой капсулой. Через месяц роста образуется осадок, широкое кольцо и тонкая всползающая пленка.

Месячная культура, выращенная при температуре 20°С на морфологическом агаре (Difoo, США) красная гладкая полуматовая пастообразная, край извилистый. Присутствуют хламидоспоры.

При росте на кукурузном агаре при температуре 20°С на десятые сутки формирует примитивный псевдомицелий, истинный мицелий не образует. Баллистоспоры, телиоспоры отсутствуют.

Базидиоспор не образует.

Физиолого-биохимические свойства.

Все физиолого-биохимические тесты проведены при температуре 18-20°С и значениях рН 6,0, которые являются оптимальными для роста мутанта. Максимальной для роста является температура 24°С. Мутант способен расти в диапазоне рН 4,0-8,0.

Сахара не сбраживает.

Ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, мелецитозу, растворимый крахмал, L-арабинозу, этанол, глицерин, маннит, салицин, молочную, янтарную, лимонную, фумаровую, уксусную, глюконовую, галактуроновую кислоты, 2- и 5-кетоглюконат, арбутин; слабо ассимилирует ксилозу, рибозу, рибит, сорбит, глюкуронат. Не ассимилирует галактозу, сорбозу, лактозу, мелибиозу, инулин, D-арабинозу, рамнозу, арабит, ксилит, эритрит, дульцит, альфа-метилглюкозид, инозит.

Утилизирует сульфат аммония, аминный азот; нитраты, нитриты не утилизирует.

В безвитаминной среде не растет, нуждается в биотине. Максимальная для роста на сусло-агаре температура - 24°С, максимальная концентрация NaCl в среде - 8%.

Не чувствителен к микоцинам Cystofilobasidium bisporidii и Cryptococcus laurentii.

Образует крахмалоподобные вещества. Обладает уреазной и ДНКазной активностями.

Штамм Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D отличается от исходного изолята 23 интенсивно красной пигментацией колоний, отсутствием способности образовывать базидиоспоры, сбраживать сахара, ассимилировать арабит и ксилит, устойчивостью к микоцинам Cystofilobasidium bisporidii и Cryptococcus laurentii. Каротиноидов, включая астаксантин, он образует в 20 раз больше, чем родительский изолят.

Методы хранения штамма: в лиофилизированном состоянии и в жидком азоте.

Данный вид дрожжей не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Штамм Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D преимущественно выращивают сначала в среде, обогащенной факторами роста, с низкой концентрацией быстро метаболизируемого источника углерода, а затем культивируют с полиолами при дефиците доступного азота.

При исследовании влияния на рост продуцента и его способность к накоплению астаксантина различных источников питания было установлено, что глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза, мальтоза, рафиноза, целлобиоза, растворимый крахмал, L-арабиноза обеспечивают быстрый рост культуры дрожжей с выходом биомассы от 6-8 г/л и содержанием каротиноидов от 400 до 1000 мкг/г сухой биомассы. Увеличение концентрации сахаров с 1 до 5% способствует повышению выхода биомассы, но при содержании их выше 3% снижается содержание каротиноидов. Обогащение среды факторами роста за счет дрожжевого экстракта (6 г/л) увеличивает как выход биомассы (до 10 г/л), так и содержание каротиноидов (1400 мкг/г). На последнем показателе резко отрицательно отражается введение в среду пептона. Более медленный рост наблюдается в средах с такими источниками углерода, как ксилоза, маннит и глицерин, однако, как выход биомассы, так и содержание каротиноидов при этом выше, чем на быстро метаболизируемых сахарах. Наиболее эффективен маннит, при выращивании на нем в колбах выход биомассы достигает 12-15 г/л, а содержание каротиноидов 3000-4000 мкг/г сухой биомассы.

Биомасса, полученная при культивировании данного штамма, может быть использована в качестве источника астаксантина в виде кормовой добавки в рыбоводстве и птицеводстве для обеспечения пигментации лососевых пород рыб и желтка. Астаксантин из биомассы может быть выделен известными биохимическими методами.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1.

Для засева используют 3-суточную культуру штамма Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y - 2912D, выращенного на сусло-агаре. Культивирование проводят в колбах на качалке (150 об/мин) при 20°С в течение 7 суток в среде состава, г/л: маннит - 30,0; дрожжевой экстракт - 6,0; КН₂PO₄ - 2,0. Выход биомассы дрожжей достигает 12 г (по сухой массе) на 1 л ферментационной среды, содержание каротиноидных пигментов достигает 4000 мкг/г сухой биомассы, содержание астаксантина - 3600 мкг/г сухой биомассы.

Пример 2.

Проводят процесс двустадийного культивирования Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y - 2912D в ферментере типа LKB 1601 Ultraferm при дневном освещении. Первую стадию культивирования осуществляют на среде состава, приведенного в примере 1, но вместо маннита используют глюкозу. Режим ферментации тот же, что в примере 1. Продолжительность первой стадии 70-80 часов. На второй стадии культивирования в ферментер постепенно подают в режиме fed-batch концентрированную среду, содержащую все компоненты исходной среды. Продолжительность второй фазы 80-100 часов. Выход биомассы к 180-190 часам составляет около 40 г/л и содержание каротиноидов 2200 мкг/г, из них астаксантина - 2090 мкг/г сухой биомассы.

Пример 3

Проводят процесс трехстадийного культивирования Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D в ферментере типа LKB 1001 Ultraferm. Первую стадию культивирования осуществляют, как в примере 2, но на первой стадии вместо глицерина используют сахарозу. Продолжительность первой стадии ферментации 60-90 часов. Вторую стадию продолжительностью 60-80 часов проводят в режиме fed-batch, добавляя постепенно в ферментер концентрированную среду того же состава, что и на первой стадии. Третью неростовую стадию продолжительностью 48-60 часов проводят также в режиме fed-batch, добавляя в ферментер глицерин. Выход биомассы к 170-220 часам составляет 50-60 г/л, содержание каротиноидов 1600-1800 мкг/г, астаксантина - 1710 мкг/г сухой биомассы.

Таким образом, предлагаемый штамм Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D обладает способностью продуцировать большие количества биомассы с высоким содержанием астаксантина.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению каротиноидных пигментов, и может быть использовано в микробиологической промышленности. Новый штамм Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D - продуцент астаксантина, получен с помощью мутагенеза воздействием нитрозогуанидином и метансульфонатом из природного изолята 23, идентифицированного как Xanthophyllomyces dendrorhous Golubev и отселекционированного на средах с ингибиторами каротиногенеза. Штамм обладает способностью продуцировать большие количества биомассы с высоким содержанием астаксантина. Для получения высокой продуктивности штамма могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях.

Штамм дрожжей Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y-2912D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) - продуцент астаксантина.