СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ С ПОМОЩЬЮ АКТИВИРОВАННЫХ IN VITRO АУТОЛОГИЧНЫХ ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2023 года по МПК A61M5/00 A61K38/20 A61P31/22 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для лечения герпес-вирусной инфекции с помощью активированных in vitro аутологичных лимфоцитов.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) герпес-вирусная инфекция занимает второе место среди вирусных заболеваний человека, уступая лишь гриппу. Благодаря способности вируса простого герпеса к длительному персистированию, приводящему к снижению противовирусной иммунной защиты, лечение больных простым герпесом является сложной задачей. Прогресс в области лечения герпес-вирусной инфекции был достигнут в 80-е годы, и связан с разработкой первого препарата из группы ациклических нуклеозидов - Ацикловира. Согласно международным стандартам лечения герпес-вирусных инфекций наиболее часто назначаемыми противогерпетическими препаратами являются Ацикловир, Валтрекс, Фамвир. Выделяют два основных способа применения противовирусных химиопрепаратов: эпизодическое назначение (по мере необходимости при обострениях герпес-вирусной инфекции коротким курсом в течение 5-10 дней) и пролонгированная терапия (ежедневно в течение нескольких месяцев для купирования данного рецидива). Целью терапии в этом случае является уменьшение выраженности симптомов рецидива и сокращение периода вирусовыделения [Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. Подходы к иммунотерапии рецидивирующего простого герпеса // Эффективная фармакология, №3, 2010].

Генитальная форма герпеса характеризуется появлением эрозивно-язвенных дефектов в области гениталий, как у мужчин, так и женщин. Симптомы развиваются при внедрении вируса через слизистые половых органов. По статистике средняя распространенность генитального герпеса составляет 20 случаев на 10 тысяч населения. У 70% носителей инфекция протекает в латентной форме (без клинических проявлений). Симптомы заболевания возникают только во время рецидивов. Источниками инфекции являются лица с острой формой заболевания, т. е. активное выделение вируса происходит в фазу формирования герпетической сыпи, соответственно в это время максимален риск заражения половых партнеров, даже в случае использования барьерных методов контрацепции. При удовлетворительном состоянии здоровья иммунная система подавляет патоген и не дает развиваться инфекции. Однако вирус не устраняется из организма, а скрывается в нервных ганглиях. Причиной возникновения рецидивов генитального герпеса является снижение иммунитета, например, на фоне гормональных сбоев, стресса, приема медикаментов, или физических нагрузок, поэтому в случае ослабления организма возбудитель активизируется и снова поражает слизистые [Асхаков М.С., Чеботарёв В.В. Современный взгляд на течение, диагностику и лечение герпесвирусной инфекции // Вестник молодого ученого, № 1, 2018, С. 25-31].

Обычно лечение герпес-вирусных инфекций включает противовирусные средства, анальгетики, жаропонижающие, местные препараты с противовирусными компонентами и анестетиками. Однако прием противовирусных препаратов не обеспечивает полной элиминации вируса из организма и часто после отмены препаратов возникают рецидивы заболевания с прежней частотой. Пациент вынужден непрерывно принимать дорогостоящие препараты, имеющие побочные эффекты, что в значительной степени снижает качество жизни. Большие надежды возлагаются на иммунотерапию, включающую иммуномодуляторы и вакцины, т.к. их главной мишенью служат вторичные иммунодефициты, проявляющиеся частыми рецидивирующими и трудно поддающимися лечению герпес-вирусными инфекциями разной локализации [Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. Подходы к иммунотерапии рецидивирующего простого герпеса // Эффективная фармакология, №3, 2010].

Известно множество Российских и зарубежных запатентованных разработок вакцин и компонентов против вируса простого герпеса (кодирующих белков, антигенов) (RU №2575067, WO2021217206, US2021299248, WO2014164699, US5858376, EP2865386).

Недостатками данных разработок является сложность получения таких компонентов и вакцин, требующих специальное оборудование и персонал. Для большинства разработок не изучалась оценка переносимости и эффективности на людях.

В России известна вакцина «Витагерпавак», содержащая инактивированные антигены вируса герпеса (RU 2731073). Группа изобретений относится к области биотехнологии и иммунологии. Рекомбинантный слитый белок из иммуногенных эпитопов вирусов герпеса человека 1-8 типов для иммунизации против герпеса характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. ДНК, кодирующая белок, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2. Плазмидная ДНК для иммунизации против герпеса представляет собой плазмидный экспрессионный вектор pcDNA3.1, содержащий указанную ДНК. Авторы заявляют, что данная вакцина является единственной в мире вакциной для лечения и профилактики рецидивов простого герпеса 1 и 2 типов, произведенная по современным международным стандартам, которая показала безопасность и высокую эффективность. Лечебный эффект заключается в стимуляции клеточного иммунитета, направленного на подавление вируса герпеса, снижает степень иммунных расстройств с 3-ей и 2-ой до 1-ой степени.

Недостатками данного изобретения является сложность получения препарата, необходимо специальное лабораторное оборудование и специально обученный персонал. Данное изобретение не гарантирует 100% эффективности против возникновения рецидива заболевания.

Известно множество Российских и зарубежных запатентованных разработок антител (RU №2703903, RU №2500422, CN108064239, AU2012202218).

Недостатками данных разработок является сложность получения, необходимость использования специального дорогостоящего оборудования и расходных материалов, для большинства разработок не изучалась оценка переносимости и эффективности на людях.

Известен способ (RU №2577299) лечения и профилактики вирусных инфекционных заболеваний (вирусные гепатиты, гепатит С, герпес-вирусная инфекция, заболевания, вызванные вирусом гриппа, острая респираторная вирусная инфекция и бактериальное инфекционное заболевание), характеризующийся тем, что в организм вводят одновременно и сочетано комплексное лекарственное средство, выполненное в виде фармацевтической композиции, содержащей активированную-потенцированную форму аффинно-очищенных антител к одному или нескольким цитокинам, выбранным из интерферона гамма, интерферона альфа, фактора некроза опухоли альфа, и активированную-потенцированную форму антител к одному или нескольким рецепторам, выбранным из CD4, CD8. Авторы изобретения отмечают хорошую переносимость препарата и отсутствие нежелательных явлений.

Однако существует сложность применения препарата, заключенная в трудоемкости получения аффинно-очищенных антител и необходимость использования специального дорогостоящего оборудования, а так же недостатком является использование антител животного происхождения (кроликов).

Известно множество Российских запатентованных разработок лекарственных препаратов, в том числе Ацикловир (RU №2179851), препарат молочной кислоты (RU №2459620), вагинальные суппозитории (RU №2729647), способ получения ИФН-α (RU №2108804), лекарственный препарат на основе инактивированного вируса простого герпеса серотипов 1 или 2 (RU №2264819) , а так же зарубежных разработок лекарственных препаратов (CA2679067, WO2008118765, WO2008118763, WO2008118762, US5182104, UA80502).

Известно множество Российских запатентованных схем лечения герпес-вирусных инфекций лекарственными препаратами (RU 2180569, RU 2492861).

Недостатками способов является необходимость приема данных противовирусных препаратов на постоянной основе, ведь, как известно после отмены препаратов возникают рецидивы заболевания с прежней частотой. Постоянная необходимость приема препаратов - это прямое ухудшение качества жизни пациентов.

Известно изобретение (RU 2147889) для лечения уретрогенитальных инфекций и герпеса, состоящее из перекиси водорода в дозировке 0,15 - 0,18% по 120 - 300 мл и отвара корней солодки 0,5 - 1,0 мл на 100 мл перекиси. Внутривенное вливание препарата проводят курсами по 10 - 15 вливаний со скоростью 50 - 60 капель в минуту, через 1 - 3 дня, при этом в качестве препарата используют смесь перекись водорода в дозировке 0,15 - 0,18% по 120 - 300 мл и отвара корней солодки 0,5 - 1,0 мл на 100 мл перекиси.

Недостатком разработки является внутривенный способ введения препарата и отсутствие информации о переносимости данного изобретения пациентами.

Известен способ лечения рецидивирующего урогенитального герпеса с симптомами синдрома хронической усталости (RU 2492861), в котором терапия проводится путем введения противовирусного препарата в сочетании с индуктором интерферона, отличающийся тем, что в качестве противовирусного препарата используют пероральную форму Ацикловира, а в качестве индуктора интерферона - инъекционную или липосомальную пероральную форму высокополимерной РНК, причем, внутримышечно высокополимерную РНК вводят по 8 мг через 72 часа в течение 10 дней и перорально Ацикловир по 200 мг пять раз в сутки в течение 10 дней или перорально липосомальную высокополимерную РНК (Акавия) вводят ежедневно по 6,5 мг два раза в сутки в течение 5 дней с последующей поддерживающей терапией по 6,5 мг через день в течение 20 дней и перорально вводят Ацикловир по 200 мг пять раз в сутки в течение 10 дней.

Однако метод трудоемок в получении липосомальной высокополимерной РНК (Акавия), необходимо специальное дорогостоящее оборудование и расходные материалы. Главным недостатком данного способа является необходимость применения в схемах лечения препарата ацикловир, имеющих ряд противопоказаний и побочных эффектов, таких как аллергические проявления: зуд, сыпь, крапивница, многоформная экссудативная эритема, синдром Стивенса-Джонсона или Лайелла, ангионевротический отек, анафилаксия.

Известны разработки в области иммунологии на основе дендритных клеток (RU 2309753). Изобретение относится к области биофармакологии и медицины. В нем предложен способ получения мононуклеарных клеток крови: активированных лимфоцитов (ЛАК) и ДК, предусматривающий: а) выделение мононуклеарных лейкоцитов (МНК) из крови или костного мозга человека, нуждающегося в лечении или профилактике злокачественного новообразования, или инфекционного заболевания, или иммунодефицитного состояния; б) инкубацию выделенных мононуклеарных лимфоцитов в культуральной среде; в) разделения прилипающих и не прилипающих к пластику культурального флакона МНК; д) обработку ростовыми факторами прилипающих МНК для получения из них дендритных клеток; е) обработку ДК лизатом опухоли больного; ж) культивирование не прилипших к пластику лимфоцитов с интерлейкином-2 для генерации ЛАК-клеток. Предложен способ лечения и профилактики злокачественных и инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний у больных, нуждающихся в этом, заключающийся в комбинированном использовании дендритных клеток и ЛАК-клеток.

Однако способ имеет главный недостаток. Из описания изобретения не ясно, позволяет ли данный подход индуцировать специфический иммунный ответ против вирусных антигенов (HCV) и какова выраженность и продолжительность иммунного ответа, как это сказывается на клиническом течении хронической вирусной инфекции. Таким образом, не известно, будет ли эффективен данный способ при лечении герпес-вирусной инфекции, которая отличается от других хронических вирусных инфекций. Также способ является технологически сложным и дорогостоящим.

Известен способ иммунотерапии хронической вирусной инфекции (RU 2485962), включающий введение больному аутологичных дендритных клеток, генерированных из моноцитов периферической крови и нагруженных вирусным антигеном в культуре in vitro, отличающийся тем, что дендритные клетки культивируют в присутствии интерферона-альфа, а в качестве антигена применяют рекомбинантный антиген вируса герпеса и используют полученные дендритные клетки 2 курсами посредством подкожных вакцинаций в сочетании с препаратом рекомбинантного интерлейкина-2 человека в качестве адъюванта для лечения часто рецидивирующей герпес-вирусной инфекции.

Недостатком способа является необходимость госпитализации больного и только в период ремиссии (как минимум через 2 недели после последнего рецидива). Способ усложнен на наш взгляд необходимостью генерации из моноцитов дендритных клеток (ДК), выделенных из фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных, необходимо большое количество крови (200 мл), использование дорогостоящих ростовых факторов и сред для активации ДК, а также присутствие антибиотиков в культуральной среде.

Известен способ вакцинотерапии герпетической инфекции (RU 2514034), заключающийся в том, что используют стандартную антигерпетическую вакцину, представляющую собой взвесь вирусов простого герпеса I и II типов, убитых формалином, отличающуюся тем, что дендритные клетки (ДК), полученные из крови пациента in vitro, «нагружают» вирусными антигенами, источником которых является данная вакцина; полученную вакцину вводят внутрикожно в 4-6 точек по ходу лимфатических коллекторов, курс вакцинотерапии состоит из 3-4 инъекций, интервалы между введениями вакцины составляют от 2 до 4 недель, первоначальная доза вакцины составляет 1×106-2×106 ДК, при втором введении дозу увеличивают в 2 раза, при третьем введении дозу увеличивают в 4 раза по сравнению с первым введением.

Недостатком способа является необходимость генерации из моноцитов дендритных клеток (ДК), выделенных из фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных. Использование источника вирусных антигенов - антигерпетическая вакцина, представляющая собой взвесь убитых формалином вирусов простого герпеса I и II типов. Следует отметить, что изобретение лишь снижает частоту возникновения рецидивов, а не избавляет от них на длительный срок.

Самым близким (прототипом) является способ лечения онкологических больных цитотоксическими лимфоцитами (RU 2596505 С1). Проводят взятие венозной крови у онкологического больного или донора, выделяют лимфоциты, активируют их в питательной среде, содержащей рекомбинантные человеческие интерлейкин-2, интерлейкин-15, альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин, на протяжении 9 дней в условиях CO2-инкубатора, затем активированные цитотоксические лимфоциты в количестве от 2 до 10 млн ресуспендируют в клеточном продукте и вводят внутрикожно паравертебрально в 2-4 точки онкологическому больному на 3, 5, 7 и 9 день активирования. В эти же дни клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении. Изобретение предназначено для лечения больных со злокачественными опухолями, такими как рак желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и меланомы, в том числе с распространенными и неоперабельными формами 3-4 стадии заболевания, а также для профилактики метастазирования после хирургического лечения.

Недостатком данного изобретения является то, что оно не изучено с точки зрения лечения герпес-вирусных инфекций. Ведь основную роль в противоопухолевом и противовирусном иммунитете играют Т-лимфоциты, активирующие цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги и NK-клетки. Иммунный надзор за нормальным составом тканей реализуется за счет неспецифических факторов, повреждающих опухолевые клетки: 1) NK-клетки, система мононуклеарных клеток, противоопухолевая активность которых усиливается под воздействием интерлейкина-2 (ИЛ-2) и альфа- и гамма- интерферонов; 2) ЛАК-клетки (мононуклеарные клетки и NK-клетки, активированные ИЛ-2); 3) цитокины (альфа- и гамма- интерфероны, ФНО- альфа и ИЛ-2). Клетки-мишени, инфицированные вирусом, уничтожаются цитотоксическими лимфоцитами, NK-клетками и фагоцитами. Интерфероны усиливают противовирусную резистентность, индуцируя в клетках синтез ферментов, подавляющих образование нуклеиновых кислот и белков вирусов. Кроме этого, интерфероны оказывают иммуномодулирующее действие, усиливают в клетках экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС). Поэтому существует основание для доработки способа получения активированных in vitro лимфоцитов и более детального изучения вопроса применения данных клеток для лечения пациентов с герпес-вирусной инфекцией.

Техническим результатом является лечение герпес-вирусной инфекции, в том числе генитального герпеса, как у первичных пациентов, так и часто рецидивирующих с помощью активированных in vitro аутологичных лимфоцитов, позволяющих индуцировать высокий иммунный ответ.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также как в известном способе проводят взятие венозной крови у пациента, выделяют лимфоциты, активируют их в питательной среде, содержащей рекомбинантные человеческие интерлейкин-2, интерлейкин-15, пируват натрия, L-глутамин, на протяжении нескольких дней в условиях CO2-инкубатора, затем активированные цитотоксические лимфоциты ресуспендируют в клеточном продукте и вводят внутрикожно паравертебрально, а клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении.

Особенность заявляемого способа заключается в том, в питательную среду добавляют инактивированную аутологичную сыворотку, причем перед добавлением в питательную среду её инактивируют при 60°С в течение 60 мин, лимфоциты культивируют на протяжении 14 дней в условиях CO2-инкубатора, на 3, 5, 7, 10 день культивирования собирают часть клеток, половину объема питательной среды меняют, на 14 день клетки собирают полностью, живые клетки в количестве от 5 до 20 млн ресуспендируют в супернатанте объемом от 1,0 до 2,0 мл и вводят пациенту внутрикожно паравертебрально в 2 точки, как на фигуре 1, оставшийся клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят при -30°С для последующего использования, далее через 1-2 суток, после пятого введения живых клеток, вводят также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт, предварительно размороженный и согретый до температуры тела, в объеме 1,5-2 мл, ежедневно. Причем концентрация рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 составляет от 200 до 500 нг/мл, а интерлейкина-15 составляет от 4 до 6 нг/мл. Концентрация аутологичной сыворотки в питательной среде составляет от 2,5 до 5%. На 3, 5, 7, 9 и 14 день активирования производят обновление половины объема питательной среды или клеточную суспензию собирают полностью, оценивают жизнеспособность, пролиферативную активность, центрифугируют при 1200-2000 оборотов/мин, и собирают клеточный продукт. При возникновении рецидива курс повторяют.

Способ поясняется подробным описанием, клиническими примерами и иллюстрацией, на которой изображено:

Фиг. 1. - Фотоиллюстрация после процедуры введения клеток -внутрикожно паравертебрально в две точки.

Способ осуществляют следующим образом.

Для лечения герпес-вирусной инфекции, в том числе генитального герпеса, с помощью активированных in vitro аутологичных лимфоцитов, у пациента проводят взятие венозной крови с герпес-вирусной инфекцией и в стерильных условиях выделяют лимфоциты. Выделенные лимфоциты активируют в питательной среде, содержащей рекомбинантные человеческие интерлейкин-2, интерлейкин-15, пируват натрия, L-глутамин и аутологичную сыворотку, инактивированную при 60°С в течение 60 мин на протяжении 14 дней в условиях CO2-инкубатора. При этом культуральная среда не содержит антибиотиков. Затем на 3, 5, 7, 10 и 14 день активации цитотоксические лимфоциты в количестве от 5 до 20 млн в стерильных условиях ресуспендируют в клеточном продукте и вводят пациенту внутрикожно паравертебрально в две точки (Фиг.1). В эти же дни оставшийся клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят при -30°C для последующего использования в амбулаторном лечении. Далее через 1-2 суток ежедневно №5 вводят также внутрикожно паравертебрально в 2 точки клеточный продукт в объеме 1,5-2 мл, предварительно согретый до температуры тела.

Таким образом, курс состоит из 10 инъекций. После окончания первого курса возможно повторение курса иммунотерапии в режиме «по требованию», т. е. при возникновении очередного обострения или для профилактики. Изобретение позволяет индуцировать высокий иммунный ответ, характеризующийся увеличением продолжительности безрецидивного периода.

Порядок реализации способа.

Для выделения лимфоцитов у больного с помощью вакуумной системы и пробирок, содержащих гепарин, берут венозную кровь и разбавляют ее в 2 раза физраствором NaCl 0,9% (Россия). Разбавленную кровь наслаивают на раствор Фиколла, плотностью-1,077 г/см³ (ПанЭко, Россия) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 25 мин, что приводит к оседанию эритроцитов и гранулоцитов на дно пробирки. В результате центрифугирования лимфоциты образуют интерфазное кольцо, которое собирают пипеткой и двукратно отмывают центрифугированием в 10-кратном объеме фосфатно-солевого буфера (Россия) при 1800 об/мин в течение 10 мин.

Выделенные лимфоциты подсчитывают, ресуспендируют в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл в питательной среде (содержащей пируват натрия, L-глутамин, с добавлением от 2,5 до 5% предварительно полученной от пациента и инактивированной при 60°С в течение 60 мин аутологичной сыворотки, и с добавлением от 200 до 500 МЕ/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкин, Биотех, Россия), и от 4 до 6 нг/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-15 (SciStore, Россия)) и активируют на протяжении 14 дней в пластиковых флаконах с вентилируемой крышкой в условиях CO2-инкубатора при температуре от 36,9 до 37,1°C. В качестве питательной среды может быть использована RPMI-1640 (ПанЭко, Россия). На 3 день культивирования получают активированные цитотоксические лимфоциты.

Ежедневно проводят морфологическую оценку культуры лимфоцитов и визуальную оценку питательной среды на отсутствие патогенной микрофлоры. Для поддержания жизнеспособности активированных цитотоксических лимфоцитов на 3, 5 , 7 и 10 день активирования меняют половину объема питательной среды, на 14 день собирают полностью. В это же время собирают необходимое количество активированных цитотоксических лимфоцитов для введения пациенту (5-20 млн), а оставшийся клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят при температуре -30°C для дальнейшего использования. При замене питательной среды оценивают жизнеспособность клеток и их пролиферативную активность.

Для проведения иммунотерапии активированными лимфоцитами на 3, 5, 7, 10 и 14 день полученные клетки собирают в количестве от 5 до 20 млн, ресуспендируют в клеточном продукте объемом от 1,0 до 2,0 мл и вводят пациенту внутрикожно паравертебрально в 2 точки. Затем ежедневно №5 вводят также внутрикожно паравертебрально в 2 точки клеточный продукт в объеме 1,5-2 мл, предварительно согретый до температуры тела.

Таким образом, курс состоит из 10 инъекций. После окончания первого курса возможно повторение курса иммунотерапии в режиме «по требованию», т. е. при возникновении очередного обострения или для профилактики.

Увеличение сроков культивирования до 14 дней достигнуто за счет добавления в культуральную среду аутологичной инактивированной сыворотки крови, что позволило получить большее количество активированных лимфоцитов, следовательно увеличить количество введений активированных лимфоцитов пациенту без дополнительных заборов крови. Все компоненты и среды, используемые для реализации предлагаемого способа, Российского производства

Клинические примеры.

Пример 1.

Пациентка Н. 1958 г.р. наблюдалась в Центре амбулаторно с мая 2015 года. Диагноз: A60.0 Герпетические инфекции половых органов и мочеполового тракта. Из анамнеза - около 20 лет страдает хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекцией половых органов и мочеполового тракта, последние 10 лет практически ежемесячные обострения, то есть не менее 12 раз в год. Обострения сопровождались общей слабостью, ознобом, субфебрилитетом, болезненностью при мочеиспускании. Лечилась местными и системными противовирусными препаратами, практически без эффекта. Со слов, обострения проходили как на фоне полного благополучия, так и на фоне стресса, переохлаждения и всегда перед месячными. Не обследовалась.

Проведён курс из 10 внутрикожных введений аутологичных активированных ин витро лимфоцитов. Пациентке ввели внутрикожно паравертебрально в две точки - на 3, 5, 7, 10 и 14 день в количестве от 10 до 12 млн. Через 2 суток ежедневно №5 ввели также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт в объеме 1,5 мл, предварительно согретый до температуры тела.

Лимфоциты вводили ежедневно по рабочим дням. Местная реакция - папула апельсиновая корка, гиперемия +1.0 см, зуд. Общая реакция в виде гриппоподобного синдрома развилась на 3-е введение и продолжалась до 10-го введения. Лёгкий озноб и ломота в мышцах начинались в 18.00 и длились около 2-х часов. Температура тела не повышалась.

Первое обострение от момента проведения 1-го курса произошло через 4 месяца и характеризовалось значительно менее выраженными проявлениями, буквально, вдвое короче по времени. Потребовалось местное лечение Виферон гелем 6 раз в сутки. Второе обострение произошло в мае 2016 года в момент второго обращения для проведения курса иммунотерапии. Был проведён ПЦР тест - обнаружена ДНК простого герпеса. На третьи сутки от начала обострения, проявившегося зудом влагалища, болезненностью при мочеиспускании, герпетическими высыпаниями на слизистой преддверия влагалища и ознобом, было проведено первое введение аутологичных лимфоцитов 3-х суток инкубации. На следующий день пациентка отметила резкое снижение зуда, отсутствие болей при мочеиспускании и отсутствие развития пузырьковых высыпаний. Все имевшиеся проявления носили сглаженный характер на фоне курса иммунотерапии и к 7-м суткам исчезли без применения стандартных препаратов. Курс был проведён в плановом режиме, и пациентка отбыла по месту жительства. В межкурсовой период пациентка не наблюдалась, поскольку живёт заграницей. Приехав на третий курс в мае 2017 года, пациентка сообщила, что рецидив был однажды и высыпания не развивались в пузырьки, а были только в виде небольшой гиперемии и лёгкого зуда. В 2018 году пациентка не приехала, однако сообщила, что обострений нет. Учитывая дальнейшую ситуацию с ковидными ограничениями, до настоящего времени она не приезжала в Россию, однако известно, что обострения возникают 1-2 раза в год, протекают значительно менее выражено и купируются местным применением противовирусных мазей. Ковидом пациентка не болела ни разу. Мониторинговые исследования ПЦР на вирусы герпеса - отрицательные. Срок наблюдения 7 лет.

Пример 2.

Пациентка К. 1992 г.р. наблюдалась амбулаторно с июня 2018 года. Срок наблюдения - 4 года. Диагноз: A60.0 Герпетические инфекции половых органов и мочеполового тракта. Из анамнеза - с 15-ти летнего возраста страдает хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекцией половых органов и мочеполового тракта. Со слов, заболевание непрерывно рецидивировало. Получала Изопринозин в непрерывном режиме 2 раза в сутки при стихании процесса и 7 раз в сутки в сочетании с Валтрексом при возобновлении высыпаний. ПЦР тест - обнаруживалась ДНК простого герпеса.

С июля 2018 года был проведён первый курс.

Для этого был произведен забор крови у пациентки в количестве 30 мл, с последующим выделением и культивированием лимфоцитов. На 3, 5, 7, 10 день культивирования меняли половину объема питательной среды, на 14 день собирали клетки полностью, супернатант (клеточный продукт) замораживали при -30°С в количестве 1,5 мл, а клетки в количестве от 5 до 8 млн ресуспендировали в супернатанте и вводили пациентке внутрикожно паравертебрально в 2 точки. Затем через 2 суток ежедневно №5 вводили также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт в объеме 2 мл, предварительно согретый до температуры тела.

Таким образом, первый курс состоял из 10 инъекций. Затем внутрикожные инъекции проводили супернатантом в режиме «по требованию», что означало проведение иммунотерапии в период обострения.

В период с июня 2018 по июнь 2019 проведено 20 внутрикожных введений в индивидуальном режиме. На фоне иммунотерапии «по требованию» безрецидивные промежутки удлинялись, а проявления пузырьковой сыпи, недомоганий, слабости, ознобов стали почти незаметными.

В период с июня 2019 по июнь 2022 пациентка обращалась трижды для проведения коротких курсов по 3 введения профилактически перед отпуском, поскольку генитальный герпес её не беспокоил. С начала эпидемии Ковид 19 до апреля 2022 пациентка работала в «красной зоне», заболела Ковид 19 только в марте 2022 в лёгкой форме. С мая 2019 года по июль 2022 г. (38 мес.) рецидивов не было. Мониторинговые исследования ПЦР на вирусы герпеса - отрицательные.

Пример 3.

Пациентка Г.1996 г.р наблюдалась амбулаторно с декабря 2020 года. Диагноз: A60.0 Герпетические инфекции половых органов и мочеполового тракта. Из анамнеза - около двух лет страдает ежемесячными обострениями, лечилась Валтрексом в периоды обострений. ПЦР тест - обнаруживалась ДНК простого герпеса. Обострения сопровождались повышением температуры тела до 38°С, пузырьковыми болезненными высыпаниями на половых губах, уретритом, снижением аппетита. В межрецидивный период ощущала слабость, головные боли, потерю аппетита, отказалась от занятий спортом, а затем не смогла работать. Была обследована эндокринологом. Диагноз: аутоиммунный тиреоидит. Потеря веса около 3 кг за полгода.

Было проведено 4 курса из 10 внутрикожных введений аутологичных активированных in vitro лимфоцитов. Пациентке вводили внутрикожно паравертебрально в две точки - на 3, 5, 7, 10 и 14 день в количестве от 5 до 20 млн. Через 1 сутки ежедневно №5 ввели также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт в объеме 1,5 мл, предварительно согретый до температуры тела.

Курсы проводились весной и осенью в заявленном режиме.

Местная реакция - папула апельсиновая корка, гиперемия +1.0 см, зуд. Общая реакция в виде гриппоподобного синдрома развилась на 2-е введение и продолжалась до 10-го введения. Лёгкий озноб и ломота в мышцах начинались в 18.00 и длились около 2-х часов. Температура тела не повышалась. После первого курса обострения сократились до 2-х в год, на третьем курсе прекратились, пациентка начала поправляться и вернулась на работу. В настоящее время обострений нет. Мониторинговые исследования ПЦР на вирусы герпеса - отрицательные. Срок наблюдения 2 года.

Пример 4.

Пациентка М. 1993 г.р. Диагноз: A60.0 Герпетические инфекции половых органов и мочеполового тракта. Из анамнеза-с ноября 2020 года страдает хронической герпесвирусной инфекцией, постоянно принимает Ацикловир 400 мг, обострения возникают на снижении дозы на 200 мг. ПЦР тест - обнаруживалась ДНК простого герпеса.

С 17.05.2022 начат курс лечения с помощью активированных in vitro аутологичных лимфоцитов. Пациентке ввели внутрикожно паравертебрально в две точки - на 3, 5, 7, 10 и 14 день в количестве от 7 до 10 млн. Через 1 сутки ежедневно №5 ввели также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт в объеме 2 мл, предварительно согретый до температуры тела.

Перенесла хорошо, отмечает улучшение настроения, общего тонуса. На фоне лечения эпизод обострения наступил на четвёртой неделе, завершился за 6 дней без приёма системных препаратов, местно применяла: на пузырьки гель Виферон, на корочки мазь Виферон 4 раз в сутки. Проявления были слабые - меньше зуда, меньше дискомфорта, меньше высыпаний. В настоящее время получает аутолимфоцитотерапию в режиме «по требованию». Обострения нет. Мониторинговые исследования ПЦР на вирусы герпеса - в плане. Срок наблюдения 2 месяца.

Предложенный способ позволяет:

- индуцировать высокий иммунный ответ и увеличить продолжительность безрецидивного периода,

- увеличить сроки культивирования клеток до 14 дней, за счет добавления в культуральную среду аутологичной инактивированной сыворотки крови,

- получить большее количество активированных лимфоцитов, тем самым увеличить количество введений активированных лимфоцитов пациенту без дополнительных заборов крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для лечения герпес-вирусной инфекции с помощью активированных in vitro аутологичных лимфоцитов. Способ включает: взятие венозной крови у пациента с герпес-вирусной инфекцией, выделение лимфоцитов с последующим культивированием в условиях CO₂-инкубатора во флаконах с питательной средой, содержащей рекомбинантные человеческие интерлейкин-2, интерлейкин-15, пируват натрия, L-глутамин. В питательную среду добавляют инактивированную аутологичную сыворотку, причем перед добавлением в питательную среду её инактивируют при 60°С в течение 60 мин, лимфоциты культивируют на протяжении 14 дней в условиях CO₂-инкубатора, на 3, 5, 7, 10 день культивирования собирают часть клеток, половину объема питательной среды меняют, на 14 день клетки собирают полностью, живые клетки в количестве от 5 до 20 млн ресуспендируют в супернатанте объемом от 1,0 до 2,0 мл и вводят пациенту внутрикожно паравертебрально в 2 точки, как на фигуре 1. Оставшийся клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят при -30°С для последующего использования, далее через 1-2 суток, после пятого введения живых клеток, вводят также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт, предварительно размороженный и согретый до температуры тела, в объеме 1,5-2 мл, ежедневно. Изобретение обеспечивает лечение больных с герпес-вирусными инфекциями, в том числе с генитальным герпесом, и позволяет индуцировать высокий иммунный ответ, характеризующийся увеличением продолжительности безрецидивного периода. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

1. Способ лечения больных герпес-вирусной инфекцией с помощью активированных in vitro аутологичных лимфоцитов, включающий взятие венозной крови у пациента с герпес-вирусной инфекцией, выделение лимфоцитов с последующим культивированием в условиях CO₂-инкубатора во флаконах с питательной средой, содержащей рекомбинантные человеческие интерлейкин-2, интерлейкин-15, пируват натрия, L-глутамин, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют инактивированную аутологичную сыворотку, причем перед добавлением в питательную среду её инактивируют при 60°С в течение 60 мин, лимфоциты культивируют на протяжении 14 дней в условиях CO₂-инкубатора, на 3, 5, 7, 10 день культивирования собирают часть клеток, половину объема питательной среды меняют, на 14 день клетки собирают полностью, живые клетки в количестве от 5 до 20 млн ресуспендируют в супернатанте объемом от 1,0 до 2,0 мл и вводят пациенту внутрикожно паравертебрально в 2 точки, как на фигуре 1, оставшийся клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,5-2 мл и хранят при -30°С для последующего использования, далее через 1-2 суток, после пятого введения живых клеток, вводят также внутрикожно паравертебрально в две точки клеточный продукт, предварительно размороженный и согретый до температуры тела, в объеме 1,5-2 мл, ежедневно.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 составляет от 200 до 500 нг/мл.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация рекомбинантного человеческого интерлейкина-15 составляет от 4 до 6 нг/мл.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация аутологичной сыворотки в питательной среде составляет от 2,5 до 5%.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на 3, 5, 7, 9 и 14 день активирования во время обновления питательной среды или полного сбора лимфоцитов для оценки жизнеспособности и пролиферативной активности клеток и для сбора клеточного продукта суспензию клеток центрифугируют при 1600 об/мин в течение 5 мин.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при возникновении рецидива курс повторяют.