Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] В данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.С. § 119(е) предварительной заявки на патент США 61/387,873 поданной 29 сентября 2010, включенной сюда во всей полноте путем ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Данное изобретение касается композиций и способов, относящихся к иммунологии и медицине. В частности, данное изобретение касается диагностических и терапевтических средств для диагностирования и лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, диабета.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Вакцинация антигенами может применяться для индукции Т-клеточной толерантности при аутоиммунных процессах. Введение белковых или пептидных аутоантигенов в растворе может ослабить начало и/или прогрессирование аутоиммунных процессов в экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний (Wraith et al., 1989; Metzler and Wraith, 1993; Liu and Wraith, 1995; Anderton and Wraith, 1998; Karin et al., 1994). Однако, ограниченные клинические испытания у людей с применением аналогичных подходов практически все оказались неудачными (Weiner, 1993; Trentham et al., 1993; McKown et al., 1999; Pozzilli et al., 2000; Group, D.P.T.-T.D.S. 2002; Kappos et al., 2000; Bielekova et al., 2000). Это позволяет предположить, что принципы, на которых основан выбор лечения и их условия, являются нечеткими и, в результате, являются не подходящими для человека.
[0004] Спонтанные органоспецифичные аутоиммунные нарушения возникают в результате сложных ответных реакций на многочисленные эпитопы большого числа антигенов, появляющихся спонтанно в случайной и зачастую непредсказуемой последовательности. Ситуация усугубляется тем, что клоны лимфоцитов, распознающие идентичные эпитопы, захватывают комплексы антиген/молекула главного комплекса гистосовместимости (МНС) с авидностью, варьирующей в широких пределах, прочность этих связей коррелирует с патогенным потенциалом (Amrani et al., 2000; Santamaria, 2001; Liblau et al., 2002). Следовательно, конечный результат любого метода иммунизации для предупреждения аутоиммунных нарушений может зависеть от выбора аутоантигена(ов), дозировки, периодичности лечения и способа и формы введения.
[0005] Диабет 1 типа (СД1) у мышей связан с аутореактивными CD8+ Т-клетками. У мышей NOD (от англ. non-obese diabetic) развивается форма СД1, близко напоминающая СД1 человека, вследствие селективного разрушения β клеток поджелудочной железы Т-клетками, распознающими растущий перечень аутоангигенов (Lieberman and DiLorenzo, 2003). Несмотря на то, что для возникновения СД1 явно необходимо участие CD4+ клеток, существуют убедительные доказательства, что СД1 является зависимым от CD8+ Т-клеток (Santamaria, 2001; Liblau et al., 2002). Было обнаружено, что существенная доля ассоциированных с панкреатическими островками CD8+ клеток мышей NOD имеют CDR3-инвариантные Vα17-Jα42+ TCR, обозначаемые «8.3-TCR-подобные» (Santamaria et al., 1995; Verdaguer et al., 1996; Verdaguer et al., 1997; DiLorenzo et al., 1998). Эти клетки, распознающие мимеотоп NRP-A7 (определенный с применением комбинаторных пептидных библиотек) в контексте Kd молекулы МНС (Anderson et al., 1999), уже являются существенным компонентом самых ранних CD8+ инфильтратов панкреатических островков мышей NOD (DiLorenzo et al., 1998; Anderson et al., 1999; Amrani et al., 2001), являются диабетогенными (Verdaguer et al., 1996; Verdaguer et al., 1997) и направленно воздействуют на пептид островково-специфичного гомологичного каталитической субъединице глюкозо-6-фосфатазы белка (IGRP) (Lieberman et al., 2003), белка с неизвестной функцией (Arden et al., 1999; Martin et al., 2001). CD8+ клетки, распознающие этот пептид (IGRP206-214, схожий с NRP-A7), содержатся в кровотоке в необычайно высокой концентрации (>1/200 CD8+ клеток) (Lieberman et al., 2003; Trudeau et al., 2003). Следует отметить, что прогрессирование инсулита в диабет у мышей NOD неизменно сопровождается циклическим увеличением пула циркулирующих способных реагировать с IGRP206-214 CD8+ клеток (Trudeau et al., 2003) и созреванием авидности их ассоциированных с островками аналогов (Amrani et al., 2000). Недавно было показано, что ассоциированные с островками CD8+ клетки мышей NOD распознают множество эпитопов IGRP, что указывает на то, что IGRP представляет собой преобладающий аутоантиген для CD8+ клеток, по меньшей мере, при СД1 мышей (Han et al., 2005). Ассоциированные с островками CD8+ клетки мышей NOD, в частности те, что обнаруживаются в ранней стадии развития заболевания, также распознают эпитоп инсулина (Ins B15-23 (Wong et al., 1999)).
[0006] Ассоциативные исследования позволили предположить, что некоторые аллели HLA класса I (т.е. HLA-A*0201) обусловливают предрасположенность к СД1 человека (Fennessy et al., 1994; Honeyman et al., 1995; Tait et al., 1995; Nejentsev et al., 1997; Nakanishi et al., 1999; Robles et al., 2002). Патологические исследования показали, что очаги поражения при инсулите у впервые диагностированных пациентов состоят преимущественно из (рестриктированных по HLA класса I) CD8+ Т-клеток (Bottazzo et al., 1985; Atkinson and Maclaren, 1990; Castano and Eisenbarth, 1990; Hanninen et al., 1992; Itoh et al., 1993; Somoza et al., 1994; Atkinson and Maclaren, 1994; Moriwaki et al., 1999; Imagawa et al., 2001), которые также представляют собой преобладающую клеточную популяцию у пациентов, которым была проведена изотрансплантация (от однояйцевых близнецов) или аллотрансплантация (от родственных доноров) поджелудочной железы (Sibley et al., 1985; Santamaria etal., 1992).
[0007] Инсулин представляет собой ключевую мишень для антительного и CD4+ ответа при СД1 как у мыши, так и у человека (Wong et al., 1999; Palmer et al., 1983; Chentoufi and Polychronakos, 2002; Toma et al., 2005; Nakayama et al., 2005; Kent et al., 2005). HLA-A*0201 презентируют эпитоп hInsB10-18 В цепи инсулина человека аутореактивным CD8+ клеткам, как у реципиентов, которым пересаживают панкреатические островки (Pinkse et al., 2005), так и в ходе спонтанного развития заболевания (Toma et al., 2005). Кроме того, было идентифицировано четыре дополнительных пептида мышиного пре-проинсулина 1 или 2, которые распознаются ассоциированными с островками CD8+ Т-клетками HLA-A*0201-трансгенных мышей в контексте HLA-A*0201.
[0008] IGRP, кодируемый геном (расположенным на хромосоме 2q28-32 (Martin et al., 2001)), перекрывающимся с локусом предрасположенности к СД1, IDDM7 (2q31) (Pociot and McDermott, 2002; Owerbach, 2000), был также недавно идентифицирован в качестве бета-клеточного аутоантигена, имеющего потенциальное значение при СД1 человека (Takaki et al., 2006). Два эпитопа IGRP человека (hIGRP228-236 и hIGRP265-273), связывающих HLA-A*0201, распознаются ассоциированными с островками CD8+ клетками мышей NOD, не имеющих МНС I класса и экспрессирующих HLA-A*0201 трансген (Takaki et al., 2006). Следует отметить, что ассоциированные с островками CD8+ Т-клетки этих «гуманизированных» HLA-A*0201-трансгенных мышей были цитотоксическими по отношению к HLA-A*0201-положительным панкреатическим островкам человека (Takaki et al., 2006).
[0009] СД1 у мышей NOD можно предотвратить путем увеличения числа аутореактивных CD8+ Т-клеток с низкой авидностью. Введение растворимых пептидов (без адъюванта) представляет собой эффективный способ индукции антиген-специфичной Т-клеточной толерантности (Aichele et al., 1994; Toes et al., 1996). Ранее было показано, что терапия мышей NOD с преддиабетом растворимым NRP-A7 ослабляла созревание авидности субпопуляции IGRP206-214-реактивных CD8+ клеток путем селективной элиминации клонотипов, экспрессирующих TCRs с наиболее высокой аффинностью к пептиду/МНС (Amrani et al., 2000). Эти наблюдения позволили предположить, что анти-СД1 активность NRP-A7 также опосредована тем, что он способствует заселению «ниши высокоавидных клонотипов» (опустошенной терапией NRP-A7) клонами с ‘низкой авидностью’ (и потенциально антидиабетогенными). Для проверки этой гипотезы были идентифицированы измененные пептидные лиганды (APL) обладающие частичной, полной или наивысшей агонистической активностью в отношении IGRP206-214-реактивных CD8+ Т-клеток и проведено сравнение их анти-СД1 активности в большом диапазоне доз.
[0010] Хроническое лечение умеренными дозами APL (NRP-A7) средней аффинности или высокими дозами низкоаффинных APL (NRP-I4) обеспечивало защиту от СД1. Это было связано с локальным накоплением низкоавидных IGRP206-214-реактивных CD8+ клеток за счет элиминации их высокоавидных аналогов. Неожиданным оказалось то, что хроническое лечение высокими дозами высокоаффинных APL (NRP-V7) или естественного лиганда (IGRP206-214) обеспечивало только незначительную защиту. Удивительно, что островки этих мышей практически не содержали IGRP206-214-реактивных CD8+ клеток, но имели увеличенную популяцию CD8+ клеток, распознающих другие эпитопы IGRP. Это позволило авторам изобретения сделать вывод, что пептидная терапия при аутоиммунных нарушениях может быть наиболее эффективной, когда она способствует заселению лимфоцитарной ниши органа-мишени непатогенными клонами с низкой авидностью (Han et al., 2005), это предположение было подтверждено путем математического моделирования (Maree et al., 2006). К сожалению, такой результат наблюдался только в узком диапазоне доз и авидности APL (в отношении TCR-мишеней), что предполагало, что пептидная терапия плохо подходит для предупреждения или лечения СД1.
[0011] Таким образом, существует потребность в дополнительных композициях и связанных с ними способах лечения диабета, а также других аутоиммунных нарушений.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] Было бы тяжело лечить пациента пептидами, поскольку, как в случае IGRP, это бы требовало несколько миллиграммов пептида на каждую дозу. Здесь предложена доставка комплексов антиген/МНС, например, комплексов пептид/МНС/наносфера (без ко-стимулирующих молекул), на биологически совместимых, биоабсорбируемых наносферах. Предполагается, что эти комплексы будут более толерогенными по сравнению с пептидами в отдельности или с комплексами небиоабсорбируемых наносфер.
[0013] Аспекты и воплощения этой заявки включают разработку новой концепции терапии аутоиммунных процессов. Обычно вакцины применяли для увеличения числа Т-клеток, способных обеспечивать защиту от патогенов или онкологического заболевания, или для элиминации Т-клеток, способных вызывать аутоиммунные процессы. Аспекты данного изобретения относятся к новому типу «вакцины», которая избирательно индуцирует увеличение числа аутореактивных CD8+ клеток с противоаутоиммунными свойствами и, в то же время, элиминацию аутореактивных CD8+ клеток с патогенными (аутоиммунными) свойствами, и то, и другое обусловлено антигенной специфичностью Т клеток. Противоаутоиммунные аутореактивные CD8+ Т-клетки (анти-патогенные CD8+ клетки) подавляют ответ аутореактивных Т-клеток тканеспецифичным (после спонтанного рекрутирования в ткань-мишень), но антиген-неспецифичным образом (например, за счет локального подавления ответов других аутореактивных Т-клеток). В результате, лечение вакцинами такого типа может предотвращать возникновение и/или облегчать СД1, а также восстанавливать нормогликемию или снижать уровень глюкозы у мышей NOD с гипергликемией без развития генерализованной иммуносупрессии. Данная стратегия может использоваться при лечении других аутоиммунных заболеваний, опосредуемых Т-клетками, и может быть способна предупреждать повторное проявление СД1 после трансплантации панкреатических островков.
[0014] Некоторые воплощения данного изобретения относятся к способам селективного снижения или увеличения числа Т-клеток, в зависимости от антигенной специфичности Т-клеток. Таким образом, предполагают, что данное изобретение может применяться для снижения числа или удаления Т-клеток, распознающих аутоантигены, таких как Т-клеток, специфичных в отношении панкреатических клеток. Так, данное изобретение может применяться для предупреждения, лечения или облегчения аутоиммунных заболеваний, таких как ИЗСД. Кроме того, данное изобретение может применяться для увеличения числа необходимых Т-клеток, таких как Т-клетки, распознающие опухолевые антигены, для предупреждения, лечения и/или облегчения заболеваний, с которыми борются эти Т-клетки.
[0015] Воплощения изобретения касаются способов диагностики, предупреждения или лечения аутоиммунного нарушения, включающих введение комплекса антиген/МНС/биологически совместимая биоабсорбируемая наносфера индивиду в количестве, достаточном для увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток. Антиген включает любую или некоторые из молекул пептида, нуклеиновой кислоты, углевода, липида или другую молекулу или соединение, способное модулировать активность Т клеток или популяции Т клеток в контексте МНС или молекулы, подобной МНС, связанной с субстратом, но не ограничивается ими. Биоабсорбируемость комплексов с наносферами является критически важной для изобретения, поскольку препятствует долговременному накоплению наносфер in vivo и какую-либо связанную с этим токсичность.
[0016] Воплощения изобретения включают толерогенные наносферы, включая биологически совместимые биоабсорбируемые наносферы, связанные с комплексом антиген-МНС. Комплекс антиген-МНС может быть связан с такими наносферами напрямую или посредством линкера. Предпочтительные наносферы могут также включать биологически совместимое биоабсорбируемое металлическое ядро и биодеградируемое биоабсорбируемое покрытие. Наносфера может также содержать покрытие или оболочку, состоящие из других молекул, которые могут быть легко присоединены к комплексу антиген-МНС (например, стрептавидин или авидин или другие известные молекулы, применяемые для присоединения компонентов к наносферам). В некоторых аспектах биологически совместимые биодеградируемые наносферы содержат материал, выбранный из группы, состоящей, например, из оксида железа III, трикальций фосфата, хрома, галлия, а также биологически совместимых биоабсорбируемых полимеров, таких как PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (все из них можно приобрести у Zeus, 3737 Industrial Blvd, Orangeburg, SC, 29118 USA под торговым названием Absorv™), гиалуроновой кислоты, альгината, полигидроксиалканоатов и т.п. В следующих аспектах биологически совместимая биоабсорбируемая наносфера представляет собой металлическую или намагничиваемую или суперпарамагнитную наносферу. Биологически совместимая биоабсорбируемая наносфера может также содержать биодеградируемое покрытие, образованное из декстранов; поли(этиленгликоля); поли(этиленоксида); маннитола; поли(гидроксалканоата) из класса PHB-PHV и других модифицированных полисахаридов, таких как крахмал, целлюлоза и хитозан.
[0017] Некоторые аспекты изобретения включают способы и композиции, касающиеся антигенных композиций, включающих сегменты, фрагменты или эпитопы полипептидов, пептидов нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других молекул, которые провоцируют или индуцируют антигенный или иммунный ответ, как правило, обозначаемых антигенами. В конкретных аспектах антиген является производным, миметиком или аутореактивным антигеном и/или их комплексом.
[0018] Пептиды и антигены включают hInsB10-18 (HLVEALYLV (SEQ ID NO:1)), hIGRP228-236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2)), hIGRP265-273 (VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3)), IGRP206-214 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)), NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)), NRP-14 (KYNIANVFL (SEQ ID NO:7)), NRP-V7 (KYNKANVFL (SEQ ID NO:8)), YAI/Db (FQDENYLYL (SEQ ID NO:9)) и/или INS B15-23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO:10)), а также пептиды и белки, описанные в публикации U.S. 20050202032, включенной сюда во всей полноте путем ссылки, но не ограничиваются ими.
[0019] В некоторых аспектах пептидный антиген для лечения СД1 представляет собой GAD65114-123, VMNILLQYW (SEQ ID NO:14); GAD65536-545, RMMEYGTTMV (SEQ ID NO:15); GFAP143-151, NLAQTDLATV (SEQ ID NO:16); GFAP214-222, QLARQQVHV (SEQ ID NO:17); IA-2172-180, SLSPLQAEL (SEQ ID NO:18); IA-2482-490, SLAAGVKLL (SEQ ID NO:19); IA-2805-813, VIVMLTPLV (SEQ ID NO:20); ppIAPP5-13, KLQVFLIVL (SEQ ID NO:21); ppIAPP9-17, FLIVLSVAL (SEQ ID NO:22); IGRP152-160, FLWSVFMLI (SEQ ID NO:23); IGRP211-219, NLFLFLFAV (SEQ ID NO:24); IGRP215-223, FLFAVGFYL (SEQ ID NO:25); IGRP222-230, YLLLRVLNI (SEQ ID NO:26); IGRP228-236, LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2); IGRP265-273, VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3); IGRP293-301, RLLCALTSL (SEQ ID NO:27); про-инсулинL2-10, ALWMRLLPL (SEQ ID NO:28); про-инсулинL3-11, LWMRLLPLL (SEQ ID NO:29); про-инсулинL6-14, RLLPLLALL (SEQ ID NO:30); про-инсулинB5-14, HLCGSHLVEA (SEQ ID NO:31); про-инсулинB10-18, HLVEALYLV (SEQ ID NO:1); про-инсулинB14-22, ALYLVCGER (SEQ ID NO:32); про-инсулинB15-24, LYLVCGERGF (SEQ ID NO:33); про-инсулинB17-25, LVCGERGFF (SEQ ID NO:34); про-инсулинB18-27, VCGERGFFYT (SEQ ID NO:35); про-инсулинB20-27, GERGFFYT (SEQ ID NO:36); про-инсулинB21-29, ERGFFYTPK (SEQ ID NO:37); про-инсулинB25-C1, FYTPKTRRE (SEQ ID NO:38); про-инсулинB27-C5, TPKTRREAEDL (SEQ ID NO:39); про-инсулинC20-28, SLQPLALEG (SEQ ID NO:40); про-инсулинC25-33, ALEGSLQKR (SEQ ID NO:41); про-инсулинC29-А5, SLQKRGIVEQ (SEQ ID NO:42); про-инсулинА1-10, GIVEQCCTSI (SEQ ID NO:43); про-инсулинА2-10, IVEQCCTSI (SEQ ID NO:44); про-инсулинА12-20, SLYQLENYC (SEQ ID NO:45) или их комбинацию.
[0020] В следующих аспектах могут применяться пептидные антигены, связанные с рассеянным склерозом (PC), включающие: MAG287-295, SLLLELEEV (SEQ ID NO:46); MAG509-517, LMWAKIGPV (SEQ ID NO:47); MAG556-564, VLFSSDFRI (SEQ ID NO:48); МВРI110-118, SLSRFSWGA (SEQ ID NO:49); MOG114-122, KVEDPFYWV (SEQ ID NO:50); MOG166-175, RTFDPHFLRV (SEQ ID NO:51); MOG172-180, FLRVPCWKI (SEQ ID NO:52); MOG179-188, KITLFVIVPV (SEQ ID NO:53); MOG188-196, VLGPLVALI (SEQ ID NO:54); MOG181-189, TLFVIVPVL (SEQ ID NO:55); MOG205-214, RLAGQFLEEL (SEQ ID NO:56); PLP80-88, FLYGALLLA (SEQ ID NO:57) или их комбинацию.
[0021] В некоторых аспектах комплекс антиген-МНС может быть сшит (конъюгирован) с описанными здесь наносферами. Один из способов конъюгирования наносфер с комплексом антиген-МНС, не являющийся исчерпывающим, включает (а) реакцию комплекса антиген-МНС с конъюгирующим агентом, приводящую к формированию комплекса антиген-МНС-; и (б) реакцию биологически совместимых биодеградируемых наносфер с комплексом, образованным на этапе (а). В одном воплощении способ включает концентрирование комплекса, образованного на этапе (а) перед осуществлением этапа (б). В другом воплощении конъюгирующий агент содержит гетеробифункциональный агент.В следующем воплощении конъюгирующий агент содержит DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол), сульфо-LC-SMPT (сульфосукцинимидил-6-(α-метил-α-(2-пиридилтио)толуамидо)гексаноат, реагент Трота (2-иминотиолан-HCl) или любую их комбинацию. См. Публикацию U.S. 20070059775; патенты США 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; 4,589,071; 7,186,814 и 5543391 заявку на европейский патент 188,256, в которых обсуждается конъюгирование комплексов с микрочастицами или наночастицами.
[0022] Аутоиммунное нарушение может включать сахарный диабет, реакцию отторжения трансплантата, рассеянный склероз, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, диффузно-токсический зоб, гипотиреоидизм, полимиозит, пемфигоид, болезнь Крона, колит, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддиссона, аутоиммунные заболевания кожи, увеит, пернициозную анемию, гипопаратиреоидизм, и/или ревматоидный артрит, но не ограничивается ими. В некоторых воплощениях пептидный компонент комплекса антиген/МНС/наносфера получают или создают на основе аутоантигена или эпитопа аутоантигена или его миметика, играющего активную роль в аутоиммунном ответе, который надлежит исследовать, снижать интенсивность, или ослаблять воздействием терапии. В конкретных воплощениях аутоантиген представляет собой пептид, углевод или липид. В некоторых аспектах аутоантиген представляет собой фрагмент, эпитоп или пептид белка, углевод или липид, экспрессируемый некоторыми клетками индивида, такими как бета-клетки поджелудочной железы, и включает фрагмент IGRP, инсулина, GAD или белка IA-2, но не ограничивается ими. При различных аутоиммунных состояниях были идентифицированы разнообразные протеины или эпитопы. Аутоантиген может представлять собой пептид, углевод, липид или т.п., полученные из второго эндокринного или нейрокринного компонента, например, околоостровковых клеток Шванна или им подобных.
[0023] В следующих аспектах данного изобретения компонент МНС комплекса антиген/МНС/наносфера представляет собой классический или неклассический полипептидный компонент МНС класса I или МНС класса II. Компонент МНС класса I может содержать любую или некоторые из молекул HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, в частности, любую или некоторые из таких молекул как молекула HLA-A*0201 МНС класса I. Неклассический компонент МНС класса I может содержать CD1-подобные молекулы. Компонент МНС класса II может содержать любую или некоторые из молекул HLA-DR, HLA-DQ или HLA-DP. В некоторых аспектах комплекс антиген/МНС ковалентно или нековалентно связан или присоединен к субстрату (комплексу антиген/МНС/наносфера). Как правило, субстрат представляет собой биологически совместимую абсорбируемую наносферу. В одном воплощении наносфера содержит металл, например, железо или оксид железа. В другом воплощении наносфера содержит биосовместимый биоабсорбируемый полимер. В любом случае наносфера претерпевает биоабсорбцию in vivo, так что накопление наночастиц in vivo ограниченно. Пептиды по изобретению могут быть химически связаны с субстратом и в частности, связаны посредством химического или пептидного линкера. Молекулы CD1 являются примером неклассических молекул МНС.Неклассические молекулы МНС характеризуются как не-полиморфные, консервативные у различных видов и имеющие узкие глубокие гидрофобные лиганд-связывающие карманы. Эти связывающие карманы способны презентировать гликолипиды и фосфолипиды естественным киллерным Т-клеткам (NKT-клеткам). NKT-клетки представляют собой уникальную популяцию лимфоцитов, ко-экспрессирующую маркеры NK-клеток и полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR). Они задействованы в регуляции иммунных ответов, связанных с широким спектром заболеваний.
[0024] В некоторых воплощениях Т клетки, число которых было увеличено под воздействием терапии, были пре-активированы в ходе патологического процесса и обладают фенотипом клеток памяти. В одном аспекте Т клетки происходят от аутореактивных предшественников, распознающих эпитоп-мишень с низкой авидностью. Авидность может быть определена при помощи теста связывания тетрамеров или аналогичным способом. В следующем аспекте комплекс антиген/МНС/наносфера вводят до, после или и до, и после появления клинических симптомов аутоиммунного заболевания, представляющего интерес. В еще одном аспекте способ может содержать этап, включающий оценку биологических параметров аутоиммунного состояния, таких как уровень глюкозы крови субъекта перед и/или после лечения. Способы по изобретению могут также включать оценку аутоиммунного статуса субъекта, включая оценку любого аутореактивного иммунного ответа. В некоторых аспектах Т клетка представляет собой CD4+ или CD8+ Т клетку или NK Т (NKT) клетку.
[0025] Следующие воплощения изобретения включают способы увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток, включая введение комплекса антиген/МНС/наносфера в количестве, достаточном для стимуляции увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток. В некоторых аспектах Т клетка представляет собой CD8+ или CD4+ Т клетку или NKT клетку.
[0026] В следующих воплощениях изобретение включает способы защиты клеток субъекта, таких как клеток островков поджелудочной железы, от аутоиммунного ответа, в частности, патогенного аутоиммунного ответа, включающие введение индивиду комплекса антиген/МНС/наносфера в количестве, достаточном для ингибирования деструкции клеток или тканей, содержащих клетки, где антиген или антигенная молекула, из которой он получен, происходит от аутоантигена, связанного с клетками.
[0027] В следующем воплощении изобретение включает способы диагностирования аутоиммунных процессов, включающие оценку вызванного терапией усиления антипатогенных CD8+ или CD4+ Т клеточных ответов как индикатора активного аутоиммунного процесса.
[0028] Воплощения изобретения могут включать способы предупреждения, облегчения или лечения отторжения трансплантированных тканей за счет аллогенного или аутоиммунного ответа при помощи введения субъекту комплекса антиген/МНС функционально связанного с субстратом (т.е. комплекса антиген/МНС/наносфера) в количестве, достаточном для увеличения числа антипатогенных аутореактивных Т клеток или индукции пролиферации антипатогенных клеток, распознающих аллоантигены или аутоантигены, экспрессируемые трансплантируемыми тканями или органами.
[0029] В воплощениях изобретения предложены способы повышения или поддержания количества функциональных клеток заданного типа у млекопитающего, например, островковых клеток, путем предупреждения или ингибирования клеточной гибели или киллинга. В некоторых воплощениях этот способ применяют для лечения аутоиммунного заболевания, когда требуется регенерация эндогенных клеток и/или тканей. Такие аутоиммунные заболевания включают сахарный диабет, рассеянный склероз, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, диффузно-токсический зоб, гипотиреоидизм, полимиозит, пемфигоид, болезнь Крона, колит, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддиссона, аутоиммунные заболевания кожи, увеит, пернициозную анемию, гипопаратиреоидизм, ревматоидный артрит и т.п, но не исчерпываются ими. В одном аспекте изобретения предложен новый двухкомпонентный терапевтический подход для прекращения существующего аутоиммунного процесса в ходе переобучения иммунной системы.
[0030] В некоторых аспектах комплекс антиген/МНС/наносфера не нуждается в совместном введении адъюванта для индукции иммунного ответа, например, антительного ответа. В конкретных воплощениях композиция антиген/МНС/наносфера может применяться вместе с известными технологиями получения поликлональных и моноклональных антител для получения антитела с применением пониженного количества адъювантов или без их применения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0031] Следующие рисунки являются частью данного описания и включены для наглядного представления некоторых аспектов данного изобретения. Ссылки на графические материалы в сочетании с подробным описанием воплощений, представленным в данном документе, дают возможность лучше понять изобретение.
[0032] Фиг.1А-1С. Низкоаффинные аутореактивные 17.6α/8.3β CD8+ Т клетки являются анти-диабетогенными. Фиг.1А, частота возникновения диабета у мышей 17.6α/8.3β-NOD (n=95) в сравнении с мышами 17.4α/8.3β-NOD (n=598). Фиг.1В, индекс инсулита у трансгенных мышей (n=6 для 17.6α/8.3β-NOD, n=3 для 17.4α/8.3β-NOD). Фиг.1C, частота возникновения диабета у мышей NOD (n=56) в сравнении с LCMV-NOD (n=10).
[0033] Фиг.2А-2В. Развитие Т-клеток, несущих 17.6α/8.3β TCR. Фиг.2А, Развитие Т-клеток трансгенных мышей, несущих 17.6α/8.3β TCR или 17.4α/8.3β TCR. На верхних панелях представлены репрезентативные графики, показывающие экспрессию CD4 и CD8 у спленоцитов. На нижней панели сравниваются CD8+ Т клетки, связанные с NRP-V7/Kd тетрамером. Фиг.2В, Развитие Т-клеток, несущих 17.6α/8.3β TCR или 17.4α/8.3β TCR, у трансгенных мышей RAG-2-/-. На верхних панелях представлены репрезентативные графики, показывающие экспрессию CD4 и CD8 у спленоцитов. На нижней панели сравниваются CD8+ Т клетки, связанные с NRP-V7/Kd тетрамером.
[0034] Фиг.3. Частота возникновения диабета у мышей 17.6α/8.3β-NOD.RAG-2-/- (n=13) в сравнении с мышами 17.4α/8.3β-NOD.RAG-2-/- (n=106).
[0035] Фиг.4А-4В. Развитие Т-клеток, несущих 17.6α/8.3β TCR или 17.4α/8.3β TCR, у трансгенных мышей TCRα-7-. Фиг.4А, На верхних панелях представлены репрезентативные графики, показывающие экспрессию CD4 и CD8 у спленоцитов. На нижней панели сравниваются CD8+ Т клетки, связанные с NRP-V7/Kd тетрамером. Фиг.4В, Частота диабета у мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- (n=14) в сравнении с мышами 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/- (n=28). Значения на точечных диаграммах проточной цитометрии соответствуют процентному содержанию клеток в каждом секторе, а значения на гистограммах соответствуют процентному содержанию позитивных клеток (среднее значение±станд. ошибка).
[0036] Фиг.5A-5J. 17.6α/8.3β CD8+ Т клетки спонтанно дифференцируются в Т-клетки памяти с регуляторной функцией. Фиг.5А, репрезентативные профили CD8+ Т клеток селезенки мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- в сравнении с клетками мышей 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-, полученные при помощи FACS-анализа. Фиг.5В, процентное содержание CD44hi CD122+ CD8+ Т клеток в селезенке (n=12 для 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- и n=9 для 17.4α/8.30β-NOD.TCRα-/-), панкреатических лимфоузлах (n=9 для 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- и n=6 для 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-) и костном мозге (n=4 для 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- и n=3 для 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-) трансгенных мышей TCRα-/- (среднее значение ± станд.ошибка). Возраст мышей составлял 9-18 недель. Фиг.5С, репрезентативные профили CD8+ Т клеток селезенки мышей 17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/-, связанные с NRP-V7/Kd тетрамером и антителом анти-CD122, полученные при помощи FACS-анализа. Приведены средние значения ± станд. ош., полученные в пяти различных экспериментах. Фиг.5D, фенотипический анализ наивных CD8+ Т-клеток в сравнении с CD8+ Т-клетками памяти селезенки мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-. Для каждого маркера приведены репрезентативные графики по меньшей мере из двух экспериментов. Фиг.5Е, окрашивание на CD122 у CD8+CD4- тимоцитов в сравнении с CD8+ спленоцитами трансгенных мышей TCRα-/-. Приведены репрезентативные графики по меньшей мере из четырех экспериментов. Фиг.5F, включение BrdU CD8+ Т клетками селезенки трансгенных мышей TCRα-/-. Фиг.5G, верхняя панель: репрезентативные профили пролиферации CD8+ Т клеток селезенки трансгенных мышей в ответ на цитокины IL-2 и IL-15 (оба в концентрации 100 нг/мл), полученные при помощи FACS-анализа. Нижняя панель: пролиферация наивных CD8+ Т клеток в сравнении с CD8+ Т-клетками памяти мышей 17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/- в ответ на различные концентрации IL-2 и IL-15. Приведены репрезентативные графики по меньшей мере из трех экспериментов. Фиг.5Н, продукция IFN-γ наивными CD8+ Т клетками селезенки мышей 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/- в сравнении с наивными и CD8+ Т клетками памяти мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- в ответ на дендритные клетки, активированные 1 мкг/мл NRP-A7 через 24 и 48 часов. Фиг.5I, внутриклеточное окрашивание на IFN-γ наивных CD8+ Т клеток селезенки мышей 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/- в сравнении с наивными и CD8+ Т клетками памяти мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- в ответ на дендритные клетки, активированные 1 мкг/мл NRP-A7, через 6 часов. Фиг.5J, продукция IL-2 и пролиферация в ответ на дендритные клетки, активированные 1 мкг/мл NRP-A7, через различные промежутки времени. На Фиг.5Н и Фиг.5J приведены репрезентативные данные из четырех экспериментов, а на Фиг.5I приведены репрезентативные данные из трех экспериментов.
[0037] Фиг.6. Пролиферация 17.4α/8.3β CD8+ Т клеток, окрашенных CFSE. Пролиферация 17.4α/8.3β CD8+ Т клеток, окрашенных CFSE, в ответ на дендритные клетки, активированные NRP-A7, в присутствии наивных или CD8+ Т клеток памяти мышей 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- (верхняя панель) или в присутствии наивных CD8+ Т клеток мышей 17.4α/8.3β-NOD в сравнении с клетками мышей LCMV-NOD (нижняя панель). Приведены репрезентативные данные, по меньшей мере, из пяти экспериментов.
[0038] Фиг.7А-7В. 17.6α/8.3β CD8+ Т клетки памяти уничтожают активированные антигеном антиген-презентирующие клетки. Фиг.7А, Цитотоксичность in vitro свежевыделенных наивных CD8+ Т клеток мышей 17.4α/8.30β-NOD.TCRα-/- в сравнении с наивными и CD8+ Т клетками памяти мышей 17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/- в отношении дендритных клеток костного мозга, активированных NRP-A7 и TUM. Приведены репрезентативные данные из трех экспериментов. Выделенные дендритные клетки костного мозга активировали 1 мкг/мл NRP-A7 или TUM и помечали [51Cr]-натрий хроматом. Соотношение эффектор:мишень составляло 8:1 (40000 эффекторных клеток:5000 клеток-мишеней). Супернатант собирали через 8 часов. Фиг.7В, определение цитотоксичности in vivo: NRP-A7-активированные (CFSElo) или TUM-активированные (CFSEhi) В-клетки (верхние панели) или свежевыделенные дендритные клетки селезенки и лимфоузлов (нижние панели) инжектировали трансгенным хозяевам в соотношении 1:1. В-клетки или свежие дендритные клетки (из селезенки и лимфоузлов) выделяли при помощи технологии MACS с использованием гранул, несущих антитела анти-В220 или анти-CD11c, активировали пептидами в концентрации 10 мкг/мл в течение 2 часов, отмывали, окрашивали CFSE (TUM: 3 мкМ CFSE, NRP-A7: 0,3 мкМ CFSE) в течение 3 мин при 37°С, отмывали 3 раза и инжектировали хозяевам по 4-5×106 клеток из каждой популяции. Через 18 часов мышей умерщвляли и исследовали спленоциты при помощи FACS анализа.
[0039] На Фиг.8 показано увеличенное изображение рМНС, конъюгированных с наносферами PLGA (поли(D,L-лактид-ко-гликолид)).
[0040] На Фиг.9 показана выработка IFNγ CD8+ Т-клетками в ответ на комплексы наносфер IGRP/Kd-PLGA при указанной концентрации наночастиц на лунку.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0041] Следует понимать, что данное изобретение не исчерпывается конкретными описанными воплощениями, поскольку они, безусловно, могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология использована только в целях описания конкретных воплощений и не является исчерпывающей, поскольку рамки данного изобретения будут ограничены только прилагаемой формулой.
[0042] Следует отметить, что используемые в описании и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе также подразумевают их множественное число, если из контекста явно не следует противоположное. Так, напрмимер, ссылка на «эксципиент» включает множество эксципиентов.
I. Определения
[0043] Все технические или научные термины в данном документе имеют такое же значение, как и в общепринятом понимании специалистов в той области, к которой относится изобретение, если не указано иначе. Следующие термины в данном документе имеют следующее значение.
[0044] Термин «содержать» или «содержащий», используемый здесь, означает, что композиции или способы включают перечисленные элементы, не исключая других. «По существу состоящий из» при определении композиций и способов будет означать исключение других элементов, имеющих принципиальное значение для комбинации в указанных целях. Так, композиция, по существу состоящая из элементов, указанных в данном документе, не будет исключать другие материалы или этапы, которые не влияют существенным образом на основы и новые характеристики заявленного изобретения. «Состоящий из» будет означать по отношению к веществу, что вещество может содержать лишь следовые примеси других веществ, а по отношению к способу, что способ не содержит других существенных стадий. Воплощения, обозначенные любым из указанных родственных терминов, находятся в рамках данного изобретения.
[0045] Под «биологически совместимыми» понимают компоненты системы доставки, которые не будут вызывать повреждение тканей или повреждение биологических систем человеческого организма. Для обеспечения биологической совместимости предпочтительно применять полимеры и эксципиенты, для которых ранее была продемонстрирована безопасность применения у человека или которые признаны безвредными (Generally Accepted As Safe). Под биологической совместимостью понимают то, что ингредиенты и эксципиенты, используемые в композициях, в конечном итоге будут «биологически абсорбированы» или выведены организмом без побочных эффектов на организм. Композиция считается биологически совместимой и нетоксичной, если она не оказывает токсичного влияния на клетки. Аналогично, термин «биоабсорбируемые» обозначает наночастицы, изготовленные из материалов, которые проходят биоабсорбцию in vivo за такой период времени, который позволяет избежать долговременного накопления материала у пациента. В предпочтительном воплощении биологически совместимые наночастицы абсорбируются за период времени менее 2 лет, предпочтительно менее 1 года и еще более предпочтительно менее 6 месяцев. Скорость биоабсорбции зависит от размера частиц, использованного материала и других факторов, хорошо известных специалистам. Для изготовления наносфер, применявшихся в данном изобретении, может применяться смесь биоабсорбируемых, биологически совместимых материалов. В одном воплощении может применяться комбинация оксида железа (III) и биологически совместимого биоабсорбируемого полимера. Например, для изготовления наночастиц можно использовать комбинацию оксида железа (III) и PGLA.
[0046] Комплекс антиген/МНС/наносфера обозначает презентирование пептида, углевода, липида или другого антигенного сегмента, фрагмента или эпитопа молекулы антигена или белка (т.е. собственного пептида или аутоантигена) на поверхности, такой как поверхность биологически совместимой биодеградируемой наносферы. «Антиген» в данном документе обозначает часть, фрагмент, сегмент молекулы или целую молекулу, которая способна вызвать иммунный ответ у субъекта или увеличение числа антипатогенных клеток.
[0047] Термин «приблизительно» при употреблении перед численным значением, например температуры, времени, количества и концентрации, включая диапазоны, означает приближенное значение, которое может варьировать в сторону увеличения или уменьшения на 10%, 5% или 1%.
[0048] «Уничтожение» или «уничтожать» означает вызывать гибель клеток путем апоптоза или некроза. Апоптоз или некроз могут быть опосредованы любым способом, приводящим к гибели клеток.
[0049] «Аутоиммунные клетки» включают, например, спленоциты взрослого человека, Т лимфоциты, В лимфоциты и клетки костномозгового происхождения, такие как аномальные антиген-презентирующие клетки млекопитающего, обладающие активностью в отношении организма, в котором они были произведены.
[0050] «Миметик» представляет собой аналог указанного лиганда или пептида, причем аналог обладает существенным сходством с лигандом. «Существенное сходство» означает, что аналог имеет схожий с лигандом профиль связывания, при этом миметик имеет одну или несколько функциональных групп или модификаций, на суммарную долю которых приходится менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10%, или менее чем приблизительно 5% от молекулярного веса лиганда.
[0051] «Эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для достижения искомой цели, например, модуляции активности Т клеток или популяций Т клеток. Как здесь подробно описано, эффективное количество или дозировка зависят от цели и антигена и могут быть определены исходя из данного описания.
[0052] «Аутореактивная Т-клетка» представляет собой Т-клетку, распознающую «аутоантиген», который представляет собой молекулу, произведенную и находящуюся в организме того же индивида, у которого находится Т-клетка. Аутореактивная Т-клетка может представлять собой CD8+ Т-клетку или CD4+ Т-клетку. Более того, CD4+ Т-клетка может быть классифицирована как TR1 клетка (регуляторная Т-клетка типа 1).
[0053] «Патогенная Т-клетка» представляет собой Т-клетку, которая причиняет вред субъекту, имеющему Т-клетку. Тогда как непатогенная Т-клетка не причиняет существенный вред субъекту, антипатогенная Т-клетка снижает, ослабляет, подавляет или устраняет вред, причиняемый патогенной Т-клеткой.
[0054] Термины «подавление», «снижение» или «предупреждение» или любые производные этих терминов, при упореблении в формуле изобретения и/или описании, включают любое измеримое уменьшение или полное ингибирование для достижения желаемого результата.
[0055] Употребление существительных в единственном числе в сочетании с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или описании может означать «один», но также предполагает значение «один или более», «по меньшей мере один» и «один или несколько».
[0056] Термин «антипатогенный» обозначает клетки, которые обладают протективным эффектом в отношении вызвавшего их заболевания. Например, «антипатогенные аутореактивные CD8+ Т клетки» обозначают клетки, которые обладают протективным эффектом в отношении СД1. «Антипатогенные аутореактивные CD8+ Т клетки» также обозначают клетки, которые обладают протективным эффектом в отношении других аутоиммунных заболеваний, таких которые перечислены в разделе V, озаглавленном «ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МИШЕНИ».
[0057] Под «наносферами» здесь понимают мелкие дискретные частицы, которые можно ввести субъекту. В некоторых воплощениях наносферы имеют по существу сферичную форму. Термин «по существу сферичный» в данном документе означает, что форма частиц не отклоняется от сферы более чем приблизительно на 10%. Различные известные антигенные или пептидные комплексы данного изобретения могут применяться с частицами. Наносферы в данном изобретении могут иметь размер от приблизительно 10 нм до приблизительно 150 мкм, предпочтительно от приблизительно 10 нм до приблизительно 1 мкм. Более мелкие наночастицы могут быть получены, например, при помощи фракционирования, когда более крупным частицам дают возможность осесть в водном растворе. После этого собирают верхнюю фракцию раствора. Эта верхняя фракция обогащена более мелкими частицами. Процесс можно повторять до получения желаемого среднего размера.
[0058] В данной заявке термин «приблизительно» употребляется для указания того, что значение включает стандартное отклонение или ошибку прибора или метода, использованного для определения значения.
[0059] Употребление термина «или» в формуле изобретения означает «и/или», если явно не указано, что он обозначает только альтернативный вариант, или если альтернативные варианты являются взаимоисключающими, причем описание содержит определения, которые относятся только к альтернативным вариантам и к «и/или».
[0060] Здесь и в формуле изобретения термины «антитело» или «иммуногобулин» используются взаимозаменяемо и обозначают любой из нескольких классов структурно родственных белков, которые составляют часть иммунного ответа животного или реципиента, эти белки включают IgG, IgD, IgE, IgA, IgM и родственные им белки.
[0061] В данном документе термины «иммуногенный агент» или «иммуноген» или «антиген» используются взаимозаменяемо для описания молекулы, способной вызвать иммунный ответ против самой себя при введении реципиенту как самостоятельно, так и в сочетании с адъювантом, или будучи презентированной на носителе.
[0062] В данном документе «аминная молекула» обозначает любую аминокислоту, производное аминокислоты или миметик аминокислоты, известный в данной области техники. В некоторых воплощениях остатки белковой молекулы расположены последовательно, и последовательность аминокислотных остатков не прерывается какими-либо молекулами, не относящимися к аминным молекулам. В других воплощениях последовательность может содержать один или более компонентов, не относящихся к аминным молекулам. В конкретных воплощениях последовательность остатков белковой молекулы может быть прервана одним или более компонентами, не относящихся к аминным молекулам.
[0063] Соответственно, термин «белковая композиция» включает последовательности аминных молекул, содержащие по меньшей мере одну из 20 известных аминокислот белков естественного происхождения, или по меньшей мере одну модифицированную или нестандартную аминокислоту.
[0064] В данном документе термин «лечение» или «терапия» означает любую терапию заболевания или патологического состояния у пациента, включая:
- предупреждение или защиту от заболевания или патологического состояния, что представляет собой отсутствие развития клинических симптомов, например, у субъекта, имеющего риск развития такого заболевания или патологического состояния, таким образом, по существу устраняя возникновение заболевания или патологического состояния;
- подавление заболевания или патологического состояния, т.е. купирование или задержку развития клинических симптомов; и/или
- облегчение заболевания или патологического состояния, т.е. ослабление клинических симптомов.
[0065] Другие объекты, признаки и преимущества данного изобретения станут очевидны исходя из следующего ниже подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и определенные примеры, показывающие определенные воплощения изобретения, приведены только в качестве иллюстраций, поскольку различные изменения и модификации, находящиеся в духе и в рамках изобретения, будут очевидны специалистам в данной области, исходя из этого подробного описания.
[0066] Данные современных наблюдений (Han et al., 2005) позволили предположить, что для того, чтобы быть эффективной при аутоиммунных процессах, пептидная терапия должна быть направлена против широкого набора специфичностей. Растворимые пептиды могут вызывать толерантность пептид-специфических Т-клеток, но не могут ослаблять полиспецифические аутоиммунные ответы. Авторы изобретения предположили, что было бы очень непрактично использовать для этой цели пептиды, т.к. только в случае одного IGRP, потребовалось бы несколько миллиграммов пептидов на каждую дозу. Поскольку пептиды являются гораздо более толерогенными (т.е. в более низких количествах) будучи связанными с молекулами ГКГС на поверхности определенных антиген-презентирующих клеток (Miller et al., 1979), было предположено, что системная доставка комплексов антиген/МНС, например, комплексов пептид/МНС (без ко-стимулирующих молекул) на наносферах может быть более толерогенной, чем пептиды в отдельности. Эта идея возникла, поскольку существовал готовый реагент, исходно разрабатывавшийся для визуализации воспаления панкреатических островков. Авторы изобретения стремились, в частности, разработать зонд, пригодный для магнитно-резонансного исследования циркулирующих 8.3-подобных CD8+ Т-клеток (наносферы оксида железа, покрытые комплексами NRP-V7/Kd (Moore et al., 2004). В частности, авторы изобретения предполагали использовать для покрытия этих наносфер несколько различных комплексов антиген/МНС для одновременной элиминации множества Т-клонотипов ниже порогового уровня, необходимого для развития СД1. Неожиданно было обнаружено, что комплексы рМНС, присоединенные к твердой основе, вызывают пролиферацию, специфичным в отношении эпитопов образом, встречавшихся с аутоантигеном аутореактивных CD8+ клеток, что подавляет рекрутинг других аутоантигенных клонотипов. Этот терапевтический подход основан на новой концепции, касающейся прогрессирования хронических аутоиммунных ответов, что делает возможным рациональное конструирование специфичных в отношении заболевания «нановакцин», способных ослабить аутоиммунный процесс без нарушения системного иммунитета, что долгое время было искомой целью в терапии этих заболеваний. Согласно упомянутой выше концепции, любой отдельный эпитоп (рМНС), играющий роль в ходе заболевания (среди сотен других), может применяться для ослабления сложных аутоиммунных ответов, будучи нанесенным на наночастицы в качестве лиганда. Частицы/твердая основа является важным компонентом, поскольку мультимерные растворимые рМНС не способны вызывать такой иммунный ответ, как индуцируют их аналоги, связанные с наночастицами. Частицы обеспечивают большую мультимеризацию рМНС и придают этим рМНС выраженную способность связываться с рецепторами. Таким образом, данная концепция и терапевтический подход, который привел к ее разработке, создают основу для создания нового класса терапевтических средств для применения при аутоиммунных процессах.
[0067] Предполагается, что наносферы, покрытые комплексами антиген/МНС (комплексы антиген/МНС/наносфера) будут способствовать увеличению числа тех низкоавидных антипатогенных аутореактивных CD8+ клеток, которые обеспечили защиту от СД1 у мышей, получавших APL (Han et al., 2005; Maree et al., 2006). Также предполагается, что эти наносферы будут способствовать увеличению предсуществующего пула аутореактивных CD8+ Т-клеток памяти (т.е. они не вызывают образования Т клеток памяти de novo). Считается, что этот предсуществующий пул преимуществнно (если не полностью) состоит из низкоавидных (антипатогенных) аутореактивных CD8+ клонотипов. Возможно, высокоавидные аналоги этих Т-клеток (с патогенной активностью) не выживают in vivo как клетки памяти, поскольку при длительном воздействии их эндогенных бета-клеточных аутоантигенов-мишеней происходит их гибель, вызванная активацией, что не ограничивает изобретение какой-либо конкретной теорией. Считается, что эти наносферы не нуждаются в направленном воздействии на превалирующую популяцию аутореактивных CD8+ Т-клеток для того, чтобы быть эффективными: аналогичные результаты были получены с наносферами, покрытыми комплексами субдоминантный пептид/МНС. Кроме того, считается, что для данной технологии не требуется создание APL с определенной авидностью (в отличие от пептидов), и таким образом, она может быть приспособлена для любого антигена-мишени или мишени пептид/МНС. Предполагается, что эта технология позволит восстановить нормогликемию у мышей NOD с впервые диагностированным СД1, со скоростью, которая по меньшей мере сравнима, если не превышает таковую при лечении моноклональными антителами против CD3, этот антиген-неспецифичный подход оказался подающим надежду в клинических испытаниях (Herold et al., 2002; Keymeulen et al., 2005).
[0068] Считается, что композиции по изобретению могут применяться для увеличения предсуществующего пула аутореактивных CD8+ Т-клеток памяти (т.е. они не способны вызывать образования Т клеток de novo). Этот предсуществующий пул преимущественно (если не полностью) состоит из низкоавидных (антипатогенных) аутореактивных CD8+ клонотипов. Высокоавидные аналоги этих Т-клеток (с патогенной активностью) не выживают in vivo как клетки памяти, а преимущественно существуют в виде наивных Т клеток. Также предполагается, что наивные Т клетки погибают сразу после захвата комплексов аутоантиген/МНС/наносфера в отсутствие ко-стимуляции, так что изобретение позволяет как элиминировать наивные патогенные Т клетки, так и увеличить число антидиабетогенных Т-клеток памяти. Описанные композиции не нуждаются в том, чтобы нацеленно воздействовать на господствующую популяцию аутореактивных CD8+ Т-клеток для того, чтобы быть эффективными. В некоторых воплощениях композиции и способы могут применяться для индукции толерантности аутореактивных Т клеток.
[0069] Предполагается, что применение биодеградируемых биоабсорбируемых наносфер может приводить к непредвиденным результатам по сравнению с комплексами рМНС/антиген, нанесенными на твердую основу из небиодеградируемых и не-биоабсорбируемых материалов. Эти непредвиденные результаты включают пониженную токсичность. Пониженная токсичность может означать снижение накопления наносфер в органах и/или тканях всего организма. Пониженная токсичность может также означать ослабление нежелательного биологического ответа, такого как уменьшение воспаления или уменьшение повреждения тканей или органов всего организма. Воспаление и повреждение тканей могут быть легко оценены специалистами при помощи известных методов. Также предполагается, что биодеградируемые биоабсорбируемые наносферы будут легче переноситься организмом. Это позволит понизить терапевтическую дозу или усилиь или повысить эффективность терапевтического ответа. Терапевтический ответ, поскольку он относится к аутоиммунному процессу, может оцениваться при помощи методов количественного анализа, описанных в Примерах.
[0070] В одном воплощении изобретения биодеградируемый биоабсорбируемый материал выбирают квалифицированные клиницисты, основываясь на рассчитанном времени полужизни наносфер in vivo. Время полужизни может быть легко определено на основании физических свойств наносфер, таких как размер наносфер и материал, использованный для их изготовления. В предпочтительном воплощении скорость деградации соответствует временному интервалу, который по мнению клинициста позволит достичь максимального терапевтического эффекта. Таким образом, считается, что биодеградируемые биоабсорбируемые наносферы будут обладать лучшим и большим терапевтическим потенциалом благодаря материалу, который будет деградировать за рассчитанный временной интервал, и будут обладать наименее выраженными отрицательными побочными эффектами.
II. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ВВЕДЕНИЕ
[0071] Данное изобретение включает способы предупреждения или облегчения аутореактивного состояния. Так, в изобретении рассматриваются «вакцины» или иммуномодуляторы для применения в различных воплощениях. Композиции, которые, как предполагают, будут пригодными для применения в качестве вакцин, могут быть изготовлены на основе аутореактивных молекул, включая аутореактивные белки и их фрагменты. Изобретение включает композиции, которые могут применяться для индукции или модуляции иммунного ответа против аутореактивного антигена, например, полипептида, пептида, углевода, липида или другой молекулы или фрагмента молекулы, а также против развития патологического состояния или заболевания, вызванного таким аутоиммунным ответом.
[0072] В обычной практике композиции по изобретению могут быть введены парентерально, путем инъекции, например, внутривенно, подкожно или внутримышечно. Дополнительные препараты, которые подходят для других способов введения, включают оральные препараты. Оральные препараты включают такие обычно применяемые эксципиенты, как, например, фармацевтической степени чистоты маннитол, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния и т.п. Эти композиции могут находиться в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов с пролонгированным высвобождением или порошков и содержать приблизительно от 10% до приблизительно 95% активного ингредиента, предпочтительно приблизительно от 25% до приблизительно 70%.
[0073] Обычно композиции по изобретению вводят способом, подходящим для лекарственных форм, и в количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуномодулирующим. Количество, которое требуется ввести, зависит от субъекта, которому проводится лечение. Точное количество активного ингредиента, которое требуется ввести, определяется специалистом-практиком. При этом подходящий диапазон дозировок составляет от десяти до нескольких сотен нанограммов или микрограммов комплекса антиген/МНС/наносфера на одно введение. Подходящие режимы для первоначального и повторного введения также могут варьировать, но характеризуются первоначальным введением, за которым следуют повторные введения.
[0074] Способы практического применения могут значительно варьировать. Может применяться любой из известных способов введения вакцин. Они включают оральное применение с использованием твердой физиологически приемлемой основы или в виде физиологически приемлемой дисперсии, парантеральное применение, инъекции и т.п. Дозировка комплексов антиген/МНС/наносфера будет зависеть от пути введения и варьировать в зависимости от габаритов и состояния здоровья субъекта.
[0075] Во многих случаях требуется проведение множественных введений комплексов пептид/МНС/наносфера, приблизительно, не более чем, или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более. Введения, как правило, занимают интервал от 2 дней до двенадцати недель, чаще от одной до двух недель. Для поддержания необходимого состояния иммунной системы желательно периодически проводить повторные введения с интервалом 0,5-5 лет, обычно через 2 года. После курса введений может проводиться оценка аутореактивного иммунного ответа и Т-клеточной активности.
А. Комбинированная терапия
[0076] Композиции и связанные к ними способы по данному изобретению, в частности, введение комплексов антиген/МНС/наносфера, могут также применяться в сочетании с традиционной терапией. Она включает проведение иммуносупрессивной или модулирующей терапии или лечения, но не ограничивается ими.
[0077] В одном аспекте предполагается, что комплекс антиген/МНС/наносфера применяется в сочетании с лечением цитокинами. В альтернативном случае введение комплекса антиген/МНС/наносфера может предшествовать или следовать за другой терапией через интервалы от нескольких минут до недель. В тех воплощениях, где другие агенты и/или комплексы антиген/МНС/наносфера вводят раздельно, как правило, следует следить за тем, чтобы между каждым введением не прошло значительное количество времени, так чтобы агент и комплекс антиген/МНС/наносфера все еще могли оказать на субъекта благоприятный комбинированный эффект.В таких случаях предполагается, что оба средства могут быть введены с промежутком приблизительно 12-24 ч и, более предпочтительно, с промежутком приблизительно 6-12 ч. Однако, в некоторых ситуациях может требоваться существенное увеличение интервала времени между введениями, чтобы промежуток между соответствующими введениями составлял от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).
[0078] Могут применяться различные комбинации, например, "А" обозначает введение комплекса антиген/МНС/наносфера, а "В" обозначает дополнительный агент:
А/В/А В/А/В В/В/А А/А/В А/В/В В/А/А А/В/В/В В/А/В/В
В/В/В/А В/В/А/В А/А/В/В А/В/А/В А/В/В/А/ В/В/А/А
В/А/В/А В/А/А/В А/А/А/В В/А/А/А А/В/А/А А/А/В/А
[0079] Введение композиций, содержащих комплексы пептид-МНС по данному изобретению пациенту/субъекту будет следовать общепринятым протоколам введения таких соединений, учитывая токсичность, если таковая существует. Ожидается, что при необходимости циклы лечения будут повторяться. Также предполагается, что в сочетании с описанной терапией могут применяться различные стандартные терапии, такие как гидратирование.
Б. Фармацевтические композиции
[0080] В некоторых воплощениях субъекту вводят фармацевтические композиции. Различные аспекты данного изобретения включают введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей комплексы антиген/МНС/наносфера. Кроме того, такие композиции могут быть введены в сочетании с иммуномодуляторами. Такие композиции, как правило, бывают растворены или диспергированы в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде.
[0081] Выражения «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» обозначают молекулярные частицы и композиции, которые не вызывают нежелательных, аллергических или иных побочных реакций при введении животному или человеку. В данном документе «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какая-либо стандартная среда или агент несовместимы с активными ингредиентами, подразумевается их применение в иммунногенных и терапевтических композициях.
[0082] Активные компоненты по данному изобретению могут быть предназначены для парентерального введения, например, для инъекции внутривенно, внутримышечно, подкожно или даже внутрибрюшинно. Изготовление водной композиции, содержащей комплексы антиген/МНС/наносфера, которые модулируют иммунное состояние субъекта, будет понятно специалистам в данной области с учетом данного описания. Обычно, такие композиции могут быть изготовлены как препараты для инъекций, в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть изготовлены твердые формы, пригодные для получения растворов или суспензий при добавлении жидкости перед инъекцией; кроме того, препараты могут быть в виде эмульсий.
[0083] Лекарственные формы, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии; препараты, содержащие кунжутное масло, арахисовое масло или водный раствор пропиленгликоля; а также стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций непосредственно перед введением. В любом случае, лекарственные формы должны быть стерильны и должны быть жидкими до такой степени, чтобы их было легко инжектировать. Они также должны сохранять стабильность в условиях производства и хранения и должны предохраняться от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.
[0084] Композиции могут быть изготовлены в нейтральной форме или в форме солей. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные при участии свободных аминогрупп белков) и образованные при участии неорганических кислот таких как, например, соляная или фосфорная кислоты, или таких органических кислот, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные при участии свободных карбоксильных групп, могут также быть производными неорганических оснований, таких как, например, оксидов натрия, калия, аммония, кальция и железа, и таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.
[0085] Носитель может также представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерол, пропиленгликоль и жидкий поли(этиленгликоль) и т.п.), их соответствующие смеси и растительные масла. Необходимое жидкое состояние можно поддерживать, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, за счет поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и за счет применения сурфактантов. Предупредить воздействие микроорганизмов можно при помощи различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Зачастую, бывает предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированного всасывания инжектируемых композиций можно добиться за счет использования в композициях агентов, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0086] Стерильные растворы для инъекций изготавливают путем включения активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель с другими различными ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией. Стерилизация раствора должна выполняться таким образом, чтобы не снижать антипатогенных свойств комплекса пептид/МНС/наносфера. Как правило, дисперсии изготавливают путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что были перечисленных выше. В случае, когда стерильные растворы для инъекций изготавливают из стерильных порошков, предпочтительными способами изготовления являются методы вакуумной сушки и сублимационной сушки, которые позволяют получить активный ингредиент в виде порошка, также содержащего любой дополнительный подходящий ингредиент из предварительно стерилизованного раствора. Одним из таких способов стерилизации раствора является стерилизация фильтрованием, однако, данное изобретение предусматривает любой способ стерилизации, который существенным образом не снижает антипатогенных свойств комплексов пептид/МНС/наносфера. Способы стерилизации, включающие интенсивное нагревание и давление, такие как автоклавирование, могут нарушить третичную структуру комплекса, таким образом существенно понизив антипатогенные свойства комплексов пептид/МНС/наносфера.
[0087] Введение композиций согласно данному изобретению, как правило, будет осуществляться любым из общепринятых способов. Они включают ортотопическое, интрадермальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное или внутривенное введение, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях композиция вакцины может быть введена путем ингалации (например, патент США 6,651,655, включенный сюда во всей полноте путем ссылки).
[0088] Эффективное количество терапевтической или профилактической композиции определяется в зависимости от намеченной цели. Термин «однократная доза» или «дозировка» обозначает физически дискретные единицы, пригодные для применения у субъекта, каждая единица содержит предопределенное количество композиции, рассчитанное для получения желаемого ответа на фоне ее введения, как обсуждалось выше, т.е. при соответствующем способе и режиме. Количество, которое необходимо ввести, в отношении как количества процедур, так и доз, зависит от желаемого результата и/или желаемой степени защиты. Точное количество композиции также определяется по усмотрению лечащего врача и является индивидуальным для каждого субъекта. Факторы, влияющие на дозу, включают физическое и клиническое состояние индивида, способ введения, желаемую цель лечения (облегчение симптомов или излечение), а также активность, стабильность и токсичность конкретной композиции. После изготовления растворы будут введены подходящим для дозированного состава способом и в количестве, которое будет терапевтически или профилактически эффективным. Препараты удобно вводить в виде различных лекарственных форм, таких как типичные образцы инъекционных препаратов, описанные выше.
В. Введение In Vitro или Ex Vivo
[0089] В данном документе термин введение in vitro обозначает манипуляции, проводимые с клетками, извлеченными из организма субъекта, или вне организма субъекта, включая, но не ограничиваясь культурами клеток. Термин введение ех vivo обозначает клетки, с которыми были проведены манипуляции in vitro, и которые затем вводят субъекту. Термин введение in vivo включает все манипуляции, проводимые внутри организма субъекта, включая введение.
[0090] В некоторых аспектах данного изобретения композиции могут вводиться либо in vitro, ex vivo, либо in vivo. В некоторых in vitro воплощениях аутологичные Т клетки инкубируют с композициями по данному изобретению. Клетки затем могут применяться в исследованиях in vitro, или в альтернативном случае, для введения ех vivo.
III. КОМПЛЕКСЫ МНС
[0091] Антигены, включая их сегменты, фрагменты, а также другие молекулы, полученные на основе антигенов, включая, пептиды, углеводы, липиды или другие молекулы, представленные классическими и неклассическими молекулами МНС по изобретению, но не ограничиваясь ими, как правило, находятся в комплексе или функционально связаны с молекулой МНС или ее производным. Распознавание антигена Т лимфоцитами рестриктировано главным комплексом гистосовместимости. Конкретный Т лимфоцит будет распознавать антиген, только если тот связан с определенной молекулой МНС.Обычно, стимуляция Т лимфоцитов происходит только в присутствии собственных молекул МНС, а антиген распознается в виде фрагментов антигена, связанных с собственными молекулами МНС. МНС-рестрикция определяет специфичность Т лимфоцитов в отношении распознаваемого антигена и молекулы МНС, которая связывается с его антигенным(и) фрагментом(ами). В конкретных аспектах некоторые антигены будут попарно связываться с некоторыми молекулами МНС или полипептидами, образованными на их основе.
[0092] Термин «функционально связан» или «покрыт» в данном документе обозначает ситуацию, когда отдельные компоненты полипептида (например, МНС) и антигена (например, пептид) объединяются и формируют активный комплекс перед связыванием сайта-мишени, например, клетки иммунной системы. Сюда же относятся и ситуации, когда отдельные компоненты полипептидного комплекса синтезированы или получены рекомбинантным способом, а затем выделены и объединены с формированием комплекса in vitro, перед введением субъекту; ситуации, когда химерный или гибридный полипептид (т.е. каждый отдельный белковый компонент комплекса находится в составе одной полипептидной цепи) синтезирован или получен рекомбинантным способом в виде интактного комплекса. Как правило, полипептидные комплексы добавляют к наносферам для получения наносфер с адсорбированными на их поверхности или присоединенными полипептидными комплексами, имеющими соотношение числа молекул к числу наносфер от приблизительно, по меньшей мере приблизительно, или не более чем приблизительно 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 500, 1000 или более к 1, чаще от 0,1 к 1 до 50 к 1. Содержание полипептидов в наносферах может быть определено при помощи стандартных методик.
А. Молекулы МНС
[0093] Внутриклеточные и внеклеточные антигены представляют достаточно различные стимулы для иммунной системы, как в плане распознавания, так и в плане возможного ответа. Презентирование антигенов Т клеткам опосредовано двумя различными классами молекул МНС класса I (МНС-I) и МНС класса II (МНС-II), которые используют различные пути процессинга антигенов. Пептиды, представляющие собой производные внутриклеточных антигенов, презентируют CD8+ Т клеткам молекулы 1 класса МНС, которые экспрессируют практически все клетки, тогда как пептиды, являющиеся производными внеклеточных антигенов, презентируют CD4+ Т клеткам молекулы МНС-II. Однако существуют некоторые исключения из этого правила. В ряде исследований было показано, что пептиды из частиц, поглощенных путем эндоцитоза, или растворимые белки презентируются молекулами МНС-I макрофагов, а также дендритных клеток. В некоторых воплощениях изобретения конкретный пептид, являющийся производным аутоантигена, идентифицируется и презентируется в комплексе пептид/МНС/наносфера в контексте соответствующих полипептидов I или II класса МНС. В некоторых аспектах можно оценить генетическое строение субъекта для определения, какие полипептиды МНС следует применять для конкретного пациента и конкретного набора пептидов.
[0094] Неклассические молекулы МНС также предусматриваются для применения в составе комплексов МНС по данному изобретению. Неклассические молекулы МНС являются неполиморфными, консервативными у разных видов и имеют узкие, глубокие гидрофобные «карманы» для связывания лигандов. Эти связывающие «карманы» способны презентировать гликолипиды и фосфолипиды естественным киллерным Т (NKT) клеткам. NKT клетки представляют уникальную популяцию лимфоцитов, которая ко-экспрессирует маркеры NK клеток и полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR). Они задействованы в регуляции иммунных ответов, связанных с широким спектром заболеваний.
Б. Антигенные компоненты
[0095] Некоторые аспекты изобретения включают способы и композиции, касающиеся антигенных композиций, включая сегменты, фрагменты или эпитопы полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других молекул, провоцирующих или индуцирующих антигенный ответ и, как правило, обозначаемых антигенами. В частности, аутоантигены или антигенные сегменты или фрагменты таких аутоантигенов, которые вызывают деструкцию клетки опосредованную аутоиммунным ответом, могут быть идентифицированы и использованы для получения комплекса МНС/наносфера по данному описанию. Такие аутоантигены могут быть презентированы на панкреатических островках или на клетках, поддерживающих клетки островков поджелудочной железы. Воплощения изобретения включают композиции и способы модулирования иммунного ответа против конкретной клетки или совокупности клеток, несущих конкретную физиологическую функцию.
1. Пептидные компоненты и белковые композиции
[0096] Полипептиды и пептиды по изобретению могут быть модифицированы посредством различных делеций, инсерций и/или замен аминокислот. В конкретных воплощениях модифицированные полипептиды и/или пептиды способны модулировать иммунный ответ у субъекта. В данном документе «белок» или «полипептид» или «пептид» обозначают молекулу, содержащую, по меньшей мере, пять аминокислотных остатков. В некоторых воплощениях используют вариант белка или пептида дикого типа, однако во многих воплощениях изобретения модифицированный белок или полипептид используют для создания комплекса пептид/МНС/наносфера. Комплекс пептид/МНС/наносфера можно применять для того, чтобы вызвать иммунный ответ и/или модифицировать популяцию Т клеток иммунной системы (т.е. переобучить иммунную систему). Описанные выше термины могут здесь употребляться взаимозаменяемо. «Модифицированный белок» или «модифицированный полипептид» или «модифицированный пептид» обозначают белок или полипептид, чья химическая структура, в частности аминокислотная последовательность, были изменены по сравнению с белком или полипептидом дикого типа. В некоторых воплощениях модифицированный белок или полипептид или пептид обладают, по меньшей мере, одной измененной активностью или функцией (с учетом того, что у белков или полипептидов или пептидов может быть множество активностей или функций). В частности, предполагается, что у модифицированного белка или полипептида или пептида может быть изменена одна активность или функция, но в остальном сохранена активность или функция дикого типа, например, иммуногенность или способность взаимодействовать с другими клетками иммунной системы в контексте комплекса МНС/наносфера.
[0097] Пептиды по изобретению включают любой аутореактивный пептид. Аутореактивные пептиды включают, но не ограничиваются hInsB10-18 (HLVEALYLV (SEQ ID NO:1)), hIGRP228-236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2)), hIGRP265-273 (VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3)), IGRP206-214 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)), hIGRP206-214 (VYLKTNLFL (SEQ ID NO:5)), NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)), NRP-I4 (KYNIANVFL (SEQ ID NO:7)), NRP-V7 (KYNKANVFL (SEQ ID NO:8)), YAI/Db (FQDENYLYL (SEQ ID NO:9)) и/или INS B15-23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO:10)), а также пептиды и белки, описанные в публикации U.S. 20050202032, которая включена сюда во всей полноте путем ссылки. Другие пептиды, которые могут применяться совместно с изобретением, в качестве аутореактивных пептидов или в качестве контрольных пептидов, включают, но не ограничиваются INS-I9 (LYLVCGERI (SEQ ID NO:11)), TUM (KYQAVTTTL (SEQ ID NO:12)) и G6Pase (KYCLITIFL (SEQ ID NO:13)). В некоторых аспектах может применяться 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пептидов. Примеры пептидов, которые могут применяться вместе с данным изобретением, также включают те, что приведены в Таблице 1. Эти пептиды могут быть связаны с определенными комбинациями наносфера/молекула МНС или множество пептидов может быть связано с общей наносферой и одной или более молекулами МНС. Введение комбинаций этих пептидов включает введение «популяции» наносфер с множеством присоединенных к ним пептидов и/или введение множества «популяций» наносфер, с каждой из которых связан определенный пептид или комбинации таких наносфер, которая включает наносферы с 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пептидами, присоединенными к 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более наносферам.
[0098] В некоторых воплощениях размеры белка или полипептида (дикого типа или модифицированного), включая любые комплексы белка или пептида, представляющего интерес, и в частности, гибрида МНС/пептид, могут составлять 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,180,190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 молекул аминокислот или более, включая любые диапазоны или значения, которые можно из этого вывести, а также их производные, но не ограничиваться ими. В некоторых аспектах в качестве антигенов могут применяться 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более смежных аминокислот, включая их производные, а также фрагменты аутоантигена, такие как аминокислотные последовательности, описанные и упоминаемые в данном документе. Предполагается, что полипептиды могут подвергаться мутациям с удалением их части, приводящим к их укорочению по сравнению с соответствующей формой дикого типа, а также они могут быть модифицированы путем сшивания или конъюгирования с последовательностью гетерологичного белка, выполняющего конкретную функцию (например, для презентирования белкового комплекса, для усиления иммуногенности и т.д.).
[0099] Белковые композиции могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области, включая (i) экспрессию белков, полипептидов или пептидов при помощи стандартных методов молекулярной биологии, (ii) выделение белковых соединений из естественных источников или (iii) химический синтез белкового материала. Нуклеотидные, а также белковые, полипептидные, и пептидные последовательности для различных генов были описаны ранее и могут быть найдены в известных компьютеризированных базах данных. Одними из таких баз данных являются базы данных GenBank и GenPept Национального Центра Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information) (веб-адрес: ncbi.nlm.nih.gov/). Кодирующие участки этих генов целиком или частично могут быть амплифицированы и/или экспрессированы при помощи методик, описанных здесь или известных специалистам в данной области.
[0100] Варианты аминокислотных последовательностей аутоантигенных эпитопов и других полипептидов в составе этих композиций могут представлять собой варианты с заменами, инсерциями или делециями. Модификации полипептида по изобретению могут затрагивать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 или более смежных или несмежных аминокислот пептида или полипептида по сравнению с вариантом дикого типа. Способы изобретения предусматривают применение пептида или полипептида, вызывающего аутоиммунный ответ, и в частности, патологический аутоиммунный ответ.
[0101] В вариантах с делециями, как правило, отсутствует один или более остатков нативной аминокислотной последовательности или последовательности дикого типа. Можно осуществлять делеции как отдельных остатков, так и нескольких смежных аминокислот. Для создания укороченного белка в кодирующую нуклеотидную последовательность может быть введен стоп-кодон (путем замены или инсерции). Мутанты с инсерциями обычно имеют добавочный материал в неконцевых участках полипептида. Сюда могут входить инсерции одного или более остатков. Кроме того, могут быть созданы варианты с концевыми надстройками, называемые гибридными белками.
[0102] Варианты с заменами, как правило, имеют замещение одной аминокислоты на другую в одном или более участках белка и могут создаваться для изменения одного или более свойств полипептида, с потерей или без потери других функций или свойств. Замены могут быть консервативными, т.е. одна аминокислота замещается другой аминокислотой со схожей структурой и зарядом. Консервативные замены хорошо известны в области техники и включают, например, замены аланина на серин; аргинина на лизин; аспарагина на глутамин или гистидин; аспартата на глутамат; цистеина на серин; глутамина на аспарагин; глутамата на аспартат; глицина на пролин; гистидина на аспарагин или глутамин; изолейцина на лейцин или валин; лейцина на валин или изолейцин; лизина на аргинин; метионина на лейцин или изолейцин; фениланалина на тирозин, лейцин или метионин; серина на треонин; треонина на серин; триптофана на тирозин; тирозина на триптофан или фенилаланин; и валина на изолейцин или лейцин. В альтернативном случае, замены могут быть неконсервативными, т.е. затрагивать функцию или активность полипептида или пептида, такие как авидность или аффинность к клеточным рецепторам. Неконсервативные изменения, как правило, включают замещение остатка на другой, отличающийся по химическим характеристикам, например, замену полярных или заряженных аминокислот на неполярные или незаряженные аминокислоты и наоборот.
[0103] Белки по изобретению могут быть рекомбинантными или синтезированными in vitro. В альтернативном случае рекомбинантный белок может быть выделен из бактерий или других клеток-хозяев.
[0104] Термин «функционально эквивалентный кодон» здесь используется для обозначения кодонов, кодирующих одинаковые аминокислоты, таких как шесть кодонов для аргинина или серина, а также обозначает кодоны, кодирующие биологически эквивалентные аминокислоты (см. Таблица 2, ниже).
[0105] Следует понимать, что последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот могут включать дополнительные остатки, такие как дополнительные N- или С-концевые аминокислоты или 5’ или 3’ последовательности нуклеиновых кислот, соответственно, и, тем не менее, по существу являться одной из указанных здесь последовательностей, при условии, что они соответствуют указанным выше критериям, включая сохранение биологической активности белка (например, иммуногенности). Добавление концевых последовательностей, в частности, распространяется на последовательности нуклеиновых кислот, которые могут, например, содержать различные некодирующие последовательности, фланкирующие либо 5’, либо 3’ участки кодирующего региона.
[0106] Предполагается, что в композициях по изобретению содержится приблизительно между 0,001 мг и 10 мг общего белка на миллилитр. Таким образом, концентрация белка в композиции может составлять приблизительно, по меньшей мере приблизительно или не более чем приблизительно 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 мкг/мл или мг/мл или более (или любой диапазон, который можно из этого вывести). При этом комплекс пептид/МНС/наносфера может составлять приблизительно, по меньшей мере приблизительно или не более чем приблизительно 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.
[0107] В данном изобретении предусматривается введение комплекса пептид/МНС/наносфера для осуществления диагностики, лечения или превентивной терапии, направленной против развития заболевания или патологического состояния, ассоциированного с аутоиммунными ответами.
[0108] Кроме того, в патенте США 4,554,101 (Норр), включенном сюда во всей полноте путем ссылки, описаны идентификация и создание эпитопов из первичной аминокислотной последовательности на основании гидрофильных свойств. Способы, описанные Норр, позволяют специалистам идентифицировать возможные эпитопы в составе аминокислотной последовательности и подтвердить их иммуногенность. Ряд научных публикаций также были посвящены расчетам вторичной структуры и идентификации эпитопов на основании анализа аминокислотных последовательностей (Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979). При необходимости, любые из них могут применяться в качестве дополнения к описанию Норр в патенте США 4,554,101.
2. Другие антигенные компоненты
[0109] Кроме пептидов в качестве антигенов или антигенных фрагментов в комплексах с молекулами МНС могут применяться другие молекулы, включая углеводы, липиды, низкомолекулярные молекулы и т.п., но не ограничиваясь ими. Углеводы являются основными компонентами внешней поверхности многих клеток. Некоторые углеводы характерны для различных стадий дифференцировки и очень часто эти углеводы распознаются специфичными антителами. Экспрессия отдельных углеводов может быть ограничена определенным типом клеток. Было показано, что ответ в виде выработки аутоантител на эндометриальные и сывороточные антигены является характерным признаком эндометриоза. При эндометриозе был описано появление в сыворотке аутоантител к ряду ранее идентифицированных антигенов, включая альфа-2-HS-гликопротеин и карбоангидразу, специфичных в отношении углеводного эпитопа этих белков (Yeaman et al., 2002).
В. Субстраты/Наносферы
[0110] В некоторых аспектах комплексы антиген/МНС функционально связаны с субстратом. Субстрат может находиться в форме наночастицы, содержащей биологически совместимый биоабсорбируемый материал. Субстрат может также быть в форме наночастицы, такой как описанные ранее в заявке на патент US 12/044,435, включенной сюда во всей полноте путем ссылки. Наночастицы могут иметь различные размеры и быть известны как наносферы или биологически совместимые биодеградируемые наносферы. Такие дисперсные препараты, содержащие комплекс антиген/МНС, могут быть образованы путем ковалентного или нековалентного связывания комплекса с наносферой.
[0111] Как правило, наносферы содержат по существу сферичное ядро и могут иметь один или более слоев. Ядро может иметь различный размер и состав. Кроме ядра наносферы могут иметь один или несколько слоев, обеспечивающих функции в соответствии с необходимым практическим применением. Толщина слоев, если таковые имеются, может варьировать в зависимости от нужд конкретных применений. Например, слои могут придавать необходимые оптические свойства.
[0112] Слои могут также вносить химические или биологические функциональные группировки и обозначаться здесь как химически активные или биологически активные слои; для этого слой или слои, как правило, имеют толщину от приблизительно 0,001 микрометра (1 нанометра) до приблизительно 10 микрометров или более (в зависимости от требуемого диаметра наносферы), эти слои обычно наносят на внешнюю поверхность наносферы.
[0113] Предпочтительно, композиции ядра и слоев могут варьировать, при условии, что наносферы будут биологически совместимыми и биоабсорбируемыми. Ядро может иметь гомогенную композицию или быть комбинацией двух или более классов материалов, в зависимости от требуемых свойств. В некоторых аспектах применяются металлические наносферы. Эти металлические наносферы могут быть образованы из Fe, Ca, Ga и т.п.
[0114] Как было заявлено ранее, кроме ядра наносферы могут иметь один или более слоев. Наносферы могут иметь слой, состоящий из биодеградируемого углевода или другого полимера. Примеры биодеградируемых слоев включают декстран; поли(этилен гликоль); поли(этиленоксид); маннитол; поли(эфиры) на основе полилактида (PLA), полигликолида (PGA), поликапролактона (PCL); поли(гидроксалканоата) класса PHB-PHV; и другие модифицированные поли(сахариды), такие как крахмал, целлюлоза и хитозан, но не ограничиваются ими. Кроме того, наносферы могут иметь слой с поверхностью, подходящей для присоединения химических функциональных группировок в сайтах химического связывания или присоединения.
[0115] Слои на наносферах могут быть получены различными способами, известными специалистам. Примеры включают методы золь-гелевой химии, такие как описанные Iler (1979); Brinker and Scherer (1990). Другие способы получения слоев на наносферах включают методы химии поверхностных явлений и инкапсулирования, такие как описанные Partch and Brown (1998); Pekarek et al. (1994); Hanprasopwattana (1996); Davies (1998); и в указанных в них ссылках. Также могут применяться технологии газофазного осаждения; см., например, Golman and Shinohara (2000); и патент США 6,387,498. Другие способы включают методики послойной самосборки, как описанные Sukhorukov et al. (1998); Caruso et al. (1998); Caruso et al. (1999); в патенте США 6,103,379 и приведенных в них ссылках.
[0116] Наносферы могут быть образованы при взаимодействии водной фазы, содержащей комплекс антиген/МНС и полимер, с безводной фазой, с последующим выпариванием безводной фазы, обеспечивающим коалесценцию частиц в водной фазе, согласно описанию в патенте США 4,589,330 или 4,818,542. Предпочтительные полимеры для таких препаратов представляют собой естественный или синтетические сополимеры или полимеры, выбранные из группы, состоящей из желатина, агара, крахмала, арабиногалактана, альбумина, коллагена, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты, гликолид-L(-) лактид поли(эпсилон-капролактона), поли(эпсилон-капролактон-СО-молочной кислоты), поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевой кислоты), поли(β-гидроксимасляной кислоты), поли(этиленоксида), полиэтилена, поли(алкил-2-цианоакрилата), поли(гидроксиэтилметакрилата), полиамидов, поли(аминокислот), поли(2-гидроксиэтил DL-аспартамида), поли(эфирмочевины), поли(L-фенилаланин/этилен гликоль/1,6-диизоцианатогексана) и поли(метилметакрилата). Наиболее предпочтительными полимерами являются полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид-L(-) лактид поли(эпсилон-капролактон), поли(эпсилон-капролактон-СО-молочная кислота) и поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевая кислота). Растворители, подходящие для растворения полимеров, включают: воду, гексафлуороизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или гексафлуороацетон полуторагидрат.
Г. Связывание комплекса антиген-МНС с наносферой
[0117] Для связывания субстрата или наносфер с комплексами антиген-МНС могут использоваться следующие способы.
[0118] Связывание можно осуществлять при помощи химической модификации субстрата или наносферы, что как правило, включает образование «функциональных групп» на поверхности, причем указанные функциональные группы способны связываться с комплексами антиген-МНС, и/или присоединение ковалентно или нековалентно связанных так называемых «линкерных молекул» к возможно химически модифицированной поверхности субстрата или наночастицы с последующим реагированием комплекса антиген-МНС с полученными наносферами.
[0119] Термин «линкерная молекула» означает вещество, способное присоединяться к субстрату или наносфере, а также способное присоединяться к комплексу антиген-МНС.
[0120] Термин «функциональная группа», использованный здесь ранее, не ограничивается реакционноспособными химическим группами, образующими ковалентные связи, но также включает химические группы, обеспечивающие ионные взаимодействия или водородные связи в составе комплекса антиген-МНС. Кроме того, следует отметить, что строгое разделение между «функциональными группами», образованными на поверхности, и линкерными молекулами, несущими «функциональные группы», невозможно, поскольку в некоторых случаях для модификации поверхности требуется взаимодействие с поверхностью наносферы более мелких линкерных молекул, таких как этиленгликоль.
[0121] Функциональные группы линкерных молекул, несущих их, могут быть выбраны из аминогрупп, карбоксильных групп, тиолов, тиоэфиров, дисульфидов, гуанидинов, гидроксильных групп, аминогрупп, вицинальных диолов, альдегидов, групп альфа-галоацетила, ртутьорганических соединений, эфирных групп, галоидангидрида, тиоэфиров кислот, ангидридов кислот, изоцианатов, изотиоцианатов, галидов сульфоновой кислоты, имидоэфиров, диазоацетатов, солей диазония, 1,2-дикетонов, фосфоновых кислот, эфиров фосфорной кислоты, сульфоновой кислоты, азолидов, имидазолов, индолов, N-малеимидов, альфа-бета-ненасыщенных карбонильных соединений, арилгалогенидов или их производных.
[0122] Другими не являющимися исчерпывающими примерами линкерных молекул с более высоким молекулярным весом являются молекулы нуклеиновых кислот, полимеры, сополимеры, полимеризуемые связывающие агенты, кремний, белки и молекулы цепочечного типа, имеющие поверхность с противоположным зарядом по отношению к субстрату или наносфере. Нуклеиновые кислоты могут образовывать связи с молекулами, обладающими аффинностью, в свою очередь содержащими молекулы нуклеиновых кислот, последовательность которых комплементарна по отношению к линкерной молекуле.
[0123] В качестве примеров полимеризуемых связывающих агентов можно перечислить диацетилен, сополимер бутадиена и стирола, винилацетат, акрилат, акриламид, винильные соединения, стирол, оксид кремния, оксид бора, оксид фосфора, бораты, пиррол, полипиррол и фосфаты.
[0124] Поверхность субстрата или наносферы может быть химически модифицирована, например, путем присоединения производных фосфоновой кислоты, имеющих реакционно-способные функциональные группировки. Одним из примеров производных фосфоновой кислоты или эфиров фосфоновой кислоты является имино-бис(метиленфосфоно)угольная кислота, которая может быть синтезирована в ходе реакции Манниха. Эта реакция связывания может быть проведена с субстратом или наносферой, как непосредственно полученными в ходе процесса изготовления, так и после предварительной обработки (например, триметилсилилбромидом). В первом случае производные (эфиров) фосфоновой кислоты могут, например, вытеснять компоненты реакционной среды, которые по-прежнему связаны с поверхностью. Такое замещение может быть усилено при более высоких температурах. С другой стороны, считается, что триметилсилилбромид деалкилирует комплексообразующие агенты на основе фосфора, содержащие алкильные группы, таким образом, способствуя образованию новых сайтов связывания для производных (эфиров) фосфоновой кислоты. Производное (эфиров) фосфоновой кислоты или связанные с ним линкерные молекулы могут экспонировать те же функциональные группы, которые указаны выше. Другой пример обработки поверхности субстрата или наносферы включает нагревание в диоле, таком как этилен гликоль. Следует отметить, что такая обработка может быть излишней, если синтез уже проведен в диоле. В этом случае продукт синтеза, полученный напрямую, скорее всего будет обладать необходимыми функциональными группами. Такая обработка, тем не менее, может применяться для субстрата или наносферы, которые были получены в N- или Р-содержащих комплексообразующих агентах. Если такой субстрат или частица подвергаются последующей обработке этиленгликолем, компоненты реакционной среды (например, комплексообразующий агент) по-прежнему связывающиеся с поверхностью, могут быть заменены на диол и/или могут быть деалкилированы.
[0125] Возможно также заменить N-содержащие комплексообразующие агенты, все еще связанные с поверхностью частицы, на производные первичных аминов, имеющие вторую функциональную группу. Поверхность субстрата или наносферы также может быть покрыта кремнием. Кремний позволяет относительно просто осуществлять химическую конъюгацию органических молекул, поскольку кремний легко реагирует с органическими линкерами, такими как триэтоксисилан или хлоросилан. Поверхность наносферы может также быть покрыта гомо- или сополимерами. Примерами полимеризуемых связывающих агентов являются N-(3-аминопропил)-3-меркаптобензамидин, 3-(триметоксисилил)пропилгидразид и 3-триметоксисилил)пропилмалеимид. Здесь упомянуты другие, не являющиеся исчерпывающими примеры полимеризуемых связывающих агентов. Эти связывающие агенты могут применяться по-отдельности или в комбинации, в зависимости от типа сополимера, который требуется получить в качестве покрытия.
[0126] Другим способом модификации поверхности, который может применяться к субстратам или наносферам, содержащим оксидные соединения переходных металлов, является конверсия оксидных соединений переходных металлов в соответствующие оксихлориды под воздействием газообразного хлора или органических хлорирующих агентов. Такие оксихлориды способны вступать в реакцию с нуклеофилами, такими как гидрокси- или аминогруппы, часто встречающимися в биомолекулах. Эта методика позволяет осуществить непосредственное конъюгирование с белками, например, через аминогруппу боковой цепи лизина. Конъюгирование с белками после модификации поверхности с помощью оксихлоридов также можно осуществить с использованием бифункционального линкера, такого как гидразид малеимидопропионовой кислоты.
[0127] Для методов нековалентного связывания особенно подходят молекулы цепочечного типа, имеющие полярность или заряд, противоположный по отношению к поверхности субстрата или наносферы. Примеры линкерных молекул, которые могут быть нековалентно связаны с наносферами ядра/оболочки, включают анионные, катионные или цвиттер-ионные сурфактанты, кислые или основные белки, полиамины, полиамиды, полисульфоны или поликарбоновую кислоту. Необходимую связь может образовать гидрофобное взаимодействие между субстратом или наносферой и амфифильным реагентом, имеющим реакционноспособную функциональную группу. В частности, могут применяться молекулы цепочечного типа с амфифильными свойствами, такие как фосфолипиды или производные полисахаридов, которые могут быть связаны друг с другом. Абсорбирование этих молекул на поверхности можно легко получить при совместной инкубации. Образование связи между молекулами, обладающими аффинностью, и субстратом или наносферой может быть также основано на нековалентных самоорганизующихся связях. Один из таких примеров включает простые детекторные зонды с биотином в качестве линкерной молекулы и авидин-или стрептавидин-связанными молекулами.
[0128] Протоколы реакций для связывания функциональных групп с биологическими молекулами могут быть найдены в литературе, например, в "Bioconjugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996). Биологические молекулы (например, молекула МНС или ее производные) могут быть связаны с линкерной молекулой, ковалентно или нековалентно, в соответствии со стандартными методами органической химии, такими как окисление, галогенизация, алкилирование, ацилирование, присоединение, замещение или амидирование. Эти способы присоединения ковалентно или нековалентно связанных линкерных молекул могут осуществляться до или после связывания линкерной молекулы с субстратом или наносферой. Кроме того, при помощи инкубации можно добиться прямого связывания молекул с субстратом или наносферами, предварительно обработанными соответствующим образом (например, триметилсилил бромидом), и обладающими модифицированной поверхностью благодаря такой предварительной обработке (например, более высоким зарядом или полярной поверхностью).
Д. Получение белков
[0129] В данном изобретении описаны полипептиды, пептиды и белки для применения в различных воплощениях данного изобретения. Например, оценивается способность определенных белков и их комплексов вызывать или модулировать иммунный ответ. В определенных воплощениях все или часть пептидов или белков по изобретению могут быть синтезированы в растворе или на твердой основе в соответствии с известными методами. Различные устройства, обеспечивающие автоматический синтез, доступны для приобретения и могут применяться в соответствии с известными протоколами. См., например, Stewart and Young (1984); Tam et al. (1983); Merrifield (1986) и Barany and Merrifield (1979), включенные сюда путем ссылки. Альтернативно, может использоваться технология рекомбинантных ДНК, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид по изобретению, встраивается в вектор экспрессии, после чего им трансформируют или трансфецируют соответствующую клетку-хозяина и проводят культивирование при условиях, обеспечивающих экспрессию.
[0130] Одно воплощение изобретения включает применение переноса генов в клетки, включая микроорганизмы, для продукции белков. Ген нужного белка может быть трансфецирован в соответствующие клетки-хозяева с последующим культивированием клеток при соответствующих условиях. Может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая по существу любой полипептид. Конструирование рекомбинантных векторов экспрессии и входящих в их состав элементов, известно специалистам в данной области и кратко описано в данном документе. Примеры линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки Vero и HeLa, другие В- и Т-клеточные линии, такие как СЕМ, 721.221, Н9, Jurkat, Raji, a также линии клеток яичников китайского хомячка, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3Т3, RIN и MDCK, но не ограничиваются ими. Кроме того, может быть выбрана линия клеток-хозяев, модулирующих экспрессию встроенных последовательностей или модифицирующих и осуществляющих процессинг генного продукта необходимым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут иметь важное значение для функций белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфичные механизмы пост-трансляционного процессинга и модификации белков. Соответствующие клеточные линии или системы клеток-хозяев могут быть выбраны для обеспечения надлежащей модификации и процессинга экспрессируемого чужеродного белка.
[0131] Можно применять ряд систем селекции, включая гены HSV тимидин киназы, гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы и аденин фосфорибозилтрансферазы в tk-, hgprt- или aprt-клетках, соответственно, но не ограничиваясь ими. Также, селекция может быть основана на использовании устойчивости к антиметаболитам: гена dhfr, обусловливающего устойчивость к триметоприму и метотрексату; gpt, обусловливающего устойчивость к микофеноловой кислоте; пео, обусловливающего устойчивость к аминогликозиду G418; и hygro, обусловливающего устойчивость к гигромицину.
Е. Нуклеиновые кислоты
[0132] Данное изобретение может включать рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие белки, полипептиды и пептиды по изобретению. Последовательности нуклеиновых кислот аутоантигенов и молекул МНС, презентирующих аутоантигены, находятся в рамках изобретения и могут применяться для получения комплексов пептид/МНС.
[0133] В данной заявке термин «полинуклеотид» обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая либо является рекомбинантной, либо выделена из общего пула геномных нуклеиновых кислот. Термин «полинуклеотид» включает олигонуклеотиды (нуклеиновые кислоты длиной 100 остатков или менее), рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фаги, вирусы и т.п. В некоторых аспектах полинуклеотиды включают регуляторные последовательности, по существу выделенные из последовательностей естественного происхождения, кодирующих белки, или генов. Полинуклеотиды могут представлять собой РНК, ДНК, их аналоги или комбинации.
[0134] В связи с этим термины «ген», «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» упоребляются для обозначения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, полипептид или пептид (включая любые последовательности, необходимые для корректной транскрипции, пост-трансляционной модификации или локализации). Специалистам очевидно, что этот термин включает геномные последовательности, экспрессионные кассеты, последовательности кДНК и более мелкие сегменты рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые экспрессируют или могут быть адаптированы для экспрессии белков, полипептидов, доменов, пептидов, гибридных белков и мутантов. Нуклеиновая кислота, кодирующая целый полипептид или его часть, может содержать непрерывающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть такого полипептида или весь полипептид, имеющую длину: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 или более нуклеотидов, нуклеозидов или пар оснований. Кроме того, предусматривается, что конкретный полипептид у заданного биологического вида может кодироваться нуклеиновыми кислотами, имеющими естественные вариации, т.е. имеющими небольшие различия в последовательностях нуклеиновых кислот, но при этом кодирующими тот же или по существу схожий белок, полипептид или пептид.
[0135] В конкретных воплощениях изобретение касается выделенных сегментов нуклеиновых кислот и рекомбинантных векторов, в которые встроены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аутоантиген и/или молекулу МНС. Термин «рекомбинантный» может употребляться в отношении полипептида или названия определенного полипептида, как правило, обозначая полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, с которой были проведены манипуляции in vitro или которая является продуктом репликации подобной молекулы.
[0136] Сегменты нуклеиновых кислот, применяемых в данном изобретении, независимо от длины самой кодирующей последовательности, можно комбинировать с другими последовательностями нуклеиновых кислот, например, промоторами, сигналами полиаденилирования, дополнительными сайтами рестрикции, сайтами множественного клонирования, другими кодирующими сегментами и т.п., при этом их общая длина может существенно варьировать. Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент нуклеиновой кислоты практически любой длины, предпочтительно, общая длина будет ограничиваться удобством получения и применения в необходимых протоколах, касающихся рекомбинантных нуклеиновых кислот.В некоторых случаях последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать полипептидную последовательность с дополнительными гетерологичными кодирующими последовательностями, например, обеспечивающими очистку полипептида, транспорт, секрецию, пост-трансляционные модификации или преимущества при терапии, такие как нацеленное воздействие или эффективность. К последовательности, кодирующей модифицированный полипептид, может быть добавлена метка (тэг) или иной гетерологичный пептид, в этом случае «гетерологичный» обозначает полипептид, отличающийся от модифицированного полипептида.
IV. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ
А. Иммунный ответ и методы количественного анализа
[0137] Как обсуждалось ранее, изобретение касается индукции или модификации иммунного ответа субъекта против аутоантигена. В одном воплощении возникающие в результате иммунный ответ или состояние могут обеспечивать защиту или лечение субъекта, у которого имеется, предполагается наличие или существует риск развития заболевания или симптомов, относящихся к аутоиммунному ответу.
1. Иммунологический анализ
[0138] Данное изобретение включает использование серологического анализа для определения наличия иммунного ответа и его выраженности, а также его индукции, провокации или модификации комплексом пептид/МНС/наносфера. Существует много видов иммунных тестов, которые могут быть использованы. Иммунологические тесты, находящиеся в рамках данного изобретения, включают описанные в патенте США 4,367,110 («сэндвич»-тест с двумя моноклональными антителами) и патенте США 4,452,901 (вестерн-блот), но не ограничиваются ими. Другие тесты включают иммунопреципитацию меченных лигандов и иммуноцитохимию, как in vitro, так и in vivo.
[0139] Одним из способов количественной оценки числа циркулирующих антиген-специфичных CD8+ Т клеток является тест связывания тетрамеров. В этом тесте специфичный эпитоп связан с синтетической тетрамерной формой флуоресцентно меченных молекул МНС I класса. Поскольку CD8+ Т клетки распознают антиген в виде коротких пептидов, связанных с молекулами I класса, клетки, несущие соответствующий Т клеточный рецептор, будут связываться с меченными тетрамерами, и их количество может быть определено при помощи проточной цитометрии. Несмотря на то, что этот способ требует меньших временных затрат, чем тест ELISPOT, тест связывания тетрамеров позволяет оценить только связывание, но не функцию. Не все клетки, связывающие конкретный антиген, обязательно будут активированы. Однако, была продемонстрирована корреляция между тестами ELISPOT, тестом связывания тетрамеров и тестом на цитотоксичность (Goulder et al., 2000).
[0140] Иммунологические тесты, как правило, представляют собой тесты связывания. Некоторые предпочтительные иммунологические тесты представляют собой различные виды иммуноферментного анализа (ELISAs), радиоиммунологического анализа (RIA) или тестов на основе гранул, такие как технология Luminex.RTM, известные в данной области техники. При использовании срезов тканей особенно целесообразно иммуногистохимическое определение.
[0141] В одном примере ELISA антитела или антигены иммобилизуют на определенной поверхности, такой как лунки полистироловых планшетов для микротитрования, тест-полосках или колонках. Затем в лунки добавляют тестируемую композицию, в которой предполагается наличие искомого антигена или антитела, например, клинический препарат. После связывания и отмывания для удаления неспецифически сваязанных иммунных комплексов, можно детектировать связавшиеся антиген или антитело. Детекция обычно проводится при добавлении другого антитела, специфичного к искомому антигену или антителу и связанного с детектируемой меткой. Этот вид ELISA известен как «сэндвич ELISA». Детекция может также проводиться при добавлении второго антитела, специфичного в отношении искомого антигена, с последующим добавлением третьего антитела, имеющего способность связываться со вторым антителом, при этом к третьему антителу присоединена детектируемая метка. Специалистам известны различные вариации методики ELISA.
[0142] Также возможно выполнение конкурентных тестов ELISA, в которых тестируемые образцы конкурируют за связывание с известным количеством меченных антигенов или антител. Количество реакционноспособных частиц в неизвестном образце определяется при смешивании образца с известным количеством меченных частиц до или во время инкубации в покрытых лунках. Присутствие реакционноспособных частиц в образце приводит к уменьшению количества меченных частиц, доступных для связывания с лунками, что снижает конечный сигнал.
[0143] Независимо от формата, ELISA имеют некоторые общие черты, такие как покрытие поверхности, инкубация или связывание, отмывка для удаления неспецифически связанных частиц и детекция связанных иммунных комплексов.
[0144] Антигены или антитела могут также быть связаны с твердой основой, например, плашками, гранулами, тест-полосками, мембранами или наполнителем колонок, а анализируемый образец может наноситься на иммобилизованный антиген или антитело. При покрывании планшетов антигеном или антителом обычно лунки планшета инкубируют с раствором антигена или антитела в течение ночи или указанного периода времени. Затем лунки планшета отмывают для удаления материала, не связавшегося полностью. Любые оставшиеся доступными поверхности лунок затем «покрывают» неспецифическим белком, который по антигенным свойствам является нейтральным по отношению к используемой в анализе антисыворотке. Сюда входят бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и растворы порошка молока. Покрытие позволяет заблокировать участки неспецифической адсорбции на иммобилизующей поверхности и таким образом снизить уровень фона, вызванного неспецифическим связыванием антисыворотки с поверхностью.
[0145] В методах ELISA чаще принято применять вторичные или третичные детектирующие агенты, чем прямую процедуру. Так, после связывания антигена или антитела с лунками, покрытия инертным материалом для снижения уровня фона и отмывки для удаления несвязанного материала, иммобилизующая поверхность затем приводится в контакт с тестируемым клиническим препаратом или биологическим образцом при условиях, обеспечивающих эффективное формирование иммунных комплексов (антиген/антитело). Для детекции иммунных комплексов затем требуется вторичный меченный связывающийся лиганд или антитело, или вторичный меченный связывающийся лиганд или антитело в сочетании с меченным третичным антителом или третьим связывающимся лигандом.
Б. Оценка аутоиммунного ответа или состояния
[0146] Кроме применения белков, полипептидов и/или пептидов для лечения или предупреждения аутоиммунного состояния, в данном изобретении предусматриваются различные варианты применения этих полипептидов, белков и/или пептидов, включая детекцию наличия аутоантигенов или наличия некоторых популяций аутореактивных клеток для диагностики аутоиммунного состояния. Согласно изобретению, способ детекции аутореактивности включает этап взятия у индивида образца для исследования, например образца крови, слюны, тканей, кости, мышцы, хряща или кожи. После взятия образца могут быть выполнены диагностические исследования с применением полипептидов, белков и/или пептидов по данному изобретению для детекции аутореактивности, эти методы исследований образцов хорошо известны специалистам и включают такие методы, как тест связывания тетрамеров, иммунологический анализ, вестерн блот и/или иммуноферментный анализ.
[0147] Используемое здесь выражение «иммунный ответ» или его эквивалент «иммунологический ответ» обозначают развитие клеточного ответа (опосредованного антиген-специфичными Т клетками или продуктами их секреции), направленного против аутоантигена или эпитопа аутоантигена. Клеточный иммунный ответ вызывает презентирование полипептидных эпитопов, связанных с молекулами I или II класса МНС, для активации антиген-специфичных CD4+ Т хелперных клеток и/или CD8+ цитотоксических Т клеток. Ответ может также включать активацию других компонентов.
[0148] Для целей данного описания и сопровождающей ее формулы изобретения термины «эпитоп» и «антигенная детерминанта» используются взаимозаменяемо для обозначения сайта антигена, на который отвечают или который распознают В и/или Т клетки. В-клеточные эпитопы могут быть образованы как последовательно расположенными аминокислотами, так и не прилегающими друг к другу аминокислотами, сближенными благодаря третичной укладке белка. Эпитопы, образованные прилегающими друг к другу аминокислотами, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих агентов, тогда как эпитопы, существующие благодаря третичной укладке, как правило, разрушаются при обработке денатурирующими агентами. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот, имеющих уникальную пространственную конформацию. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерно-магнитный резонанс. См, например, Epitope Mapping Protocols (1996). Т-клетки распознают линейные эпитопы размером приблизительно 9 аминокислот в случае CD8 клеток или приблизительно 13-15 аминокислот в случае CD4 клеток. Т клетки, распознающие эпитоп, могут быть идентифицированы при помощи in vitro тестов, в которых определяется антиген-зависимая пролиферация, например, по включению 3H-тимидина в примированные Т клетки в ответ на эпитоп (Burke et al., 1994), по антиген-зависимому киллингу (исследованию цитотоксических Т лимфоцитов, Tigges et al., 1996) или по секреции цитокинов. Наличие клеточно-опосредованного иммунологического ответа может быть определено при помощи исследования пролиферации (CD4+ Т клеток) или исследования CTL (цитотоксических Т лимфоцитов).
[0149] Здесь и в формуле изобретения термины «антитело» или «иммуноглобулин» используются взаимозаменяемо и обозначают любые из нескольких классов структурно родственных белков, функционирующих как часть иммунного ответа животного или реципиента, эти белки включают IgG, IgD, IgE, IgA, IgM и родственные им белки.
[0150] Возможно, аутоантиген или, предпочтительно, эпитоп аутоантигена могут быть химически конъюгированы или экспрессированы в виде белка, сшитого с другими белками, такими как МНС и родственные МНС белки.
[0151] Термины «иммуногенный агент» или «иммуноген» или «антиген» здесь используются взаимозаменяемо и описывают молекулу, способную индуцировать иммунологический ответ против себя при введении реципиенту, как самостоятельно, так и в сочетании с адъювантом или будучи презентированной на носителе.
В. Способы лечения
[0152] Способы данного изобретения включают лечение заболевания или патологического состояния, вызванного одним или более аутоантигенами. Иммуногенный полипептид по изобретению может даваться для индукции или модификации иммунного ответа у человека, который имеет, у которого подозревают наличие или у которого существует риск развития аутоиммунного состояния или заболевания. Способы могут осуществляться в отношении индивидов, у которых был выявлен положительный результат при тестировании на аутореактивность, или у которых признается риск развития такого состояния или схожего состояния.
V. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МИШЕНИ
[0153] Воплощения изобретения могут осуществляться для лечения или облегчения ряда иммуно-опосредованных или аутоиммунных заболевий, например, диабета, реакции отторжения трансплантата, и т.д. «Аутоиммунное заболевание» включает заболевания или нарушения, а также их проявления или возникающие в результате состояния, которые направлены против собственных тканей или органов индивида. В одном воплощении этот термин обозначает состояние, возникающее или отягощаемое вследствие выработки Т клеток, которые способны реагировать на нормальные ткани и антигены организма. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают: артрит (ревматоидный артрит, такой как острый артрит, хронический ревматоидный артрит, подагру или подагрический артрит, острый подагрический артрит, острый иммунологический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, индуцированный коллагеном II типа артрит, инфекционный артрит, Лайм-артрит, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, вертебральный артрит и ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, хронический прогредиентный артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит и анкилозирующий спондилит), воспалительные гиперпролиферативные заболевания кожи, псориаз, такой как бляшечный псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, атопию, включая атопические заблевания, такие как сенная лихорадка и синдром Джоба, дерматит, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, эксфолиативный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, герпетиформный дерматит, монетовидный дерматит, себорейный дерматит, неспецифический дерматит, первичный раздражающий контактный дерматит и атопический дерматит, Х-сцепленный гипер-IgM-синдром, аллергические внутриглазные воспалительные заболевания, крапивницу, такую как хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, миозит, полимиозит/дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, склеродермию (включая системную склеродермию), склероз, такой как системный склероз, рассеянный склероз (PC), такой как спинооптический PC, первичный прогрессирующий PC (ППРС) и рецидивирующий ремитирующий PC (PPPC), прогрессирующий системный склероз, атеросклероз, артериосклероз, sclerosis disseminate, атаксический склероз, нейромиелит зрительного нерва, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) (например, болезнь Крона, иммуноопосредованные желудочно-кишечные заболевания, колит, такой как язвенный колит, colitis ulcerosa, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит, а также аутоиммунные воспалительные заболевания кишечника), воспаление кишечника, гангренозную пиодермию, узелковую эритему, первичный склерозирующий холангит, респираторный дистресс-синдром, включая респираторный дистресс-синдром взрослых или острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), менингит, воспаление всей или части сосудистой оболочки глаза, ирит, хориоидит, аутоиммунные гематологические нарушения, ревматоидный спондилит, ревматоидный синовит, наследственный ангионевротический отек, поражение черепно-мозговых нервов как при менингите, гестационный герпес, гестационный пемфигоид, мошоночный зуд, аутоиммунный синдром истощения яичников, внезапную потерю слуха из-за аутоиммунного нарушения, IgE-опосредованные заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и энцефалит с поражением лимбической системы и/или энцефалит ствола головного мозга, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит или аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (ГН) с нефротическим синдромом или без, такой как хронический или острый гломерулонефрит, такой как первичный ГН, иммуноопосредованный ГН, мембранозный ГН (мембранозную нефропатию), идиопатический мембранозный ГН или идиопатическую мембранозную нефропатию, мембранный или мембранозный пролиферативный ГН (МПГН), включая тип I и тип II, а также быстро прогрессирующий ГН, пролиферативный нефрит, аутоиммунную полигландулярную эндокринную недостаточность, баланит, включая ограниченный плазмоклеточный баланит, баланопостит, кольцевидную центробежную эритему, стойкую дисхромическую эритему, мультиформную эритему, кольцевидную гранулему, блестящий лишай, склерозирующий атрофический лишай, простой хронический лишай, шиловидный лишай, плоский лишай, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предраковый кератоз, гангренозную пиодермию, аллергические состояния и ответы, аллергические реакции, экзему, включая аллергическую или атопическую экзему, астеатотическую экзему, дисгидротическую экзему и пузырчатую ладонно-подошвенную экзему, астму, такую как asthma bronchiale, бронхиальная астма и аутоиммунная астма, нарушения, сопровождающиеся Т-клеточной инфильтрацией и хроническим воспалительным ответом, иммунные реакции против чужеродных антигенов, таких как группы крови А-В-O плода во время беременности, хронические воспалительные заболевания легких, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, волчанку, включая волчаночный нефрит, волчаночный церебрит, детскую волчанку, непочечную волчанку, экстраренальную волчанку, дискоидную волчанку и дискоидный волчаночный эритематоз, волчаночную алопецию, системную красную волчанку (СКВ), такую как кожная СКВ или подострая кожная СКВ, неонатальный волчаночный синдром (NLE) и диссеминированный волчаночный эритематоз, ювенильный сахарный диабет (I типа), включая детский инсулин-зависимый сахарный диабет (ИЗСД) и сахарный диабет взрослых (диабет II типа). Кроме того, рассматриваются иммунные ответы, ассоциированные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, саркоидоз, гранулематоз, включая лимфоматоидный гранулематоз, гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулиты, включая васкулит, васкулит крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (Такаясу), васкулит сосудов среднего калибра (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит/узелковый периартериит), микроскопический полиартериит, иммуноваскулит, васкулит ЦНС, кожный васкулит, васкулит гиперчувствительности, некротизирующий васкулит, такой как системный некротизирующий васкулит и АНЦА-ассоциированный васкулит, такой как васкулит или синдром Черджа-Стросса (СЧС) и АНЦА-ассоциированный васкулит мелких сосудов, височный артериит, апластическую анемию, аутоиммунную апластическую анемию, анемию с положительной реакцией Кумбса, анемию Даймонда-Блэкфана, гемолитическую анемию или иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА), болезнь Аддисона, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, сопровождающиеся диапедезом лейкоцитов, воспалительные заболевания ЦНС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром множественного поражения органов, такой как вторичные синдромы при септицемии, травме или геморрагии, заболевания, опосредованные комплексами антиген-антитело, заболевания, обусловленные антителами к базальной мембране клубочков, антифосфолипидный синдром, аллергический неврит, болезнь/синдром Бехчета, синдром Кастлемана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивена-Джонсона, пемфигоид, такой как буллезный пемфигоид и кожный пемфигоид, пемфигус (включая обыкновенную пузырчатку, листовидный пемфигус, пемфигус и пемфигоид слизистой оболочки и эритематозный пемфигус), аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь или синдром Рейтера, термическое повреждение, преэклампсию, заболевания, опосредованные иммунными комплексами, такие как иммунокомплексный нефрит, антитело-опосредованный нефрит, полинейропатии, хроническую нейропатию, такую как IgM-полинейропатии или IgM-опосредованная нейропатия, аутоиммунную или иммуно-опосредованную тромбоцитопению, такую как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), включая хроническую или острую ИТП, склерит, такой как идиопатический кератосклерит, эписклерит, аутоиммунные заболевания семенников и яичников, включая аутоиммунные орхит и оофорит, первичный гипотиреоидизм, гипопаратиреоидизм, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото) или подострый тиреоидит, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, идиопатический гипотиреоз, болезнь Грейвса, полигландулярные синдромы, такие как аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластические синдромы, включая неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Итона-Лабмерта, синдром мышечной скованности или синдром «негнущегося человека», энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит, или encephalomyelitis allergica и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), миастению гравис, такую как ассоциированная с тимомой миастения гравис, мозжечковую дегенерацию, нейромиотонию, опсоклонус или опсоклонус-миоклонус синдром (ОМС) и сенсорную нейропатию, мультифокальную моторную нейропатию, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, люпоидный гепатит, гигантокпеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (ЛИП), облитерирующий бронхиолит (не трансплантационный), отличающийся от НСИП, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (IgA-нефропатия), идиопатическую IgA-нефропатию, линейный IgA дерматоз, острый фебрильный нейтрофильный дерматоз, подроговичный пустулезный дерматоз, транзиторный акантолитический дерматоз, цирроз, такой как первичный билиарный цирроз и пневмоноцирроз, аутоиммунную энтеропатию, целиакию, спру-целиакию (глютеновую энтеропатию), рефракторную спру, идиопатическую спру, криоглобулинемию, амиотрофический латеральный склероз (АЛС; болезнь Лоу-Герига), болезнь коронарных артерий, аутоиммунные болезни уха, такие как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), аутоиммунную потерю слуха, полихондрит, такой как рефракторный или рецидивирующий хондрит, легочный альвеолярный протеиноз, синдром Когана/несифилитический интерстициальный кератит, паралич Белла, болезнь/синдром Свита, аутоиммунную розацеа, боль, связанную с опоясывающим лишаем, амилоидоз, незлокачественный лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, включая моноклональный В-клеточный лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммапатию и моноклональную гаммапатию неясного значения (МГНЗ), периферическую нейропатию, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные расстройства, глухота, слепота, пароксизмальный паралич и каналопатии ЦНС, аутизм, воспалительную миопатию, фокальный или сегментарный или фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), эндокринную офтальмопатию, увеоретинит, хориоретинит, аутоиммунные поражения печени, фибромиалгию, множественную эндокринную недостаточность, синдром Шмидта, адреналит, атрофию желудка, пресенильную деменцию, демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, синдром Дресслера, гнездную алопецию, тотальную алопецию, CREST-синдром (кальциноз, синдром Рейно, эзофагальная дискинезия, склеродактилия и телеангиэктазия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, например, из-за наличия антиспермальных антител, смешанные заболевания соединительной ткани, болезнь Чагаса, ревматическую лихорадку, привычную потерю беременности, легкое фермера, полиморфную эритему, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легкое птицевода, аллергический гранулематозный ангиит, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический альвеолит и фиброзирующий альвеолит, интерстициальные заболевания легких, трансфузионную реакцию, лепру, малярию, паразитарные заболевания, такие как лейшманиоз, кипаносомиоз, шистозомоз, аскаридоз, аспергиллез, синдром Самптера, синдром Каплана, лихорадку денге, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, диффузный интерстициальный легочный фиброз, интерстициальный легочный фиброз, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, кистозный фиброз, эндофтальмит, стойкую возвышающуюся эритему, гемолитическую болезнь новорожденных, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филариоз, циклит, такой как хронический циклит, гетерохронный циклит, иридоциклит (острый или хронический) или циклит Фукса, пурпуру Шенлейна-Геноха, инфицирование вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), тяжелую комбинированную иммунную недостаточность, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), эховирусную инфекцию, сепсис, эндотоксемию, панкреатит, тиреотоксикоз, парвовирусную инфекцию, инфицирование вирусом краснухи, пост-вакцинальные синдромы, синдром врожденной краснухи, инфицирование вирусом Эпштейна-Барр, паротит, синдром Эванса, аутоиммунное поражение гонад, хорею Сиденгама, постстрептококковый нефрит, облитерирующий тромбангиит, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозга, хориоидит, гигантоклеточную полимиалгию, хронический гиперчувствительный пневмонит, сухой кератоконъюнктивит, эпидемический кератоконъюнктивит, идиопатический нефритический синдром, нефропатию с минимальными изменениями, доброкачественное семейное повреждение и повреждение вследствие ишемии-реперфузии, реперфузионное повреждение трансплантированного органа, аутоиммунные заболевания сетчатки, воспаления суставов, бронхит, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей/легких, силикоз, афты, афтозный стоматит, артериосклеротические заболевания, асперматогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Бека, криоглобулинемию, контрактуру Дюпюитрена, факоанафилактический эндофтальмит, аллергический энтерит, лепрозную узелковую эритему, идиопатический паралич лицевого нерва, синдром хронической усталости, ревматическую лихорадку, болезнь Хаммена-Рича, сенсоневральную потерю слуха, пароксизмальную гемоглобинурию, гипогонадизм, региональный илеит, лейкопению, инфекционный мононуклеоз, поперечный миелит, первичную идиопатическую микседему, нефроз, симпатическую офтальмию, гранулематозный орхит, панкреатит, острый полирадикулит, гангренозную пиодермию, тиреоидит Кервена, приобретенную атрофию селезенки, незлокачественную тимому, витилиго, синдром токсического шока, пищевые отравления, состояния, сопровождающиеся Т-клеточной инфильтрацией, нарушение адгезии лейкоцитов, иммунные ответы, ассоциированные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, заболевания, сопровождающиеся диапедезом лейкоцитов, синдром множественного поражения органов, заболевания, опосредованные комплексами антиген-антитело, заболевания, обусловленные антителами к базальной мембране клубочков, аллергический неврит, аутоиммунные полиэндокринопатии, оофорит, первичную микседему, аутоиммунный атрофический гастрит, симпатическую офтальмию, ревматические заболевания, смешанные заболевания соединительной ткани, нефротический синдром, инсулит, полиэндокринную недостаточность, аутоиммунный полигландулярный синдром I типа, идиопатический гипопаратиреоз взрослых, кардиомиопатии, такие как дилятационная кардиомиопатия, приобретенный буллезный эпидермолиз (ПБЭ), гемохроматоз, миокардит, нефротический синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или негнойный синусит, острый или хронический синусит, этмоидный, фронтальный, максиллярный или сфеноидный синусит, нарушения, связанные с эозинофилами такие как эозинофилия, легочная инфильтрация с эозинофилией, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Леффлера, хроническую эозинофильную пневмонию, тропическую легочную эозинофилию, бронхолегочный аспергиллез, аспергиллому или гранулемы, содержащие эозинофилы, анафилаксию, серонегативные спондилоартриты, полиэндокринные аутоиммунные заболевания, склерозирующий холангит, хронический кожно-слизистый кандидоз склеры и эписклеры, синдром Брутона, транзиторную гипогаммаглобулинемию грудного возраста, синдром Вискотта-Олдрича, синдром атаксии-телеангиэктазии, ангиэктазию, аутоиммунные нарушения, связанные с коллагеновыми заболеваниями, ревматизм, неврологические заболевания, лимфаденит, снижение ответа кровяного давления, сосудистую дисфункцию, повреждение тканей, сердечно-сосудистую ишемию, гипералгезию, почечную ишемию, церебральную ишемию и заболевания, сопровождающие васкуляризацию, аллергические расстройства, связанные с гиперчувствительностью, гломерулонефриты, реперфузионное повреждение, ишемическое реперфузионное повреждение, реперфузионное повреждение миокарда или других тканей, лимфоматозный трахеобронхит, воспалительный дерматоз, дерматозы с острым воспалительным компонентом, полиорганную недостаточность, буллезные заболевания, почечный кортикальный некроз, острый гнойный менингит или другие воспалительные заболевания центральной нервной системы, воспалительные заболевания глаз и глазницы, ассоциированные с трансфузией гранулоцитов синдромы, индуцированную цитокинами токсичность, нарколепсию, острое тяжелое воспаление, стойкое хроническое воспаление, пиелит, эндартериальную гиперплазию, пептическую язву, вальвулит и эндометриоз, но не ограничиваются ими.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0154] Следующие примеры приведены в целях иллюстрации различных воплощений изобретения и не исчерпывают данного изобретения каким-либо образом. Специалисты без труда определят, что данное изобретение способно обеспечить реализацию указанных целей, и получение результатов и эффектов, а также целей, результатов и эффектов, присущих данному изобретению. Данные примеры в совокупности с описанными здесь способами, являются репрезентативными для предпочтительных воплощений, приводятся в качестве примеров и не ограничивают рамок изобретения. Специалистам в данной области могут быть очевидны модификации и другие применения, находящиеся в духе изобретения, границы которого определены формулой изобретения.
Пример 1
Защита от СД1 при помощи терапии наносферами с покрытием пептид/МНС
[0155] Защита от диабета при помощи терапии супер-парамагнитными наносферами, покрытыми мономерами NRP-V7/Kd. Для исследования, вызывают ли наносферы, покрытые NRP-V7/Kd, иммунную толерантность in vivo, 8.3-TCR-трансгенные мыши NOD (далее также обозначаемые 8.3-NOD или Vα17.4+TCR-TG мыши) будут получать несколько внутривенных инъекций малых объемов наносфер (5 мкл, несущих 0,6 мкг NRP-V7, один раз каждые 3 дня). Предполагается, что трансгенные высокоавидные IGRP206-214-реакционноспособные пулы CD8+ Т-клеток селезенки этих мышей будут существенно истощены. Также предполагается, что у тех CD8+T клеток, которые не были элиминированы, терапия будет индуцировать анергию.
[0156] Для исследования эффективности «мультиплексирования» наносферы будут покрыты 6 различными мономерами пептид/МНС. Группы мышей NOD дикого типа будут получать совокупность этих наносфер, покрытых контрольным пептидом (TUM)/Kd или покрытых NRP-V7/Kd. Предполагается, что мыши NOD, получавшие NRP-V7/Kd-покрытые наносферы (один раз в 2-3 недели) будут иметь высокую степень защиты от СД1, а мыши, получавшие непокрытые наносферы, наносферы покрытые авидином и биотином, наносферы покрытые TUM/Kd или только пептид NRP V7, не будут защищены от СД1.
[0157] Системная пролиферация низкоавидных клонотипов при терапии наносферами, покрытыми мономерами NRP-V7/Kd. Исследования будут проводиться с применением радиоактивно-меченных наносфер для изучения их распределения в тканях. Предполагается, что будет иметь место системное распределение в тканях у обследованных мышей всех возрастов. Также предполагается, что у мышей терапия наносферами не приведет к повышению сывороточного уровня цитокинов в результате стимуляции различных типов клеток иммунной системы, включая NRP-V7- реакционноспособные CD8+ Т-клетки.
[0158] Считается, что у мышей, получавших NRP-V7/Kd-покрытые наносферы, будут существенно увеличены пулы циркулирующих и внутриостровковых NRP-V7/Kd тетрамер-позитивных CD8+ клеток в конце периода наблюдения (32 недели) по сравнению с теми не имеющими диабета животными сопоставимого возраста, которые получали контрольные наносферы. Также считается, что, внутриостровковые CD8+ Т-клетки мышей, получавших NRP-V7/Kd-наносферы, будут связывать тетрамеры NRP-V7/Kd с существенно более низкой авидностью (более высокой Kd) по сравнению с клетками панкреатических островков контрольных мышей, что позволит предположить, что терапия наносферами будет дозозависимым образом усиливать пролиферацию антипатогенных низкоавидных клонотипов в ущерб их патогенным высокоавидным аналогам.
[0159] Для исследования распознавания и поглощения NRP V7/K/Kd-покрытых наносфер авторы изоретения будут оценивать наличие зеленой флуоресценции (связанного с авидином комплекса пептид-МНС-наночастица) в различных субпопуляциях спленоцитов мышей NOD, экспрессирующих трансгенные TCR, способные реагировать с NRP-V7, а также у нетрансгенных мышей NOD дикого типа. Предполагается, что при инъекции NRP-V7/Kd наносфер зеленая флуоресценция будет наблюдаться только в субпопуляции CD8+ Т-клеток TCR-трансгенных мышей и, в гораздо меньшей степени, в субпопуляции CD8+ Т-клеток нетрансгенных мышей. Также считается, что зеленая флуоресценция не будет наблюдаться в субпопуляциях CD4+ Т, В, CD11b+ или CD11c+ клеток селезенки мышей любого типа.
[0160] Антидиабетогенные свойства наносфер, покрытых комплексами субдоминантный аутоантигенный пептид/МНС (DMK138-146/Db). Авторы изобретения будут изучать, является ли протективный эффект вышеупомянутого терапевтического подхода особенностью CD8+ Т-клеток, способных реагировать с NRP-V7 (преобладающей субпопуляции аутореактивных Т-клеток у мышей NOD) или феноменом, касающимся и других менее распространенных аутоантигенных клонотипов. С этой целью мыши будут получать гранулы, покрытые пептидом, полученным на основе другого аутоантигена, презентируемого Db, с которым направленно взаимодействует существенно меньший пул диабетогенных аутореактивных CD8+ Т-клеток (остатки 138-146 белка DMK (от англ. Dystrophia Myotonica Kinase); обозначаемые здесь как "DMK138-146/Db") (Lieberman et al., 2004). Предполагается, что терапия мышей NOD наносферами, покрытыми DMK138-146/Db, вызовет значительную пролиферацию способных реагировать с DMK138-146/Db CD8+ Т клеток в циркуляции, в селезенке и внутри островков и обеспечит выраженную защиту от диабета. Также предполагается, что пролиферация Т клеток in vivo. будет антиген-специфичной, поскольку наносферы, покрытые DMK138-146/Db, вероятно, не будут вызывать пролиферацию CD8+ Т клеток, способных реагировать с NRP-V7, а наносферы, покрытые NRP-V7/Kd, вероятно, не будут вызывать пролиферацию Т клеток, способных реагировать с DMK138-146/Db.
[0161] Нарушенный рекрутинг других IGRP-аутореактивных CD8+ Т-клонотипов, в панкреатические островки мышей, получавших NRP-V7/Kd- или DMK138-146/Db-покрытые наносферы. Авторы изобретения исследуют, будет ли рекрутинг низкоавидных NRP-V7- и/или DMK138-146/Db- реакционноспособных CD8+ Т клеток, пролиферация которых была вызвана наносферами, нарушать рекрутинг в островки других аутореактивных в отношении бета-клеток Т-клонотипов. Для этого будет проведено сравнение ответной реакции ассоциированных с островками CD8+ Т клеток мышей, получавших контрольные, NRP-V7/Kd- или DMK138-146/Db-покрытые наносферы, на панель 76 различных эпитопов IGRP, а также на DMK138-146. Ожидается, что ассоциированные с островками CD8+ Т клетки мышей, получавших NRP-V7/Kd-покрытые и DMK138-146/Db-покрытые наносферы, будут продуцировать существенно больше IFN-γ в ответ на NRP-V7 и DMK138-146, соответственно, чем клетки контрольных мышей. Предполагается, что у мышей, получавших NRP-V7/Kd или DMK138-146/Db-покрытые наносферы, по сравнению с мышами, получавшими контрольные наносферы, существенно меньшее количество эпитопов будет способно вызывать значительную выработку IFN-γ ассоциированными с островками CD8+ Т клетками, что будет предполагать нарушение их рекрутинга и/или накопления.
[0162] Считается, что NRP-V7/Kd- и DMK138-146/Db-покрытые наносферы будут индуцировать высокую частоту наступления ремиссии у мышей NOD с впервые диагностированным диабетом. Будет исследована возможность восстанавливать нормогликемию у мышей с впервые диагностированным диабетом посредством терапии с применением наносфер. В группах мышей будет дважды в неделю определяться уровень глюкозы, и уровень глюкозы крови ≥10,5 мМ будет расцениваться как гипергликемия. Мыши будут рандомизированы в группы, которые будут получать TUM/Kd-покрытые наносферы или NRP-V7/Kd-покрытые наносферы (две инъекции в неделю). Мышам с глюкозурией будет вводиться половина дозы инсулина подкожно один раз в неделю для снижения нагрузки на бета-клетки и содействия регенерации бета-клеток. Другие группы мышей будут получать DMK138-146/Db-покрытые наносферы. Терапия моноклональными антителами к CD3 (20 мкг/сут в течение 5 дней), продемонстрировавшая способность вызывать стабильную ремиссию у различного процента животных в разных исследованиях, будет применяться в качестве положительного контроля. Предполагается, что у большинства мышей, получавших NRP-V7/Kd-покрытые наносферы, нормогликемия установится через 5-12 недель терапии. Аналогично, предполагается, что нормогликемия установится у большинства мышей, получавших DMK138-146/Db-покрытые наносферы. Ожидается, что у большинства мышей, получавших контрольные TUM/Kd-покрытые наносферы, будет прогрессировать выраженная гипергликемия.
[0163] Для исследования того, является ли эффект лечения мышей с диабетом долговременным, лечение будет прекращено после сохранения нормогликемии в течение 4 недель подряд, и у мышей будут отслеживать рецидивирование диабета. Эффект терапии на величину циркулирующего пула тетрамер-позитивных клеток будет оцениваться при отмене лечения, через 4 недели и в момент повторного возникновения гипергликемии. Предполагается, что через 4 недели после прекращения терапии величина пула циркулирующих Т клеток, способных реагировать с тетрамерами, будет снижена. В этом случае для долговременной защиты может потребоваться реактивация пролиферировавшего пула низкоавидных аутореактивных Т-клеток, либо при помощи эндогенного аутоантигена (т.е. у животных с преддиабетом), либо при помощи повторных инъекций наносфер (т.е. у больных диабетом животных с резко пониженной массой бета-клеток).
[0164] Предполагается, что интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе (ИПТТГ) у излеченных мышей по сравнению с мышами, имеющими диабет, и нелеченными мышами, не имеющими диабета, продемонстрирует, что у первых кривые концентраций глюкозы практически идентичны животным, не имеющим диабета и не получавшим лечения, и существенно лучше, чем у мышей с диабетом. Кроме того, считается, что у излеченных животных уровни постпрандиального инсулина сыворотки будут статистически сопоставимы с уровнями нелеченных мышей, не имеющих диабета, и существенно выше, чем у нелеченных животных с диабетом.
[0165] Исследование возможности наносфер с покрытием пептид/МНС эффективно «различать» высоко- и низкоавидные аутореактивные CD8+ Т-клетки. Большинство способных реагировать с IGRP206-214 CD8+ клеток обладают CDR3-инвариантными Vα17-Jα42 цепями и гетерогенными VDJβ цепями. «Созревание авидности» этой субпопуляции Т клеток в ходе развития диабета связано с изменением соотношения 3 различных элементов Vα17. Подтверждение тому, что эти 3 разных Vα элемента обусловливают различия в авидности связывания лигандов (Vα17.5>Vα17.4>Vα17.6) было получено в исследованиях клеток, трансфецированных TCRαβ, экспрессирующих 3 различные CDR3-инвариантные цепи Vα17-Jα42 и одинаковые TCRβ цепи (Han et al., 2005). Для исследования того, способны ли наносферы с покрытием пептид/МНС по-разному воздействовать на Т клетки, распознающие лиганды с различной авидностью, будет оцениваться способность NRP-V7/Kd-покрытых наносфер индуцировать «кэппинг» молекул CD8 у этих трансфектантов. Предполагается, что через 5 мин инкубации с NRP-V7/Kd-покрытыми наносферами «шапочки» будут образовываться у большего числа Vα17.5+ клеток по сравнению с Vα17.4+ или Vα17.6+ клетками. Данный результат будет указывать, что NRP-V7/Kd-покрытые наносферы могут действительно «различать» высоко- и низкоавидные Т клетки, и объяснять, почему эти наносферы предпочтительно вызывают элиминацию высокоавидных наивных клонотипов.
[0166] CD8+ клетки, экспрессирующие низкоаффиннные Vα17.6/8.3β TCR, являются антидиабетогенными. Для исследования, обладают ли низкоавидные аутореактивные CD8+ Т-клетки антидиабетогенными свойствами in vivo, Vα17.6/8.3β TCR, способные реагировать с IGRP206-214 с низкой аффинностью (обозначаемые здесь ‘Vα17.6+’; имеющие ~в 10 раз меньшую аффинность по сравнению с 8.3-TCR (Vα17.4+); Teyton and Santamaria, неопубликованные данные), будут трансгенно экспрессировать в мышах NOD. Было показано, что эти TCR способствуют положительной селекции CD8+ клеток, но значительно слабее, чем 8.3-TCR (Vα17.4+) (Han et al., 2005). В результате Vα17.6+ TCR-TG мыши имеют меньшее количество CD8+ тимоцитов и спленоцитов, способных связывать тетрамеры NRP-V7, по сравнению с Vα17.4+ TCR-TG мышами. Кроме того, при стимуляции пептидом in vitro, тетрамер-позитивных (hi и lo) CD8+ клетки мышей Vα17.6+ TCR-TG секретируют меньше IFN-γ (и IL-2), чем клетки мышей Vα17.4+ TCR-TG, и менее эффективно уничтожают NRP-V7-активированные клетки-мишени RMA-S-Kd, что находится в соответствии с их низкой авидностью к лигандам (Han et а1., 2005; и не приведенные данные). Наиболее важно то, что эти мыши имеют практически полную защиту от диабета (только у 2 из 70 самок развился СД1) и инсулита [индекс <0,4 против >3 (из максимально 4) у мышей Vα17.6+ по сравнению с мышами Vα17.4+ TCR-TG, соответственно (Р<0,012)] (Фиг.1А и Фиг.1В).
[0167] Это разительно контрастирует с тем, что происходит у NOD мышей, экспрессирующих иррелевантный не являющийся аутореактивным TCR, распознающий эпитоп LCMV (LCMV TCR-TG NOD мыши). Как было описано ранее Serreze et al. (2001) и подтверждено в данном исследовании, у этих мышей развивается СД1 по-существу, как у мышей NOD дикого типа, и имеет место рекрутинг эдогенных CD8+ клеток, способных реагировать с IGRP206-214, в островки (полностью отсутствующий в островках мышей Vα17.6+ TCR-TG) (Фиг.1C). Таким образом, в отличие от Vα17.4+ TCR и LCMV TCR (продиабетогенного и нейтрального, соответственно), Vα17.6+ TCR проявляет антидиабетогенные свойства.
[0168] Несмотря на то, что большинство трансгенных Т клеток мышей Vα17.6+ TCR-TG связывают тетрамеры слабо или совсем не связывают, фракция клеток, образуемых в тимусе, связывает тетрамер с очевидно высокой авидностью (т.е. с высокими значениями средней интенсивности флуоресценции) (Фиг.2А). Авторы изобретения предполагают, что CD8+ Т клетки этих мышей с низким уровнем связывания или с отсутствием связывания тетрамеров происходят от CD4+CD8+ тимоцитов, экспрессирующих TG TCR, но проходящих позитивную селекцию при участии эндогенных TCRs (т.е. TCRα цепей). Клетки с высоким уровнем связывания тетрамеров, напротив, происходят от CD4+ CD8+ тимоцитов, которые экспрессируют только TG TCRαβ цепи, и из-за своей низкой аффинности к комплексам пептид/МНС, могут проходить позитивную селекцию только в случае экспрессии ими TG TCR, превышающей нормальный уровень. В пользу данной интерпретации свидетельствует тот факт, что у мышей RAG-2-/-, экспрессирующих Vα17.6+ TCR, созревание проходят только те клетки, которые связывают тетрамер с высокой авидностью (FIG.2B). Важно, что у этих двух типов мышей RAG-2-/- TCR-TG диабет возникает с одинаковой частотой (Фиг.3). Таким образом, исследователи полагают, что CD8+ Т клетки с низким уровнем связывания тетрамеров и с отсутствием связывания, проходящие созревание у мышей RAG-2+Vα17.6 TCR-TG, ингибируют диабетогенный потенциал своих аналогов с высоким уровнем связывания тетрамеров (что приводит к развитию диабета у мышей RAG-/- TCR-TG). Эти результаты были воспроизведены в линии мышей Vα17.6 TCR-TG, имеющих эндогенный дефицит TCR-Cα, что препятствует экспрессии эндогенных (т.е., не являющихся трансгенными) TCRα цепей (Фиг.4А и 4В).
[0169] Мыши Vα17.6+ (но не Vα17.4+) TCR-TG спонтанно образуют пул CD8+ клеток памяти с иммуносупрессорной активностью. Цитофлуориметрический анализ тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток, содержащихся в различных лимфоидных органах мышей Vα17.6 TCR-TG и мышей Vα17.6 TCR-TG с дефицитом TCR-Cα, обнаружил наличие увеличенных пулов CD44hi и CD44hiCD122+ CD8+ клеток в селезенке, лимфатических узлах и особенно, в костном мозге, который известен как резервуар Т-клеток памяти (Фиг.5А и 5В) по сравнению с мышами Vα17.4+ TCR-TG. Важное значение имеет тот факт, что это по большей части было характерно для субпопуляции с низким, а не с высоким уровнем связывания тетрамеров, которая не содержит CD122+ клеток (Фиг.5С). Эти клетки экспрессируют маркеры, описанные как для центральных, так и для эффекторных лимфоцитов памяти (Фиг.5D), и преимущественно обнаруживаются в периферических лимфоидных органах, но не в тимусе, что предполагает их «периферическое» происхождение (Фиг.5Е). Более того, тесты включения BrdU позволили предположить, что для них характерна пролиферация in vivo (Фиг.5F). В функциональном плане эти подобные клеткам памяти клетки четко ведут себя как Т-клетки «памяти», поскольку выделенные Vα17.6+ (но не Vα17.4+) TCR-TG CD8+ клетки селезенки бурно пролиферируют в ответ на IL-2 или IL-15 в отсутствие антиген-презентирующих клеток и антигена (Фиг.5G). Более того, они быстро продуцируют IFN-γ при стимуляции антигеном in vitro (Фиг.5Н и 5I). Однако, они не пролиферируют и не продуцируют интерлейкин-2 при стимуляции антигеном in vitro (Фиг.5J). Такой функциональный профиль во многом напоминает профиль субпопуляции регуляторных (супрессорных) CD4+CD25+ Т клеток. В совокупности, эти данные позволяют предположить, что Vα17.6+ (но не Vα17.4+) TCR-TG CD8+ клетки обладают повышенной способностью становиться долгоживущими Т-клетками памяти (при встрече с одним или более антигенами), предположительно способными выживать неопределенно долго в ответ на гомеостатические стимулы, даже в отсутствие антигена.
[0170] Эти наблюдения позволили авторам изобретения предположить, что лучшее гомеостатическое «состояние» этих низкоавидных Т-клеток памяти, не способных уничтожать бета-клетки, способствует их антидиабетогенной активности (т.е. путем обеспечения конкурентного преимущества по сравнению с высокоавидными, но преимущественно наивными клонотипами, уничтожающими бета-клетки, и/или путем ингибирования их активации). Для оценки последнего предположения исследовали способность изолированных CD122+ и CD122-Vα17.6+’ TCR-TG CD8+ Т клеток ингибировать пролиферацию меченных CFSE CD8+ Т клеток селезенки Vα17.4+ TCR-TG мышей NOD. Как показано на Фиг.6, CD122+ (но не CD122-) Vα17.6+ TCR-TG CD8+ Т клетки практически полностью ингибировали пролиферацию своих наивных Т клеточных аналогов, обладающих более высокой авидностью.
[0171] В соответствии с предположением о том, что спонтанно увеличенный пул (CD122+) аутореактивных CD8+ Т клеток памяти с низкой авидностью у Vα17.6+ TCR-TG мышей NOD является антидиабетогенным, системная (внутривенная) терапия Vα17.6+ и Vα17.4+ TCR-TG мышей NRP-V7-активированными дендритными клетками, агонистическим моноклональным антителом к CD40 или агонистическим моноклональным антителом к 4-1ВВ (для повышения активации/жизнеспособности CD8+ Т клеток), вызывала быстрое развитие диабета у Vα17.4+ TCR-TG NOD мышей, но была неспособна вызвать заболевание у Vα17.6+ TCR-TG мышей (Таблица 4).
[0172] Способность CD122+ Vα17.6+ TCR-TG CD8+ Т клеток подавлять ответы родственных и неродственных диабетогенных Т клеток (т.е., направленных против аутоантигенных пептидов, отличных от аутоантигенных пептидов-мишеней этих супрессорных Т-клеток-IGRP206-214-), позволила авторам изобретения предположить, что они могут осуществлять свою супрессорную активность путем направленного воздействия на антиген-презентирующие клетки (APCs). Определение цитотоксичности (по высвобождению 51хрома) с применением в качестве клеток-мишеней активированных пептидом дендритных клеток и в качестве эффекторных клеток CD122+ или CD122-Vα17.6+ и CD122-Vα17.4+ TCR-TG CD8+ Т клеток показало, что первые из них, но не последние были способны вызывать специфичный лизис NRP-V7-активированных дендритных клеток in vitro (Фиг.7А). Авторы изобретения подтвердили, что это же имело место и in vivo. Мышам Vα17.6+ TCR-TG и Vα17.4+ TCR-TG вводили одинаковое количество NRP-V7-активированных и TUM-активированных В-клеток (меченных низкими или высокими концентрациями красителя CFSE, соответственно) и через день их умерщвляли, чтобы определить, какие клетки выжили в результате переноса. Как показано на Фиг.7В, NRP-V7- активированные В-клетки выживали только у мышей Vα17.4+ TCR-TG, тогда как В-клетки, активированные пептидом TUM, представляющим отрицательный контроль, выживали у обеих TCR-TG линий. По существу аналогичные результаты были получены при использовании дендритных клеток в качестве антиген-презентирующих клеток вместо В-клеток (Фиг.7В). Эти результаты позволили предположить, что низкоавидные CD122+ Vα17.6+ TCR-TG CD8+ Т клетки подавляют ответы родственных и неродственных диабетогенных Т клеток путем уничтожения антиген-презентирующих клеток, нагруженных аутоантигенами.
[0173] Исследование возможности NRP-V7/Kd-покрытых наносфер индуцировать пролиферацию низкоавидных (со средним уровнем связывания тетрамеров) аутореактивных CD8+ клеток памяти у мышей NOD дикого типа. Предполагается, что терапия мышей NOD наносферами с покрытием пептид/МНС, приведет к исчезновению высокоавидных клонотипов, а также пролиферации и рекрутингу низкоавидных CD8+ Т клеток, нарушению рекрутинга других способных реагировать с эпитопом IGRP клонотипов в островки, и защитит от диабета.
[0174] Для выяснения, являются ли CD8+ Т-клетки, пролиферация которых была вызвана гранулами, долгоживущими низкоавидными Т-клетками памяти у мышей NOD дикого типа, авторы изобретения проанализируют наличие маркеров памяти (CD44 и CD122) у NRP-V7/Kd тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток, содержащихся в селезенке и костном мозге мышей, получавших NRP-V7/Kd-покрытые наносферы. Предполагается, что увеличенные популяции тетрамер-позитивных клеток, содержащиеся в селезенке и костном мозге этих мышей, будут иметь повышенное содержание CD44hi и CD44hiCD122+ CD8+ Т-клеток, что позволит предполагать, что терапия NRP-V7/Kd наносферами увеличивает размер пулов тетрамер+CD44hi и тетрамер+CD44hiCD 122+ Т клеток.
[0175] Предполагается, что подобные клеткам памяти Т-клетки, число которых возросло под воздействием терапии in vivo наносферами, покрытыми NRP-V7/Kd будут вести себя как CD122+ Vα17.6+ TCR-TG CD8+ Т клетки памяти, которые спонтанно накапливаются у Vα17.6+ TCR-TG мышей: они не производят IL-2 и не пролиферируют, хотя продуцируют большое количество IFN-γ в ответ на антигенную стимуляцию in vitro. Также предполагается, что при активации моноклональными антителами к CD3 и IL-2 эти подобные клеткам памяти Т-клетки будут эффективно подавлять пролиферацию меченных CFSE Vα17.4+ TCR-TG CD8+ Т-клеток-респондеров in vitro.
[0176] Наносферы с покрытием пептид/МНС вызывают пролиферацию предсуществующих низкоавидных Т-клеток памяти. Предполагается, что наносферы с покрытием пептид/МНС не будут способствовать образованию Т-клеток памяти de novo, а скорее увеличивать предсуществующие пулы Т-клеток памяти. Предполагается, что терапия мышей NOD наносферами, покрытыми TUM/Kd, не будет вызывать системную экспансию CD8+T клеток, способных реагировать с TUM. Также предполагается, что терапия мышей В 10.H2g7 наносферами, покрытыми NRP-V7/Kd, не будет индуцировать существенную пролиферацию субпопуляции NRP-V7/Kd тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток во всех лимфоидных органах, и системная пролиферация реагирующих с тетрамерами CD8+ Т-клеток у мышей NOD, получавших наносферы, будет существенно более эффективной, будучи инициированной при манифестации диабета, а не в стадии преддиабета. Также предполагается, что в отличие от наивных CD8+ Т клеток, имеющих тенденцию подвергаться апоптозу при связывании TCR в отсутствие ко-стимуляции, пролиферация CD8+ Т клеток памяти не зависит от ко-стимуляции.
[0177] Для официальной проверки вышеупомянутой гипотезы авторы изобретения будут исследовать способность наносфер, покрытых IGRP206-214/Kd, вызывать пролиферацию IGRP206-214/Kd- реакционноспособных CD8+ Т-клеток генномодифицированной линии NOD, экспрессирующей мутантную форму IGRP, в которой два остатка IGRP206-214, контактирующих с TCR, заменены на аланин (K209A и F213A). Животных с модифицированными аллелями (обозначаемые здесь FLEX1 или NOD.IGRPK209A/F213AKI/KI) возвратно скрещивали с линией NOD (из 129) при помощи технологии «speed-congenic», для обеспечения гомозиготности по NOD аллелям во всех локусах Idd. Поскольку CD8+ Т-клетки, созревающие у этих генномодифицированных мышей, никогда не были подвержены воздействию IGRP206-214 in vivo, эти мыши не способны к спонтанному образованию CD8+ Т-клеток памяти, способных реагировать с IGRP206-214/Kd. Несмотря на то, что у этих мышей развивается как диабет, так и инсулит (данные не приведены), их ассоциированные с островками CD8+ Т-клетки распознают эпитопы IGRP, но полностью лишены CD8+ клонотипов, способных реагировать с IGRP206-214. Предполагается, что лимфоидные органы гомозиготных по FLEX1 мышей NOD, получавших оптимальные дозы наносфер, покрытых IGRP206-214/Kd, не будут содержать увеличенного пула CD8+ Т-клеток, способных реагировать с IGRP206-214/Kd. Это позволит предположить, что наносферы с покрытием пептид/МНС вызывают увеличение предсуществующего пула Т-клеток памяти с супрессорными свойствами и не способны вызывать образования Т-клеток памяти de novo.
[0178] Поскольку низкоавидные клонотипы (т.е. у мышей Vα17.6+ TCR-TG) являются более эффективными в произведении потомства Т-клеток памяти по сравнению со своими высокоавидными аналогами (т.е., у мышей Vα17.4+ TCR-TG) в ходе развития диабета, считается, что эффект наносфер с покрытием пептид/МНС связан с тем, что они вызывают элиминацию наивных высокоавидных клонотипов и экспансию небольших пулов предсуществующих низкоавидных клонотипов памяти.
Пример 2
Исследование способности наносфер из оксида железа, покрытых комплексами СД1-ассоциированный пептид/HLA, восстанавливать нормогликемию
[0179] «Гуманизированные» мыши, экспрессирующие HLA трансгены и комплексы пептид/HLA, подходящие для предлагаемых исследований. Как упоминалось выше, пептиды, являющиеся производными инсулина и IGRP, представляют собой первичные мишени CD8+ Т клеток у мышей NOD дикого типа. Исследование пептидов, являющихся производными этих двух антигенов, презентируемых молекулами МНС человека (человеческими лейкоцитарными антигенами, HLA) в ходе развития диабета, проводится на «гуманизированных» трансгенных по HLA мышах NOD. Изначально исследования были сфокусированы на HLA-A*0201, молекуле МНС, которую экспрессируют почти 50% некоторых этнических групп. В данном исследовании используется линия, обозначенная NOD.β2 mnull.HHD, у которой отсутствует ген мышиного β2 макроглобулина и которая экспрессирует химерную одноцепочечную конструкцию HHD (Pascolo et al., 1997). Эта конструкция кодирует человеческий β2m, ковалентно связанный с α1 и α2 доменами HLA-A*0201 человека, и α3, трансмембранным и цитоплазматическим доменами H-2Db мыши. Несмотря на то, что мыши этой линии экспрессируют только HLA-А*0201, а не эндогенные мышиные молекулы МНС класса I, они предрасположены к диабету, и у 55% самок диабет развивается к 30 недельному возрасту (Takaki et al., 2006). Два эпитопа человеческого IGRP (hIGRP228-236 и hIGRP265-273), связывающие HLA-А*0201, распознаются ассоциированными с островками CD8+ Т клетками этих мышей, а CD8+ Т клетки, выделенные из островков мышей NOD.β2 mnull.HHD являются цитотоксическими по отношению к HLA-A*0201-позитивным панкреатическим островкам человека (Takaki et al., 2006). С применением одного из этих пептидов были получены тетрамеры пептид/HLA-А*0201. Для облегчения связывания этих тетрамеров с молекулами CD8 мыши, α3 (CD8-связывающий) домен комплекса HLA-А*0201 заменили на соответствующий домен Н-2 Kb молекулы мыши. Результаты этих исследований продемонстрировали практическую ценность этих мышей для идентификации рестриктированных по HLA-A*0201 Т клеток и бета-клеточных аутоантигенов, имеющих потенциальное значение для СД1 человека (Takaki et al. 2006). На основании данного описания можно идентифицировать человеческие пептиды, с которыми направленно взаимодействуют HLA-А*0201-рестриктированные Т-клетки пациентов с СД1. Кроме того, авторы изобретения вывели мышей NOD, экспрессирующих HLA-A*1101, HLA-B*0702 или HLA-Cw*0304. У этих мышей также произведена замена мышиного β2m на человеческий β2m путем скрещивания их с линией NOD.β2 mnull.hβ2m (Hamilton-Williams et al., 2001). Все три трансгена HLA хорошо экспрессируются и все три трансгенных по HLA линии предрасположены к диабету. В совокупности HLA этих «гуманизированных» животных являются репрезентативными для четырех различных HLA супертипов: HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7 и HLA-C1, соответственно (Sidney et al., 1996; Doytchinova et al., 2004). Частоты генов HLA-A*1101, HLA-B*0702 или HLA-Cw*0304 могут достигать 23%, 11% или 10%, соответственно, в зависимости от изучаемой этнической группы (Сао et al., 2001). Охват популяции может составлять более 90%, в зависимости от этнической группы, если в качестве мишеней использовать все четыре супертипа (Sidney et al., 1996; Doytchinova et al., 2004; Сао et al., 2001). Данные факторы имеют важное значение для трансляции этих исследований на человека. Эти животные, а также ранее описанная линия NOD.β2mnull.HHD пригодны для последующих исследований.
[0180] В данном Примере авторы изобретения предлагают решение, позволяющее транслировать эти наблюдения, полученные на мышах NOD дикого типа, на «гуманизированных» трансгенных по HLA мышей NOD. Целью является исследование возможности терапии наносферами, покрытыми несколькими различными комплексами пептид/HLA, направленно воздействующими на пул аутореактивных CD8+ Т клеток, связанных с человеческим СД1, защищать мышей от диабета, а также восстанавливать нормогликемию у их сородичей с впервые диагностированным диабетом. Авторы изобретения предлагают трансляционный подход для идентификации комбинаций СД1-ассоциированный пептид/HLA для применения при СД1 человека. В частности, авторы предполагают, что наносферы, покрытые различными комплексами СД1-ассоциированный аутоантигенный пептид/HLA-А*0201, обеспечат защиту от диабета и излечат СД1 у мышей NOD.β2mnull.HHD (экспрессирующих HLA-A*0201). Любой специалист в данной области может применять это описание для применения с другими эпитопами, ассоциированными с другими аутоиммунными заболеваниями, применяя композиции и способы, аналогичные тем, что применялись в отношении инсулиновых и/или IGRP эпитопов, презентированных другими молекулами_HLA «гуманизированных» трансгенных по HLA мышей ассоциированным с островками CD8+ Т клеткам, чтобы получить другие композиции и способы. Любой специалист может определить минимально необходимые условия для терапии и тип комплексов пептид/HLA, которые обеспечат максимально благоприятный терапевтический эффект, а также необходимость существования до начала терапии низкоавидных CD8+ Т клеток памяти для успешности терапии и идентификации дополнительных комбинаций пептид/HLA, позволящих охватить максимально возможное количество индивидов в различных этнических группах.
[0181] Синтез наносфер. Наносферы синтезируют и характеризуют на физическом и химическом уровне, по существу, в соответствии с предыдущим описанием (Moore et al., 2004), но с применением биотинилированных мономеров пептид/HLA-А*0201. Молекула МНС этого комплекса состоит из человеческого β2 микроглобулина и химерной формы HLA-A*0201 человека, где домены α1 и α2 сшиты с α3 доменом Н-2 Kd мыши (для облегчения распознавания молекулой CD8 мыши). Используют аутоантигенные пептиды, являющиеся различными производными инсулина и IGRP (такие как, например, hlnsB10-18, hIGRP228-236 и hIGRP265-273), которые, как было показано, распознаются ассоциированными с островками CD8+ Т клетками в контексте HLA-A*0201. Мономеры биотинилированный пептид/HLA-А*0201 будут добавлять в молярном соотношении 4 моля биотина на 1 моль авидина. Биотинилированные белки будут добавлять несколькими частями (приблизительно 0,4 моля биотина на авидин) в течение 24 часов при 4°С при медленном перемешивании (10 об/мин). Полученные зонды будут очищать на магнитных разделительных колонках (Milteny Biotec). Мономеры, содержащие посторонний HLA-A*0201-связывающий пептид в комплексе с молекулами HLA-A*0201, будут использовать для синтеза зонда, служившего негативным контролем. Будут определять размер наносфер и их релаксивность (изменения скорости релаксации на мМ), число сайтов связывания биотина и содержание железа и белка.
[0182] Введение наносфер. Группы 10-15 самок мышей NOD.β2mnull.HHD будут получать терапию наносферами, покрытыми различными комплексами пептид/HLA, описанными выше, или комплексом пептид (грипп)/HLA в качестве негативного контроля (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 мкг в пересчете на пептид, одну дозу в 3 недели, начиная с 4 недельного и до 30 недельного возраста, или две дозы в неделю, начиная с 10 недельного возраста в течение 5 последующих недель). Увеличение количества антиген-специфичных CD8+ Т клеток в периферических органах будут определять по связыванию мононуклеарных клеток крови с монокональными антителами к CD8 и тетрамерами пептид/МНС (перед началом терапии и по окончанию терапии). Мышей будут умерщвлять при манифестации гипергликемии или в конце исследования. У некоторых мышей при помощи многоцветной проточной цитометрии будут изучать наличие центральных и/или эффекторных CD8+ Т клеток памяти с фенотипом (CD69-, CD44hi, CD62Lhi или CD62Llo, CD122+, Ly6C+) тетрамер+ в различных лимфоидых органах (селезенка, лимфоузлы), костном мозге (известном резервуаре Т клеток памяти), печени, легких и панкреатических островках. Авидность связывания тетрамеров будут определять, как было описано ранее (Han et al., 2005; Amrani et al., 2000). Авторы изобретения полагают, что терапия вызывает системную пролиферацию низкоавидных центральных и эффекторных тетрамер-позитивных CD8+ клеток памяти и предпочтительную (но не исключительныю) аккумуляцию этих Т-клеток в костном мозге, панкреатических лимфоузлах (PLN) и островках.
[0183] Введение множественных доз комплекса пептид/МНС. В другом исследовании группы мышей будут получать одну, две, три или четыре инъекции эффективной дозы, по мнению авторов изобретения аналогичной всем тем комплексам, что проявляли терапевтическую эффективность в других исследованиях (на 4, 7, 10 и 13 неделе). Ожидается, что для индукции защиты потребуется одна или более доз (для увеличения пула низкоавидных Т-клеток памяти выше уровня, необходимого для достижения протективного эффекта), и что увеличенная популяция тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток памяти будет постепенно исчезать из циркуляции и накапливаться в костном мозге, панкреатических лимфоузлах и панкреатических островках.
[0184] Введение комплексов пептид/МНС при манифестации гипергликемии. Мыши будут получать терапию при манифестации гипергликемии (>10,5 мМ/л) по протоколу более агрессивной терапии наносферами (1-5 мкг в пересчете на пептид дважды в неделю в течение 5 недель). Отрицательные и положительные контроли будут получать наносферы, покрытые комплексами иррелевантный пептид/HLA или моноклональными антителами к CD3 (однократную внутривенную инъекцию 20 мкг в течение 5 дней (Mailer, 2005)), соответственно. У мышей будут брать кровь непосредственно перед началом терапии для оценки исходного процентного содержания тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток в циркуляции. Купирование симптомов СД1 будет признаваться при стабилизации значений глюкозы крови <10 мМ/л по меньшей мере на протяжении 4 недель, после чего терапия будет прекращена. У мышей вновь будут брать кровь для подтверждения существенного увеличения пула циркулирующих тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток. За животными будут наблюдать в течение, по меньшей мере, дополнительных 8-12 недель для подтверждения стабильной ремиссии. Мышей будут умерщвлять по окончанию периода наблюдения для установления факта долговременной персистенции увеличенного пула тетрамер-позитивных CD8+ Т-клеток памяти в различных лимфоидных и нелимфоидных органах. Кроме этого, будет браться ткань поджелудочной железы на гистологический анализ. Ожидается, что долговременная ремиссия будет связана с присутствием большого числа небольших островков, не имеющих инфильтрации мононуклеарными клетками. Таким образом, в отличие от картины, наблюдающейся у мышей с преддиабетом, когда ожидается, что терапия будет способствовать заселению пораженных островков защитными Т-клетками памяти, прогнозируют, что терапия у мышей с диабетом будет усиливать накопление защитных Т-клеток памяти в панкреатических лимфоузлах (в дополнение к другим резервуарам Т-клеток памяти), но не в островках (предположительно, новые островки, не имеют воспалительного потенциала).
[0185] Наносферы с покрытием пептид/HLA оказывают действие, индуцируя элиминацию наивных высокоавидных клонотипов. Авторы изобретения полагают, что низкоавидные аутореактивные CD8+ Т клетки склонны накапливаться в качестве клеток памяти во время прогрессирования СД1 (в небольших количествах) и что наносферы с покрытием пептид/HLA оказывают эффект, индуцируя элиминацию наивных высокоавидных клонотипов (благодаря связыванию TCR без ко-стимуляции) и пролиферацию небольших пулов предсуществующих низкоавидных клонотипов памяти (независящую от ко-стимуляции). Отчасти, этот вывод следует из наблюдения, что терапия мышей иррелевантным пептидом (из комплекса, содержащего опухолевый антиген (TUM/H-2 Kd)) не вызывала увеличения количества CD8+ Т клеток, способных реагировать с тетрамерами TUM/Kd, в периферических органах выше базального уровня (см. выше). Эти низкоавидные аутореактивные CD8+ клетки памяти затем ингибируют активацию своих наивных высокоавидных (предположительно, более слабых) аналогов за счет конкуренции за источники стимулов (т.е. антиген/МНС на дендритных клетках, цитокины и т.д.). Действительно, есть свидетельства о том, что в других системах клетки памяти могут эффективно конкурировать с наивными Т-клетками за гомеостатические стимулы (т.е. IL-15) (Tan et al., 2002). Эти превалирующие низкоавидные клонотипы памяти будут также ингибировать активацию других аутореактивных Т-клонотипов путем образования стабильных контактов с нагруженными аутоантигенами дендритными клетками в панкреатических лимфоузлах.
[0186] Для реализации пролиферации Т клеток (и антидиабетогенной активности) под воздействием наносфер с покрытием пептид/HLA требуется экспрессия эндогенного аутоантигена-мишени в бета-клетках. Считается, что экспрессия эндогенных аутоантигенов-мишеней является источником стимулов, вызывающих образование пулов низкоавидных аутореактивных CD8+ Т-клеток памяти, впоследствии пролиферирующих в ответ на терапию наносферами. У мышей NOD.β2mnull.HHD будет индуцирован дефицит IGRP. Эти мыши будут получать терапию наносферами, покрытыми hIGRP228-236 (перекрестно реагирующий антиген для mIGRP228-236) и hIGRP265-273 (идентичен mIGRP265-273)/HLA-A*0201 (Takaki et al., 2006). Мыши NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD будут получать терапию оптимальными дозами наносфер, покрытых двумя комплексами IGRP/HLA. Авторы изобретения предполагают, что терапия не будет вызывать пролиферации/рекрутинга соответствующих hIGRP пептид/HLA-реакционноспособных CD8+ клеток.
[0187] Если экспрессия IGRP является несущественной для развития диабета (известно, что отсутствие экспрессии IGRP не является летальным, и его экспрессия отсутствует у крыс) и у мышей будет спонтанно развиваться диабет, прогнозируется, что терапия наносферами не будет защищать мышей от СД1 (поскольку не будет CD8+ Т клеток памяти, способных реагировать с IGRP). Напротив, считается, что терапия наносферами, покрытыми комплексами HLA-А*0201 и инсулиновыми эпитопами, будет вызывать пролиферацию пулов соответствующих Т клеток памяти и оказывать протективный эффект, поскольку мыши будут по-прежнему экспрессировать инсулин.
[0188] Возможно, что типы тестируемых здесь наносфер не будут индуцировать существенной пролиферации Т клеток у всех мышей. Вероятно, это будет зависеть от того, была ли соответствующая популяция Т клеток предварительно примирована in vivo до начала терапии. Может оказаться полезным/необходимым изучение дополнительных групп мышей, получающих комбинации нескольких различных типов наносфер. Можно предположить, что в противоположность ожиданиям, терапия наносферами будет способна вызывать образование пулов низкоавидных Т-клеток памяти de novo. Авторы изобретения предполагают, что таком случае эти клетки не будут обладать протективными свойствами, поскольку они не будут способны захватывать комплексы эндогенный IGRP/HLA-A*0201 на поверхности дендритных клеток у получавших терапию мышей NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD.
[0189] Мыши, экспрессирующие hIGRP. Авторы изобретения вывели несколько линий мышей, экспрессирующих трансген IGRP человека под контролем крысиного инсулинового промотора, и в каждой из этих линий сравнили уровни экспрессии человеческого трансгена и белка, кодируемого эндогенным mIGRP-кодирующим локусом при помощи RT-PCR в реальном времени. Несмотря на то, что уровни экспрессии трансгенов существенно варьировали у разных линий, уровни экспрессии были сопоставимы между разными особями внутри отдельных линий. В одной из этих линий (#1114) уровни экспрессии hIGRP были эквивалентны уровням mIGRP.
[0190] Авторы изобретения внедрят данный RIP-hIGRP трансген мышам NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD и мышам NOD.β2mnull.IGRPnull трансгенным по hβ2m/HLA-А*1101, HLA-B*0702 или HLA-Cw*0304, чтобы идентифицировать дополнительные эпитопы hIGRP, которые являются мишенями CD8+ Т-клеточных ответов в контексте этих четырех различных аллелей HLA. Будет проведен скрининг реакционной способности ассоциированных с островками CD8+ Т клеток этих мышей против библиотек HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-B*0702 и HLA-Cw*0304-связывающих пептидов hIGRP.
[0191] Затем будет проведено тестирование соответствующих наносфер, покрытых комплексами пептид/HLA, на антидиабетогенную эффективность у соответствующих hβ2 m/HLA-A*1101, HLA-B*0702 или HLA-Cw*0304-трансгенных мышей NOD.β2mnull.IGRPnull. Общей целью этих экспериментов является расширение спектра комбинаций пептид/HLA, которые смогут применяться для лечения как можно большего числа пациентов.
[0192] Оптимизация терапевтических свойств наночастиц и конъюгирование с рМНС. Данные исследования с применением комплексов рМНС класса I были проведены для оптимизации размера и концентрации наночастиц, а также валентности рМНС. Для этого были использованы наночастицы из золота, поскольку они более пригодны для такого типа исследований, по сравнению с оксидом железа. Это также позволило авторам изобретения показать, что способность рМНС-наночастица вызывать пролиферацию ауторегуляторных Т-клеток памяти не зависит от химического состава ядра наночастиц (оксид железа или золото). Была проведена обширная работа с применением наночастиц из золота, имеющих различный диаметр, и результаты позволяют предположить, что наночастицы диаметром <14 нм имеют преимущества, что согласуется с мнением, что меньший размер является предпочтительным для наночастиц. Направленное связывание множества pMHCs с поверхностью наночастиц (>50-200/НЧ) через их карбокси-концы и надлежащая стабилизация покрытых наночастиц обеспечивают высокую концентрацию частиц (>10^10/мкл) без нарушения монодисперсности наночастиц или их стабильности. При тестировании этих нановакцин класса I у мышей NOD с преддиабетом были установлены рабочие диапазоны доз наночастиц и валентности рМНС, обеспечивающие значительную пролиферацию родственных ауторегуляторных CD8+ Т-клеток in vivo (~10-20 кратную). Было установлено, что общая доза рМНС имеет ключевое значение и что наилучшие результаты получаются при большем количестве мелких наночастиц, покрытых меньшим количеством рМНС, чем при меньшем количестве крупных наночастиц, покрытых рМНС с большей валентностью (при одинаковом общем количестве рМНС). Такие условия также снижают накопление в тканях и обеспечивают доставку терапевтических количеств рМНС при минимально возможных дозах металла.
[0193] В одном предпочтительном воплощении применяли режим дозирования, основанный на следующих ориентировочных расчетах:
Расчеты: 4 нм наночастиц из оксида железа, покрытых антигеном рМНС в концентрации, при которой общее количество белка на дозу составляет приблизительно от 1 мкг до 25 мкг.
Например, общее количество рМНС на дозу (1 мкг - 25 мкг) = (от 134×1013 рМНС/дозу до 3,33×1014 рМНС/дозу)
Общее количество железа на дозу наночастиц (4 нм)
(1 мкг - 15 мкг) = (от 3,73×1012 НЧ/дозу до 5,60×1013 НЧ/дозу)
[0194] Следует понимать, что количество рМНС на дозу может варьировать от 0,1 мкг до 500 мкг.
[0195] Например, у человека весом 60 кг количество рМНС на дозу может варьировать от 0,24 до 6,08 мг при том, что это соответствует от 1 мкг до 25 мкг, в соответствии с описанием выше. Как указано выше, эти дозы могут быть изменены, чтобы соответствовать диапазону от 0,1 мкг до 500 мкг.
[0196] Как указано выше, 4-нм частицы оксида железа обладают большей эффективностью по сравнению с наночастицами золота, имеющими диаметр 14 нм, что позволяет предположить, что частицы меньшего размера обладают лучшими свойствами. Следует понимать, что термин «оксид железа» подразумевает все виды оксидов железа, доступные или известные специалистам, и включает в качестве примера оксигидроксиды железа.
Пример 3
НАНОСФЕРЫ С ПОКРЫТИЕМ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ПЕПТИД-МНС КЛАССА II
[0197] Получение СД1-ассоциированных комплексов рМНС класса II. Для тестирования гипотезы о том, что наносферы, покрытые комплексами СД1-ассоциированный пептид/I-Ag7 также могут обеспечивать защиту от СД1 и излечивать СД1 у мышей NOD, можно сконструировать несколько различных комплексов пептид/I-Ag7 на основе следующих последовательностей пяти СД1-ассоциированных и контрольных пептидов: мимеотопы BDC2.5: AHHPIWARMDA (SEQ ID No. 59); IGRP128-145: TAALSYTISRMEESSVTL (SEQ ID No. 60); IGRP4-22: LHRSGVLIIHHLQEDYRTY (SEQ ID No. 61); IGRP195-214: HTPGVHMASLSVYLKTNVFL (SEQ ID No. 62); и инсулина B9-23: SHLVEALYLVAGERG (SEQ ID No. 63). В качестве отрицательных контролей может применяться комплекс пептид G6P-изомеразы (LSIALHVGFDH; SEQ ID No. 64)/I-Ag7 (контроль на собственный рМНС) и два комплекса лизоцима куриного яйца (HEL14-22 -RHGLDNYRG; SEQ ID No. 65- и HEL11-25 -AMKRHGLDNYRGYSL; SEQ ID No. 66-)/I-Ag7 (кот-роли на чужеродный рМНС). Рекомбинантные мономеры I-Ag7 получают, как было описано ранее. Вкратце, итоговые конструкции в векторе pRMHa3 кодируют природные лидерные последовательности, за которыми следуют пептидные последовательности, описанные выше, и экстрацитоплазматические домены а и b цепей I-Ag7, соответственно. Обе цепи продолжает линкерная последовательность (SSAD), сайт расщепления тромбина (LVPRGS) и последовательность кислотного или основного лейцинового зиппера для а и b цепи, соответственно, за которой следует шесть последовательно расположенных остатков гистидина. На а цепи за кислотным зиппером следует последовательность биотинилирования #85. Клетки Drosophila melanogaster SC2 ко-трансфецируют конструкциями ДНК вместе с геном устойчивости к пуромицину для получения стабильных клеточных линий. Для крупномасштабной продукции (12 литров) рекомбинантные белки выделяют при помощи тангенциально-поточной фильтрации из супернатантов CuSO4-индуцированных клеток и очищают при помощи металло-хелатной аффинной хроматографии, анионообменной хроматографии, а также эксклюзионной хроматографии. Биотинилирование очищенных молекул проводят с применением фермента BirA. Биотинилирование исследуют при помощи иммунодеплеции на стрептавидин-агарозных гранулах с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Эти комплексы можно конъюгировать с биоабсорбируемыми биодеградируемыми наносферами. Эти мономеры также можно применять для получения тетрамеров, конъюгированных с флуорохромом, для подсчета количества родственных аутореактивных CD4+ Т-клеток, как до, так и после терапии наносферами, покрытыми рМНС. Очищенные биотинилированные комплексы рМНС затем можно наносить в качестве покрытия на наносферы. Для предлагаемых здесь исследований можно продуцировать комплексы рекомбинантных рМНС в клетках мухи, как описано выше, но с применением конструкций другого дизайна, повышающего общую валентность рМНС, которые можно наносить в качестве покрытия на отдельные наносферы: димеров рМНС, сшитых с Fc фрагментом IgG2a.
[0198] Оптимизация терапевтическх свойств наносфер и конъюгация с рМНС. Исследования с применением комплексов рМНС класса I можно проводить для оптимизации размера наносфер и их концентрации, а также валентности рМНС. Размер, концентрация, заряд и монодисперсность наносфер можно определять при помощи спектрофотометрии, трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и динамического светорассеяния. Затем наносферы можно сконцентрировать, конъюгировать с 3,4 kD тиол-PEG-NH2-рМНС, отмыть и сконцентрировать с получением высокой концентрации (~104/мл) без нарушения монодисперсности.
[0199] Предполагается, что оптимальным является размер наносфер 5-15 нм в диаметре. Новые протоколы синтеза обеспечат направленное связывание множества рМНС с поверхностью наносфер (например, до 200 на наносферу) через их карбокси-концы и надлежащую стабилизацию покрытых наносфер с возможностью получения высокой концентрации частиц (>1010/мкл) без нарушения монодисперсности или стабильности. Эти нановакцины класса I могут быть протестированы на мышах NOD с преддиабетом для установления рабочих диапазонов доз наносфер и валентности рМНС, обеспечивающих массивную пролиферацию родственных ауторегуляторных CD8+ Т-клеток in vivo. Предполагается, что терапия мышей с впервые диагностированным диабетом этими рМНС-наносферами будет с высокой эффективностью восстанавливать нормогликемию. Предполагается, что наилучшие результаты будут получены при введении больших количеств мелких наносфер, покрытых меньшим количеством рМНС, чем при меньшем количестве крупных наносфер, покрытых рМНС с большей валентностью (при одинаковом общем количестве рМНС). Также предполагается, что эти параметры и свойства биоабсорбируемости и биодеградируемости наносфер позволят уменьшить их накопление в тканях и обеспечат доставку терапевтических количеств рМНС при минимально возможных дозах.
[0200] Купирование симптомов гипергликемии у мышей NOD при помощи терапии наносферами, покрытыми СД1-ассоциированными рМНС класса II. Предполагается, что биодеградируемые биоабсорбируемые наносферы, покрытые рМНС класса II, могут купировать гипергликемию у мышей NOD с впервые диагностированным диабетом, по существу как описано для наносфер, покрытых рМНС класса I. Мыши NOD, больные диабетом, могут получать дважды в неделю 7,5 мкг наночастиц. Мыши считаются излеченными, когда у них сохраняется нормогликемия в течение 4 последующих недель. Предполагается, что наносферы 2.5mi/I-Ag7 будут купировать гипергликемию практически у всех тестируемых мышей. Гипергликемию можно оценить, например, при помощи интраперитонеального теста толерантности к глюкозе (ИПТТГ). Предполагается, что большинство, если не все мыши с гипергликемией, получавшие наносферы IGRP128-145/I-Ag7, наносферы B9-23/I-Ag7 и наносферы IGRP4-22/I-Ag7, будут иметь нормогликемию. В качестве контроля могут применяться наносферы, покрытые GPI282-292/I-Ag7 (собственным антигеном, иррелевантным в отношении СД1) и HEL14-22/I-Ag7 (чужеродным антигеном). Предполагается, что эти эксперименты продемонстрируют, что «моноспецифичные» наносферы, покрытые несколькими различными комплексами СД1-ассоциированных рМНС класса II, могут быть, по меньшей мере, настолько же эффективны при купировании СД1, как и наносферы, покрытые рМНС класса I. Считается, что в некоторых случаях для стойкого и всестороннего долговременного поддержания нормогликемии может потребоваться бустерное введение.
[0201] Наносферы, покрытые СД1-ассоциированными рМНС класса II, и пролиферация родственных Tr1-подобных и имеющих фенотип клеток памяти ауторегуляторных CD4+ Т-клеток. Предполагается, что в крови, селезенке, панкреатических лимфоузлах (PLNs), мезентериальных лимфоузлах (MLNs) и костном мозге 50-недельных мышей, больных диабетом, которые могут быть приведены в состояние нормогликемии при терапии наносферами 2.5mi/I-Ag7, будет выявляться существенно более высокое процентное содержание 2.5mi/I-Ag7 тетрамер-позитивных CD4+ Т-клеток во всех органах, за исключением мезентериальных лимфоузлов, по сравнению с мышами, обследованными немедленно при возникновении диабета или нелеченными животными сопоставимого возраста, не имеющими диабета. Считается, что пролиферация CD4+ Т-клеток будет антиген-специфичной, и не будет наблюдаться увеличения пулов неродственных аутореактивных CD4+ Т-клеток. Предполагается, что для стабильного поддержания нормогликемии будет необходимо поддержание пролиферации ауторегуляторных Т-клеток. Фенотипический анализ этих 2.5mi/I-Ag7 тетрамер-позитивных клеток, пролиферирующих при воздействии наночастиц, при сравнении с 2.5mi/I-Ag7 тетрамер-негативными клетками может обнаружить фенотип, подобный клеткам памяти (CD62low, CD44high и умеренное повышение CD69). Эти клетки могут быть CD25-негативными и FoxP3-негативными. Это может быть подтверждено на мышах NOD, экспрессирующих FoxP3-eGFP, у которых клетки Treg конститутивно экспрессируют eGFP. Терапия этих мышей в возрасте 10 недель наносферами 2.5mi/I-Ag7 может вызвать пролиферацию eGFP- 2.5mi тетрамер-позитивных CD4+ Т-клеток. Функциональные исследования in vitro отсортированных при помощи FACS 2.5mi/I-Ag7 тетрамер-позитивных CD4+ Т-клеток помогут определить, пролиферируют ли они в ответ на дендритные клетки, активированные родственным, а не посторонним пептидом, и секретируют ли они IL-10 и IFNγ. Эти исследования могут быть проведены с применением ELISA и технологии «Luminex». Предполагается, что эти Tr1-подобные CD4+ Т-клетки будут экспрессировать высокие уровни поверхностного TGFβ.
[0202] Предполагается, что размножившиеся под воздействием комплексов рМНС II класса-наносфера тетрамер-позитивные клетки, но не их тетрамер-негативные аналоги будут эффективно подавлять пролиферацию наивных LCMV Gp33-специфичных CD8+ клеток в ответ на Gp33 и 2.5mi пептид-активированные дендритные клетки (распознаваемые клетками-респондерами и тетрамер-позитивными Tr1 CD4+ клетками, соответственно). Также предполагается, что добавление моноклонального анти-IL10 антитела к культурам будет частично ингибировать эту супрессорную активность, по сравнению с культурами, получавшими контрольные IgG крысы. Прогнозируется, что эксперименты на больных диабетом мышах, получавших наносферы IGRP4-22/I-Ag7 с блокированием IL-10 или с IgG крысы (в качестве контроля), а также эксперименты на мышах NOD с дефицитом перфорина, продемонстрируют, что восстановление нормогликемии при помощи наносфер рМНС класса II является IL-10- и перфорин-зависимым. Также предполагается, что IFNγ необходим для развития Tr1 клеток, пролиферацию которых могут вызвать рМНС-наносферы, но не для их супрессорной активности. Родственные аутореактивные Т-клетки, способные пролиферировать в ответ на терапию рМНС-наносферами у IFNγ-/- мышей, могут иметь фенотип Th2 (продуцирующих IL-4 и IL-10 в ответ на стимуляцию пептидами ex vivo), тогда как те, что пролиферируют у IL-10-/- мышей, могут продуцировать IFNγ и IL-4, но не IL-10. Эти результаты будут указывать, что купирование диабета опосредовано Tr1-подобными клетками.
Пример 4
ЭКСПАНСИЯ Т-КЛЕТОК С ПРИМЕНЕНИЕМ НАНОСФЕР IGRP/Kd-PLGA.
[0203] Наносферы IGRP206-214/Kd-PLGA индуцируют активацию родственных CD8+ Т-клеток in vitro. Этот эксперимент проводили по существу в соответствии с описанием Tsai et al., Immunity (2010) 32, 568-680, включенным сюда путем ссылки. Вкратце, очищенные наивные IGRP206-214/Kd-специфичные трансгенные по Т-клеточному рецептору (TCR) CD8+ Т-клетки мышей 8.3-NOD культивировали с наносферами IGRP206-214/Kd-PLGA в течение 48 ч. В супернатантах определяли IFN-гамма. Клетки активировали 1 мкКи [3Н]-тимидина и собирали. Количество импульсов в мин и IFN-гамма определяли относительно количества наносфер на лунку. Это показано на Фиг.9. На Фиг.8 показано увеличенное изображение IGRP/Kd-конъюгированных частиц PLGA. Частицы PLGA были получены следующим образом:
Концентрация: 100 нм (PLGA: 20 мг/мл в 1,5 мл).
Размер DLS: 154,72 нм
Конъюгирование рМНС: конъюгировали 5 мг IGRP/Kd с 2 мл частиц PLGA
Конечный объем: 2 мл
ССЫЛКИ
Следующие ссылки, в той степени, в которой они раскрывают методические или другие детали дополнительно к представленным здесь, включены сюда во всей полноте путем ссылки.
U.S. Pat. No. 4,367,110
U.S. Pat. No. 4,452,901
U.S. Pat. No. 4,554,101
U.S. Pat. No. 4,589,330
U.S. Pat. No. 4,818,542
U.S. Pat. No. 6,103,379
U.S. Pat. No. 6,387,498
U.S. Pat. No. 6,651,655
U.S. Pat. No. 6,712,997
U.S. Publication 20050202032
U.S. Patent Application No. 12/044,435
Aichele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:444-448, 1994.
Amrani et al., J. Immunology, 167:655-666, 2001.
Amrani et al., Nature, 406:739-742, 2000.
Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9311-9316, 1999.
Anderton and Wraith, Eur. J. Immunol., 28:1251-1261, 1998.
Arden et al., Diabetes, 48:531-539, 1999.
Atkinson and Maclaren, N. Engl. J. Med., 331:1428-1436, 1994.
Atkinson and Maclaren, Sci. Am., 7:62-67, 1990.
Banga, In: Therapeutic Peptides and Proteins. Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Pub. Co., Inc., Lancaster, Pa., 1995.
Barany and Merrifield, In: The Peptides, Gross and Meienhofer (Eds.), Academic Press, NY, 1-284, 1979.
Bielekova et al., Nat. Med., 6:1167-1175, 2000.
Bottazzo et al., N. Engl. J. Med., 313:353-360, 1985.
Brinker and Scherer, In: Sol-gel Science, Academic Press, 1990.
Burke et al., J. Inf. Dis., 170:1110-1119, 1994.
Cao et al., Hum. Immunol., 62:1009, 2001.
Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, 1999.
Caruso, J. Amer. Chem. Soc., 121(25):6039-6046, 1999.
Castano and Eisenbarth, Annu. Rev. Immunol., 8:647-679, 1990.
Chentoufi and Polychronakos, Diabetes, 51:1383, 2002.
Chou and Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148, 1978a.
Chou and Fasman, Annu. Rev. Biochem., 47:251-276, 1978b.
Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974a.
Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974b.
Chou and Fasman, Biophys. J, 26(3):385-399, 1979.
Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, 1998.
DiLorenzo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:12538-12543, 1998.
Doytchinova et al., J. Immunol., 172:4314, 2004.
Epitope Mapping Protocols (1996)
Fennessy et al., Diabetologia, 37:937-945, 1994.
Golman and Shinohara, Trends Chem. Engin., 6:1-6, 2000.
Goulder et al. J. Exp. Med., 192:1819-1832, 2000.
Group, D.P.T.-T.D.S, N. Engl. J. Med., 346:1685-1691, 2002.
Haller et al, N. Engl. J. Med., 353:2086-2087, 2005.
Hamilton-Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:11533, 2001.
Han et al., J. Clin. Invest., 115:1879 2005.
Han et al., Nat. Med., 11:645-652, 2005.
Hanninen et al., J. Clin. Invest, 90:1901-1910, 1992.
Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, 1996
Honeyman et al., Mol. Med., 1(5):576-582, 1995.
Iler In: Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979.
Imagawa et al., Diabetes, 50:1269-1273, 2001.
Itoh et al., J. Clin. Invest, 92:2313-2322, 1993.
Kappos et al., Nat. Med., 6:1176-1182, 2000.
Karin et al., J. Exp. Med., 180:2227-2237, 1994.
Kent et al., Nature, 435:224-228, 2005.
Keymeulen et al. N. Engl. J. Med., 352(25):2598-608, 2005.
Kreuter, In: Colloidal Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., NY., 219-342, 1994.
Liblau et al., Immunity, 17:1-6, 2002.
Lieberman and DiLorenzo, Tissue Antigens, 62:359-377, 2003.
Lieberman et al., J. Immunol., 173:6727, 2004.
Lieberman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:8384-8388, 2003.
Liu and Wraith, Int. Immunol., 7:1255-1263, 1995.
Maree et al., Int. Immunol., 18:1067-1077, 2006.
Martin et al., J. Biol. Chem., 276:25197-25207, 2001.
McKown, et al., Arthritis Rheum., 42:1204-1208,1999.
Merrifield, Science, 232(4748):341-347, 1986.
Metzler and Wraith, Int. Immunol., 5:1159-1165, 1993.
Miller et al., J. Exp. Med., 149:758-766, 1979.
Moore et al., Diabetes, 53:1459-1466, 2004.
Moriwaki et al., Diabetologia, 42:1332-1340, 1999.
Nakanishi et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:3721-3725, 1999.
Nakayama et al., Nature, 435:220-224, 2005.
Nejentsev et al., Diabetes, 46:1888-1895, 1997.
Owerbach, Diabetes, 49:508-512, 2000.
Palmer et al., Science, 222:1337-1339, 1983.
Partch and Brown., J Adhesion, 67:259-276, 1998.
Pascolo et al., J. Exp. Med., 185:2043, 1997.
Pekarek et al., Nature, 367:258, 1994.
Pinkse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:18425-18430, 2005.
Pociot and McDermott, Genes Immun., 3:235-249, 2002.
Pozzilli, et al., Diabetologia, 43:1000-1004, 2000.
Robles et al., Clin. Immunol., 102:117-224, 2002.
Santamaria et al., Diabetes, 41:53-61, 1992.
Santamaria et al., J. Immunol., 154:2494, 1995.
Santamaria, Curr. Opin Immunol., 13:663-669, 2001.
Serreze et al., Diabetes, 43:505, 1994.
Serreze et al., Diabetes, 50:1992-2000, 2001.
Sibley et al., Lab. Invest, 53:132-144, 1985.
Sidney et al., Hum. Immunol., 45:79, 1996.
Somoza et al., J. Immunol., 153:1360-1377, 1994.
Stewart and Young, In: Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co., 1984.
Sukhorukov et al., Polymers Adv. Tech., 9(10-11):759-767, 1998.
Tail et al., Hum. Immunol., 42:116-124, 1995.
Takaki et al., J. Immunol., 176:3257-3265, 2006.
Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, 1983.
Tan et al., J. Exp. Med., 12:1523-1532, 2002.
Tice & Tabibi, In: Treatise on Controlled Drug Delivery, Kydonieus (Ed.), Marcel Dekker, Inc. NY, 315-339, 1992.
Tigges et al., J. Immunol., 156(10):3901-3910, 1996.
Toes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7855-7860, 1996.
Toma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:10581-10585, 2005.
Trentham, et al., Science, 261:1727-1730, 1993.
Trudeau et al., J. Clin. Invest, 111:217-223, 2003.
Verdaguer et al., J Immunology, 157:4726-4735, 1996.
Verdaguer et al., J. Exp. Med., 186:1663-1676, 1997.
Weiner, Science, 259:1321-1324, 1993.
Wong et al., Nat. Med., 5:1026-1031, 1999.
Wraith et al., Cell, 59:247-255, 1989.
Yeaman et al., Ann. NY Acad. Sci., 955:174-182, 2002.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения композиции для предупреждения или лечения аутоиммунного заболевания. Композиция для предупреждения или лечения аутоиммунного заболевания, содержащая полипептидные комплексы антиген-МНС, функционально связанные с биологически совместимыми биоадсорбируемыми наносферами, образующими популяцию наносфер с присоединенными к ним полипептидными комплексами, где соотношение множества полипептидных комплексов составляет более 50 до 200 на наносферу, имеющую размер менее 14 нм. Группа изобретений включает также к применению данной композиции для лечения аутоиммунного нарушения, при этом композиция вводится в количестве, достаточном для пролиферации антипатогенных аутореактивных Т-клеток. Использование данной группы изобретений обеспечивает значительную пролиферацию CD8+ Т-клеток за счет применения полипептидных комплексов антиген-МНС, связанных с биологически совместимыми биоадсорбируемыми наносферами, где множество полипептидных комплексов составляет более 50 до 200 на наносферу, имеющую размер менее 14 нм. Направленное связывание множества рМНС с поверхностью наночастиц через их карбокси-концы приводит к стабилизации покрытых наночастиц, получая высокую концентрацию частиц без нарушения монодисперсности и их стабильности. 6 н. и 28 з.п. ф-лы, 4 пр., 4 табл., 9 ил.
1. Композиция для предупреждения или лечения аутоиммунного заболевания, содержащая полипептидные комплексы антиген-МНС, функционально связанные с биологически совместимыми биоадсорбируемыми наносферами, образующими популяцию наносфер с присоединенными к ним полипептидными комплексами, где соотношение множества полипептидных комплексов составляет более 50 до 200 на наносферу, имеющую размер менее 14 нм.
2. Композиция для предупреждения или лечения аутоиммунного заболевания, содержащая полипептидные комплексы антиген-МНС, функционально связанные с биологически совместимыми биоадсорбируемыми наносферами, образующими популяцию наносфер с присоединенными к ним полипептидными комплексами, где каждый комплекс биологически совместимых биоабсорбируемых наносфер содержит ядро биологически совместимой биоабсорбируемой наносферы, и где ядро биологически совместимой биоабсорбируемой наносферы дополнительно содержит биодеградируемое покрытие на внешней поверхности указанного ядра, где комплексы антиген-МНС, функционально связаны с биодеградируемым покрытием и/или ядром, и где соотношение множества полипептидных комплексов составляет более 50 до 200 на наносферу, имеющую размер менее 14 нм.
3. Композиция по п. 2, где указанное биологически совместимое покрытие содержит один или более из декстрана, маннита и поли(этиленгликоля).
4. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где комплексы антиген-МНС функционально связаны с ядром биологически совместимой биоабсорбируемой наносферы или биодеградируемым покрытием при помощи линкера.
5. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где ядро биологически совместимой биоабсорбируемой наносферы содержит металл или полимер.
6. Композиция по п. 5, где металл содержит один или более из золота, железа или оксида железа.
7. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где молекула МНС в составе комплексов антиген-МНС содержит классические или неклассические молекулы МНС класса I и/или класса II.
8. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где молекула МНС в составе комплексов антиген-МНС содержит весь или часть белка HLA-A, HLA-B, HLA-C, CD1, HLA-DR, HLA-DQ или HLA-DP.
9. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где молекула МНС в составе комплексов антиген-МНС содержит весь или часть белка HLA-A*0201.
10. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где комплексы антиген-МНС содержат различные антигенные эпитопы.
11. Композиция по п. 10, где антигенные эпитопы получены от одного антигена или множества различных антигенов.
12. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где антиген комплексов антиген-МНС представляет собой аутоантиген.
13. Композиция по любому из пп. 1 и 2, где комплексы антиген-МНС ковалентно или нековалентно связаны с ядром биологически совместимой биоабсорбируемой наносферы или биодеградируемым покрытием.
14. Композиция по любому из пп. 1 и 2, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
15. Применение композиции по любому из пп. 1 и 2 для лечения аутоиммунного нарушения, при этом композиция вводится в количестве, достаточном для пролиферации антипатогенных аутореактивных Т-клеток.
16. Применение по п. 15, при котором молекула МНС множества комплексов антиген-МНС содержит молекулы МНС класса I и класса II.
17. Применение по п. 15, при котором антипатогенные аутореактивные Т клетки включают CD4+ Т-клетки и/или CD8+ Т-клетки.
18. Применение по п. 15, при котором аутоиммунное нарушение представляет собой преддиабет, сахарный диабет, сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа, астму, рассеянный склероз, отторжение трансплантата, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, пемфигус, первичный билиарный цирроз, нейромиелит зрительного нерва, обыкновенную пузырчатку, листовидный пемфигус, гипотиреоидизм, полимиозит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, колит, ревматоидный артрит, псориатически артрит, системную красную волчанку, целиакию, псориаз, кардиомиопатию, миастению, увеит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Грейвса, воспалительную миопатия, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания кожи, пернициозную анемию, гипопаратиреоз, синдром мышечной скованности, хроническую обструктивную болезнь легких, АНЦА-ассоциированный васкулит или антифосфолипидный синдром.
19. Применение по п. 15, при котором
a) аутоиммунное нарушение представляет собой сахарный диабет I типа, антиген получен из антигена, выбранного из группы, состоящей из PPI, IGRP, GAD или проинсулина, а молекула МНС содержит весь или часть HLA-DR; или
b) аутоиммунное нарушение представляет собой рассеянный склероз, антиген получен из антигена, выбранного из группы, состоящей из MOG, MBP или PLP, а молекула МНС содержит весь или часть HLA-DR.
20. Применение композиции по любому из пп. 1 и 2 для увеличения и/или развития популяций антипатогенных аутореактивных Т-клеток у субъекта, при этом композиция вводится в количестве и с частотой, достаточными для увеличения указанных популяций.
21. Применение по п. 20, при котором увеличение популяции антипатогенных аутореактивных Т-клеток является антиген-специфичным, но клетки обладают антиген-неспецифичным характером супрессии.
22. Применение по п. 20, при котором введение композиции вызывает деплецию популяции патогенных аутореактивных Т-клеток одного происхождения.
23. Применение по п. 20, при котором введение композиции вызывает деплецию популяции патогенных аутореактивных Т-клеток различного происхождения.
24. Применение по п. 20, при котором антипатогенные аутореактивные Т-клетки включают CD4+ Т-клетки и/или CD8+ Т-клетки.
25. Применение композиции по любому из пп. 1 и 2 для ингибирования начала аутоиммунного заболевания, при этом композиция вводится в количестве, достаточном для пролиферации антипатогенных аутореактивных Т-клеток, в котором молекула МНС содержит молекулы II класса МНС.
26. Применение по п. 25, при котором указанные аутореактивные Т-клетки представляют собой CD4+ TR1 клетки.
27. Применение по п. 26, при котором указанные CD4+ TR1 клетки характеризуются экспрессией IL-10 и IFNγ и/или экспрессией TGFβ.
28. Применение по п. 25, при котором аутоиммунное нарушение представляет собой преддиабет, сахарный диабет, сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа, астму, рассеянный склероз, отторжение трансплантата, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, пемфигус, первичный билиарный цирроз, нейромиелит зрительного нерва, обыкновенную пузырчатку, листовидный пемфигус, гипотиреоидизм, полимиозит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, колит, ревматоидный артрит, псориатически артрит, системную красную волчанку, целиакию, псориаз, кардиомиопатию, миастению, увеит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Грейвса, воспалительную миопатия, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания кожи, пернициозную анемию, гипопаратиреоз, синдром мышечной скованности, хроническую обструктивную болезнь легких, АНЦА-ассоциированный васкулит или антифосфолипидный синдром.
29. Применение по п. 25, при котором
a) аутоиммунное нарушение представляет собой сахарный диабет I типа, антиген получен из антигена, выбранного из группы, состоящей из PPI, IGRP, GAD или проинсулина, а молекула МНС содержит весь или часть HLA-DR; или
b) аутоиммунное нарушение представляет собой рассеянный склероз, антиген получен из антигена, выбранного из группы, состоящей из MOG, МВР или PLP, а молекула МНС содержит весь или часть HLA-DR.
30. Применение композиции по любому из пп. 1 и 2 для лечения воспалительного компонента аутоиммунного заболевания, при этом композиция вводится в количестве, достаточном для увеличения популяции антипатогенных аутореактивных клеток TR1, которые экспрессируют IL-10, где:
молекула МНС включает молекулы II класса МНС, а указанный антиген специфичен в отношении аутоиммунного заболевания;
существует возможность накопления указанных TR1 клеток в очагах указанного аутоиммунного заболевания, за счет чего в указанных очагах накапливается IL-10, при условиях, приводящих к уменьшению воспалительного компонента аутоиммунного заболевания.
31. Применение по п. 30, при котором указанные аутореактивные Т-клетки представляют собой CD4+ TR1 клетки.
32. Применение по п. 31, при котором указанные CD4+ TR1 клетки характеризуются экспрессией IL-10 и IFNγ и/или TGFβ.
33. Применение по п. 30, при котором аутоиммунное нарушение представляет собой преддиабет, сахарный диабет, сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа, астму, рассеянный склероз, отторжение трансплантата, синдром истощения яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, волчанку, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, пемфигус, первичный билиарный цирроз, нейромиелит зрительного нерва, обыкновенную пузырчатку, листовидный пемфигус, гипотиреоидизм, полимиозит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, колит, ревматоидный артрит, псориатически артрит, системную красную волчанку, целиакию, псориаз, кардиомиопатию, миастению, увеит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Грейвса, воспалительную миопатия, аутоиммунный гепатит, гипопитуитаризм, миокардит, болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания кожи, пернициозную анемию, гипопаратиреоз, синдром мышечной скованности, хроническую обструктивную болезнь легких, АНЦА-ассоциированный васкулит или антифосфолипидный синдром.
34. Применение по п. 30, при котором
a) аутоиммунное нарушение представляет собой сахарный диабет I типа, антиген получен из антигена, выбранного из группы, состоящей из PPI, IGRP, GAD или проинсулина, а молекула МНС содержит весь или часть HLA-DR; или
b) аутоиммунное нарушение представляет собой рассеянный склероз, антиген получен из антигена, выбранного из группы, состоящей из MOG, МБР или PLP, а молекула МНС содержит весь или часть HLA-DR.
| WO 2008109852 A2, 12.09.2008 | |||
| MOORE A | |||
| et al | |||
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| TSAI S | |||
| et al | |||
| Reversal of autoimmunity by boosting memory-like autoregulatory T cells // Immunity, 2010, Apr 23;32(4), pp.568-80, фиг.1 | |||
| GREGORI S | |||
| et al | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
