СПОСОБ ИММУНОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕВЫМ ЛИЗАТОМ С АДЪЮВАНТОМ БЕТАЛЕЙКИН БОЛЬНЫХ СОЛИДНЫМИ ОПУХОЛЯМИ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/20 A61K35/12 A61P35/00 A61B5/145 

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения больных с диссеминированной меланомой кожи и распространенным раком почки, резистентных к стандартному лечению (химиотерапии, иммунотерапии, лучевому лечению), но отвечающих на противоопухолевую вакцинотерапию. Противоопухолевая вакцинотерапия - это лечебный и профилактический метод активной специфической иммунотерапии, основанный на использовании антигенов с/без адъюванта для усиления противоопухолевого иммунного ответа. Особенностью действия противоопухолевых вакцин является то, что они индуцируют иммунный ответ, направленный на элиминацию иммунорезистентных опухолевых клеток. Противоопухолевый эффект достигается повторным введением антигенного материала в режиме вакцинотерапии. При этом, как показали клинические и экспериментальные исследования, для повышения эффективности вакцинотерапии необходимо:

- максимальное уменьшение объема опухолевой массы в организме посредством классических методов лечения злокачественных опухолей;

- высокая иммуногенность вакцины;

- достаточная иммунокомпетентность организма с опухолью;

- отсутствие иммуносупрессивных воздействий;

- одновременная активная неспецифическая иммунотерапия (адъюванты) (Моисеенко В.М., Балдуева И.А., Хансон К.П. Вакцинотерапия злокачественных опухолей// Вопросы онкологии. - 1999. - №3. - С.327-332).

Таким образом, формирование устойчивого вакцино-индуцированного противоопухолевого иммунитета в организме с распространенным опухолевым процессом становится важной стратегией иммунотерапии.

Многократно описаны нарушения в иммунном ответе у больных с различными злокачественньми опухолями и у животных с опухолью. Эти нарушения большинство авторов объясняет супрессивной функцией Т-клеток. Клинические и экспериментальные данные о значении функционального состояния антигенпредставляющих клеток (АПК) противоречивы. Некоторые исследователи указывают на дефектную функцию макрофагов при опухолях, в то же время описана нормальная, а иногда и повышенная функция макрофагов у экспериментальных животных с опухолью. В ряде исследований было показано, что активированные макрофаги могут ингибировать или стимулировать рост опухоли, способствовать образованию структурно-аномального комплекса на Т-клетках (Т-клеточный рецептор-СВ3 антиген) и тем самым снижать литическую функцию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Более того, указывается, что макрофаги способны индуцировать толерантность к опухолевым антигенам.

Как стало ясно в последнее время, дендритные клетки (ДК) играют важную роль в процессе опухолевой прогрессии. Установлено, что по причине отсутствия ДК в опухоли или слабой экспрессии молекул HLA I и II класса, а также костимулирующих (вспомогательных) молекул на ДК, инфильтрирующих опухоль, не создается устойчивый антиген-специфический Т-клеточный ответ. По мнению ряда авторов, это может быть следствием продукции злокачественной опухолью факторов (ИЛ-10, ТФР-бета, фактор роста эндотелия и др.), угнетающих дифференцировку, созревание и функциональную активность периферических ДК. При культивировании таких ДК в условиях in vitro, позволяющих получить их максимальный рост и активацию, наблюдается увеличение экспрессии поверхностных молекул, которая коррелирует с иммуногенностью.

Более того, в результате исследований последних лет стала понятна биологическая целесообразность ДК в противоопухолевом иммунитете. Она заключается в следующем: индукция Т-клеточного иммунного ответа требует распознавания Т-лимфоцитами опухолеассоциированных антигенных пептидов в связи с молекулами HLA, которые могут находиться в организме повсеместно. Трудности в распознавании связаны с тем, что количество специфических антиген-HLA комплексов на опухолевых клетках обычно мало (100 и меньше на клетку) и должно быть распознано различными Т-клеточными клонами (обычно с частотой 1/100,000 и меньше) через Т-клеточные рецепторы, которые имеют с ними низкое сходство (1μМ и ниже). Кроме того, на опухолевых клетках часто наблюдается недостаток костимулирующих молекул, которые усиливают клональную пролиферацию (размножение), продуцирующих цитокины и рост Т-клеток-киллеров. ДК решают эти проблемы. Располагаясь в большинстве тканей, ДК захватывают, обрабатывают антигены и представляют их на своей поверхности в виде HLA-пептидных комплексов Т-лимфоцитам. ДК поддерживают также повышенный уровень костимулирующих молекул. После взаимодействия с антигенами они мигрируют в периферические лимфоидные органы, где активируют антигенспецифические Т-клетки.

До последнего времени трудности в изучении ДК были связаны с малочисленностью и ограниченностью специфических маркеров. В настоящее время эта проблема решена. Достаточное количество ДК может быть получено из гемопоэтических предшественников - костно-мозговых клеточных культур, стимулированных соответствующими факторами роста, а также из моноцитов периферической крови, путем культивирования в присутствии ГМ-КСФ, ИЛ-4, ФНО-альфа, ИЛ-1 и др.

В большинстве тканей ДК представлены в форме незрелой покоящейся ДК, которая не способна стимулировать Т-клетки и выполняет наблюдательную функцию. У этой ДК отсутствуют костимулирующие сигналы для Т-клеточной активации (такие как CD40, CD54, CD86 и др.), но она достаточно хорошо «оснащена» молекулами для захвата антигена. Именно захват антигена является пусковым моментом в индукции ее полного созревания и мобилизации. Наблюдательная функция незрелой ДК особенно хорошо прослеживается, когда на поверхности кожи метят in vivo на молекулы ДК (например, окрашивание HLA молекул II класса). У человека в коже обнаружено несколько популяций ДК с отличительными чертами и около 10⁹ эпидермальных клеток Лангерганса (КЛ), т.е. незрелых ДК кожи, которые находятся над базальным слоем пролиферирующих кератиноцитов. Свежевыделенные КЛ слабо стимулируют Т-клетки, у них мало молекул HLA и костимулирующих молекул, но много антигензахватывающих Fc_γ и Fc_ε рецепторов. Этот фенотип основательно изменяется в течение дня культивирования: клетки подвергаются экстенсивной трансформации, антигензахватывающее свойство исчезает, функции, связанные со стимуляцией Т-клеток, усиливаются. В случае, когда кожный лоскут эксплантирован и КЛ захватывают антиген, через некоторое время, обычно через день, наблюдается миграция зрелых ДК в культуральную среду. Подобная же картина имеет место in vivo, когда КЛ встречаются с сильным иммуностимулятором, например антиген-специфическим вакцинным препаратом и сильным провоспалительным цитокином.

Как показано многими исследованиями, незрелые ДК имеют ряд характерных особенностей, которые позволяют именно им захватывать антиген. Они могут фагоцитировать частицы и микроорганизмы, могут образовывать большие пиноцитозные вакуоли (макропиноцитоз). Кроме того, незрелые ДК экспрессируют рецепторы, которые опосредуют адсорбтивный эндоцитоз, включая рецепторы лектина С-типа (подобно маннозному и DEC-205 рецепторам макрофага), а также Fc_γ и Fc_ε рецепторы. Макропиноцитоз и рецептор-опосредованный захват антигена способствует более «качественной» обработке антигена, а представление его пептидов становится таким эффективным, что пикомолярной и наномолярной концентрации антигена оказывается достаточно для активации Т-клеток. Это в несколько раз меньше, чем микомолярные количества обычно «используемых» другими АПК.

ДК, захватившая антиген, теряет способность захватывать другие антигены, в отличие от макрофагов, так как в это время происходит образование антиген-HLA класс II комплексов. Отличительной особенностью ДК является их способность продуцировать большие количества молекул HLA класс II пептидных комплексов за короткий период своей жизни. Этому способствуют специализированные HLA класс-II компартменты, которые в изобилии находятся в незрелых ДК. HLA класс-II компартменты являются поздними эндосомальными структурами, которые содержат HLA-DM или Н-2М продукты, усиливающие и «редактирующие» пептидную связь HLA класса II молекул. В период созревания ДК, фрагменты антигена нагружаются намолекулы HLA II класса и эти комплексы посылаются на клеточную поверхность для анализа Т-хелперам. Для получения клона Т-клеток-киллеров (ЦТЛ), которые способны лизировать опухолевые клетки, ДК представляют на своей поверхности антигенные пептиды, соединенные с молекулами HLA I класса, покоящимся Т-лимфоцитам, экспрессирующим CD8 антиген.

Созревание ДК является чрезвычайно важным моментом в индукции иммунного ответа. На него могут влиять различные факторы, в особенности это относится к продуктам воспаления. Цитокины - ИЛ-1, ГМ-КСФ, ФНО-альфа и ИНФ-альфа, стимулируют созревание ДК, в то время как ИЛ-10, ИЛ-13, ТФР-бета и др. блокируют этот процесс.

Созревание антигензахватывающих ДК сопровождается изменением их формы. При этом они приобретают необычную для клеток крови форму со множеством отростков, что соответствует их названию. При рассмотрении этих клеток через микроскоп видны длинные (>10 μM) и тонкие цитоплазматические отростки (веретенообразные или плоские). При наблюдении за живыми ДК с помощью фазово-контрастной микроскопии можно видеть активные движения цитоплазматических отростков. Эти отростки изгибаются, сокращаются, вновь вытягиваются и втягиваются. Форма и подвижность ДК соответствует их функциям, которые заключаются в отборе антигенспецифических Т-клеток.

Зрелые ДК теряют фагоцитарную способность. Они представляют антиген Т-лимфоцитам (как CD4⁺, так и CD8⁺ клеткам). Причем однократно активированные антигенспецифические Т-хелперы способны усилить иммунный ответ путем взаимодействия с ЦТЛ, стимулируя их киллерную функцию и с В-лимфоцитами - для образования антител. Незрелые ДК, как упоминалось ранее, обладают меньшей способностью индуцировать иммунный ответ, но специализируются на захвате антигена для образования HLA-пептидных комплексов. Таким образом, две ключевые функции ДК разделены во времени: сначала незрелые ДК захватывают и обрабатывают антиген, а затем зрелые ДК через день или более стимулируют Т-клетки.

В зависимости от условий ДК могут стимулировать образование и активацию различных клонов Т-клеток. Они способны «заставлять» ЦТЛ, экспрессирующие CD8 антигены, необычно активно пролиферировать. В присутствии ДК и ИЛ-1 Т-хелперы созревают в Т-клетки, продуцирующие ИНФ-гамма, который вместе с ИЛ-12 (продукт ДК) способствует дифференцировке покоящихся CD8⁺ Т-лимфоцитов в антиген-специфические Т-клетки-киллеры.

Взаимодействие между Т-клетками и ДК высокоспецифическое, в котором Т-клетки так же хорошо отвечают ДК: CD40 рецептор и недавно описанный TRANCER/RANK рецептор на ДК связываются семейством ФНО-белков, экспрессирующихся на активированных Т-клетках и Т-клетках памяти. Это ведет в повышению выживания ДК и, в случае CD40 рецептора, повышает регуляцию CD80 и CD86 молекул, секрецию ИЛ-12 и освобождает некоторые хемокины (ИЛ-8, MIP-1-альфа и бета).

Таким образом, для индукции устойчивого (напряженного) противоопухолевого иммунитета у больных с распространенным опухолевым процессом, резистентных к стандартному лечению, необходимо применять вакцину, механизм действия которой опосредован «высокопрофессиональными» ДК, в том числе клетками Лангерганса и дермальными дендритными клетками, а также использовать адекватный режим вакцинации (Балдуева И.А. Противоопухолевые вакцины// Практическая онкология. - 2003. - Т.4. - №3. - С.157-166).

Прототипом нашего способа является индукция противоопухолевого иммунного ответа ДК, полученными из аутологичных моноцитов периферической крови или костно-мозговых предшественников дендритных клеток и активированных аутологичным опухолевым лизатом in vitro. В последующем эти антигенпредставляющие клетки вводят в организм в режиме вакцинотерапии (Chag А.Е., Redman B.G., Whitfield J.R. et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer// Clin. Cancer Res. - 2002. - Vol.8. - P.1021-1032). Преимуществом нашего метода является то, что мы индуцируем, а также поддерживаем противоопухолевый иммунный ответ в организме с распространенным опухолевым процессом с помощью активированных аутологичным опухолевым лизатом ДК (клетки Лангерганса, дермальные дендритные клетки), исключая этап их выделения из организма.

Технический результат изобретения заключается в активации и созревании (дифференцировке) дендритных клеток кожи (клетки Лангерганса и дермальные дендритные клетки) аутологичным опухолевым лизатом с Беталейкином у больных с распространенным опухолевым процессом. Этот результат достигается путем

- проведения циторедуктивной операции;

- получения образца опухоли не менее 1 куб. см и дезагрегации его в течение 30-60 секунд в стандартных условиях - использование Медикона (разовый стерильный набор ножей и фильтра) и Медимашины ("DAKO", Дания);

- очищения диспергированных опухолевых клеток от клеточных конгломератов соединительной ткани в Филконах с клеточными фильтрами 70 μm и 50 μm ("DAKO" Дания);

- очищения изолированных опухолевых клеток от клеточного детрита центрифугированием в течение 40 мин при 1200 об/мин в ступенчатом градиенте плотности Перколла ("Sigma" США);

- определения жизнеспособности клеток с помощью 0,1% трипанового синего ("Sigma" США), камеры Горяева и светового микроскопа ("Бимам Р11", Санкт-Петербург) объектив ×10. Количество жизнеспособных клеток составляет 95-97,2% (в рекомендациях Dr. Erba, Institute Marion Negri, Milan, Italy число живых клеток должно быть не менее 93%);

- суспендирования 10¹¹ клеток в 1 мл питательной среде DMEM/F12 (Биолот, РФ), и забор 100 мкл для исследования уровня экспрессии опухолеассоциированнных антигенов и антигенов системы HLA I и II класса;

- ресуспендирования клеток в питательной среде DMEM/F12, содержащей 20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС) (Биолот, РФ), 20% кондиционированной среды культуры фибробластов легких эмбриона человека, трансферрин, инсулин, селен в стандартной дозе (Invitrogen, США) и культивирование при 37°С, 5% CO₂ и 98% влажности в пластиковых флаконах (Sarstedt, ФРГ);

- замораживания клеток в поддерживающей среде с 10% диметилсульфоксида с помощью программного замораживателя "SY-Lab" при -180°С и хранение в криобанке до использования.

Непосредственно перед использованием производится

- размораживание 10⁷ клеток до комнатной температуры;

- облучение на терапевтическом аппарате "Рокус-у" Со⁶⁰ 1,25 mev при 2000 сГр (мощность дозы 0,99 сГр/с) с целью девитализации опухолевых клеток;

- лизис опухолевых клеток по стандартной методике;

- соединение лизированных опухолевых клеток с 60 нг интерлейкина-1-бета человека (Беталейкин).

Приготовленную вакцину вводили строго внутрикожно паравертебрально в 3 точки на расстоянии 3 см друг от друга. В 4-ю точку вводили опухолевый лизат без Беталейкина с целью контроля реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (иммунологическая реакция in vivo). Внутрикожное введение вакцины комбинировали с подкожным введением 470 нг Беталейкина в переднюю брюшную стенку в 1-й и 2-й дни вакцинации.

Беталейкин применяли местно и системно с целью индукции синтеза и усиления биологического действия колониестимулирующих факторов, в том числе ГМ-КСФ, который необходим для активации и созревания ДК (захват, процессинг и представление опухолеассоциированных антигенов ДК для Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах).

Вместе с тем, действие вакцины зависит от иммунокомпетентности организма с распространенным опухолевым процессом, которую мы оценивали по ряду лабораторных тестов in vitro и по реакции ГЗТ (4-я контрольная точка) in vivo.

Реакция ГЗТ, которая развивалась на лизат аутологичных опухолевых клеток без Беталейкина в течение 24-48 ч в форме покраснения кожи (3-17 мм) и могла сохраняться в течение нескольких дней, расценивалась нами как признак возможной эффективности применяемого вида иммунотерапии. Таким больным мы продолжали введение вакцины каждые 3 недели до использования аутологичного материала. Реакция ГЗТ коррелировала с клиническим эффектом в 14% случаев, но мы не наблюдали клинической эффективности применяемого способа иммунотерапии без реакции ГЗТ.

В процессе иммунотерапии (каждые 3 мес) оценивали объем метастатических образований опухоли с помощью ультразвукового, рентгенологического методов, а также компьютерной томографии, получение их изображения в динамике. Важным элементом метода является тот факт, что в процессе динамического наблюдения мы имеем возможность своевременно внести коррективы в схему проводимого лечения, изменив ее на более адекватную в случае прогрессирования заболевания.

Анализ известного уровня науки и техники показал новизну метода, т.к. до настоящего времени применяли адъюванты, действие которых не могло обеспечить длительную противоопухолевую напряженность иммунитета посредством «высокопрофессиональных» антигенпредставляющих ДК in vivo.

Изобретательский уровень предлагаемого изобретения подтверждается тем, что метастатические формы солидных опухолей, устойчивых к традиционным методам лечения, требуют разработки новых методов биотерапии, в том числе активной специфической иммунотерапии (вакцинотерапии). Эти знания дополнят наше понимание биологии опухолевого роста и позволят изучить возможности аутологичной вакцинотерапии и механизмы противоопухолевого ответа у больных солидными опухолями.

Для лучшего понимания сущности заявленного изобретения, а также для подтверждения соответствия решения условию промышленной принимаемости приводим примеры конкретной реализции, которыми оно исчерпаться не может.

1. Больной П., 49 лет, рак правой почки с метастазами в параортальные лиматические узлы. После правосоторонней нефрэктомии в марте 1999 г. проведено 6 вакцинаций лизатом аутологичных опухолевых клеток с Беталейкином, с интервалом три недели. В процессе проводимого лечения зарегистрирована реакция ГЗТ (5-8 мм), параортальные лимфатические узлы уменьшились в размерах в среднем с 3 см в диаметре до 1,8 см в диаметре. На момент последнего обследования (март 2001 г.) по данным компьютерной томографии подтверждено уменьшение размеров наблюдаемых лимфоузлов в среднем до 1,2 см в диаметре. Больной прибавил в весе, данных за прогрессирование заболевания нет.

2. Больной Н., 48 лет, рак правой почки с метастатическими поражениями скелета, патологический перелом диафиза правой плечевой кости. После правосторонней нефрэктомии в октябре 2000 года проведено 5 вакцинаций лизатом аутологичных опухолевых клеток с Беталейкином, с интервалом три недели. Реакция ГЗТ регистрировалась после каждого введения (6-8 мм). В процессе лечения и динамического наблюдения (последнее обследование в августе 2001 г.) состояние метастатических образований скелета оценивалось как стабилизация.

3. Больной Б., 54 года, меланома кожи левого плеча, состояние после лазеротерапии (1999), левосторонняя подмышечная лимфоаденэктомия (24.02.2000). Иссечение рецидива опухоли в марте 2000 г. Проведено 6 вакцинаций лизатом аутологичных опухолевых клеток с Беталейкином и интервалом три недели. Реакция ГЗТ (6-12 мм) наблюдалась после каждого введения вакцины. На момент последнего обследования (июнь 2001 г.) данных за прогрессирование заболевания нет.

4. Больной Л., 49 лет, меланома кожи спины с метастазами в левые надключичные и подмышечные лимфатические узлы. Иссечение опухолевого образования в апреле 2000 г. Проведено 3 вакцинации (из планируемых 6 вакцинаций) лизатом аутологичных опухолевых клеток с Беталейкином и интервалом три недели. В процессе лечения реакция ГЗТ не была зарегистрирована, наблюдалось прогрессирование заболевания (появление новых метастатических образований в подкожной клетчатке спины), что послужило основанием для отмены вакцинотерапии и назначения химиотерапии.

Сущность нашего изобретения состоит в том, что мы предлагаем современный, безопасный и действенный способ активной специфической иммунотерапии больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки наряду с химиотерапией, лучевой терапией, хирургическим лечением или гормонотерапией.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения больных с диссеминированной меланомой кожи, распространенным раком почки, резистентных к стандартному лечению, но отвечающих на противоопухолевую вакцинотерапию. Для этого вакцину из 10⁷ клеток аутологичного опухолевого лизата соединяют с 60 нг беталейкина и вводят строго внутрикожно паравертебрально в 3 точки на расстоянии 3 см друг от друга. Введение осуществляют каждые 3 недели, причем первую и вторую вакцинации комбинируют с введением 470 нг беталейкина в переднюю брюшную стенку. Продолжение вакцинаций осуществляют в случае положительной реакции гиперчувствительности замедленного типа на введение после каждой вакцинации опухолевого лизата без беталейкина. Способ позволяет индуцировать и поддерживать противоопухолевый иммунный ответ с помощью активированных опухолевым лизатом дендритных клеток без их выделения из организма, а также контролировать эффективность такого ответа.

Способ иммунотерапии больных солидными опухолями, включающий введение опухолевого лизата с адъювантом беталейкин, отличающийся тем, что вакцину из 10⁷ клеток аутологичного опухолевого лизата соединяют с 60 нг беталейкина и вводят строго внутрикожно паравертебрально в 3 точки на расстоянии 3 см друг от друга, введение осуществляют каждые 3 недели, причем 1 и 2 вакцинации комбинируют с введением 470 нг беталейкина в переднюю брюшную стенку; продолжение вакцинаций осуществляют в случае положительной реакции гиперчувствительности замедленного типа на введение после каждой вакцинации опухолевого лизата без беталейкина.