Способ лечения больных аллергическими заболеваниями аутологичными лимфоцитами Российский патент 2017 года по МПК A61M1/38 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам лечения аллергических заболеваний, и предназначено для использования врачами аллергологами-иммунологами в условиях аллергологического стационара или амбулаторно в аллергологическом кабинете поликлиники.

Аллергические заболевания занимают важное место среди болезней, характеризующих картину современной патологии. В большинстве стран мира отмечается неуклонный рост числа аллергических заболеваний. Аллергия в наши дни становится, по существу, национальным бедствием для многих стран мира. Высокий уровень заболеваемости аллергией - обратная сторона прогресса, своего рода «плата за цивилизацию». Загрязнение биосферы токсичными, раздражающими и сенсибилизирующими веществами, стресс, выраженная химизация условий труда и быта, злоупотребление фармакологическими средствами способствуют постоянному напряжению гомеостатических механизмов с вовлечением резервных возможностей организма, создают почву для срыва адаптации, развития различных заболеваний, в том числе и аллергических [В.В. Новицкий, Е.Д. Гольдберг. Учебник по патофизиологии для студентов медицинских вузов. 2009 г.]. Как пример - аллергическое воспаление способствует внедрению респираторных вирусов, которые, в свою очередь, влияют на развитие и нарастание тяжести клинических симптомов аллергии [Л.В. Лусс. Роль иммуномодуляторов в комплексной терапии респираторных заболеваний. Материалы II Научно-практической конференции «Актуальные вопросы респираторной медицины», М., 2010, с. 42-43].

В рамках существующих стандартов лечения аллергических заболеваний, в зависимости от типа иммунного повреждения, практикуют элиминацию аллергена, назначение лекарственных препаратов, направленных на устранение клинических проявлений измененной реактивности человека, а также антигенспецифическую иммунотерапию (АСИТ). АСИТ считается приоритетным в лечении аллергии, основанной на иммунных процессах. К недостаткам АСИТ относится непредсказуемость реакции пациента на вводимый антиген, невозможность применения метода при поливалентной аллергии, в остром периоде заболевания и многие другие противопоказания.

Способ лечения больных аллергическими заболеваниями методом внутрикожного введения собственных лимфоцитов, по сути, модифицированный метод аутогемотерапии.

На волне стремительного развития прикладной иммунологии в последние 20 лет создана и оценена эффективность иммунотерапии препаратами аутокрови как персонифицированного иммунокорректора. С момента, когда стало возможным безопасное выделение лимфоцитов, для последующего введения пациенту иммунокомпетентной популяции клеток крови, началась новая жизнь аутогемотерапии. Побочные эффекты устранены, а эффективность лечения повысилась [Пасова И.А. и соавт. Российский биотерапевтический журнал. Материалы XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 2015 г., Т.14, №1. с. 119].

Известен способ «Аутологичные клетки моноцитарного происхождения, индуцирующие аутотолерантность, и их применение в фармацевтических препаратах» по патенту RU 2346041. Способ предназначен для профилактики и/или лечения аллергии и аутоиммунных заболеваний. Способ включает выделение из крови пациента моноцитов таким образом, что вместе с моноцитами присутствуют лимфоциты в количестве, равном по крайней мере 10% от общего числа клеток в изоляте, культивирование сначала в культуральной среде, содержащей фактор роста клеток M-CSF, затем через 3-6 дней в среде, содержащей γ-IFN в течение 24-72 ч, затем клетки суспендируют в PBS или растворе NaCl. Клетки суспендируют в среде для замораживания и затем подвергают глубокому замораживанию.

Недостатки способа заключаются в сложной процедуре культивирования с добавлением ростовых факторов и цитокинов, требующей времени и специального оборудования, а также компонентов для подготовки сред и дополнительных затрат на расходные материалы.

Известен «Способ лечения хронических рецидивирующих воспалительных заболеваний слизистой носа и околоносовых пазух методом эндоназальной аутолимфоцитотерапии» по патенту RU 2403071. Способ включает предварительное получение аутологичных лимфоцитов из венозной крови больного, культивирование полученных лимфоцитов совместно с иммуномодулятором, предпочтительно иммунофаном. Затем 0,1 до 3,0 мл взвеси лимфоцитов, содержащей 10⁶-10⁷ клеток/мл, вводят в придаточные пазухи носа с интервалом между введениями от 2 до 7 дней. Способ применяют для лечения хронических рецидивирующих воспалительных заболеваний слизистой носа и околоносовых пазух, в т.ч. при рецидивирующем полипозном риносинусите.

Недостатками способа является проведение забора крови непосредственно перед каждой процедурой введения на протяжении всего курса, этап культивирования клеток в течение 1-6 ч, требующий дополнительных расходных материалов и иммуномодуляторов, а также необходимость в специальном кабинете и расходных материалах для проведения инвазивной процедуры введения взвеси лимфоцитов в придаточные пазухи носа.

Известен «Способ лечения хронических рецидивирующих аллергических заболеваний слизистой носа и околоносовых пазух методом эндоназальной аутолимфоцитотерапии» по патенту RU 2411048. Способ включает предварительное получение аутологичных лимфоцитов из венозной крови больного, культивирование полученных лимфоцитов совместно с фармпрепаратом, а именно с преднизолоном, и последующее поочередное введение в правую и левую часть носа в дозах от 0,1 до 3,0 мл взвеси лимфоцитов в приемлемой среде при их концентрации 10⁶-10⁷ кл/мл, с интервалом между введениями от 2 до 6 дней.

Недостатками способа является проведение дополнительного забора крови непосредственно перед каждой процедурой введения на протяжении всего курса, культивирование клеток в течение 1-6 ч, требующее дополнительных расходных материалов и фармпрепаратов, а также необходимость в специальном катетере для введения взвеси лимфоцитов в верхнечелюстные пазухи.

Известен «Способ лечения атопического дерматита» по патенту RU 2340348. Способ включает в себя выделение из крови пациента МНК (мононуклеарных клеток), их культивирование в течение 10-14 дней с добавлением в культуральную среду 1 мкл/мл антиСD3антител (НПЦ МедБиоСпектр), 50 ед./мл интерлейкина-2 (ООО Биотех) и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS - Fetal bovine serum), подкожное введение полученных активированных лимфоцитов 1 раз в неделю в течение 4 недель и далее 1 раз в месяц в течение одного года. При этом клетки хранят в морозильной камере в криопробирках при -80°С, предварительно добавив к ним FBS и диметилсульфоксид (DMSO). Перед введением клетки отмывают с помощью физиологического раствора, осаждают с помощью метода центрифугирования, ресуспендируют в 2 мл физиологического раствора и в таком виде вводят пациентам. В качестве базисной терапии использовались антигистаминные препараты и топические глюкокортикостероиды.

Недостатками способа являются необходимость забора большого количества крови; сложная методика выделения клеток; дополнительная процедура культивирования клеток, требующая добавления антител, активаторов и белков животного происхождения в культуральную среду; использование дополнительных расходных материалов и криопротекторов и необходимость в специальном дорогостоящем оборудовании для культивирования и хранения клеток, а также длительность лечения в течение года.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ лечения аллергических заболеваний методом аутолимфоцитотерапии» по патенту RU 2395305. Способ включает предварительное получение аутологичных лимфоцитов из венозной крови больного и последующее их подкожное введение, характеризующийся тем, что осуществляют введение взвеси аутологичных лимфоцитов в физиологическом растворе в дозах от 0,1 до 1,0 мл взвеси при концентрации аутологичных лимфоцитов 10⁵-10⁷ кл./мл. Введение проводят от 4 до 10 раз с интервалом между ними от 2 до 6 дней. Предпочтительно введение подкожно взвеси аутологичных лимфоцитов в физиологическом растворе осуществляется в латеральную поверхность плеча.

Главным недостатком данного способа является регулярный дополнительный забор крови непосредственно перед каждой процедурой введения аутологичных лимфоцитов и многократное повторное выделение лимфоцитов.

Технический результат.

В предлагаемом техническом решении предусматривается упрощение способа лечения, сокращение сроков лечения, уменьшение дозы вводимого препарата, снижение частоты проявления симптомов заболевания и увеличение продолжительности безрецидивного периода у пациентов.

Показания к использованию предлагаемого способа:

- хроническая рецидивирующая крапивница,

- хронический рецидивирующий отек Квинке,

- атопический дерматит,

- аллергический ринит,

- аллергическая бронхиальная астма,

- поллиноз.

Сущность предлагаемого технического решения, включающего взятие венозной крови у больного и выделение лимфоцитов.

Выделенные аутологичные лимфоциты ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и распределяют в ампулы по 1-2 млн клеток в физиологическом растворе в дозах от 0,4 до 0,5 мл. Одну ампулу оставляют для введения больному в тот же день, а остальные хранят в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении. Полученные аутологичные лимфоциты вводят внутрикожно паравертебрально в 1-2 точки больному 2 раза в неделю, в течение 4-5 недель.

Перечень фигур.

Фиг. 1 - Введение аутологичных лимфоцитов внутрикожно паравертебрально.

Фиг. 2 - Пациентка Ф., 2000 г.р. Кожа локтевых сгибов до курса внутрикожного введения лимфоцитов.

Фиг. 3 - Пациентка Ф., 2000 г.р. Кожа локтевых сгибов после курса внутрикожного введения лимфоцитов.

Фиг. 4 - Пациентка Ф., 1972 г.р. Кожа кистей рук до курса внутрикожного введения лимфоцитов: А - трещины, Б - сухость, В - лихенизация.

Фиг. 5 - Пациентка Ф., 1972 г.р. Кожа кистей рук до курса внутрикожного введения лимфоцитов: А - трещины, Б - сухость, В - лихенизация.

Фиг. 6 - Пациентка Ф., 1972 г.р. Кожа кистей рук после курса внутрикожного введения лимфоцитов: Г - увлажненная, гладкая кожа без трещин сухости и лихенизации.

Фиг. 7 - Пациент К., 1984 г.р. Во время паравертебрального внутрикожного введения лимфоцитов.

Фиг. 8 - Пациент К., 1984 г.р. Через 1-2 минуты после паравертебрального внутрикожного введения лимфоцитов.

Порядок реализации способа.

1. У больного с помощью вакуумной системы и пробирок, содержащих гепарин, берут венозную кровь в объеме 15-20 мл и разбавляют ее в 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (Gibco by life technologies, Великобритания). Далее наслаивают на градиент Hystopague-1077 (Sigma, Великобритания) плотностью 1,077 г/см³ и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин, что приводит к оседанию эритроцитов и гранулоцитов на дно пробирки. В результате центрифугирования лимфоциты образуют интерфазное кольцо, которое собирают пипеткой и двукратно отмывают центрифугированием в 10-кратном объеме ФСБ при 1500 об/мин.

2. Выделенные аутологичные лимфоциты подсчитывают, ресуспендируют в ФСБ и распределяют в пробирки по 1-2 млн клеток в физиологическом растворе в объеме от 0,4 до 0,5 мл. Выделение лимфоцитов из венозной крови больного, подсчет их концентрации, проверку на чистоту и жизнеспособность клеток проводит лаборант-исследователь под контролем врача аллерголога-иммунолога.

3. В тот же день больному вводят внутрикожно паравертебрально в 1-2 точки первую порцию клеток в количестве 1-2 млн, а остальные пробирки с клетками хранят в морозильной камере при температуре -30°С для последующего использования во время амбулаторного лечения.

4. Аутологичные лимфоциты из морозильной камеры перед введением больному необходимо предварительно согреть до температуры тела.

5. Полученные аутологичные лимфоциты вводят больному внутрикожно паравертебрально [фиг. 1] в 1-2 точки 2 раза в неделю, в течение 4-5 недель.

Примеры реализации способа.

Пример 1. Пациентка К., 1948 г.р. Диагноз - хроническая рецидивирующая крапивница, отек Квинке, экзема кистей рук. Из анамнеза - с детства диффузный нейродермит, экзема кистей рук средней степени тяжести, заболевание носило круглогодичный характер, обострения провоцировались психоэмоциональным стрессом и контактом с моющими средствами. Аллергодиагностика не проводилась, лечилась топическими стероидами по требованию. Впервые приступ крапивницы и ангионевротического отека лица языка и губ в 63 года на фоне почечной колики. До начала лечения аутологичными лимфоцитами на протяжении 8 месяцев наблюдались еженедельные приступы, получала традиционную экстренную помощь гормональными и антигистаминными препаратами, 10 курсов плазмафереза положительного эффекта не дали. Больной в комплексе с антигистаминным препаратом Парлазин (цетиризин) 10 мг утром, атаракс 25 мг на ночь, курсом 30 дней, проводилась иммунотерапия аутологичными лимфоцитами по схеме. Практически с первых инъекций снизилась выраженность и частота приступов. Введение лимфоцитов всегда сопровождалось гиперемией и зудом в месте введения, на месте введения оставались петехии, по площади соответствовавшие гиперемии, гриппоподобный синдром развивался через 24 часа, длился не более 3 часов. На фоне второго курса отмечалось обострение заболевания в виде выраженных высыпаний. Отек Квинке наблюдался в менее выраженной форме и реже сопровождал приступы крапивницы. Клиническая стабилизация наступила на третьем курсе. На четвертом курсе иммунотерапии аутологичными лимфоцитами уровень общего иммуноглобулина (IgE) снизился до 1200 МЕ/мл по сравнению с исходным уровнем 1800 МЕ/мл. Нормальный уровень общего иммуноглобулина составляет IgE<100 МЕ/мл.

На фоне четвертого курса необходимость в приеме этиотропной терапии становилась менее востребованной. После пятого курса иммунотерапии наступила клинико-лабораторная ремиссия, которая продолжается 2 года. В настоящее время уровень IgE составляет 87 МЕ/мл. Наблюдение продолжается.

Пример 2. Пациентка С., 1977 г.р. Диагноз - бронхиальная астма, смешанная среднетяжелая форма. Сезонный аллергический ринит. Из анамнеза - страдает сезонными обострениями весной и осенью с 15-летнего возраста, на момент обращения получала стандартную терапию топическими стероидами, короткодействующими β2-агонистами и антигистаминными препаратами по требованию и в сезон цветения. Первый курс проводился на фоне стандартной терапии. На фоне курса иммунотерапии собственными лимфоцитами пациентка отмечала значительное улучшение носового дыхания, улучшились показатели функции внешнего дыхания, уровень IgE - 135 МЕ/мл не изменился. Пациентка получила 3 курса иммунотерапии на протяжении 1.5 лет (весна-осень) и на втором году лечения перестала пользоваться топическими стероидами, лето и осень 2015 года прошли без привычного ухудшения, зимний период впервые за много лет прошел без заболеваний респираторными инфекциями. Продолжает наблюдаться.

Пример 3. Пациентка X., 1966 г.р. С. Диагноз - бронхиальная астма, смешанная форма, среднетяжелая. Хронический диффузный нейродермит, экзема. Из анамнеза - с детства диффузный нейродермит. Экзема локтевых сгибов средней степени тяжести, заболевание носило круглогодичный характер. Аллергодиагностика не проводилась, лечилась топическими стероидами по требованию. В 2012 году переехала из Средней Азии в Калужскую область и начала работать в цехе на птицефабрике. Впервые появились приступы удушья, заложенность носа, IgE - 1350 МЕ/мл, снижение функции внешнего дыхания, получала стандартную терапию топическими стероидами, короткодействующими β2-агонистами и антигистаминными препаратами с эффектом, но обострились кожные проявления - зуд, мокнутие на локтевых сгибах. Получила 2 курса иммунотерапии собственными лимфоцитами, на фоне которых стихли проявления экземы, снизились IgE до 800 МЕ/мл, сократилась частота и интенсивность приступов бронхиальной астмы. Со слов больной, никогда ранее кожа рук не была в таком отличном состоянии. Пациентка получила рекомендации вернуться в привычную климатическую зону и уехала на родину.

Пример 4. Пациентка Т., 1974 г.р. Бронхиальная астма, смешанная форма, легкое течение. Аллергический ринит. Поллиноз. Из анамнеза - около 3-х лет после перенесенного острого бронхита начались приступы удушья, в весенний период учащались. Пациентка является курильщиком с большим стажем. Уровень IgE - 110 МЕ/мл. Снижение функции внешнего дыхания. Получала стандартную терапию топическими стероидами, короткодействующими β2-агонистами и антигистаминными препаратами. Накануне начала первого курса перенесла острый бронхит. Был проведен один курс иммунотерапии собственными лимфоцитами весной, в результате улучшились показатели функции внешнего дыхания, увеличились периоды безрецидивного течения и тяжесть приступов удушья, снизилась доза и кратность применения топических стероидов, период реабилитации после острого бронхита значительно сократился. Продолжает наблюдаться.

Пример 5. Пациентка Φ., 2000 г.р. Диагноз - атопический дерматит, распространенная форма, средней степени тяжести. Страдает атопией с детства, получала этиотропную терапию, с переменным успехом. Площадь поражения кожных покровов занимает локтевые сгибы, периорбитальную область, кожу туловища. Кожа с множеством расчесов, полиморфной сыпи, первичной лихенизацией локтевых сгибов, ярко выраженный красный дермографизм [фиг. 2], жалобы на плохой сон и неустойчивость психики, IgE - 2000 МЕ/мл. На фоне лечения после первого курса обострение, затем стихание кожных проявлений, зуда, снижение Ig Ε до 500 МЕ/мл [фиг. 3].

Пример 6. Пациентка Ф., 1972 г.р. Диагноз - атопический дерматит, экзема кистей, средней степени тяжести. IgE - 65 МЕ/мл. Страдает атопией с детства, получала этиотропную терапию, с переменным успехом. Кожа кистей сухая, трещины, лихенизация запястья [фиг. 4, 5], на фоне первого курса значительное улучшение [фиг. 6]. В настоящее время пациентка продолжает лечение.

Пример 8. Пациент К., 1984 г.р. Диагноз - себорейный дерматит. Из анамнеза - страдает повышенной сальностью кожи лица, спины и волосистой части головы с подросткового периода, IgE - 18 МЕ/мл. Лечился косметическими средствами и топическими стероидами, практически без эффекта. Получил один курс иммунотерапии собственными лимфоцитами. Во время первого введения кожные проявления значительно уменьшались [фиг. 7, 8]. После проведения первого курса наблюдаются значительные уменьшения проявлений себорейного дерматита. В настоящее время пациент продолжает лечение.

Пример 9. Пациент А., 2003 г.р. Диагноз - бронхиальная астма, смешанная форма легкое течение. Аллергический ринит, поллиноз. IgE - 3200 МЕ/мл снижение функции внешнего дыхания, получал стандартную терапию топическими стероидами, короткодействующими β2-агонистами и антигистаминными препаратами. Получил три курса иммунотерапии аутологичными лимфоцитами и в результате снизилась концентрация IgE до 1800 МЕ/мл, улучшились показатели функции внешнего дыхания, увеличились периоды безрецидивного течения и тяжесть приступов удушья, снизилась доза и кратность применения топических стероидов. Продолжает иммунотерапию.

Подтверждение достижения технического результата.

Предлагаемое изобретение позволяет с помощью собственных лимфоцитов проводить аутолимфоцитотерапию пациентам с аллергическими заболеваниями в качестве основного и сопроводительного лечения.

Предложенный способ лечения больных методом аутолимфоцитотерапии является безопасным и эффективным. Способ отличается упрощенным методом проведения процедуры получения лимфоцитов, введения и возможностью длительного хранения аутологичных лимфоцитов.

Изобретение используют для лечения больных с хронической рецидивирующей крапивницей, хроническим рецидивирующим отеком Квинке, атопическим дерматитом, аллергическим ринитом, бронхиальной астмой, поллинозом. Предлагаемый способ лечения больных методом аутолимфоцитотерапии проводят в течение 4-5 недель без дополнительного забора крови.

Способ позволяет индуцировать высокий иммунный ответ, характеризующийся снижением проявления симптомов заболевания уже после первой недели и увеличением продолжительности безрецидивного периода у пациентов, не ответивших на стандартную этиотропную терапию. Способ можно применять как в период ремиссии, так и обострения, как базовую терапию, что важно при лечении поллинозов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и аллергологии. Вводят аутологичные лимфоциты. При этом проводят однократное взятие венозной крови у больного с выделением из крови лимфоцитов, которые вначале ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере, а затем помещают в физиологический раствор, равномерно перемешивают и хранят в морозильной камере в пробирках в концентрации 1-2 млн клеток в объеме от 0,4 до 0,5 мл. Одну дозу полученных лимфоцитов вводят больному, а остальные порции замораживают и вводят в дальнейшем, предварительно согрев до температуры тела пациента, внутрикожно паравертебрально в 1-2 точки 2 раза в неделю, в течение 4-5 недель. Способ позволяет снизить частоту проявления симптомов заболевания и увеличить продолжительность безрецидивного периода, у способа отсутствуют побочные явления, он является полностью безопасным для больных. 9 пр., 8 ил.

Способ лечения больных аллергическими заболеваниями, включающий введение аутологичных лимфоцитов, отличающийся тем, что проводят однократное взятие венозной крови у больного с выделением из крови лимфоцитов, которые вначале ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере, а затем помещают в физиологический раствор, равномерно перемешивают и хранят в морозильной камере в пробирках в концентрации 1-2 млн клеток в объеме от 0,4 до 0,5 мл, при этом одну дозу полученных лимфоцитов вводят больному, а остальные порции замораживают и вводят в дальнейшем, предварительно согрев до температуры тела пациента, внутрикожно паравертебрально в 1-2 точки 2 раза в неделю, в течение 4-5 недель.