СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА Российский патент 2008 года по МПК A61K35/14 A61K31/4402 A61K31/56 A61P37/02 

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии и аллергологии, и касается способа лечения атопического дерматита.

Атопический дерматит (АД) - это один из самых частых и проблематичных дерматозов, заболеваемость которым в мире, по разным данным, у взрослых может составлять от 5% до 16,8% населения. Начинаясь в раннем детстве, примерно в половине случаев он может протекать долгие годы, то обостряясь, то затихая с характерной сезонной зависимостью [1, 2, 4].

Атопический дерматит характеризуется аллергической сенсибилизацией с гиперпродукцией иммуноглобулина Е против различных антигенов окружающей среды. В аллергической сенсибилизации большую роль играет активация Тh2-клеток, т.к. эти клетки могут опосредовать синтез IgE через ИЛ-4. Современные данные свидетельствуют о том, что Th-2 ответ в норме подавлен Т-регуляторными клетками (Treg), а у атопиков эта супрессия ослаблена [4, 9, 10, 12].

Регуляторные Т-клетки являются важным компонентом гомеостаза иммунной системы и контролируют ее функционирование через взаимодействие с лимфоцитами, моноцитами, НК-клетками и дендритными клетками, находящимися в активированном состоянии. При этом согласно исследованиям последних лет Treg клетки активно мигрируют в очаги воспаления и оказывают негативное влияние на клетки-мишени посредством контакт-зависимых (перфорин/гранзим опосредованный киллинг) и контакт-независимых (продукция противовоспалительных цитокинов - TGF-β и IL10) механизмов [5, 6, 8, 11, 14].

Используемые в настоящее время стандартные методы лечения, включающие применение системных и топических препаратов, являются недостаточно эффективными, что послужило основанием для поиска новых направлений системной терапии данного заболевания, целью которых является активация механизмов супрессии активированных клеток.

В течение многих лет в комплексном лечении атопического дерматита используется аллерген-специфическая иммунотерапия - подкожное введение низких доз аллергена в возрастающих концентрациях [15]. Данный способ лечения взят за прототип. Согласно последним исследованиям такое лечение приводит к индукции Т-регуляторных клеток, которые подавляют Тh2-ответ на аллерген и переключают антителопродукцию с IgE на IgG4 [9, 10].

Показано, что в процессе вакцинации антиген-специфическими клетками происходит активация регуляторных Т-клеток 2 типов: антиидиотипических и антиэрготипических. Причем антиэрготипические Т-клетки, в отличие от антиидиотипических, распознают эффекторные Т-клетки независимо от их TCR-принадлежности. В настоящее время в качестве эрготопов рассматриваются такие молекулы, как TCR, CD25, CD122, эпитопы HSP60 [5]. В экспериментальных работах показано, что регуляторные Т-клетки модулируют Th2 иммунный ответ, характерный для аллергических заболеваний, снижая продукцию провоспалительных цитокинов CD4+Тh2-клетками [10, 12].

Однако аллерген-специфическая иммунотерапия требует использования конкретных аллергенов, что не всегда возможно, т.к. не во всех случаях удается установить связь конкретного аллергена с развитием заболевания, кроме того, большинство пациентов имеют поливалентную сенсибилизацию.

Целью изобретения является создание способа лечения атопического дерматита, использующего воздействие на измененный иммунный ответ, характерный для пациентов с атопическим дерматитом, через индукцию антиэрготипического ответа.

Это достигается благодаря применению Т-лимфоцитов, которые выделяют из периферической крови больного и затем активируют с помощью антиСD3антител и ИЛ-2. Активированные аутологичные Т-лимфоциты вводят больному подкожно 1 раз в неделю в течение 4-х недель и далее 1 раз в месяц в течение 1 года на фоне базисной терапии антигистаминными препаратами и топическими глюкокортикостероидами.

Иммунотерапия атопического дерматита с использованием аутологичных активированных Т-лимфоцитов имеет преимущества по сравнению с прототипом, поскольку базируется на использовании собственных клеток пациента, поэтому предложенный способ является более иммуногенным и значительно менее аллергенным. Способ позволяет достичь существенного клинического эффекта и даже полного выздоровления пациентов.

Способ осуществляется следующим образом.

К 200 мл периферической крови, стабилизированной с гепарином, добавляют 10-20 мл 10% желатина (Промикс) и инкубируют 45 минут в термостате при 37°. Полученную в результате лейковзвесь собирают, разбавляют забуференным физиологическим раствором с ЭДТА (ЗФР-ЭДТА), содержащим на 100 мл раствора 2 мг тиенама (Мерк), 125 мкл гентамицина (KRKA) и 500 мкл FBS (Fetal Bovine Serum, HyClone); затем центрифугируют в градиенте фиколл-верографин (Sigma, Швеция) в течение 35 минут при 1,2 тыс. об/мин в центрифуге ОС-6. Образовавшееся кольцо мононуклеарных клеток собирают и отмывают трижды ЗФР-ЭДТА при 1,2 тыс. об/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок ресуспендируют в 10 мл полной среды RPMI 1640 (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) (с добавлением 2 мг тиенама, 125 мкл гентамицина и 30 мг L-глутамина (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) на 100 ml среды) и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Все полученные МНК садят в культуральные матрасы (NUNC, Италия) из расчета 2 млн клеток на 1 мл полной среды с 10% FBS и активаторами (1 мкл/мл антиСD3антител (НПЦ МедБиоСпектр) и 50 ед/мл IL-2 (ООО Биотех)). На 5-6 день (по состоянию культуры) заменяют 70% среды на новую с таким же составом. На 10-14 день клетки собирают, осаждают при 1,2 тыс. об/мин в течение 10 минут, ресуспендируют в 10 мл FBS и подсчитывают количество клеток. Добавляют FBS и DMSO (Riedel-deHaën, Германия) с таким расчетом, чтобы в результате получить 30 млн клеток на 1 мл FBS с 10% DMSO и фасуют в криопробирки по 1 мл. Хранят клетки в морозильной камере при -80°С.

Перед введением к клеткам добавляют 10 мл физиологического раствора и осаждают в течение 5 минут при 1 тыс. об/мин в медицинской лабораторной центрифуге. Осадок ресуспендируют в 2 мл физиологического раствора и в таком виде вводят пациентам.

Данный способ лечения был проверен в клинических условиях. Клинические испытания проводились на базе отделения аллергологии клиники иммунопатологии ГУ НИИ КИ СО РАМН, г.Новосибирск. Его применяли для лечения пациентов с атопическим дерматитом.

В исследование были включены 18 больных (7 мужчин и 11 женщин). Возраст пациентов составлял от 17 до 49 лет (средний возраст 24,5±1,8 лет). Пациенты получали базисную терапию антигистаминными препаратами и топическими глюкокортикостероидами.

Критерии включения

1. Мужчины и женщины в возрасте от 18 до 65 лет включительно.

2. Диагноз АД верифицирован в соответствии с МКБ-10 не менее чем за 6 месяцев до включения пациента в исследование.

3. Наличие умеренной активности АД.

4. Попутная доза базисных препаратов должна быть стабильной в течение предшествующих скринингу 1-3-х месяцев.

5. Мужчины и женщины детородного возраста не должны планировать деторождение на период исследования, а при включении в исследование должны использовать адекватные меры контрацепции (кроме приема оральных контрацептивов).

6. Пациенты должны быть в достаточной степени мобильными, чтобы следовать графику визитов.

7. Больные должны быть в состоянии дать информированное согласие, и это согласие должно быть получено до начала какой-либо скрининговой процедуры.

Критерии исключения

1. Одновременное участие в другом клиническом исследовании.

2. Несоответствие критериям включения.

3. Наличие серьезных инфекций типа гепатита, пневмонии, пиелонефрита, герпеса зостер в предшествующие скринингу 3 месяца.

4. Тяжелое соматическое состояние, обусловленное прогрессирующими заболеваниями печени, сердечно-сосудистой системы, почек, органов дыхания, системы крови, а также эндокринного или церебрального происхождения.

5. Любое известное злокачественное заболевание или наличие в анамнезе рака в течение предшествующих 5 лет.

6. Наличие активного алкоголизма или признаков алкогольного поражения печени.

7. Наличие острого инфекционного заболевания.

8. Любая вакцинация в предшествующие 3 месяца.

Проведенные методы исследования для выявления клинической эффективности применения активированных аутологичных Т-клеток включали:

клинические характеристики по шкале SCORAD:

A) распространенность процесса (%);

B) интенсивность проявлений, в том числе наличие эритемы, отек/образование папулы, мокнутие/корки, экскориации, лихенификация, сухость (выраженное в баллах от 0 до 3);

C) субъективные симптомы: зуд и нарушение сна (выраженное в баллах от 0 до 10);

клинические характеристики по шкале DCSS:

эритема, отек, мокнутие, лихенификация, папулы, сухость, шелушение, трещины, зуд (выраженное в баллах от 0 до 3);

оценка качества жизни DLQI.

Степень тяжести также оценивалась по количеству рецидивов в год, средней продолжительности рецидивов, распространенности поражения кожи [3, 7].

Отслеживалось возникновение местных и общих реакций на введение клеток.

Статистический анализ проводился с использование метода сравнения двух зависимых величин Вискоксона.

Вмешательство. Обследуемые получали лечение активированными аутологичными Т-лимфоцитами в сочетании со стандартной терапией. Стандартная терапия: антигистаминные препараты (Зиртек 0,01 по 1 т. 1 раз в день), топические глюкокортикостероиды (крем Элоком).

Активированные аутологичные Т-лимфоциты вводили подкожно с кратностью 1 раз в неделю №4, далее 1 раз в месяц, всего 10 инъекций.

Оценка состояния пациентов проводилась исходно, на 5 и 10 введении активированных аутологичных Т-клеток.

У 4 пациентов отмечены местные побочные реакции в виде гиперемии, припухлости, болезненности в месте инъекции, у 7 больных - общие в виде обострения атопического дерматита, повышения температуры тела до субфебрильных цифр (1 пациент).

К концу лечения (10 введение) клинического выздоровления достигли 3 пациента (16,7%), значительного улучшения (уменьшение симптомов на 85-100%) - 5 (27,8%), улучшения (уменьшение симптомов на 50-85%) - 8 (44,4%), незначительного улучшения (уменьшение симптомов менее чем на 50%) - 1 (5,55%), без изменения - 1 пациент (5,55%). Таким образом, хороший эффект от терапии (уменьшение симптомов более чем на 50%) наблюдался у 16 человек (88,9%), не отмечено выраженного эффекта у 2 пациентов (11,1%). Среднее значение индексов SCORAD и DCSS исходно составляло 52,2±4,8 и 11,9±1,3 балла соответственно, обе группы были идентичны. К 5 инъекции у пациентов с хорошим ответом на лечение индексы составили - 22,8±4,5 и 6,7±1,1, без эффекта - 83±13 и 19±4, к 10 инъекции у пациентов с хорошим ответом - 10,2±1,9 и 3,1±0,5, без эффекта - 60,5±35,5 и 14,5±8,5 баллов соответственно.

Индекс качества жизни DLQI исходно составлял 10,8±1,7 баллов, к 5 инъекции в группе пациентов с хорошим эффектом - 7,1±1,9, без эффекта - 29±1, к концу лечения у пациентов с хорошим эффектом - 2,9±0,8, без эффекта - 21,5±8,5 баллов.

Ниже приведены результаты, поясняющие данный способ лечения атопического дерматита.

Пример 1. Больная В., 20 л. Диагноз: атопический дерматит, распространенная форма, средней степени тяжести. Площадь поражения кожных покровов носила распространенный характер: на коже передней поверхности грудной клетки, рук, ног высыпания эритематозно-папулезного характера, экскориации, геморрагические корочки. При поступлении предъявляла жалобы на кожные высыпания, сопровождающиеся интенсивным кожным зудом, усиливающимся в ночное время, сухость кожи, шелушение, нарушение сна. С 3 лет страдает атопическим дерматитом. Течение заболевания круглогодичное с обострением в осенне-зимний период. Обострения провоцируются психоэмоциональными стрессами, употреблением в пищу шоколада, цитрусовых. Степень выраженности клинических проявлений по шкалам SCORAD и DCSS исходно составляла 45 и 12 соответственно, индекс качества жизни DLQI был 5. Больной в комплексе со стандартной терапией антигистаминными препаратами (Зиртек 0,01 по 1 т. в день) и топическими глюкокортикостероидами (крем Элоком) проводилась терапия активированными аутологичными Т-лимфоцитами по схеме. После 2 инъекции отмечались побочные реакции в виде болезненности мышц в месте инъекции, повышение температуры тела до 37,6°С в течение суток. После 3 и 4 инъекции также отмечалась некоторая болезненность в месте введения клеток, но менее выраженная. После 4 инъекции отмечено обострение заболевания в виде появления небольшого количества новых высыпаний в области локтевых сгибов, усиления зуда в ночное время. Начиная с 6 инъекции отмечалась тенденция к снижению выраженности клинических проявлений в виде уменьшения количества высыпаний, уменьшения гиперемии кожи, снижения интенсивности зуда, улучшения сна. После курса терапии отмечалось достоверное улучшение состояния больной: распространенность кожных высыпаний значительно уменьшилась, высыпания не рецидивировали, зуд кожи не беспокоит, сон нормализовался. Степень выраженности клинических проявлений к 5 введению активированных аутологичных Т-лимфоцитов по шкалам SCORAD и DCSS составила 54 и 15 соответственно, индекс качества жизни DLQI стал 18. Степень выраженности клинических проявлений после проведения курса лечения по шкалам SCORAD и DCSS составила 11 и 3 соответственно, индекс качества жизни DLQI стал 4. Таким образом, у пациентки отмечено значительное улучшение состояния.

Пример 2. Больная М., 19 л. Диагноз: атопический дерматит, распространенная форма, средней степени тяжести. Площадь поражения кожных покровов носила распространенный характер: на коже туловища, локтевых, коленных сгибов эритематозно-сквамозные высыпания, в области лица единичные папулы, гиперемия, отечность, шелушение век, на коже волосистой части головы - серозные корки. При поступлении предъявляла жалобы на высыпания, сопровождающиеся интенсивным кожным зудом, усиливающимся в ночное время, отек и зуд век, сухость кожи, шелушение, нарушение сна. Течение заболевание круглогодичное без четкой сезонности. Обострения провоцируются психоэмоциональными стрессами. Степень выраженности клинических проявлений по шкалам SCORAD и DCSS исходно составляла 43 и 11 соответственно, индекс качества жизни DLQI был 22. Больной в комплексе со стандартной терапией антигистаминными препаратами (Зиртек 0,01 по 1 т. в день) и топическими глюкокортикостероидами (крем Элоком) проводилась терапия активированными аутологичными Т-лимфоцитами по схеме. После 1 инъекции отмечались побочные реакции в виде гиперемии, припухлости, болезненности в месте инъекции. К 5 инъекции отмечалось обострение заболевания в виде появления новых высыпаний в области лица, туловища, усиления сухости кожи. Начиная с 6 инъекции отмечалась четкая тенденция к снижению выраженности клинических проявлений в виде уменьшения количества высыпаний, уменьшения гиперемии, сухости кожи, снижения интенсивности зуда, улучшения сна, высыпания не рецидивировали. К 9 инъекции кожа полностью очистилась, зуд не беспокоил, сон нормализовался. После курса терапии отмечалось стойкое клиническое выздоровление: кожа чистая, зуда нет, сон нормализовался. Степень выраженности клинических проявлений к 5 введению активированных аутологичных Т-лимфоцитов по шкалам SCORAD и DCSS составила 50 и 13 соответственно, индекс качества жизни DLQI стал 24. Степень выраженности клинических проявлений после проведения курса лечения по шкалам SCORAD и DCSS составила 0 и 0 соответственно, индекс качества жизни DLQI стал 0. Таким образом, у пациентки отмечается полное клиническое выздоровление.

Следовательно, включение в стандартное лечение пациентов с атопическим дерматитом введения активированных аутологичных Т-лимфоцитов характеризуется клинической эффективностью в 88,9% случаев, причем степень выраженности клинических проявлений заболевания уменьшается в среднем на 80,5%/74% по индексам SCORAD/DCSS соответственно, качество жизни улучшается на 73,2%, что позволяет широко применять данный способ в клинической практике для лечения пациентов с атопическим дерматитом.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, аллергологии, дерматологии, и касается лечения атопического дерматита. Для этого используют аутологичные Т-лимфоциты, активированные с помощью антиCD3антител и интерлейкина-2. Активированные Т-лимфоциты вводят подкожно 1 раз в неделю в течение 4-х недель и далее 1 раз в месяц в течение одного года. Одновременно проводят базисную терапию антигистаминными препаратами и топическими глюкокортикостероидами. Изобретение позволяет снизить клинические проявления заболевания за счет воздействия на измененный иммунный ответ через индукцию антиэрготипического ответа.

Способ лечения атопического дерматита с применением вакцинотерапии, отличающийся тем, что используют аутологичные Т-лимфоциты, выделенные из периферической крови больного и активированные с помощью анти CD3 антител и интерлейкина-2 (ИЛ-2), которые вводят больному подкожно 1 раз в неделю в течение 4 недель и далее 1 раз в месяц в течение 1 года на фоне базисной терапии антигистаминными препаратами и топическими глюкокортикостероидами.