ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, ДЛЯ ВЫРАБОТКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ КОМПЛЕКСОВ ПЕПТИД-MHC, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A01K67/27 C07K14/705 C12N15/85 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] В данном документе раскрыты генетически модифицированные животные, отличные от человека (например, грызуны (например, крысы, мыши и т.д.)), которые являются подвергнутыми индуцированию толерантности к человеческой (гуманизированной) молекуле МНС (например, без ограничения пустой человеческой (гуманизированной) молекуле МНС) или ее пептидсвязывающей части (например, пептидсвязывающей полости молекулы МНС), так что животные, отличные от человека, могут вырабатывать устойчивый В-клеточный ответ на человеческую (гуманизированную) молекулу МНС, если она презентирует, например образует комплекс, с пептидом, который является чужеродным для животного, отличного от человека, например, если он является частью комплекса пептид/МНС (рМНС), где пептид является гетерологичным для животного, отличного от человека. Такие животные могут быть применимыми для выработки терапевтических антиген связывающих белков против патогенных комплексов рМНС, например аутоиммуногенных аутопептидов человека, презентирующихся в контексте человеческого HLA.

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0002] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/647720, поданной 24 марта 2018 г., и предварительной заявки на патент США с серийным номером 62/647724, поданной 24 марта 2018 г., каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0003] В настоящем описании содержится ссылка на перечень последовательностей, поданный в электронной форме в виде файла ascii.txt под названием «10116 WO 01_ST25_AsFiled», который был создан 22 марта 2019 г. и имеет размер файла 38,9 килобайта, содержание которого включено посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Хотя Т-клетки играют важные роли в адаптивных противоинфекционных или противоопухолевых ответах, они также играют роли в неадаптивных иммунных ответах, таких как аутоиммунные ответы и реакции отторжения трансплантата. Как правило, опосредованный Т-клетками иммунный ответ предусматривает тесный контакт между Т-клеткой и антигенпрезентирующей клеткой (АРС). Спаривание нескольких молекул участвует в формировании иммунологического синапса, который запускает активность Т-клеток, включая без ограничения (а) Т-клеточный рецептор (TCR) на Т-клетке, который специфически связывается с пептидом, презентирующимся в пептидсвязывающей полости молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) на АРС, и (b) CD28 (на Т-клетке), который спаривается с молекулой В7 на АРС.TCR вместе с молекулами CD3 образуют TCR-комплекс, и при спаривании TCR с комплексом пептид-МНС (рМНС) сигнал передается через CD3. Передача сигнала через как TCR-комплекс, так и CD28 на Т-клетке приводит к активации Т-клетки.

[0005] Эффект иммунотерапевтических подходов к лечению заболеваний заключается в регулировании активности Т-клеток in vivo, например в подавлении аутоиммунных ответов и реакций отторжения трансплантата и т.д. Однако специфичность таких способов обычно является недостаточной, поскольку многие иммунотерапевтические средства оказывают направленное воздействие на передачу сигнала TCR-комплексом путем связывания CD3 и/или спаривания костимулирующих молекул и т.д. Такие подходы часто приводят к нежелательным побочным эффектам, например гиперактивному иммунному ответу или генерализованному подавлению иммунитета. Соответственно, терапевтические средства, в которых используются преимущества уникального взаимодействия между TCR и комплексом рМНС, могут обеспечивать возможность модулирования активности специфических Т-клеток in vivo и обеспечивать новые виды лечения, основанные на модуляции Т-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Раскрыты животные, отличные от человека (например, млекопитающие, например грызуны, например крыса или мышь), которые являются генетически модифицированными и подвергнутыми индуцированию толерантности против человеческих молекул HLA и/или β2-микроглобулина, а также способны продуцировать человеческие или гуманизированные антитела. Как (1) толерантность таких животных, отличных от человека, к молекулам человеческого HLA, так и (2) способность таких животных, отличных от человека, обеспечивать гуманизированные антиген связывающие белки делают возможным их применение в качестве уникальной платформы для выделения клеток, которые могут быть применимы в исследованиях in vitro, например, аллогенных реакций, и/или для продуцирования человеческих или гуманизированных антиген связывающих белков, которые специфически связываются с представляющим интерес комплексом пептид-МНС, при этом антигенсвязывающие белки уникально подходят для применения в качестве терапевтических средств. Соответственно, в данном документе также предусмотрены способы получения и применения животных, отличных от человека, раскрытых в данном документе, и выделенных из них клеток, тканей, нуклеиновых кислот и антиген связывающих белков.

[0007] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть; и (b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, где необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным, при этом у генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируется человеческая или гуманизированная молекула МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающая часть, при этом у генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируются иммуноглобулины, содержащие человеческий или гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи и/или человеческий или гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, и при этом животное, отличное от человека, является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающей части, за счет чего у него вырабатывается специфический В-клеточный ответ при иммунизации антигенным комплексом пептид-МНС (рМНС), который содержит (i) пептид, который является гетерологичным в отношении животного, отличного от человека, в комплексе с (ii) человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС, или ее частью. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, дополнительно содержит антигенный комплекс пептид-МНС (рМНС), который содержит пептид, гетерологичный в отношении животного, отличного от человека, соединенный с человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, дополнительно содержит (с) антигенный комплекс пептид-МНС (рМНС), который содержит (i) пептид, гетерологичный в отношении животного, отличного от человека, соединенный с (ii) человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС, или ее частью; и (d) человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий белок, который специфически связывает антигенный рМНС и не связывает человеческую молекулу HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС.

[0008] В некоторых вариантах осуществления человеческая или гуманизированная молекула МНС выбрана из группы, состоящей из человеческой или гуманизированной молекулы МНС класса I, человеческой или гуманизированной молекулы МНС класса II α, человеческой или гуманизированной молекулы МНС класса II β или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления человеческая или гуманизированная молекула МНС представляет собой человеческую или гуманизированную молекулу МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления человеческая или гуманизированная молекула МНС получена из молекулы HLA класса I, выбранной из группы, состоящей из молекулы HLA-A, молекулы HLA-B, молекулы HLA-C и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, дополнительно содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, необязательно в локусе эндогенного β2-микроглобулина, при этом у животного, отличного от человека, экспрессируется человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, так что животное, отличное от человека, является подвергнутым индуцированию толерантности к β2-микроглобулину отдельно или в сочетании с человеческой или гуманизированной молекулой класса I.

[0009] В некоторых вариантах осуществления человеческая или гуманизированная молекула МНС представляет собой человеческую или гуманизированную молекулу МНС класса II, где необязательно человеческая или гуманизированная молекула МНС получена из α- и/или β-цепей или по меньшей мере пептидсвязывающей полости молекулы HLA класса II, выбранной из группы, состоящей из молекулы HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR и любой их комбинации.

[0010] В некоторых вариантах осуществления человеческая или гуманизированная молекула МНС представляет собой молекулу человеческого HLA. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе МНС нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую молекулу HLA, при этом необязательно нуклеотидная последовательность замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенную молекулу МНС. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эктопическом локусе нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую молекулу HLA. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в локусе ROSA26 нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую молекулу HLA. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гомозиготным по нуклеотидной последовательности в эндогенном локусе МНС, эктопическом локусе или локусе ROSA26. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности в эндогенном локусе МНС, эктопическом локусе или локусе ROSA26.

[0011] В некоторых вариантах осуществления человеческая или гуманизированная молекула МНС представляет собой гуманизированную, например химерную, молекулу МНС. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе МНС нуклеотидную последовательность, кодирующую химерную молекулу МНС, при этом необязательно нуклеотидная последовательность замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенную молекулу МНС. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эктопическом локусе нуклеотидную последовательность, кодирующую химерную молекулу МНС. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в локусе ROSA26 нуклеотидную последовательность, кодирующую химерную молекулу МНС. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гомозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей химерную молекулу МНС в эндогенном локусе МНС, эктопическом локусе или локусе ROSA26. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей химерную молекулу МНС в эндогенном локусе МНС, эктопическом локусе или локусе ROSA26.

[0012] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность кодирует химерную человеческую/отличную от человеческой молекулу МНС, содержащую внеклеточные домены человеческой молекулы HLA, функционально связанные с трансмембранными и цитоплазматическими доменами эндогенной молекулы МНС. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность кодирует (i) химерную человеческую/отличную от человеческой молекулу МНС класса I, содержащую домены α1, α2 и α3 человеческой молекулы МНС класса I, выбранную из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B и HLA-C, функционально связанные с трансмембранными и цитоплазматическими доменами эндогенной молекулы МНС класса I, отличной от человеческой, такой как эндогенный мышиный полипептид Н-2K, эндогенный мышиный полипептид H-2D или эндогенный мышиный полипептид H-DL, и/или (ii) химерную человеческую/отличную от человеческой молекулу МНС класса II, содержащую домены α1 и α2 человеческого полипептида HLA класса II α, функционально связанные с трансмембранными и цитоплазматическими доменами эндогенной молекулы МНС класса II α, отличной от человеческой, такими как эндогенный мышиный полипептид Н-2А α или эндогенный мышиный полипептид Н-2Е α, и/или домены β1 и β2 человеческого полипептида HLA класса I β, функционально связанные с трансмембранными и цитоплазматическими доменами эндогенной молекулы МНС класса II, отличной от человеческой, такими как эндогенный мышиный полипептид Н-2А α или эндогенный мышиный полипептид Н-2Е α.

[0013] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу МНС, не нарушает эндогенный локус МНС, отличный от человеческого. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу МНС, интегрируется в локус вне эндогенного локуса МНС. В некоторых вариантах осуществления такая интеграция не нарушает функциональность какого-либо другого эндогенного гена. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность помещена в эндогенный локус ROSA26.

[0014] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть.

[0015] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи последовательность неперегруппированной человеческой (гуманизированной) гибридной тяжелой цепи, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе легкой цепи неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе легкой цепи последовательность, кодирующую общую легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе легкой цепи рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе легкой цепи модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе легкой цепи модифицированную гистидином перегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи.

[0016] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит функциональный ген ADAM6, где необязательно функциональный ген ADAM6 представляет собой эндогенный ген ADAM6.

[0017] В некоторых вариантах осуществления у генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируется экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT).

[0018] В некоторых вариантах осуществления способ получения генетически модифицированного животного, отличного от человека, по любому из предыдущих пунктов предусматривает модификацию генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, и (b) (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, где необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным, при этом генетически модифицированное животное, отличное от человека, является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле МНС или по меньшей мере ее пептид связывающей части, за счет чего у него вырабатывается специфический В-клеточный ответ при иммунизации комплексом пептид-МНС, который содержит (i) пептид, являющийся гетерологичным в отношении животного, отличного от человека, в комплексе с (ii) человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС, или ее частью, и способно обеспечивать человеческие или гуманизированные антиген связывающие белки, содержащие человеческий или гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи и/или человеческий или гуманизированный вариабельный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления способ включает:

(а)

(i) вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, в первый эктопический локус, или

(ii) замещение в эндогенном локусе МНС I животного, отличного от человека, нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид МНС I животного, отличного от человека, нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид человеческого (гуманизированного) МНС I, и/или в эндогенном локусе МНС II животного, отличного от человека, нуклеотидной последовательности, кодирующей молекулу МНС II животного, отличного от человека, нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческую (гуманизированную) молекулу МНС II,

при этом необязательно человеческая (гуманизированная) молекула МНС I содержит домены α1, α2 и α3 человеческого МНС I и по меньшей мере трансмембранные и цитоплазматические домены эндогенного полипептида МНС I, отличного от человеческого,

при этом необязательно человеческая (гуманизированная) молекула МНС II содержит домены α1, α2, β1 и β2 человеческого МНС II и по меньшей мере трансмембранные и цитоплазматические домены эндогенного полипептида МНС II грызуна, и

(b)

(i) вставку (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина во второй эктопический локус или

(ii) замещение

(А) в эндогенном локусе тяжелой цепи, отличном от человеческого, эндогенного вариабельного сегмента гена иммуноглобулина (V_H), отличного от человеческого, неперегруппированным человеческим вариабельным сегментом гена иммуноглобулина (V_H), и необязательно замещение эндогенного вариативного сегмента гена иммуноглобулина (D_H), отличного от человеческого, и/или эндогенного соединяющего сегмента гена (J_H), отличного от человеческого, неперегруппированным человеческим вариативным сегментом гена иммуноглобулина (D_H) и/или неперегруппированным человеческим соединяющим сегментом гена иммуноглобулина (J_H) соответственно, при этом неперегруппированный человеческий сегмент гена V_H и необязательные сегменты гена D_H и J_H функционально связаны с эндогенной последовательностью гена константной области тяжелой цепи, и/или

(В) в эндогенном локусе легкой цепи, отличной от человеческой, эндогенного вариабельного сегмента гена легкой цепи (V_L), отличного от человеческого, и эндогенного соединяющего сегмента гена легкой цепи (J_L), отличного от человеческого, человеческим вариабельным сегментом гена легкой цепи (V_L) и человеческим соединяющим сегментом гена легкой цепи (J_L), которые необязательно являются перегруппированными с образованием последовательности гена V_L/J_L, при этом человеческий сегмент гена V_L и соединяющий сегмент гена J_L функционально связаны с эндогенной последовательностью гена константной области легкой цепи,

при этом (а) нуклеотидная последовательность, соответственно кодирующая молекулу МНС I, отличную от человеческой, и/или молекулу МНС II, отличную от человеческой, и (b) сегменты гена V_H, D_H, J_H, V_L, и J_L либо

(I) вставлены или вставлены посредством замещения с помощью последовательной гомологичной рекомбинации в одну отличную от человеческой эмбриональную стволовую (ES) клетку, либо

(II) в первую и вторую ES-клетку соответственно, используемые для получения первого и второго животного, отличного от человека, и при этом способ дополнительно включает скрещивание первого и второго животного, отличного от человека.

[0019] В некоторых вариантах осуществления способ получения генетически модифицированного животного, отличного от человека, включает введение животному, отличному от человека, антигенного комплекса рМНС, который содержит пептид, гетерологичный в отношении животного, отличного от человека, соединенный с человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС. В некоторых вариантах осуществления антигенный комплекс рМНС соединен с эпитопом хелперной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления эпитоп хелперной Т-клетки содержит PADRE, например, представленный под SEQ ID NO: 28.

[0020] В некоторых вариантах осуществления способ получения антиген связывающего белка, который специфически связывает представляющий интерес антигенный комплекс рМНС, или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей его, включает содержание генетически модифицированного животного, отличного от человека, описанного в данном документе, в условиях, необходимых для того, чтобы у животного, отличного от человека, сформировался иммунный ответ на представляющий интерес антигенный комплекс рМНС, где представляющий интерес антигенный комплекс рМНС содержит пептид, который является гетерологичным в отношении животного, отличного от человека, и презентируется в контексте человеческого HLA, из которого получена человеческая или гуманизированная молекула МНС, или его части. В некоторых вариантах осуществления способ включает в качестве первой(-ых) стадии(-ий) иммунизацию животного, отличного от человека, представляющим интерес антигенным комплексом рМНС и необязательно стимулирование иммунного ответа у иммунизированного животного, отличного от человека, при этом необязательно иммунизация и/или стимулирование предусматривают введение животному, отличному от человека, представляющего интерес комплекса рМНС, связанного с эпитопом хелперной Т-клетки, например PADRE (SEQ ID NO: 28).

[0021] В некоторых вариантах осуществления способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, включает выделение из животного, отличного от человека, описанного в данном документе, нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность гена перегруппированной человеческой вариабельной области иммуноглобулина, которая кодирует человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом животного, отличного от человека, или гибридомой, полученной из лимфоцита, при этом человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом или гибридомой, полученной из него, соединяется с его когнатным вариабельным доменом с образованием антигенсвязывающего домена, специфического в отношении антигенного комплекса рМНС. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает иммунизацию животного, отличного от человека, представляющим интерес антигенным комплексом рМНС и обеспечение формирования у животного, отличного от человека, иммунного ответа на антиген перед получением нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полученная перегруппированную последовательность гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина содержит по меньшей мере одну соматическую гипермутацию.

[0022] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, содержит последовательность гена человеческой константной области, функционально связанную с перегруппированной последовательностью гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления последовательность гена человеческой константной области тяжелой цепи содержит модификацию, которая повышает аффинность области СН2-СН3 в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG в отношении неонатального Fc-рецептора (FcRn) при рН в диапазоне от 5,5 до 6,0, при этом модификация представляет собой мутацию в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG, выбранную из группы, состоящей из M428L, N434S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, Т256Е, T250Q, H433K, N434Y и их комбинации. Также в данном документе описаны клетки-хозяева млекопитающих, например, для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческую тяжелую и/или легкую цепь иммуноглобулина, специфическую в отношении антигенного комплекса рМНС.

[0023] В некоторых вариантах осуществления способ получения клетки, которая экспрессирует человеческий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, включает выделение лимфоцита из животного, отличного от человека, описанного в данном документе, при этом лимфоцит экспрессирует человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, который образует антигенсвязывающий домен, специфический в отношении антигенного комплекса рМНС. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение гибридомы из выделенного лимфоцита.

[0024] В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка, например зародышевая клетка, эмбриональная стволовая клетка, соматическая клетка (например, В-клетка), описанная в данном документе, содержит (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, и (b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным. В некоторых вариантах осуществления выделенную клетку получают согласно способу, описываемому в данном документе.

[0025] В некоторых вариантах осуществления способ получения человеческого вариабельного домена иммуноглобулина in vitro включает обеспечение экспрессии в клетке первой нуклеиновой кислоты, содержащей перегруппированную последовательность гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина, которая кодирует человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом животного, отличного от человека, или гибридомой, полученной из лимфоцита, при этом человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом или гибридомой, полученной из него, соединяется с его когнатным вариабельным доменом с образованием антиген связывающего домена, специфического в отношении антигенного комплекса рМНС. В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность гена человеческой константной области иммуноглобулина, функционально связанную с перегруппированной последовательностью гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления последовательность гена человеческой константной области иммуноглобулина представляет собой последовательность гена константной области тяжелой цепи и содержит модификацию, которая повышает аффинность области СН2-СН3 в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG в отношении неонатального Fc-рецептора (FcRn) при рН в диапазоне от 5,5 до 6,0, при этом модификация представляет собой мутацию в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG, выбранную из группы, состоящей из M428L, N434 S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, Т256Е, T250Q, H433K, N434Y и их комбинации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0026] На фиг. 1А-1С представлены иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения, которые являются схематическими представлениями (без соблюдения масштаба) локусов химерных МНС I и МНС II, например локуса химерного HLA-A2/H-2K, например в локусе эндогенного Н-2K, (фиг. 1А), локуса химерного HLA-DR2/H-2E, например в локусе эндогенного Н-2Е, (фиг. 1В), и локуса гуманизированного β2М, например в локусе эндогенного β2М (фиг. 1С). Если не указано иное, человеческие последовательности изображены в виде незаштрихованных фигур, а мышиные последовательности изображены в виде заштрихованных фигур. Фигуры в полоску представляют экзон 1 и находящуюся ниже него часть интрона из последовательности гена Н-2Е, полученной из линии мышей, отличной от той, которой принадлежит эндогенный локус. Флоксированная(-ые) кассета(-ы) неомицинфосфотрансферазы до опосредованного Cre удаления кассеты (фиг. 1С) и после Cre-удаления кассеты (фиг. 1А и 1В) изображена(-ы) с помощью стрелок, помеченных соответствующим образом.

[0027] На фиг. 2 представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) иллюстративного трансгена (SEQ ID NO: 22) по настоящему изобретению, кодирующего одноцепочечную молекулу МНС (SEQ ID NO: 23), содержащую полноразмерный зрелый полипептид HLA-A2 (α2) (например, аминокислоты 25-365 HLA-α2), соединенный с человеческим β2-микроглобулином (β2m) в локусе ROSA26 (Gt (ROSA) 26 Sor). Если не указано иное, человеческие последовательности изображены в виде незаштрихованных фигур, мышиные последовательности изображены в виде заштрихованных фигур, а последовательности, которые не являются ни человеческими, ни мышиными последовательностями, изображены с помощью различных узоров. Заштрихованные стрелки обозначают экзоны локуса эндогенного мышиного ROSA26. 5'НВ и 3'НВ: блоки гомологии в гене ROSA 26, используемые для вставки трансгена B2m-G4Sx4-HLA-A2 (SEQ ID NO: 22), который кодирует одноцепочечный комплекс HLA-A2/p2M (SEQ ID NO: 23) путем гомологичной рекомбинации. SA: консенсусный акцептор сплайсинга. ROR: мышиная сигнальная последовательность ROR. G4Sx4: линкер GGGS (SEQ ID NO: 21), SV40PA: сигнал полиаденилирования из вируса SV40. LoxP-New-LoxP: флоксированная кассета неомицинфосфотрансферазы перед опосредованным Cre удалением кассеты.

[0028] На фиг. 3 показаны результаты иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения, где образцы сыворотки крови от тестируемых мышей (содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие гуманизированную молекулу МНС I (HLA-A2/H-2K), гуманизированный β2-микроглобулин, локус неперегруппированной гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и локус гуманизированной общей легкой цепи Vκ1-39/Jκ; или от контрольных мышей (содержащих функциональный (например, мышиный) ген ADAM6 и локусы гуманизированных тяжелой и легкой цепей; иммунизированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей иммуноген, содержащий пептид В, презентирующийся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином, тестировали на предмет титров (ось у) антител, которые связывают нерелевантный или релевантный пептид (пептид А (нерелевантный), пептид В (релевантный) или пептид С (нерелевантный)), презентирующийся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином в виде одноцепочечного комплекса рМНС. Титр антител в образцах сыворотки крови, которые связывают отдельные комплексы рМНС, рассчитывают в виде интерполированного коэффициента разведения сыворотки крови, сигнал связывания при котором в 2 раза превышает фон.

[0029] На фиг. 4 показаны результаты иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения, где образцы сыворотки крови от тестируемой мыши (содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие гуманизированную молекулу МНС I (HLA-A2/H-2K), гуманизированный β2-микроглобулин, локус неперегруппированной гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и локус гуманизированной общей легкой цепи Vκ1-39/Jκ; или от контрольной мыши (содержащей функциональный (например, мышиный) ген ADAM6 и локусы гуманизированных тяжелой и легкой цепей; иммунизированных иммуногеном, представляющим собой одноцепочечный комплекс рМНС, содержащий пептид В, презентирующийся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином, тестировали на предмет титров (ось у) антител, которые связывают нерелевантный или релевантный пептид (пептид А (нерелевантный), пептид В (релевантный) или пептид С (нерелевантный)), презентирующийся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином в виде одноцепочечного комплекса рМНС. Титр (ось у) антител в образцах сыворотки крови, которые связывают отдельные комплексы рМНС, рассчитывают в виде интерполированного коэффициента разведения сыворотки крови, сигнал связывания при котором в 2 раза превышает фон.

[0030] На фиг. 5 показаны результаты иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения, где образцы сыворотки крови от тестируемых мышей (содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие гуманизированную молекулу МНС I (HLA-A2/H-2K), гуманизированный β2-микроглобулин, локус неперегруппированной гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и локус гуманизированной общей легкой цепи Vκ1-39/Jκ), иммунизированных иммуногеном, содержащим пептид В, презентирующийся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином, и обеспеченных стимуляциями другим рекомбинантным полипептидом, содержащим пептид В, презентирующийся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином, и эпитоп хелперной Т-клетки (PADRE), тестировали на предмет связывания с нерелевантным или релевантным пептидом (пептидом А (нерелевантным), пептидом В (релевантным) или пептидом С (нерелевантным)), презентирующимся в пептидсвязывающей полости HLA-A, соединенного с человеческим β2-микроглобулином в виде одноцепочечного комплекса рМНС. Титр антител (ось у) для антител в образцах сыворотки крови, связывающих отдельные комплексы рМНС, рассчитывают в виде интерполированного коэффициента разведения сыворотки крови, сигнал связывания при котором в 2 раза превышает фон.

ОПИСАНИЕ

[0031] Как показано в данном документе, у контрольных животных, отличных от человека, которые не являются подвергнутыми индуцированию толерантности к молекулам человеческого HLA и человеческого β2-микроглобулина, но иммунизируют представляющим интерес пептидом, презентирующимся в контексте молекулы HLA, т.е. представляющим интерес комплексом рМНС, появляются титры антител к представляющему интерес комплексу рМНС. Фиг. 3-4 (квадратные символы). Однако, образцы сыворотки крови контрольных животных, не подвергнутых индуцированию толерантности и иммунизированных, также содержали сопоставимые титры антител к нерелевантным комплексам рМНС (например, нерелевантному пептиду, презентирующемуся в том же контексте), против которых животные, отличные от человека, не были иммунизированы, что позволяет предположить, что ответ, вырабатываемый против представляющего интерес комплекса рМНС, не является специфическим ответом. См. фиг. 3-4 (квадратные символы).

[0032] Напротив, у животных, отличных от человека, которые являются подвергнутыми индуцированию толерантности к молекулам человеческого HLA и человеческого β2-микроглобулина или по меньшей мере к их пептидсвязывающей полости (например, их внеклеточной части) и иммунизированными представляющим интерес комплексом рМНС, полученным из человеческой молекулы HLA, возникают более высокие титры антител к представляющему интерес комплексу рМНС, чем к нерелевантным комплексам рМНС. См. фиг. 3-5. Следовательно, в данном документе показано, что животные, отличные от человека, которые являются подвергнутыми индуцированию толерантности к молекулам человеческого HLA и человеческого β2-микроглобулина (или по меньшей мере к его пептидсвязывающей полости (например, его внеклеточной части)), обеспечивают платформу выработки специфического иммунного ответа на представляющий интерес рМНС in vivo, из которой могут быть выбраны основное соединение или соединения. Такая платформа улучшена по сравнению с платформой, предусматривающей не подвергнутых индуцированию толерантности животных, у которых вырабатываются неспецифические иммунные ответы на представляющий интерес рМНС. Соответственно, в данном документе предусмотрено животное, отличное от человека, генетически модифицированное с возможностью индуцирования толерантности к человеческой молекуле HLA, так им образом, что при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС, который содержит представляющий интерес пептид, презентирующийся в контексте человеческой молекулы HLA, у животного, отличного от человека, может вырабатываться специфический В-клеточный ответ на представляющий интерес комплекс рМНС.

[0033] В иллюстративных вариантах осуществления животные, отличные от человека, генетически модифицированы с возможностью индуцирования толерантности к человеческой молекуле HLA, ее части и/или ее одноцепочечному производному, но не к антигенному комплексу пептид-МНС (рМНС), содержащему антигенный пептид (например, пептид, гетерологичный в отношении генетически модифицированного животного, отличного от человека) соединенный (например, презентирующийся) с человеческой молекулой HLA, в отношении которой животное, отличное от человека, было подвергнуто индуцированию толерантности. Поскольку животное, отличное от человека, не является подвергнутым индуцированию толерантности к такому антигенному комплексу рМНС, животное, генетически модифицированное, как раскрыто в данном документе, может быть применимо не только для выделения иммунных клеток, которые не отвечают на человеческую молекулу HLA, ее часть и/или ее одноцепочечное производное, например, для исследований in vitro, но также для выработки антиген связывающих белков, в частности, человеческих или гуманизированных антиген связывающих белков, которые специфически связываются с представляющим интерес антигенным комплексом рМНС. Такие специфические (человеческие или гуманизированные) антиген связывающие белки могут быть применимы в терапевтических средствах для лечения человеческих заболеваний, например, при предупреждении образования иммунологического синапса между аутореактивным TCR и комплексом рМНС, содержащим аутореактивный аутоантиген (например, для предупреждения и/или лечения аутоиммунных нарушений, болезни «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата и т.д.), нацеливания на клетки, инфицированные патогеном (например, вирусом) и презентирования вирусного пептида посредством комплекса рМНС, экспрессированного на клеточной поверхности, и т.д. В дополнение к описанию животных, отличных от человека, и способов получения таких животных, отличных от человека, которые являются подвергнутыми индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле HLA, ее части и/или ее одноцепочечному производному; также раскрыты способы введения антигенного комплекса рМНС животным, отличным от человека, для выработки гуморального иммунного ответа на рМНС, а также получения таких антигенных комплексов рМНС.

Определения

[0034] Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимает специалист средней квалификации в данной области техники.

[0035] Формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на «способ» включает один или более способов и/или стадий, описанных в данном документе, и/или которые станут очевидными специалистам в данной области при прочтении настоящего раскрытия.

[0036] Термин «приблизительно» или «примерно» включает нахождение в пределах значимого диапазона значения. Допустимое отклонение, охватываемое терминами «приблизительно» или «примерно», зависит от конкретной исследуемой системы и может быть легко оценено специалистом средней квалификации в данной области техники.

[0037] Термины «главный комплекс гистосовместимости» и «МНС» охватывают термины «человеческий лейкоцитарный антиген» или «HLA» (последние два из которых обычно предназначены для человеческих молекул МНС), встречающиеся в природе молекулы МНС, отдельные цепи молекул МНС (например, а (тяжелая) цепь МНС класса I, {32-микроглобулин, α-цепь МНС класса II и β-цепь МНС класса II), отдельные субъединицы таких цепей молекул МНС (например, субъединицы α1, α2 и/или α3 α-цепи МНС класса I, субъединицы α1-α2 α-цепи МНС класса II, субъединицы β1-β2 β-цепи МНС класса II), а также части (например, пептидсвязывающие части, например пептидсвязывающие полости), мутанты и различные их производные (в том числе слитые белки), при этом такие часть, мутанты и производные сохраняют способность экспонировать антигенный пептид для распознавания Т-клеточным рецептором (TCR), например антигенспецифическим TCR. Молекула МНС класса I содержит пептидсвязывающую полость, образованную доменами α1 и α2 тяжелой α-цепи, которая может размещать пептид из около 8-10 аминокислот. Несмотря на то, что оба класса МНС связывают ядро из приблизительно 9 аминокислот (например, 5-17 аминокислот) в составе пептидов, открытая природа пептидсвязывающей полости МНС класса II (домен α1 α-полипептида МНС класса II, соединенный с доменом β1 β-полипептида МНС класса II) обеспечивает более широкий диапазон длин пептидов. Длина пептидов, связывающихся с помощью МНС класса II, обычно варьирует от 13 до 17 аминокислот, хотя нередко встречаются меньшие или большие длины. В результате пептиды могут сдвигаться в пептидсвязывающей полости МНС класса II, меняя 9-мер, который непосредственно расположен в полости в любой данный момент времени. В данном документе используют традиционные идентификации конкретных вариантов МНС. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит нуклеотид, кодирующий человеческую (гуманизированную) молекулу МНС, которая содержит по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость (например, пептидсвязывающую часть) и в дополнительных вариантах осуществления по меньшей мере внеклеточные домены молекулы человеческого HLA класса I/человеческого β2-микроглобулина и/или молекулы человеческого HLA класса II.

[0038] Термины «являющийся подвергнутым индуцированию толерантности», «толерантность», «индуцирование толерантности» и т.п. относятся к неспособности или пониженной способности животного, например генетически модифицированного животного, отличного от человека, раскрытого в данном документе, формировать иммунный ответ на вещество. Как правило, животное является подвергнутым индуцированию толерантности, проявляет толерантность, подвергается индуцированию толерантности и т.д. к своим собственным белкам или молекулам, экспрессируемым во время эмбриогенеза и/или при рождении, например, животное не может формировать иммунный ответ на свои собственные белки или молекулы, экспрессируемые из его генома, например генома зародышевой линии, или такая его способность является маловероятной. Путем генетической модификации животного, таким образом, чтобы его геном, например геном зародышевой линии, содержал человеческую (гуманизированную) молекулу МНС при экспрессии «пустой» человеческой (гуманизированной) молекулы МНС, животное становится подвергнутым индуцированию толерантности, проявляет толерантность, подвергается индуцированию толерантности и т.д. к пустой человеческой (гуманизированной) молекуле МНС, как если бы человеческая (гуманизированная) молекула МНС была собственным белком. «Пустая» в контексте молекулы HLA, молекулы МНС, человеческой (гуманизированной) молекулы МНС и т.п. включает молекулу HLA, молекулу МНС, человеческую (гуманизированную) молекулу МНС и т.п., экспрессируемую либо без пептида в своей пептидсвязывающей полости, либо с пептидом, который является эндогенным в отношении животного, экспрессирующего молекулу HLA, молекулу МНС, человеческую (гуманизированную) молекулу МНС и т.п. Например, у животного пустая молекула МНС может включать человеческую (гуманизированную) молекулу МНС, которая экспрессируется из генома, например генома зародышевой линии, животного и презентирует эндогенный собственный белок животного или его часть.

[0039] Геном животного, отличного от человека, можно рассматривать как «соматический геном», например, это может быть геном, находящийся в соматических клетках животного, отличного от человека, или можно рассматривать как «геном зародышевой линии», например, это может быть геном, который находится в зародышевых клетках животного, отличного от человека, и передается потомству животного, отличного от человека. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что локусы вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, которые являются неперегруппированными в геноме зародышевой линии, способны перегруппировываться в соматической клетке (например, В-клетке) животного, отличного от человека, с образованием перегруппированного локуса вариабельной области иммуноглобулина, который кодирует вариабельный домен иммуноглобулина. Соответственно, неперегруппированный локус тяжелой и/или легкой цепи в иллюстративных вариантах осуществления может быть обнаружен в геноме зародышевой линии животного, отличного от человека, а полученная из него перегруппированная последовательность может быть обнаружена, например, в В-клетке животного, отличного от человека.

[0040] Термин «животное, отличное от человека» и т.п. относится к любому позвоночному организму, который не является человеком. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является круглоротым, костной рыбой, хрящевой рыбой (например, акула или скат), земноводным, пресмыкающимся, млекопитающим и птицей. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее, отличное от человека, представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

[0041] Термин «гуманизированная», «химерная», «человеческая/отличная от человеческой» и т.п. относится к молекуле (например, нуклеиновой кислоте, белку и т.д.), которая не являлась человеческой по происхождению и в которой часть была замещена соответствующей частью соответствующей человеческой молекулы, за счет чего модифицированная (например, гуманизированная, химерная, человеческая/отличная от человеческой и т.д.) молекула сохраняет свою биологическую функцию и/или сохраняет структуру, которая осуществляет сохраненную биологическую функцию. Гуманизированная молекула может считаться полученной из человеческой молекулы, если гуманизированная молекула кодируется нуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует человеческую молекулу (или ее часть). В отличие от этого, термин «человеческая» и т.п. охватывает молекулы, характеризующиеся исключительно человеческим происхождением, например человеческие нуклеотиды или белок, содержащие исключительно человеческие нуклеотидные и аминокислотные последовательности соответственно. Термин «человеческая (гуманизированная)» используют для отображения того, что человеческая (гуманизированная) молекула может быть (а) человеческой молекулой или (b) гуманизированной молекулой.

[0042] В некоторых вариантах осуществления человеческая (гуманизированная) молекула МНС содержит, или у животного, отличного от человека, экспрессируется и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой (гуманизированной) молекуле МНС, содержащей по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость человеческой молекулы HLA, при этом человеческая (гуманизированная) молекула МНС сохраняет способность презентировать антиген в человеческой пептидсвязывающей полости, и/или человеческая (гуманизированная) молекула МНС сохраняет структуру человеческой пептидсвязывающей полости человеческой молекулы HLA. В некоторых вариантах осуществления человеческая (гуманизированная) молекула МНС содержит, или у животного, отличного от человека, экспрессируется и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой (гуманизированной) молекуле МНС, которая содержит по меньшей мере человеческий внеклеточный домен человеческой молекулы HLA, при этом человеческая (гуманизированная) молекула МНС сохраняет способность презентировать антиген, и/или человеческая (гуманизированная) молекула МНС сохраняет структуру человеческого внеклеточного домена человеческой молекулы HLA, что обеспечивает образование пептидсвязывающей полости. В некоторых вариантах осуществления человеческая (гуманизированная) молекула МНС содержит, или у животного, отличного от человека, экспрессируется и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой (гуманизированной) молекуле МНС, которая содержит человеческую пептидсвязывающую полость человеческого полипептида HLA класса I (например, по меньшей мере домены α1 и α2 человеческого полипептида HLA класса I, например внеклеточную часть человеческого полипептида HLA класса I, например по меньшей мере полноразмерный зрелый человеческий полипептид HLA класса I), при этом человеческий (гуманизированный) полипептид МНС класса I сохраняет способность презентировать антиген и/или структуру, необходимую для презентации антигена в человеческой пептидсвязывающей полости. В некоторых вариантах осуществления человеческая (гуманизированная) молекула МНС содержит, или у животного, отличного от человека, экспрессируется и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой (гуманизированной) молекуле МНС, которая содержит человеческую пептидсвязывающую полость человеческого полипептида HLA класса I (например, по меньшей мере домены α1 и α2 человеческого полипептида HLA класса I, например внеклеточную часть человеческого полипептида HLA класса I, например по меньшей мере полноразмерный зрелый человеческий полипептид HLA класса I), при этом человеческая (гуманизированная) молекула МНС класса I сохраняет способность презентировать антиген и/или структуру, необходимую для презентации антигена в человеческой пептидсвязывающей полости, и при этом человеческая (гуманизированная) молекула МНС класса I дополнительно содержит человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, который стабилизирует молекулу МНС класса I.

[0043] Термин «антиген» относится к любому средству (например, белку, пептиду, полисахариду, гликопротеину, гликолипиду, нуклеотиду, их частям или их комбинациям), которое при введении иммунокомпетентному хозяину распознается иммунной системой хозяина и вызывает у хозяина иммунный ответ. Т-клеточный рецептор распознает пептид, презентирующийся в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС) как часть иммунологического синапса. Комплекс пептид-МНС (рМНС) распознается TCR, при этом пептид (антигенная детерминанта) и идиотип TCR обеспечивают специфичность взаимодействия. Соответственно, термин «антиген» охватывает пептиды, презентирующиеся в контексте МНС, например комплексы пептид-МНС, например комплексы рМНС. Пептид, представленный на МНС, также может называться «эпитопом» или «антигенной детерминантой». Термины «пептид», «антигенная детерминанта», «эпитопы» и т.д. охватывают не только те пептиды, которые в естественных условиях презентируются антигенпрезентирующими клетками (АРС), но могут представлять собой любой необходимый пептид, если он распознается иммунной клеткой генетически модифицированного животного, отличного от человека, например, при презентировании соответствующим образом клеткам иммунной системы. Например, пептид, имеющий искусственно полученную аминокислотную последовательность, также можно использовать в качестве эпитопа.

[0044] «Комплекс пептид-МНС», «комплекс рМНС», «пептид в полости» и т.п. включают

(i) молекулу МНС, например человеческую и/или гуманизированную (например, «человеческую (гуманизированную)») молекулу МНС или ее часть (например, ее пептидсвязывающую полость, и, например, ее внеклеточную часть), и

(ii) антигенный пептид,

при этом молекула МНС и антигенный пептид образуют комплекс, за счет чего комплекс рМНС может специфически связывать Т-клеточный рецептор. Комплекс рМНС охватывает комплексы рМНС, экспрессируемые на клеточной поверхности, и растворимые комплексы рМНС. В иллюстративных вариантах осуществления животные, отличные от человека, содержащие в своем геноме, например геноме зародышевой линии, нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую (гуманизированную) молекулу МНС или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, становятся подвергнутыми индуцированию толерантности к пустой человеческой (гуманизированной) молекуле МНС или ее пустой человеческой пептидсвязывающей полости. При введении животному, отличному от человека, антигенного комплекса рМНС, например комплекса, содержащего человеческую (гуманизированную) молекулу МНС в комплексе с пептидом, который является чужеродным для животного-хозяина, отличного от человека, которому вводят комплекс рМНС, животное, отличное от человека, способно вырабатывать гуморальный иммунный ответ на антигенный комплекс рМНС. Такие специфические антигенсвязывающие белки затем могут быть выделены и использованы в качестве терапевтических средств для специфической модуляции взаимодействия специфического Т-клеточного рецептора с антигенным рМНС. В иллюстративных вариантах осуществления растворимый комплекс рМНС, содержащий пептид (который является чужеродным для животного-хозяина, отличного от человека, которому вводят комплекс рМНС) в комплексе с молекулой МНС, в отношении которой животное, отличное от человека, было подвергнуто индуцированию толерантности, может не вызывать Т-клеточного иммунного ответа по причине растворимой природы вводимого комплекса рМНС. Однако такой растворимый комплекс рМНС все же может считаться антигенным, поскольку он может вызывать опосредованный В-клетками иммунный ответ, который обеспечивает выработку антигенсвязывающих белков, которые специфически связывают растворимый комплекс рМНС.

[0045] Фраза «сегмент гена» или «сегмент» включает ссылку на вариабельный (V) сегмент гена (например, вариабельный сегмент гена легкой цепи иммуноглобулина (V_L) или вариабельный сегмент гена тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), вариативный сегмент гена тяжелой цепи иммуноглобулина (D_H) или соединяющий (J) сегмент гена, например соединяющий сегмент гена легкой цепи иммуноглобулина (J_L) или соединяющий сегмент гена тяжелой цепи иммуноглобулина, (J_L), который включает неперегруппированные последовательности в локусах иммуноглобулина, которые могут участвовать в перегруппировке (опосредованной, например, эндогенными рекомбиназами) с образованием последовательности перегруппированной легкой цепи V_L/J_L или перегруппированной тяжелой цепи V_H/D_H/J_H. Если не указано иное, то неперегруппированные сегменты V, D и J содержат последовательности сигнала рекомбинации (RSS), которые обеспечивают возможность рекомбинации V_L/J_L или рекомбинации V_H/D_H/J_H в соответствии с правилом 12/23.

[0046] Термины «антигенсвязывающий белок», «иммуноглобулин», «антитело», «антитела», «связывающий белок» и т.п. относятся к моноклональным антителам, полиспецифическим антителам, человеческим антителам, гуманизированным антителам, химерным антителам, одноцепочечным Fv (scFv), одноцепочечным антителам, Fab-фрагментам, F(ab')-фрагментам, связанным дисульфидной связью Fv (sdFv), интрателам, минителам, диателам и антиидиотипическим (anti-Id) антителам (включая, например, антитела anti-Id к антигенспецифичным TCR) и эпитопсвязывающим фрагментам любого из вышеперечисленных. Термины «антитело» и «антитела» также относятся к ковалентным диателам, таким как раскрытые в публикации заявки на патент США №20070004909, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и Ig-DARTS, таким как раскрытые в публикации заявки на патент США №20090060910, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. рМНС-связывающий белок относится к антигенсвязывающему белку, иммуноглобулину, антителу или подобному, которые специфически связывают комплекс рМНС.

[0047] Термины «специфически связывает», «связывает специфическим образом», «антигенспецифический» или подобные указывают на то, что молекулы, вовлеченные в специфическое связывание, (1) способны стабильно связываться, например, соединяться, например, образовывать межмолекулярные нековалентные связи, при физиологических условиях и (2) не способны образовывать стабильную связь при физиологических условиях с другими молекулами вне указанной пары связывания. Соответственно, антигенсвязывающий белок (например, иммуноглобулин, антитело и т.п.), который специфическим образом связывается с комплексом рМНС, указывает на то, что рМНС-связывающий белок образует стабильные межмолекулярные нековалентные связи с комплексом рМНС. Соответственно, рМНС-связывающий белок, который специфически связывается, например связывается специфическим образом, со специфическим комплексом рМНС, содержащим первый пептид в комплексе с первой молекулой МНС, (i) не связывается стабильно в физиологических условиях с комплексом рМНС, содержащим второй пептид, презентирующийся в контексте первой молекулы МНС, при этом первый и второй пептиды не идентичны, например проявляют разные идиотипы (конформационные структуры) при ассоциации с пептидсвязывающей полостью первой молекулы МНС,

(ii) может мешать (например, блокировать) взаимодействию между (а) первым TCR, который специфически распознает первый пептид, презентирующийся в контексте первой молекулы МНС, и (b) комплексом рМНС, содержащим первый пептид и первую молекулу МНС, но

(iii) не будет мешать взаимодействию между (а) вторым TCR, который специфически распознает второй пептид, презентирующийся в контексте первой молекулы МНС, или (b) комплексом рМНС, содержащим второй пептид, презентирующийся в контексте первой молекулы МНС, при этом первый и второй пептиды различны, например проявляют разные идиотипы (конформационные структуры) при ассоциации с пептидсвязывающей полостью первой молекулы МНС. рМНС-связывающий белок, который специфически связывает комплекс рМНС, содержащий первый пептид и первую молекулу МНС, может также или независимо связывать первую клетку, презентирующую первый пептид в контексте первой молекулы МНС, но не будет связывать вторую клетку, презентирующую второй пептид в контексте первой молекулы МНС, при этом первый и второй пептиды различны, проявляют разные идиотипы (конформационные структуры) при ассоциации с пептидсвязывающей полостью молекулы МНС. Специфическое связывание также может быть охарактеризовано с помощью равновесной константы диссоциации (K_D), находящейся в диапазоне от низких микромолярных до пикомолярных значений. Значения, соответствующие высокой специфичности, могут находиться в диапазоне низких наномолярных значений, а значения, соответствующие очень высокой специфичности - в диапазоне пикомолярных значений. Способы определения того, связываются ли специфически две молекулы, хорошо известны из уровня техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п.

[0048] Термины «индивидуум», или «субъект», или «животное» относятся к людям, животным, подлежащим ветеринарному контролю (например, кошкам, собакам, коровам, лошадям, овцам, свиньям и т.д.), и экспериментальным животным моделям заболеваний (например, мышам, крысам). В одном варианте осуществления субъект представляет собой человека.

[0049] Термин «белок», используемый в данном документе, охватывает все виды встречающихся в природе и синтетических белков, включая фрагменты белков любой длины, слитые белки и модифицированные белки, в том числе без ограничения гликопротеины, а также все другие типы модифицированных белков (например, белки, полученные в результате фосфорилирования, ацетилирования, миристоилирования, пальмитоилирования, гликозилирования, окисления, формилирования, амидирования, полиглутамилирования, АДФ-рибозилирования, пегилирования, биотинилирования и т.д.).

[0050] Термины «нуклеиновая кислота» и «нуклеотид» охватывают как ДНК, так и РНК, если не указано иное.

[0051] Термины «титр», «титр антитела», «титр антител» или подобные относятся к мере способности образца антител (например, в сыворотке крови, полученной от субъекта), которые характеризуются общим свойством, например изотипом, мере способности связываться с антигеном специфическим или неспецифическим образом и т.д. Способы определения титра антител в сыворотке крови, собранной у субъекта, известны в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления титр антител в сыворотке крови, собранной у субъекта, рассчитывают в виде интерполированного коэффициента разведения сыворотки крови, сигнал связывания при котором в 2 раза превышает фон. В некоторых вариантах осуществления у животного, отличного от человека, у которого экспрессируется человеческая (гуманизированная) молекула МНС и которое является подвергнутым индуцированию толерантности к таковой, может вырабатываться или действительно вырабатывается специфический ответ (например, специфический иммунный ответ, например специфический В-клеточный ответ, например специфический гуморальный иммунный ответ) при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС (например, представляющим интерес пептидом, презентирующимся в контексте молекулы HLA, из которой получена человеческая (гуманизированная) молекула МНС). В некоторых вариантах осуществления ответ считается «специфическим ответом» или подобным, если животное, отличное от человека, вырабатывает при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС титр антител к представляющему интерес комплексу рМНС, который превышает титр антител к нерелевантному комплексу рМНС. В некоторых вариантах осуществления ответ считается специфическим ответом или подобным, если животное, отличное от человека, вырабатывает при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС титр антител к представляющему интерес комплексу рМНС, который по меньшей мере в 2 раза превышает титр антител к нерелевантному комплексу рМНС. В некоторых вариантах осуществления ответ считается специфическим ответом или подобным, если животное, отличное от человека, вырабатывает при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС титр антител к представляющему интерес комплексу рМНС, который по меньшей мере в 5 раз превышает титр антител к нерелевантному комплексу рМНС. В некоторых вариантах осуществления ответ считается специфическим ответом или подобным, если животное, отличное от человека, вырабатывает при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС титр антител к представляющему интерес комплексу рМНС, который по меньшей мере в 10 раз превышает титр антител к нерелевантному комплексу рМНС. В некоторых вариантах осуществления ответ считается «специфическим ответом» или подобным, если животное, отличное от человека, вырабатывает при иммунизации представляющим интерес комплексом рМНС титр антител к представляющему интерес комплексу рМНС, который значительно превышает титр антител к нерелевантному комплексу рМНС.

[0052] Термин «функционально связанный» или подобный относится к совместному расположении, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Например, неперегруппированные сегменты гена вариабельной области «функционально связаны» со смежным геном константной области, если неперегруппированные сегменты гена вариабельной области способны к перегруппировке с образованием перегруппированного гена вариабельной области, который экспрессируется в сочетании с геном константной области в виде полипептидной цепи антиген связывающего белка. Контролирующая последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована с ней за счет чего экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с функционированием контролирующих последовательностей. «Функционально связанные» последовательности предусматривают как последовательности, контролирующие экспрессию, которые находятся в смежном положении с представляющим интерес геном, так и последовательности, контролирующие экспрессию, действующие в транс-положении или на некотором расстоянии, осуществляя контроль над представляющим интерес геном (или представляющей интерес последовательностью). Термин «последовательность, контролирующая экспрессию» предусматривает полинуклеотидные последовательности, которые являются необходимыми для осуществления воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. «Последовательности, контролирующие экспрессию» включают соответствующие последовательности для инициации, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Kozak); последовательности, повышающие стабильность полипептида; и при необходимости последовательности, усиливающие секрецию полипептида. Природа таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие контролирующие последовательности включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательность для терминации транскрипции, тогда как у эукариот такие контролирующие последовательности обычно включают промоторы и последовательность для терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» подразумевает включение компонентов, наличие которых является существенным для экспрессии и процессинга, и также может включать дополнительные компоненты, наличие которых является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности-партнеры по слиянию.

[0053] Термин «ведение» и подобные, используемые в данном документе, относятся к введению композиции субъекту или в систему (например, в клетку, орган, ткань, организм или их соответствующий компонент или набор компонентов) и предусматривают таковое. Специалист в данной области техники поймет, что путь введения может варьировать, например, в зависимости от субъекта или системы, которым будет вводиться композиция, природы композиции, цели введения и т.д. Например, в определенных вариантах осуществления введение субъекту-животному (например, человеку или грызуну) может быть бронхиальным (в том числе посредством бронхиальной инстилляции), трансбуккальным, энтеральным, внутрикожным, внутриартериальным, интрадермальным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, интравентрикулярным, чресслизистым, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, подъязычным, местным, трахеальным (в том числе посредством интратрахеальной инстилляции), трансдермальным, вагинальным и/или витреальным. В некоторых вариантах осуществления введение может подразумевать прерывистое введение доз. В некоторых вариантах осуществления введение может предусматривать непрерывное введение доз (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.

[0054] Термин «полученный из» при использовании в отношении перегруппированного гена вариабельной области или вариабельного домена, «полученного из» неперегруппированной вариабельной области и/или неперегруппированных сегментов гена вариабельной области, относится к способности отслеживать перегруппированную последовательность гена вариабельной области или вариабельного домена до группы неперегруппированных сегментов гена вариабельной области, которые были перегруппированы с образованием перегруппированного гена вариабельной области, который экспрессирует вариабельный домен (с учетом, где это применимо, различий сплайсинга и соматических мутаций). Например, то, что перегруппированный ген вариабельной области претерпел соматическую мутацию, не изменяет тот факт, что он получен из неперегруппированных сегментов гена вариабельной области.

[0055] Термин «эндогенный локус» или «эндогенный ген», используемый в данном документе, относится к генетическому локусу, находящемуся в родительском или эталонном организме до введения нарушения, делеции, замещения, изменения или модификации, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, обнаруживаемую в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой сконструированный локус.

[0056] Термин «гетерологичный» относится к средству или объекту из другого источника. Например, при использовании в отношении полипептида, гена или продукта гена, представленного в конкретных клетке или организме, термин поясняет, что релевантный полипептид, ген или продукт гена 1) был сконструирован человеком; 2) был введен в клетку или организм (или их предшественника) человеком (например, посредством генной инженерии) и/или 3) в естественных условиях не вырабатывается соответствующими клеткой или организмом (например, соответствующий тип клетки или тип организма) или отсутствует в них. «Гетерологичный» также предусматривает полипептид, ген или продукт гена, которые обычно присутствуют в конкретных нативной клетке или организме, но были изменены или модифицированы, например, за счет мутации или помещения под контроль регуляторных элементов (например, промотора), с которыми они не соединены в естественных условиях, и в некоторых вариантах осуществления, которые не являются эндогенными.

[0057]

[0058] В соответствии с настоящим раскрытием, приведенным в данном документе, могут использоваться традиционные методики молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, известные в уровне техники. Такие методики полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (в данном документе «Sambrook et al., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, тома I и II (под ред. D.N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (под ред. M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization [под ред. B.D. Hames и S.J. Higgins (1985)]; Transcription And Translation [под ред. B.D. Hames и S.J. Higgins (1984)]; Animal Cell Culture [под ред. R.I. Freshney (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F.M. et al. (ред.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994, при этом каждая из публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Такие методики включают сайт-направленный мутагенез, см., например, в Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985), патент США №5071743, Fukuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kim and Maas, BioTech. 28: 196 198 (2000); Parikh and Guengerich, BioTech. 24: 4 28 431 (1998); Ray and NickolofF, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680 682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26: 639 641 (1999), патенты США №№5789166 и 5932419, Hogrefe, Strategies 14. 3: 74-75 (2001), патенты США №№5702931, 5780270 и 6242222, Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001), Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch and Joly, Nucl. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem and Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996), Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197 198 (1995), Barrenttino et al., Nuc. Acids. Res. 22: 541 542 (1993), Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237, и Pons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218; при этом каждая из публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Индуцирование толерантности к человеческим или гуманизированным молекулам МНС

[0059] В иллюстративных вариантах осуществления у генетически модифицированных животных, отличных от человека, например млекопитающих, например грызунов, например крыс или мышей, экспрессируется и они являются подвергнутыми индуцированию толерантности по меньшей мере к одной пустой человеческой или гуманизированной молекуле МНС, или по меньшей мере к ее пустой человеческой пептидсвязывающей полости, но могут вырабатывать антиген связывающие белки, например, антигенсвязывающие белки, содержащие человеческие или гуманизированные вариабельные домены, к человеческой (гуманизированной) молекуле МНС при образовании ею комплекса с антигенным, например гетерологичным, пептидом. В некоторых вариантах осуществления индуцирования толерантности у животного, отличного от человека, к пустой человеческой (гуманизированной) молекуле МНС достигают путем генетической модификации животного, отличного от человека, таким образом, чтобы в его геноме содержалась нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую (гуманизированную) молекулу МНС или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, таким образом, чтобы у животного, отличного от человека, экспрессировалась человеческая (гуманизированная) молекула МНС или по меньшей мере ее человеческая пептидсвязывающая полость в виде пустой человеческой (гуманизированной) молекулы МНС или ее пустой человеческой пептидсвязывающей полости. То же самое животное, генетически модифицированное таким образом, чтобы оно содержало нуклеотид, кодирующий человеческую (гуманизированную) молекулу МНС, может быть дополнительно модифицировано таким образом, чтобы оно содержало гуманизированные локусы тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, с которых экспрессируются человеческие или гуманизированные антигенсвязывающие белки, например антигенсвязывающие белки, имеющие человеческие или гуманизированные вариабельные домены.

[0060] Молекулы МНС обычно делят на две категории: молекулы МНС класса I и класса II. Молекула МНС класса I представляет собой интегральный мембранный белок, содержащий тяжелую цепь гликопротеина, также называемую в данном документе α-цепью, которая имеет три внеклеточных домена (т.е. α1, α2 и α3), и два внутриклеточных домена (например, трансмембранный домен (ТМ) и цитоплазматический домен (CYT)). Тяжелая цепь нековалентно соединена с растворимой субъединицей, называемой β2-микроглобулином (β2m или β2М). Молекула МНС класса II или белок МНС класса II представляет собой гетеродимерный интегральный мембранный белок, содержащий одну α-цепь и одну β-цепь, соединенные нековалентно. α-Цепь содержит два внеклеточных домена (α1 и α2) и два внутриклеточных домена (домен ТМ и домен CYT). β-Цепь содержит два внеклеточных домена (β1 и β2) и два внутриклеточных домена (домен ТМ и домен CYT).

[0061] Доменная организация молекул МНС класса I и класса II формирует сайт связывания антигенной детерминанты, например пептид связывающую часть или пептидсвязывающую полость, молекулы МНС. Пептид связывающая полость относится к части белка МНС, которая образует полость, в которой пептид, например антигенная детерминанта, может связываться. Конформация пептидсвязывающей полости может изменяться при связывании пептида, чтобы обеспечить правильное выравнивание аминокислотных остатков, важных для связывания TCR с комплексом пептид-МНС (рМНС).

[0062] В некоторых вариантах осуществления молекулы МНС включают фрагменты цепей МНС, которые достаточны для образования пептидсвязывающей полости. Например, пептидсвязывающая полость белка класса I может содержать части доменов α1 и α2 тяжелой цепи, способные образовывать два β-складчатых листа и две α-спирали. Включение части цепи β2-микроглобулина стабилизирует молекулу МНС класса I. В то время как для большинства версий молекул МНС класса II взаимодействие α- и β-цепей может происходить в отсутствие пептида, двухцепочечная молекула МНС класса I является нестабильной до тех пор, пока связывающая полость не заполнится пептидом. Пептидсвязывающая полость белка класса II может содержать части доменов α1 и β1, способные образовывать два β-складчатых листа и две a-спирали. Первая часть домена α1 образует первый β-складчатый лист, и вторая часть домена α1 образует первую a-спираль. Первая часть домена β1 образует второй β-складчатый лист, и вторая часть домена β1 образует вторую α-спираль. Рентгеновская кристаллографическая структура белка класса II с пептидом, вовлеченным в связывающую полость белка, показывает, что один или оба конца вовлеченного пептида могут выступать за пределы белка МНС (Brown et al., ст. 33-39, 1993, Nature, Vol. 364; включенная в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Таким образом, концы α-спиралей α1 и pi класса II образуют открытую полость, так что концы пептида, связанные со связывающей полостью, не погружаются в полость. Более того, рентгеновская кристаллографическая структура белков класса II показывает, что N-терминальный конец β-цепи МНС, по-видимому, выступает со стороны белка МНС неструктурированным образом, поскольку первые 4 аминокислотных остатка β-цепи не могут быть определены рентгеновской кристаллографией.

[0063] Многие МНС человека и других млекопитающих хорошо известны в уровне техники.

[0064] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит по меньшей мере одну из первой, второй и/или третьей нуклеотидной последовательности, каждая из которых кодирует отличающийся человеческий или гуманизированный полипептид МНС, выбранный из группы, состоящей из человеческого или гуманизированного a-полипептида МНС II, человеческого или гуманизированного β-полипептида МНС II и человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС I; животное, отличное от человека, также может содержать человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, например, в тех вариантах осуществления, когда оно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный a-полипептид МНС I. Применение первого, второго и третьего обозначений в данном документе не следует истолковывать как ограничение животных, отличных от человека, раскрытых в данном документе, таковыми, которые требуют всех трех нуклеотидных последовательностей или присутствия любого из человеческих или гуманизированных полипептидов МНС в каком-либо конкретном порядке.

[0065] В различных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено генетически модифицированное животное, отличное от человека, например млекопитающее, например грызун (например, мышь или крыса), содержащее в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид МНС I и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный белок МНС II или по меньшей мере их человеческие пептидсвязывающие полости. Нуклеотидная последовательность МНС I может кодировать полипептид МНС I, который является полностью человеческим (например, человеческую молекулу HLA класса I), или гуманизированный полипептид МНС I, который является частично человеческим и частично отличным от человеческого (например, химерный человеческий/отличным от человеческого полипептид МНС I), и нуклеотидная последовательность МНС II может кодировать белок МНС II, который является полностью человеческим (например, человеческую молекулу HLA класса II), или гуманизированный белок МНС класса II, который является частично человеческим и частично отличным от человеческого (например, химерный человеческий/отличный от человеческого белок МНС II, например, содержащий химерные человеческие/отличные от человеческих α- и β-полипептиды МНС II).

[0066] В примерах в данном документу показано, что генетически модифицированные животные, экспрессирующие из эндогенного локуса химерную человеческую/отличную от человеческой молекулу МНС I, содержащую человеческую внеклеточную часть (которая содержит человеческий пептидсвязывающий домен) человеческой молекулы HLA класса I, функционально связанную с трансмембранными и цитоплазматическими доменами отличной от человеческой молекулы МНС I, являются подвергнутыми индуцированию толерантности к человеческой внеклеточной части, например человеческому пептидсвязывающему домену, человеческой молекулы HLA класса I, когда она пустая, и способны продуцировать специфический иммунный ответ на человеческий пептидсвязывающий домен при образовании им комплекса с антигеном, например пептидом, гетерологичным в отношении животного, отличного от человека. См., например, раздел «Примеры». Таким образом, в некоторых вариантах осуществления у животных, отличных от человека, например грызунов, например крыс или мышей,

(1) экспрессируется, например из эндогенного локуса МНС, химерная человеческая/отличная от человеческой молекула МНС, содержащая (а) по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость, например человеческую внеклеточную часть человеческой молекулы HLA, функционально связанную с (b) отличными от человеческих трансмембранными и цитоплазматическими доменами отличной от человеческой молекулы МНС I, и

(2) они являются подвергнутыми индуцированию толерантности по меньшей мере к внеклеточной части человеческой молекулы HLA.

[0067] Генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме, например в эндогенном локусе, нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/отличным от человеческого полипептид МНС I, раскрыто в патентах США №№9591835 и 9615550, при этом каждая из публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме, например в эндогенном локусе, нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированные, например химерные человеческие/отличные от человеческих, полипептиды МНС II, раскрыто в патентах США №№8847005 и 9043996, при этом каждая из публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме, например в эндогенном локусе, нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированный, например химерный человеческий/отличным от человеческого, полипептид МНС I, и содержащее в своем геноме, например, в эндогенном локусе, нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированные, например химерные человеческие/отличные от человеческих, полипептиды МНС II, раскрыто в патенте США №10154658, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0068] В различных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме, например в своем геноме зародышевой линии, например в одном или нескольких эндогенных локусах МНС:

(i) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС I, содержащий человеческую часть, которая содержит внеклеточную часть (или ее часть, например один или более внеклеточных доменов, например пептидсвязывающую полость) человеческого полипептида МНС I, функционально связанную с отличной от человеческой частью, которая содержит трансмембранные и цитоплазматические домены отличного от человеческого полипептида МНС I, например эндогенного полипептида МНС I; и/или

(ii) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/отличный от человеческого α-полипептид МНС II, содержащий человеческую часть, функционально связанную с отличной от человеческой частью, при этом человеческая часть химерного α-полипептида МНС II содержит внеклеточную часть (или ее часть, например, один или более внеклеточных доменов, например, домен α1) α-полипептида человеческой молекулы МНС класса II, и третью нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/отличный от человеческого β-полипептид МНС II, содержащий человеческую часть, функционально связанную с отличной от человеческой частью, при этом человеческая часть химерного β-полипептида МНС II содержит внеклеточную часть (или ее часть, например, один или более внеклеточных доменов, например, по меньшей мере домен β1) β-полипептида человеческой молекулы МНС класса II;

при этом у животного, отличного от человека, экспрессируются химерные человеческие/отличные от человеческих белки МНС I и/или МНС II и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к химерным человеческим/не являющимся человеческими белкам МНС I и/или МНС II. В одном варианте осуществления первая, вторая и/или третья нуклеотидные последовательности соответственно расположены в эндогенных отличных от человеческих локусах МНС I, МНС II α и МНС II β. В одном варианте осуществления, где животное, отличное от человека, представляет собой мышь, первая, вторая и/или третья нуклеотидные последовательности расположены в эндогенном мышином локусе МНС на мышиной хромосоме 17. В одном варианте осуществления первая нуклеотидная последовательность располагается в эндогенном отличном от человеческого локусе МНС I. В одном варианте осуществления вторая нуклеотидная последовательность располагается в эндогенном отличном от человеческого локусе МНС II α. В одном варианте осуществления третья нуклеотидная последовательность располагается в эндогенном отличном от человеческого локусе МНС II β.

[0069] В одном варианте осуществления химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС I содержит человеческую часть, функционально связанную с отличной от человеческой частью, при этом человеческая часть содержит по меньшей мере пептидсвязывающую полость человеческого полипептида МНС I. В одном варианте осуществления человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточную часть человеческой молекулы МНС I. В этом варианте осуществления человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточный домен α-цепи человеческой молекулы МНС I. В одном варианте осуществления человеческая часть химерного полипептида содержит домены α1 и α2 человеческой молекулы МНС I. В другом варианте осуществления человеческая часть химерного полипептида содержит домены α1, α2 и α3 человеческой молекулы МНС I.

[0070] В одном варианте осуществления человеческая часть химерного α-полипептида МНС II и/или человеческая часть химерного β полипептида МНС II содержит пептидсвязывающий домен человеческого α-полипептида МНС II и/или человеческого βполипептида МНС II соответственно, например α- и β-полипептиды МНС II человеческого белка МНС II. В одном варианте осуществления человеческая часть химерного α- и/или β-полипептида МНС II содержит внеклеточную часть человеческого α- и/или β-полипептида МНС II соответственно, например α- и β-полипептиды МНС II из человеческого белка МНС II. В одном варианте осуществления человеческая часть химерного α-полипептида МНС II содержит домен α1 человеческого α-полипептида МНС II; в другом варианте осуществления человеческая часть химерного α-полипептида МНС II содержит домены α1 и α2 человеческого α-полипептида МНС II. В дополнительном варианте осуществления человеческая часть химерного β-полипептида МНС II содержит домен βi человеческого β-полипептида МНС II; в другом варианте осуществления человеческая часть химерного β-полипептида МНС II содержит домены β1 и β2 человеческого β-полипептида МНС II.

[0071] Животные, отличные от человека, в иллюстративных вариантах осуществления содержат химерные человеческие/отличные от человеческих молекулы МНС, таковые у них экспрессируются и они являются подвергнутыми индуцированию толерантности к таковым. В одном варианте осуществления, где человеческая часть соответственно содержит внеклеточную часть человеческой молекулы МНС I, МНС II α и/или МНС II β, человеческая часть функционально связана с отличной от человеческой частью, при этом отличная от человеческой часть химерного(-ых) человеческого(-их)/отличного(-ых) от человеческого(-их) полипептида(-ов) МНС I, МНС II α и/или МНС II β содержит трансмембранные и/или цитоплазматические домены эндогенного(-ых) отличного(-ых) от человеческого(-их) (например, грызунов, например, мыши, крысы и т.д.) полипептида(-ов) МНС I, МНС II α и/или МНС II β соответственно. Таким образом, отличная от человеческой часть химерного человеческого/отличного от человеческого полипептида МНС I может содержать трансмембранные и/или цитоплазматические домены эндогенного отличного от человеческого полипептида МНС I. Отличная от человеческой часть химерного α-полипептида МНС II может содержать трансмембранные и/или цитоплазматические домены эндогенного отличного от человеческого α-полипептида МНС II. Отличная от человеческой часть химерного человеческого/отличного от человеческого β-полипептида МНС II может содержать трансмембранные и/или цитоплазматические домены эндогенного отличного от человеческого β-полипептида МНС II. В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой мышь, и отличная от человеческой часть химерного полипептида МНС I получена из мышиного белка Н-2K. В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой мышь, и отличные от человеческих части химерных α- и β-полипептидов МНС II получены из мышиного белка Н-2Е. Таким образом, отличная от человеческой часть химерного полипептида МНС I может содержать трансмембранные и цитоплазматические домены, полученные из мышиного Н-2K, а отличные от человеческих части химерных α- и β-полипептидов МНС II могут содержать трансмембранные и цитоплазматические домены, полученные из мышиного белка Н-2Е. Хотя конкретные последовательности Н-2K и Н-2Е рассматриваются в примерах, любые подходящие последовательности, например полиморфные варианты, консервативные/неконсервативные аминокислотные замены и т.д., охватываются данным документом.

[0072] В одном варианте осуществления человеческая часть химерного человеческого/мышиного полипептида МНС I содержит пептидсвязывающий домен или внеклеточный домен человеческого МНС I (например, человеческий HLA-A, например человеческий HLA-A2, например человеческий HLA-A2.1). Пептид связывающая полость человеческого МНС I может содержать домены α1 и α2. В качестве альтернативы пептидсвязывающая полость человеческого МНС I может содержать домены α1, α2 и α3. В одном варианте осуществления внеклеточный домен человеческого МНС I содержит внеклеточный домен α-цепи человеческого МНС I. В одном варианте осуществления эндогенный мышиный локус МНС I представляет собой локус Н-2K (например, Н-2Kb), и мышиная часть химерного полипептида МНС I содержит трансмембранные и цитоплазматические домены мышиного полипептида Н-2K (например, Н-2Kb). Таким образом, в одном варианте осуществления мышь по настоящему изобретению содержит в своем эндогенном мышином локусе МНС I нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный МНС I, при этом человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточный домен человеческого полипептида HLA-A2 (например, HLA-A2.1), а мышиная часть содержит трансмембранные и цитоплазматические домены мышиного полипептида Н-2K (например, Н-2Kb) (см., например, SEQ ID NO: 24), и у мыши экспрессируется химерный человеческий/мышиный белок HLA-A2/H-2K. В других вариантах осуществления мышиная часть химерного полипептида МНС I может быть получена из другого мышиного МНС I, например H-2D, H-2L и т.д.; а человеческая часть химерного полипептида МНС I может быть получена из другого человеческого МНС I, например HLA-B, HLA-C и т.д.

[0073] В одном варианте осуществления человеческая часть химерного человеческого/мышиного α-полипептида МНС II содержит связывающий или внеклеточный домен человеческого α-пептида МНС II, и человеческая часть химерного человеческого/мышиного β-полипептида МНС II содержит связывающий или внеклеточный домен человеческого β-пептида МНС II. Пептидсвязывающий домен человеческого α-полипептида МНС II может содержать домен α1, и пептидсвязывающий домен человеческого β-полипептида МНС II может содержать домен β1; таким образом, пептидсвязывающий домен химерной молекулы МНС II может содержать человеческие домены α1 и β1. Внеклеточный домен человеческого аполипептида МНС II может содержать домены α1 и α2, а внеклеточный домен человеческого β-полипептида МНС II может содержать домены β1 и β2; таким образом, внеклеточный домен химерной молекулы МНС II может содержать человеческие домены α1, α2, β1 и β2. В одном варианте осуществления мышиная часть химерной молекулы МНС II содержит трансмембранные и цитозольные домены мышиного МНС II, например мышиного Н-2Е (например, трансмембранные и цитозольные домены α- и β-цепей мышиного Н-2Е). Таким образом, в одном варианте осуществления мышь по настоящему изобретению содержит в своем эндогенном мышином локусе МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный МНС II α, при этом человеческая часть химерного полипептида МНС II α содержит внеклеточный домен, полученный из α-цепи человеческого МНС II (например, из α-цепи HLA-DR2), а мышиная часть содержит трансмембранные и цитоплазматические домены, полученные из α-цепи мышиного МНС II (например, Н-2Е); и мышь содержит в своем эндогенном мышином локусе МНС II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный МНС II β, при этом человеческая часть химерного β-полипептида МНС II содержит внеклеточный домен, полученный из β-цепи человеческого МНС II (например, из β-цепи HLA-DR2), а мышиная часть содержит трансмембранные и цитоплазматические домены, полученные из β-цепи мышиного МНС II (например, Н-2Е); например, при этом у мыши экспрессируется химерный человеческий/мышиный белок HLA-DR2/H-2E. В другом варианте осуществления мышиная часть химерного белка МНС II может быть получена из другого мышиного МНС II, например Н-2А и т.д.; и человеческая часть химерного белка МНС II может быть получена из другого человеческого МНС II, например HLA-DQ и т.д.

[0074] В некоторых вариантах осуществления химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид может содержать человеческую или отличную от человеческой лидерную (сигнальную) последовательность. В одном варианте осуществления химерный полипептид МНС I содержит отличную от человеческой лидерную последовательность эндогенного полипептида МНС I. В одном варианте осуществления химерный α-полипептид МНС II содержит отличную от человеческой лидерную последовательность эндогенного α-полипептида МНС II. В одном варианте осуществления химерный β-полипептид МНС II содержит отличную от человеческой лидерную последовательность эндогенного β-полипептид а МНС II. В альтернативном варианте осуществления химерный(-ые) полипептид(-ы) МНС I, МНС II α и/или МНС II β содержит(-ат) отличную от человеческой лидерную последовательность полипептида(-ов) МНС I, МНС II α и/или МНС II β соответственно, от другого животного, отличного от человека, например другого грызуна или другой мышиной линии. Таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный полипептид МНС I, МНС II α и/или МНС II β, может быть функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей лидерную последовательность отличных от человеческих МНС I, МНС II α и/или МНС II β соответственно. В еще одном варианте осуществления химерный(-ые) полипептид(-ы) МНС I, МНС II α и/или МНС II β содержит(-ат) человеческую лидерную последовательность человеческого полипептида МНС I, человеческого α-полипептида МНС II и/или человеческого β-полипептида МНС II соответственно (например, лидерную последовательность человеческого HLA-A2, человеческого HLA-DRα и/или человеческого HLA-DRβ1*1501 соответственно).

[0075] В некоторых вариантах осуществления химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС I, α-полипептид МНС II и/или β-полипептид МНС II может содержать в своей человеческой части полный или практически полный внеклеточный домен человеческого полипептида МНС I, человеческого α-полипептида МНС II и/или человеческого β-полипептида МНС II соответственно. Таким образом, человеческая часть может составлять по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, например 95%, или больше аминокислот, составляющих внеклеточный домен человеческого полипептида МНС I, человеческого α-полипептида МНС II и/или человеческого β-полипептида МНС II (например, человеческого HLA-A2, человеческого HLA-DRα и/или человеческого HLA-DRβ1*1501). В одном примере в практически полном внеклеточном домене человеческого полипептида МНС I, человеческого α-полипептида МНС II и/или человеческого β-полипептида МНС II отсутствует человеческая лидерная последовательность. В другом примере химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС I, химерный человеческий/отличный от человеческого α-полипептид МНС II и/или химерный человеческий/отличный от человеческого β-полипептид МНС II содержат человеческую лидерную последовательность.

[0076] Более того, в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид МНС I, α-полипептид МНС II и/или β-полипептид МНС II может быть функционально связан с (например, может экспрессироваться под регуляторным контролем) эндогенными отличными от человеческих промоторными и регуляторными элементами, например мышиными регуляторными элементами МНС I, МНС II α и/или МНС II β соответственно. Такое расположение будет способствовать правильной экспрессии химерных полипептидов МНС I и/или МНС II у животного, отличного от человека, например, во время иммунного ответа у животного, отличного от человека.

[0077] Хотя в приведенных в данном документе примерах показано индуцирование толерантности к человеческим пептидсвязывающим доменам химерных человеческих/отличных от человеческих молекул МНС, экспрессируемым из эндогенных локусов МНС, такое индуцирование толерантности также происходит у животных, отличных от человека, экспрессирующих человеческую молекулу МНС (или ее функциональный пептидсвязывающий домен) из эктопического локуса (данные не показаны). Кроме того, животные, отличные от человека, у которых экспрессируется пустая человеческая молекула МНС (или ее пустой пептидсвязывающий домен) из эктопического локуса и которые являются подвергнутыми индуцированию толерантности в отношении таковой, способны вырабатывать специфический иммунный ответ против человеческой молекулы HLA (или ее пептидсвязывающего домена, или ее производного), из которой получена экспрессируемая человеческая молекула МНС, когда животное, отличное от человека, иммунизируют человеческой молекулой HLA (или ее пептидсвязывающим доменом, и/или ее производным) в комплексе с антигенным пептидом, например пептидом, гетерологичным в отношении животного, отличного от человека (данные не показаны).

[0078] Без углубления в теорию, предполагается, что индуцирование толерантности у животного, отличного от человека, происходит при экспрессии человеческих или гуманизированных молекул МНС. Таким образом, необязательно, чтобы человеческие или гуманизированные молекулы МНС экспрессировались из эндогенного локуса. Соответственно, в различных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме первую нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий (гуманизированный) полипептид МНС I (или его части и/или производные), вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий (гуманизированный) α-полипептид МНС II (или его части и/или производные), и/или третью нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий (гуманизированный) β-полипептид МНС II (или его части и/или производные); при этом у животного, отличного от человека, экспрессируются человеческие (гуманизированные) полипептиды МНС I, МНС II α и/или МНС II β (или их части и/или производные) и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческим (гуманизированным) полипептидам или частям и/или производным. В одном варианте осуществления первая, вторая и/или третья нуклеотидная(-ые) последовательность(-и) соответственно не нарушает(-ют) эндогенные отличные от человеческого локусы МНС I, МНС II α и МНС II β, например располагается в эктопическом локусе, например локусе ROSA26. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная мышь содержит в эктопическом локусе, например в локусе ROSA26, нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный МНС I, при этом человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточный домен человеческого полипептида HLA-A2 (например, HLA-A2.1), и мышиная часть содержит трансмембранные и цитоплазматические домены мышиного полипептида Н-2K (например, Н-2Kb) (см., например, SEQ ID NO: 24), и у мыши экспрессируется химерный человеческий/мышиный белок HLA-A2/H-2K или она является подвергнутой индуцированию толерантности в отношении такового.

[0079] Более того, в случае экспрессии из эктопического локуса могут быть экспрессированы полностью человеческие молекулы МНС или их полностью человеческие части и/или производные. Соответственно, в различных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме первую нуклеотидную последовательность, кодирующую полностью человеческий полипептид МНС I (или его полностью человеческие части и/или производные), вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую полностью человеческий α-полипептид МНС II (или его полностью человеческие части и/или производные), и/или третью нуклеотидную последовательность, кодирующую полностью человеческий β-полипептид МНС II (или его полностью человеческие части и/или производные); при этом у животного, отличного от человека, экспрессируется полностью человеческие полипептиды МНС I, МНС II α и/или МНС II β (или их полностью человеческие части и/или производные) и оно является подвергнутым индуцированию толерантности к полипептидам или их полностью человеческим частям и/или производным. В одном варианте осуществления первая, вторая и/или третья нуклеотидная(-ые) последовательность(-и) соответственно не нарушает(-ют) эндогенные отличные от человеческих локусы МНС I, МНС II α и МНС II β, необязательно не нарушает никакие эндогенные локусы, например располагается в эктопическом локусе, например локусе ROSA26.

[0080] В некоторых вариантах осуществления человеческий или гуманизированный полипептид МНС I может быть получен из, например, человеческого или гуманизированного полипептида МНС I, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая кодирует или содержит часть нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональную человеческую молекулу HLA, выбранную из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G и их комбинации. Человеческий или гуманизированный α- или β-полипептид МНС II может быть получен из α- или β-полипептидов функциональной человеческой молекулы HLA, кодируемой локусами HLA-DP, -DQ и -DR. Перечень широко используемых антигенов и аллелей HLA описан у Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103), включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Shankarkumar et al. также представили краткое объяснение номенклатуры HLA, используемой в уровне техники. Дополнительную информацию, касающуюся номенклатуры HLA и различных аллелей HLA, можно найти в Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -В, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -В, -C, -DR, and DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, и недавнем уточнении Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455, при этом каждая из публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления полипептиды МНС I или МНС II могут быть получены из любых функциональных человеческих молекул HLA-A, В, С, DR или DQ. Таким образом, человеческий или гуманизированный полипептиды МНС I и/или II могут быть получены из любых функциональных человеческих молекул HLA в иллюстративных вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления все полипептиды МНС I и МНС II, экспрессируемые на клеточной поверхности, содержат часть, полученную из человеческих молекул HLA.

[0081] Особый интерес представляют полиморфные аллели человеческого HLA, которые, как известно, ассоциированы с рядом заболеваний человека, например аутоиммунными заболеваниями человека. Фактически, были идентифицированы определенные полиморфизмы в локусах HLA, которые коррелируют с развитием ревматоидного артрита, диабета типа I, тиреоидита Хашимото, рассеянного склероза, миастении гравис, болезни Грейвса, системной красной волчанки, целиакии, болезни Крона, язвенного колита и других аутоиммунных нарушений. См., например, Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker et al. (2006), A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 и дополнительная информация; и International МНС and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85, при этом каждая из публикаций включена в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления человеческие или гуманизированные полипептиды МНС I и/или II могут быть получены из человеческой молекулы HLA, ассоциированной, как известно, с конкретным заболеванием, например аутоиммунным заболеванием.

[0082] В одном конкретном варианте осуществления человеческий или гуманизированный полипептид МНС I получен из человеческого HLA-A. В конкретном варианте осуществления полипептид HLA-A представляет собой полипептид HLA-A2 (например, и полипептид HLA-A2.1). В одном варианте осуществления полипептид HLA-A представляет собой полипептид, кодируемый аллелем HLA-A*0201, например аллелем HLA-A*02:01:01:01. Аллель HLA-A*0201 обычно распространен среди населения Северной Америки. Хотя в данном примере описывается эта конкретная последовательность HLA, в данном документе охвачена любая подходящая последовательность HLA-A, например полиморфные варианты HLA-A2, представленные в человеческой популяции, последовательности с одной или несколькими консервативными или неконсервативными аминокислотными модификациями, нуклеотидные последовательности, отличающиеся от последовательности в иллюстративных вариантах осуществления, представленных в данном документе, из-за вырожденности генетического кода и т.д.

[0083] В другом конкретном варианте осуществления человеческий или гуманизированный полипептид МНС I получен из человеческого МНС I, выбранного из HLA-B и HLA-C. В одном варианте осуществления он получен из HLA-B, например HLA-B27. В другом варианте осуществления он получен из HLA-A3, -В7, -Cw6 и т.д.

[0084] В одном конкретном варианте осуществления человеческие или гуманизированные α- и β-полипептиды МНС II получены из человеческого HLA-DR, например HLA-DR2. Как правило, α-цепи HLA-DR являются мономорфными, например α-цепь белка HLA-DR кодируется геном HLA-DRA (например, геном HLA-DRα*01). С другой стороны, β-цепь HLA-DR является полиморфной. Таким образом, HLA-DR2 содержит α-цепь, кодируемую геном HLA-DRA и β-цепь, кодируемую геном HLA-DR1β*1501. В данном документе охватываются любые подходящие последовательности HLA-DR, например полиморфные варианты, выявляемые в человеческой популяции, последовательности с одной или несколькими консервативными или неконсервативными аминокислотными модификациями и т.д.

[0085] В некоторых вариантах осуществления человеческий или гуманизированный α- и/или β-полипептид МНС II может кодироваться нуклеотидными последовательностями или их частями из аллелей HLA, ассоциированных, как известно, с распространенными заболеваниями человека. Такие аллели HLA включают без ограничения: HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 и их комбинации. Краткое описание вариантов ассоциации аллелей HLA и заболеваний см. в Bakker et al. (2006) выше, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0086] В дополнительных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению, например грызун, например крыса или мышь, содержит (например, в эндогенном локусе β2-микроглобулина) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин. β2-Микроглобулин или легкая цепь белка МНС класса I (также сокращенно β2М») представляет собой небольшой (12 кДа) негликозилированный белок, функцией которого главным образом является стабилизация α-цепи МНС I. Получение животных с человеческим или гуманизированным β2-микроглобулином подробно описано в патенте США №9615550, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0087] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина может содержать нуклеотидные остатки, соответствующие только части человеческого гена β2-микроглобулина, например по меньшей мере части, которая помогает стабилизировать человеческую (гуманизированную) молекулу МНС I. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий полипептид β2-микроглобулина содержит весь человеческий ген β2-микроглобулина. В качестве альтернативы в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидные остатки, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 21-119 человеческого белка β2-микроглобулина (т.е. аминокислотными остатками, соответствующими зрелому человеческому β2-микроглобулину). В альтернативном варианте осуществления нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидные остатки, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 23-115 человеческого белка β2-микроглобулина, например аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 23-119 человеческого белка β2-микроглобулина. Последовательности нуклеиновых и аминокислот человеческого β2-микроглобулина описаны в Gussow et al., (1987) The β2-Microglobulin Gene. Primary Structure and Definition of the Transcriptional Unit, J. Immunol. 139:3131-38, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0088] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина может содержать аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 23-115 человеческого полипептида β2-микроглобулина, например аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 23-119 человеческого полипептида β2-микроглобулина, например аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 21-119 человеческого полипептида β2-микроглобулина. В качестве альтернативы человеческий β2-микроглобулин может содержать аминокислоты 1-119 человеческого полипептида β2-микроглобулина.

[0089] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, содержит нуклеотидную последовательность, представленную последовательностью от экзона 2 до экзона 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В качестве альтернативы нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидные последовательности, представленные в последовательностями экзонов 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В этом варианте осуществления нуклеотидные последовательности, представленные последовательностями экзонов 2, 3 и 4, функционально связаны с обеспечением нормальной транскрипции и трансляции гена. Таким образом, в одном варианте осуществления человеческая последовательность содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности от экзона 2 до экзона 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В конкретном варианте осуществления человеческая последовательность содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности от экзона 2 до приблизительно 267 п.о. после экзона 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В конкретном варианте осуществления человеческая последовательность содержит приблизительно 2,8 т.п.н. человеческого гена β2-микроглобулина.

[0090] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина может кодироваться нуклеотидной последовательностью, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную последовательностью от экзона 2 до экзона 4 человеческого β2-микроглобулина, например нуклеотидной последовательностью, соответствующей последовательности от экзона 2 до экзона 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В качестве альтернативы в некоторых вариантах осуществления полипептид может кодироваться нуклеотидной последовательностью, содержащей нуклеотидные последовательности, представленные последовательностями экзонов 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В конкретном варианте осуществления человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина кодируется нуклеотидной последовательностью, соответствующей последовательности от экзона 2 до приблизительно 267 п.о. после экзона 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В другом конкретном варианте осуществления человеческий или гуманизированный полипептид кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей приблизительно 2,8 т.п.н. человеческого гена β2-микроглобулина. Поскольку экзон 4 гена β2-микроглобулина содержит 5'-нетранслируемую область, человеческий или гуманизированный полипептид может кодироваться нуклеотидной последовательностью, содержащей экзоны 2 и 3 гена β2-микроглобулина.

[0091] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный белок β2-микроглобулина, также содержит нуклеотидную последовательность, представленную последовательностью экзона 1 гена β2-микроглобулина, отличного от человеческого. Таким образом, в конкретном варианте осуществления животное, отличное от человека, содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, при этом нуклеотидная последовательность содержит экзон 1 отличного от человеческого β2-микроглобулина и экзоны 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина. Таким образом, человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулин кодируется экзоном 1 гена β2-микроглобулина, отличного от человеческого, и экзонами 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина (например, экзонами 2 и 3 человеческого гена β2-микроглобулина).

[0092] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, находится в эндогенном локусе β2-микроглобулина животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность человеческого β2-микроглобулин замещает соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие эндогенный β2-микроглобулин, отличный от человеческого, в эндогенном в локусе β2-микроглобулина, отличном от человеческого. Например, в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, соответствующая последовательности от экзона 2 до экзона 4 человеческого гена β2-микроглобулина, замещает эндогенную мышиную последовательность, соответствующую последовательности от экзона 2 до экзона 4 мышиного гена β2-микроглобулина, в эндогенном мышином локусе β2-микроглобулина (см., фиг. 1С). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, содержащая нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина, замещает нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 мышиного гена β2-микроглобулина и т.д.

[0093] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, не нарушает эндогенный локус β2-микроглобулина, отличный от человеческого, например, располагается в эктопическом локусе, например в локусе ROSA26.

[0094] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит в своем геноме в эктопическом локусе, например в локусе ROSA26, первую нуклеотидную последовательность и/или вторую нуклеотидную последовательность, при этом первая нуклеотидная последовательность кодирует одноцепочечный полипептид, содержащий функциональную пептидсвязывающую часть молекулы HLA класса I (например, по меньшей мере домены α1 и α2 человеческой молекулы МНС класса I), необязательно функционально связанную, например слитую, с человеческим или гуманизированным β2-микроглобулином (или его частью), и при этом вторая нуклеотидная последовательность кодирует одноцепочечный полипептид, содержащий функциональную пептидсвязывающую часть молекулы HLA класса II (например, по меньшей мере домены α1 и β1 человеческой молекулы МНС класса II). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный полипептид, содержащий по меньшей мере функциональную пептидсвязывающую часть человеческого полипептида HLA-A2 (например, полноразмерного зрелого полипептида HLA-A2), слитую с человеческим β2-микроглобулином, например в эктопическом локусе (см., например, фиг. 2). В некоторых вариантах осуществления одноцепочечный полипептид, содержащий по меньшей мере функциональную пептидсвязывающую часть человеческого полипептида HLA-A2 (например, полноразмерного зрелого полипептида HLA-A2), слитую с человеческим β2-микроглобулином, содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, описанное в данном документе, содержит в эктопическом локусе, например в локусе ROSA26, нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую (гуманизированную) молекулу МНС класса I, содержащую по меньшей мере функциональную пептидсвязывающую часть человеческой молекулы HLA-A2, слитую с человеческим (гуманизированным) β2-микроглобулином, например нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, или ее вырожденный вариант. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, описанное в данном документе, содержит в качестве эктопического локуса, например в локусе ROSA26, нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный полипептид МНС, например полипептид HLA-A2/H2-K, представленный под SEQ ID NO: 24.

[0095] Специалистам средней квалификации в данной области техники будет понятно, что хотя некоторые варианты осуществления включают специфические нуклеотидные и аминокислотные последовательности для получения генетически сконструированных животных, также считается, что последовательности с одной или несколькими консервативными или неконсервативными аминокислотными заменами или последовательности, отличающиеся от вариантов осуществления, описанных в данном документе, из-за вырожденности генетического кода, попадают в объем настоящего изобретения.

[0096] Поэтому, в некоторых вариантах осуществления предусмотрено животное, отличное от человека, у которого экспрессируется последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса I, при этом последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса I или ее часть не является идентичной последовательности нуклеиновой кислоты человеческого α-полипептида МНС класса I из-за вырожденности генетического кода, но при этом они являются идентичными на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса I на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты человеческого α-полипептида МНС класса I по вариантам осуществления, иллюстрируемым в данном документе. В одном варианте осуществления экспрессируемая человеческая (гуманизированная) последовательность α-полипептида МНС класса I содержит одну или несколько консервативных замен. В одном варианте осуществления человеческая (гуманизированная) последовательность α-полипептида МНС класса I содержит одну или несколько неконсервативных замен.

[0097] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления предусмотрено животное, отличное от человека, которое экспрессирует человеческую (гуманизированную) последовательность β2-микроглобулина, при этом человеческая (гуманизированная) последовательность β2-микроглобулина или ее часть не является идентичной человеческой последовательности β2-микроглобулина из-за вырожденности генетического кода, но при этом они являются идентичными на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В конкретном варианте осуществления человеческая (гуманизированная) последовательность β2-микроглобулина на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична человеческой последовательности β2-микроглобулина по вариантам осуществления, иллюстрируемым в данном документе. В одном варианте осуществления человеческая (гуманизированная) последовательность β2-микроглобулина содержит одну или несколько консервативных замен. В одном варианте осуществления человеческая (гуманизированная) последовательность β2-микроглобулина содержит одну или несколько неконсервативных замен.

[0098] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено животное, отличное от человека, у которого экспрессируется последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса II, при этом последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса II или ее часть не является идентичной последовательности нуклеиновой кислоты человеческого α-полипептида МНС класса I из-за вырожденности генетического кода, но при этом они являются идентичными на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В одном варианте осуществления экспрессируемая последовательность человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса II содержит одну или несколько консервативных замен. В одном варианте осуществления последовательность человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса II содержит одну или несколько неконсервативных замен.

[0099] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено животное, отличное от человека, у которого экспрессируется последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) β-полипептида МНС класса II, при этом последовательность нуклеиновой кислоты человеческого (гуманизированного) β-полипептида МНС класса II или ее часть не является идентичной последовательности нуклеиновой кислоты человеческого α-полипептида МНС класса I из-за вырожденности генетического кода, но при этом они являются идентичными на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В одном варианте осуществления экспрессируемая последовательность человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса II содержит одну или несколько консервативных замен. В одном варианте осуществления последовательность человеческого (гуманизированного) α-полипептида МНС класса II содержит одну или несколько неконсервативных замен.

[00100] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным по первой, второй и/или третьей нуклеотидной последовательности, каждая из которых кодирует отличающийся человеческий или гуманизированный полипептид МНС, выбранный из группы, состоящей из человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС II, человеческого или гуманизированного β-полипептида МНС II и человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС I или их частей. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гомозиготным по первой, второй и/или третьей нуклеотидной последовательности, каждая из которых кодирует отличающийся человеческий или гуманизированный полипептид МНС, выбранный из группы, состоящей из человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС II, человеческого или гуманизированного β-полипептида МНС II и человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС I или их частей.

Иммунные ответы человеческих или гуманизированных В-клеток

[00101] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, в дополнение к содержанию первой, второй и/или третьей нуклеотидной последовательности, каждая из которых кодирует отличающийся человеческий или гуманизированный полипептид МНС, выбранный из группы, состоящей из человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС II, человеческого или гуманизированного β-полипептида МНС II и человеческого или гуманизированного α-полипептида МНС I или их частей, например, также содержит человеческие или гуманизированные локусы тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, за счет чего животное, отличное от человека, способно обеспечивать человеческие или гуманизированные антигенсвязывающие белки, содержащие человеческий или гуманизированный антиген связывающий домен, например, человеческий или гуманизированный вариабельные домены.

[00102] Локусы иммуноглобулина, содержащие сегменты гена человеческой вариабельной области, известны в уровне техники и могут быть найдены, например, в патентах США №№5633425, 5770429, 5814318, 6075181, 6114598, 6150584, 6998514, 7795494,7910798,8232449,8502018,8697940,8703485,8754287,8791323,8809051, 8907157, 9035128, 9145588, 9206263, 9447177, 9551124, 9580491 и 9475559, каждый из которых тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте, а также в публикациях патентов США №№20100146647, 20110195454, 20130167256, 20130219535, 20130326647, 20130096287 и 2015/0113668, каждый из которых тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте, и в публикациях согласно РСТ №№ WO 2007117410, WO 2008151081, WO 2009157771, WO 2010039900, WO 2011004192, WO 2011123708 и WO 2014093908, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00103] В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, раскрытые в данном документе, содержат в дополнение к нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу МНС, экзогенно введенные полностью человеческие трансгены иммуноглобулина, которые способны перестраиваться в В-клетках-предшественниках у мышей (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236; включенная в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В таких вариантах осуществления полностью человеческие трансгены иммуноглобулина могут быть (рандомно) вставлены, а эндогенные гены иммуноглобулина также могут быть нокаутированы (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143; при этом каждая из публикаций включенная посредством ссылки во всей своей полноте), например, при этом эндогенные локусы тяжелой цепи и легкой κ-цепи иммуноглобулина инактивируют, например путем направленной делеции небольших, но важных частей каждого эндогенного локуса, с последующим введением человеческих локусов гена иммуноглобулина в виде рандомно встроенных больших трансгенов или минихромосом (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727; включенная посредством ссылки во всей своей полноте).

[00104] В некоторых вариантах осуществления человеческие или гуманизированные локусы тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина находятся в эндогенных локусах тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина соответственно. Ранее был описан способ осуществления масштабной генетической замены in situ для локусов генов вариабельных областей иммуноглобулина зародышевой линии мыши на локусы генов вариабельных областей иммуноглобулина зародышевой линии человека с сохранением способности мышей давать потомство. См., например, патенты США №№6596541 и 8697940, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В частности, описана точная замена шести мегабаз локусов генов вариабельных областей как мышиной тяжелой цепи, так и легкой κ-цепи иммуноглобулина их человеческими аналогами, при этом мышиные константные области оставались интактными. В результате были получены мыши, у которых имелась точная замена всего их репертуара вариабельных областей иммуноглобулина зародышевой линии эквивалентными последовательностями вариабельных областей иммуноглобулина зародышевой линии человека при сохранении мышиных константных областей. Человеческие вариабельные области связаны с мышиными константными областями с образованием химерных человеческих-мышиных локусов иммуноглобулина, которые перегруппировываются и экспрессируются на физиологически приемлемых уровнях. Экспрессируемые антитела представляют собой «обратные химеры», т.е. они содержат человеческие последовательности вариабельной области и мышиные последовательности константной области. Этих мышей, имеющих гуманизированные вариабельные области иммуноглобулина, у которых экспрессируются антитела, имеющие человеческие или гуманизированные вариабельные области и мышиные константные области, называют мышами VELOCIMMUNE®.

[00105] Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® демонстрируют наличие полностью функциональной гуморальной иммунной системы, которая практически неотличима от таковой у мышей дикого типа. У них показаны нормальные клеточные популяции на всех стадиях развития В-клеток. У них продемонстрирована нормальная морфология лимфоидных органов. Последовательности антител мышей VELOCIMMUNE® демонстрируют нормальную перегруппировку V(D)J и нормальные частоты соматических гипермутаций. Популяции антител у этих мышей отображают распределения изотипов, которые возникают в результате нормального переключения класса (например, нормального цис-переключения изотипа). Иммунизация мышей VELOCIMMUNE® приводит к устойчивым гуморальным иммунным ответам, при которым вырабатывается большой, разнообразный репертуар антител, имеющих человеческие вариабельные домены иммуноглобулина, подходящие для применения в качестве кандидатов терапевтических средств. Эта платформа обеспечивает богатый источник человеческих последовательностей вариабельной области иммуноглобулина с естественным образом созревшей аффинностью для получения фармацевтически приемлемых антител и других антиген связывающих белков. Также было показано, что замена даже одного эндогенного сегмента гена V_H человеческим сегментом гена V_H может приводить к иммунному ответу, предусматривающему гуманизированный вариабельный домен иммуноглобулина. См., например, Tien et al. (2016) Cell 166:1471-84; включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Это точная замена мышиных вариабельных последовательностей иммуноглобулина человеческими вариабельными последовательностями иммуноглобулина, так что человеческие вариабельные последовательности иммуноглобулина являются функционально связанными с эндогенной(-ыми) отличной(-ыми) от человеческой(-их) последовательностью(-ями) гена константной области обратным химерным способом, что обеспечивает получение мышей VELOCIMMUNE®.

[00106] Мыши, модифицированные обратным химерным способом, включают мышей, модифицированных таким образом, чтобы они содержали в эндогенном локусе иммуноглобулина человеческую (гуманизированную) вариабельную область (например, содержащую (D), J и один или более человеческих V сегментов гена), функционально связанную с эндогенной константной областью, например (а) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, при этом неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит несколько неперегруппированных человеческих сегментов гена V_H вариабельной области тяжелой цепи (например, все функциональные неперегруппированные человеческие сегменты гена V_H), один или более неперегруппированных сегментов гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина и один или более неперегруппированных сегментов гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина,

при этом необязательно один или более неперегруппированных сегментов гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина и один или более неперегруппированных сегментов гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина представляют собой один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина (например, все функциональные человеческие сегменты гена D_H) и/или один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина (например, все функциональные человеческие сегменты гена J_H);

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, при этом рестриктированная неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область тяжелой цепи состоит по сути из одного неперегруппированного человеческого сегмента гена V_H вариабельной области тяжелой цепи, функционально связанного с одним или несколькими неперегруппированными сегментами гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина и одним или несколькими неперегруппированными сегментами гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом необязательно один или более неперегруппированных сегментов гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина и один или более неперегруппированных сегментов гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина представляют собой один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина и/или один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина соответственно;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь, содержащую перегруппированную человеческую (гуманизированную) последовательность вариабельной области тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, при этом перегруппированная человеческая (гуманизированная) последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит человеческий сегмент гена V_H вариабельной области тяжелой цепи, перегруппированный с сегментом гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина, который перегруппирован с сегментом гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина,

при этом необязательно сегмент гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина или сегмент гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина представляют собой человеческий сегмент гена D_H тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческий сегмент гена J_H тяжелой цепи иммуноглобулина соответственно;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, при этом модифицированная гистидином неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область тяжелой цепи содержит неперегруппированную последовательность гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в кодирующей определяющую комплементарность область 3 (CDR3) последовательности замену по меньшей мере одного негистидинового кодона гистидиновым кодоном или вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей, содержащую неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, при этом эндогенная константная область тяжелой цепи содержит (1) интактный эндогенной ген IgM, который кодирует изотип IgM, который соединяется с легкой цепью, и (2) отличный от IgM ген, например ген IgG, не содержащий последовательности, которая кодирует функциональный домен СН1, при этом отличный от IgM ген кодирует отличный от IgM изотип, не содержащий домена СН1, способный ковалентно связываться с константным доменом легкой цепи; или

(vi) последовательность неперегруппированной человеческой (гуманизированной) гибридной тяжелой цепи, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина, при этом последовательность неперегруппированной человеческой (гуманизированной) гибридной тяжелой цепи содержит неперегруппированные вариабельные сегменты гена человеческой легкой цепи (V_L) и неперегруппированные соединяющие сегменты гена человеческой легкой цепи (J_L) в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи,

при этом необязательно эндогенная константная область тяжелой цепи содержит (1) интактный эндогенный ген IgM, который кодирует изотип IgM, который соединяется с легкой цепью, и (2) отличный от IgM ген, например ген IgG, не содержащий последовательности, которая кодирует функциональный домен СН1, при этом отличный от IgM ген кодирует отличный от IgM изотип, не содержащий домена СН1, способный ковалентно связываться с константным доменом легкой цепи;

и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит несколько неперегруппированных человеческих сегментов гена V_L вариабельной области легкой цепи (например, все функциональные человеческие неперегруппированные сегменты гена V_L) и один или более неперегруппированных сегментов гена J_L легкой цепи иммуноглобулина,

при этом необязательно один или более неперегруппированных сегментов гена J_L легкой цепи иммуноглобулина представляют собой один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена J_L легкой цепи иммуноглобулина (например, все функциональные человеческие сегменты гена J_HL),

при этом необязательно эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина представляет собой эндогенный локус легкой каппа-цепи иммуноглобулина (κ), неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит человеческие вариабельные κ (V_κ) и соединяющие к (J_κ) сегменты гена, и при этом эндогенная константная область легкой цепи представляет собой эндогенную последовательность константной области κ-цепи, и/или при этом эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина представляет собой эндогенную легкую лямбда-цепь (λ) иммуноглобулина, неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит человеческие вариабельные сегменты гена λ (V_λ) и соединяющие сегменты гена λ (J_λ), и эндогенная константная область легкой цепи представляет собой эндогенную последовательность константной области λ-цепи, при этом необязательно эндогенный локус легкой λ-цепи иммуноглобулина содержит (а) один или более человеческих сегментов гена V_λ, (b) один или более человеческих сегментов гена J_λ и (с) один или более человеческих сегментов гена С_λ, при этом (а) и (b) функционально связаны с (с) и константным сегментом гена легкой цепи иммуноглобулина грызуна (С_λ), и при этом эндогенный локус легкой λ-цепи иммуноглобулина дополнительно содержит один или более энхансеров легкой λ-цепи иммуноглобулина грызуна (Еλ), и один или несколько энхансеров человеческой легкой λ-цепи (Еλ), с необязательным содержанием трех человеческих Еλ;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь, содержащую перегруппированную человеческую (гуманизированную) последовательность вариабельной области легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом перегруппированная человеческая (гуманизированная) последовательность вариабельной области легкой цепи содержит человеческий сегмент гена V_L, перегруппированный с сегментом гена легкой цепи иммуноглобулина J_L;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом рестриктированная неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи содержит не более двух неперегруппированных человеческих вариабельных сегментов гена легкой цепи иммуноглобулина (V_L), функционально связанных с одним или несколькими неперегруппированными человеческими соединяющими сегментами гена легкой цепи иммуноглобулина (J_L);

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом модифицированная гистидином неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи содержит неперегруппированную человеческую (гуманизированную) последовательность гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в кодирующей определяющую комплементарность область 3 (CDR3) последовательности замену по меньшей мере одного негистидинового кодона гистидиновым кодоном или вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую (гуманизированной) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом модифицированная гистидином перегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи содержит перегруппированную человеческую (гуманизированную) последовательность гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в кодирующей определяющую комплементарность область 3 (CDR3) последовательности замену по меньшей мере одного негистидинового кодона гистидиновым кодоном или вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона,

при этом необязательно мышь дополнительно содержит:

(i) локус человеческой (гуманизированной) тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий функциональный ген ADAM6, за счет чего мышь проявляет фертильность дикого типа животного, отличного от человека; и/или

(ii) экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) для обеспечения повышенной вариативности антигенного рецептора, необязательно такой, что по меньшей мере 10% перегруппированных генов вариабельной области содержат добавления, не соответствующие матрице, которые были описаны ранее. См., например, патенты США №№8697940; 8754287; 9204624; 9334334; 9801362; 9332742 и 9516868; публикации патентов США №№20110195454, 20120021409, 20120192300, 20130045492; 20150289489; 20180125043; 20180244804; публикации согласно РСТ №№ WO 2017210586 и WO 2011163314; Lee et al. (2014) Nature Biotechnology 32:356, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00107] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает генетически модифицированное животное, отличное от человека, чей геном, например геном зародышевой линии, содержит:

эндогенный локус иммуноглобулина, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую человеческий сегмент гена V_H, человеческий сегмент гена D_H и сегмент гена человеческий J_H, при этом вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью, и/или

эндогенный локус цепи, содержащий вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую человеческий сегмент гена VL и человеческие сегменты гена JL, при этом вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью.

[00108] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает генетически модифицированное животное, отличное от человека, чей геном, например геном зародышевой линии, содержит:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую человеческий сегмент гена V_H, человеческий сегмент гена D_H и человеческий сегмент гена J_H, при этом вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью, и/или

эндогенный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую человеческий сегмент гена VL и человеческие сегменты гена JL, при этом вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью.

[00109] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, например грызун, например крыса или мышь, кроме нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный МНС, содержит в своем геноме замену одного или нескольких эндогенных сегментов V_H, D_H и J_H в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина одним или несколькими человеческими сегментами V_H, D_H и J_H, при этом один или более человеческих сегментов V_H, D_H и J_H функционально связаны с эндогенным геном тяжелой цепи иммуноглобулина; и необязательно неперегруппированные или перегруппированные человеческий сегмент V_L и человеческий сегмент J_L функционально связаны с отличным от человеческого, например грызуна, например мышиным или крысиным, или человеческим геном константной области легкой цепи иммуноглобулина (C_L), например, в эндогенном отличном от человеческого локусе легкой цепи, так что животное, отличное от человека, является подвергнутым индуцированию толерантности против человеческой или гуманизированной молекулы МНС и продуцирует обратные химерные антитела в ответ на иммуноген, например антигенный комплекс рМНС.

[00110] В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные животные, отличные от человека, которые экспрессируют человеческую или гуманизированную молекулу МНС и являются подвергнутыми индуцированию толерантности к таковой, также содержат в своем геноме, например геноме зародышевой линии, локус (экзогенный или эндогенный) иммуноглобулина, содержащий вариабельную область иммуноглобулина, содержащую один или более сегментов неперегруппированного гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина, и константную область иммуноглобулина, содержащую ген константной области иммуноглобулина, и в котором один или более сегментов неперегруппированного гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина функционально связаны с геном константной области иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, которые экспрессируют человеческую или гуманизированную молекулу МНС и являются подвергнутыми индуцированию толерантности в отношении таковой, содержат в своем геноме, например геноме зародышевой линии, несколько таких локусов иммуноглобулина. Например, в некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные животные, отличные от человека, содержат в своем геноме, например геноме зародышевой линии, нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу МНС, и один или более локусов иммуноглобулина (в том числе генетически модифицированные перегруппированные или неперегруппированные локусы иммуноглобулина), так что мыши вырабатывают человеческие, гуманизированные, частично человеческие и/или обратные химерные (с человеческими вариабельными и отличными от человеческих константными областями) антитела.

[00111] Как правило, генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит вариабельную область иммуноглобулина (содержащую сегменты гена вариабельной области иммуноглобулина), функционально связанную с константной областью иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит один или более человеческих неперегруппированных сегментов гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанных с геном константной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит человеческие неперегруппированные сегменты гена легкой цепи иммуноглобулина, например κ, функционально связанные с геном константной области тяжелой цепи, см., например, патент США №9516868, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит человеческие неперегруппированные сегменты гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанные с геном константной области κ-цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит человеческие неперегруппированные сегменты гена вариабельной области к иммуноглобулина, функционально связанные с геном константной области κ-цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит человеческие неперегруппированные сегменты гена вариабельной области λ иммуноглобулина, функционально связанные с геном константной области κ-цепи. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус иммуноглобулина содержит человеческие неперегруппированные сегменты гена вариабельной области λ иммуноглобулина, функционально связанные с геном константной области λ-цепи.

[00112] В определенных вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, при этом вариабельная область иммуноглобулина содержит один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена вариабельной области тяжелой цепи Ig. В некоторых вариантах осуществления один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена вариабельной области Ig содержат по меньшей мере один человеческий вариабельный сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), один или более вариативных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина (D_H) (необязательно один или более неперегруппированных человеческих сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина D_H сегментов) и один или более соединяющих сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина (J_H) (необязательно один или более неперегруппированных человеческих сегментов J_H). В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные человеческие сегменты гена вариабельной области Ig включают несколько неперегруппированных человеческих сегментов V_H, один или более неперегруппированных (человеческих) сегментов D_H и один или более неперегруппированных (человеческих) сегментов J_H. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные человеческие сегменты гена вариабельной области Ig включают по меньшей мере 3 сегмента гена V_H, по меньшей мере 18 сегментов гена V_H, по меньшей мере 20 сегментов гена V_H, по меньшей мере 30 сегментов гена V_H, по меньшей мере 40 сегментов гена V_H, по меньшей мере 50 сегментов гена V_H, по меньшей мере 60 сегментов гена V_H, по меньшей мере 70 сегментов гена V_H или по меньшей мере 80 сегментов гена V_H. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные человеческие сегменты гена Ig включают все из функциональных человеческих сегментов гена D_H. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные человеческие сегменты гена Ig включают все из функциональных человеческих сегментов гена J_H. Иллюстративные вариабельные области, содержащие сегменты гена тяжелой цепи Ig, представлены, например, в Macdonald et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 и в дополнительной информации, которые тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте.

[00113] В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, предусмотренные в данном документе, содержат в эндогенном локусе тяжелой цепи рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере отличным от человеческого ген IgM, при этом рестриктированная неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область тяжелой цепи характеризуется наличием единственного человеческого сегментом гена V_H, нескольких сегментов гена D_H (например, человеческих сегментов гена D_H) и нескольких сегментов гена J_H (например, человеческих сегментов гена J_H), при этом рестриктированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина способен перегруппировываться и образовывать несколько отдельных перегруппировок, при этом каждая перегруппировка получена из единственного человеческого сегмента гена V_H, одного из сегментов D_H и одного из сегментов J_H, и при этом каждая перегруппировка кодирует отличающийся вариабельный домен тяжелой цепи (например, как описано в публикации патента США №20130096287, которая тем самым включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления единственный человеческий сегмент гена V_H представляет собой V_H1-2 или V_H1-69.

[00114] В определенных вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе легкой цепи неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина содержит неперегруппированные человеческие сегменты гена вариабельной области κ Ig. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область иммуноглобулина содержит несколько неперегруппированных человеческих сегментов Vκ и один или более неперегруппированных человеческих сегментов J_K. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина включают все из человеческих сегментов Jκ. В некоторых вариантах осуществления сегменты гена вариабельной области иммуноглобулина содержат четыре функциональных сегмента Vκ и все человеческие сегменты Jκ. В некоторых вариантах осуществления сегменты гена вариабельной области иммуноглобулина содержат 16 функциональных сегментов Vκ и все человеческие сегменты Jκ (например, все функциональные человеческие сегменты Vκ и сегменты Jκ). В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина включают все из человеческих сегментов Vκ и все человеческие сегменты Jκ. Иллюстративные вариабельные области, содержащие сегменты гена κ Ig, представлены, например, в Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1 11:5147-52 и в дополнительной информации, которые тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте.

[00115] В некоторых вариантах осуществления рестриктированная неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи характеризуется тем, что неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи содержит не более двух человеческих сегментов гена V_L и несколько сегментов гена J_L (например, двойную легкую цепь мышей или DLC, как описано в патент США №9796788, который тем самым включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления сегменты гена V_L представляют собой сегменты гена Vκ. В некоторых вариантах осуществления сегменты гена V_L представляют собой сегменты гена-Vλ. В некоторых вариантах осуществления сегменты гена Vκ представляют собой IGKV3-20 и IGKV1-39. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит ровно два неперегруппированных человеческих сегмента гена Vκ и пять неперегруппированных человеческих сегментов гена Jκ, функционально связанных с мышиной константной областью легкой цепи, в эндогенных локусах легкой κ-цепи мыши, при этом необязательно ровно два неперегруппированных человеческих сегмента гена Vκ представляют собой человеческий сегмент гена Vκ1-39 и человеческий сегмент гена Vκ3-20, при этом пять неперегруппированных человеческих сегментов гена Jκ представляют собой человеческий сегмент гена Jκ1, человеческий сегмент гена Jκ2, человеческий сегмент гена Jκ3, человеческий сегмент гена Jκ4 и человеческий сегмент гена Jκ5, при этом неперегруппированные человеческие сегменты гена легкой каппа-цепи способны перегруппировываться и кодировать человеческие вариабельные домены антитела, и, кроме того, при этом необязательно животное, отличное от человека, не содержит эндогенный сегмент гена Vκ, который способен перегруппировываться с образованием вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина.

[00116] В определенных вариантах осуществления неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи содержит неперегруппированные человеческие сегменты гена вариабельной области Igλ. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина включают несколько человеческих сегментов Vλ и один или более человеческих сегментов Jλ. В определенном варианте осуществления неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина включают один или более человеческих сегментов Vλ, один или более человеческих сегментов Jλ и один или более человеческих последовательностей константной области Сλ. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области содержат все из человеческих сегментов Vλ. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области содержат все из человеческих сегментов Jλ. Иллюстративные вариабельные области, содержащие сегменты гена Ig λ, представлены, например, в патентах США №№9035128 и 6998514, каждый из которых тем самым включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи содержит (а) один или более человеческих сегментов гена Vλ, (b) один или более человеческих сегментов гена Jλ и (с) один или более человеческих сегментов гена Сλ, при этом (а) и (b) функционально связаны с (с) и эндогенным (например, грызуна) сегментом гена Сλ, и при этом эндогенный локус легкой λ-цепи иммуноглобулина дополнительно содержит один или более энхансеров легкой λ-цепи иммуноглобулина (Еλ) грызуна и один или более человеческих энхансеров легкой λ-цепи иммуноглобулина (Еλ), с необязательным содержанием трех человеческих Eλ.

[00117] В определенных вариантах осуществления неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи содержит неперегруппированные человеческие сегменты гена вариабельной области Igλ, функционально связанные с эндогенным (например, грызуна, например крысы или мыши) геном Сκ, так что у животного, отличного от человека, экспрессируется легкая цепь иммуноглобулина, которая содержит человеческую последовательность вариабельного домена λ, полученную из сегментов гена Vλ и Jλ слитых с эндогенным константным доменом κ, см., например, патент США №9226484, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00118] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область иммуноглобулина, предусматривающая неперегруппированные сегменты гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина, также содержит межгенные последовательности человеческой вариабельной области иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область иммуноглобулина содержит отличные от человеческих (например, грызуна, крысы, мыши) межгенные последовательности вариабельной области Ig. В некоторых вариантах осуществления межгенная последовательность имеет эндогенное видовое происхождение.

[00119] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область иммуноглобулина представляет собой перегруппированную вариабельную область тяжелой цепи (универсальную вариабельную область тяжелой цепи или последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь). В некоторых вариантах осуществления перегруппированный ген вариабельной области тяжелой цепи Ig представляет собой человеческий перегруппированный ген вариабельной области тяжелой цепи Ig. Иллюстративные перегруппированные вариабельные области тяжелой цепи Ig представлены в публикации патента США №20140245468 и в патентах США №№9204624 и 9930871, каждый из которых тем самым включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления для получения биспецифических антител применяют организм, отличный от человеческого, содержащий универсальную вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержит в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь, например перегруппированную человеческую нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанную с эндогенной последовательностью гена константной области иммуноглобулина, например перегруппированную человеческую нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанную с эндогенной последовательностью гена константной области тяжелой цепи, при этом перегруппированная нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи кодирует последовательность V_H3-23/X₁X₂/J_H, при этом X₁ представляет собой любую аминокислоту, и Х₂ представляет собой любую аминокислоту, при этом у животного, отличного от человека, экспрессируется вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который получен из перегруппированной человеческой нуклеотидной последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, например гена V_H3-23/X₁X₂/J_H, связанной с эндогенной последовательностью константной области тяжелой цепи гена и необязательно когнатной по отношению к человеческому вариабельному домену легкой цепи иммуноглобулина.

[00120] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область иммуноглобулина представляет собой перегруппированную вариабельную область легкой цепи (универсальную вариабельную область легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления перегруппированный ген вариабельной области легкой цепи Ig представляет собой человеческий перегруппированный ген вариабельной области легкой цепи Ig. Иллюстративные перегруппированные вариабельные области легкой цепи Ig представлены, например, в патентах США №№9969814; 10130181 и 10143186, и публикациях патентов США №№20120021409, 20120192300, 20130045492, 20130185821, 20130302836 и 20150313193, каждый из которых тем самым включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления для получения биспецифических антител применяют организм, отличный от человеческого (организм с «универсальной легкой цепью»), содержащий универсальную вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая общую легкую цепь, содержит одну перегруппированную последовательность человеческий легкой цепи иммуноглобулина Vκ/Jκ, функционально связанную с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом одна перегруппированная человеческая последовательность легкой цепи иммуноглобулина Vκ/Jκ представляет собой либо (i) человеческую последовательность Vκ1-39/Jκ5, содержащую человеческий сегмент гена Vκ1-39, слитый с человеческим сегментом гена Jκ5, либо (ii) человеческую последовательность Vκ3-20/Jκ1, содержащую человеческий сегмент гена Vκ3-20, слитый с человеческим сегментом гена Jκ1.

[00121] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область иммуноглобулина представляет собой вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит вставки и/или замены гистидиновых кодонов, предназначенных для придания рН-зависимых свойств связывания антителам, вырабатываемым в таком организме, отличном от человеческого. В некоторых из таких вариантов осуществления гистидиновые кодоны вставляют и/или вставляют посредством замещения в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CDR3. Различные такие локусы легкой и/или тяжелой цепи иммуноглобулина представлены в патентах США №№9301510; 9334334 и 9801362 и в публикации заявки на патент США №20140013456, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления модифицированная гистидином перегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи содержит одну перегруппированную человеческую последовательность гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, содержащую человеческие последовательности сегментов Vκ и Jκ, при этом необязательно последовательность сегмента Vκ получена из человеческого сегмента гена Vκ1-39 или Vκ3-20, и при этом одна перегруппированная человеческая последовательность гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона последовательности сегмента Vκ гистидиновым кодоном, который экспрессируется в положении, выбранном из группы, состоящей из 105, 106, 107, 108, 109, 111 и их комбинации (согласно нумерации IMGT). В некоторых вариантах осуществления модифицированная гистидином неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи содержит неперегруппированную человеческую (гуманизированную) последовательность гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в кодирующей определяющую комплементарность область 3 (CDR3) последовательности замену по меньшей мере одного негистидинового кодона гистидиновым кодоном или вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона. В некоторых вариантах осуществления неперегруппированная человеческая (гуманизированная) последовательность гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина содержит следующие сегменты гена: неперегруппированный человеческий V_H, неперегруппированный человеческий D_H или синтетический D_H и неперегруппированный человеческий J_H, при этом необязательно неперегруппированный человеческий сегмент гена D_H или синтетический сегмент гена D_H содержат замену по меньшей мере одного негистидинового кодона гистидиновым кодоном или вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона. В некоторых вариантах осуществления модифицированная гистидином неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи содержит неперегруппированный сегмент гена V_L и неперегруппированный сегмент гена J_L. В некоторых вариантах осуществления модифицированная гистидином неперегруппированная человеческая (гуманизированная) вариабельная область легкой цепи содержит не более двух неперегруппированных человеческих сегментов гена V_L (например, не более двух сегментов гена Vκ) и один или более неперегруппированных человеческих сегментов гена J_L (например, Jκ), при этом каждый из не более двух человеческих сегментов гена V_L содержит в кодирующей CDR3 последовательности замену по меньшей мере одного негистидинового кодона гистидиновым кодоном или вставку по меньшей мере одного гистидинового кодона. В некоторых вариантах осуществления не более двух неперегруппированных человеческих сегментов гена Vκ представляют собой человеческие сегменты гена Vκ1-39 и Vκ3-20, каждый из которых содержит одну или несколько замен негистидинового кодона гистидиновым кодоном, и при этом человеческие сегменты гена Vκ и Jκ способны перегруппировываться, и человеческие сегменты гена Vκ и Jκ кодируют человеческий вариабельный домен легкой цепи, содержащий один или более остатков гистидина в положении, выбранном из группы, состоящей из 105, 106, 107, 108, 109, 111 (согласно нумерации IGMT) и их комбинации, при этом один или более остатков гистидина получают из одной или более замен.

[00122] В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина предусматривает ген константной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления ген константной области тяжелой цепи представляет собой человеческий ген константной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления ген константной области тяжелой цепи имеет эндогенное видовое происхождение. В некоторых вариантах осуществления ген константной области тяжелой цепи представляет собой мышиный ген константной области или крысиный ген константной области. В некоторых вариантах осуществления ген константной области представляет собой смесь человеческой и отличной от человеческой последовательности. Например, в некоторых вариантах осуществления ген константной области кодирует человеческую область СН1 и отличную от человеческой (например, эндогенного видового происхождения, мышиную, крысиную) область СН2 и/или СН3. В некоторых вариантах осуществления ген константной области тяжелой цепи представляет собой ген константной области Cμ, Сδ, Сγ (Cγ1, Сγ2, Сγ3, Сγ4), Сα или Cε. В некоторых вариантах осуществления ген константной области представляет собой эндогенный ген константной области. В некоторых вариантах осуществления ген константной области кодирует мутантную область СН1, так что у животного, отличного от человека, экспрессируются антитела, состоящие только из тяжелых цепей (см., например, патент США №8754287, публикацию заявки на патент США №2015/0289489, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления, например, где цель заключается в выработке тяжелых цепей для получения биспецифических антител (например, в организмах с универсальной или двойной легкой цепью), Fc-домены тяжелых цепей содержат модификации для облегчения образования гетеродимера тяжелых цепей и/или для ингибирования образования гомодимера тяжелых цепей. Такие модификации представлены, например, в патентах США №№5731168; 5807706; 5821333; 7642228 и 8679785 и в публикации патента США №2013/0195849, каждый из которых тем самым включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00123] В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина предусматривает ген константной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления ген константной области легкой цепи представляет собой ген константной области κ. В некоторых вариантах осуществления ген константной области легкой цепи представляет собой ген константной области λ. В некоторых вариантах осуществления ген константной области легкой цепи имеет эндогенное видовое происхождение. В некоторых вариантах осуществления ген константной области легкой цепи представляет собой мышиный ген константной области или крысиный ген константной области. В некоторых вариантах осуществления ген константной области легкой цепи представляет собой смесь человеческой и отличной от человеческой последовательности.

[00124] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область иммуноглобулина предусматривает человеческие сегменты гена вариабельной области и ген константной области иммуноглобулина, с которым функционально связаны сегменты гена вариабельной области, расположенные в эндогенном локусе иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус иммуноглобулина представляет собой эндогенный локус тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления эндогенном локус иммуноглобулина представляет собой эндогенный локус κ. В некоторых вариантах осуществления эндогенном локус иммуноглобулина представляет собой эндогенный локус λ. В некоторых вариантах осуществления ген константной области, с которым функционально связаны человеческие сегменты гена вариабельной области, представляет собой эндогенный ген константной области.

[00125] В некоторых вариантах осуществления один или более эндогенных локусов иммуноглобулина или часть одного или нескольких эндогенных локусов (например, вариабельная область и/или константная область) в геноме животного, отличного от человека, предусмотренного в данном документе, являются инактивированными. Эндогенные локусы гена вариабельной области иммуноглобулина и их части могут быть инактивированы с применением любого способа, известного в уровне техники, включающего без ограничения делецию локуса или его части из генома организма, замену локуса или его части отличающейся последовательностью нуклеиновой кислоты, инверсию части локуса и/или перемещение части локуса в другое положение в геноме организма, отличного от человеческого. В некоторых вариантах осуществления инактивация локуса является только частичной инактивацией. В некоторых вариантах осуществления локус вариабельной области инактивирован, но константная область остается функциональной (например, поскольку она функционально связана с неэндогенными сегментами гена вариабельной области).

[00126] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит инактивированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина или его часть инактивированы делецией, заменой, перемещением и/или инверсией по меньшей мере части эндогенной вариабельной области эндогенного локуса тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть вариабельной области эндогенного локуса тяжелой цепи, которая подвергается делеции, замене, перемещению и/или инверсии, содержит сегменты J вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина или его часть инактивированы делецией, заменой, перемещением и/или инверсией по меньшей мере части эндогенной константной области эндогенного локуса тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть константной области эндогенного локуса тяжелой цепи, которая подвергается делеции, замене, перемещению и/или инверсии, содержит ген Оμ, эндогенной константной области.

[00127] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит инактивированный эндогенный локус κ-цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус κ-цепи иммуноглобулина или его часть инактивированы делецией, заменой, перемещением и/или инверсией по меньшей мере части эндогенной вариабельной области эндогенного локуса κ-цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть вариабельной области эндогенного локуса κ-цепи, которая подвергается делеции, замене, перемещению и/или инверсии, содержит сегменты J вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус κ-цепи иммуноглобулина или его часть инактивированы делецией, заменой, перемещением и/или инверсией по меньшей мере части эндогенной константной области эндогенного локуса κ-цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть константной области эндогенного локуса κ-цепи, которая подвергается делеции, замене, перемещению и/или инверсии, содержит ген Сκ эндогенной константной области.

[00128] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит инактивированный эндогенный локус λ-цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус λ- цепи иммуноглобулина или его часть инактивированы делецией, заменой, перемещением и/или инверсией по меньшей мере части эндогенной вариабельной области эндогенного локуса λ-цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть по меньшей мере одного кластера генов V-J-C в эндогенном локусе λ-цепи подвергается делеции, замене, перемещению и/или инверсии. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус λ-цепи иммуноглобулина или его часть инактивированы делецией, заменой, перемещением и/или инверсией по меньшей мере части эндогенной константной области эндогенного локуса λ-цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть константной области эндогенного локуса λ-цепи, которая подвергается делеции, замене, перемещению и/или инверсии, содержит ген С эндогенной константной области.

[00129] В различных вариантах осуществления модификации локуса иммуноглобулина не влияют на фертильность животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи содержит функциональный, например, эндогенный ген ADAM6a, ген ADAM6b или оба, и генетическая модификация не влияет на экспрессию и/или функцию эндогенного гена ADAM6a, гена ADAM6b или обоих. В некоторых вариантах осуществления геном генетически модифицированного животного, отличного от человека, дополнительно содержит эктопически расположенный функциональный, например, эндогенный ген ADAM6a, ген ADAM6b или оба. Иллюстративные животные, отличные от человека, экспрессирующие экзогенный ADAM6a и/или ADAM6b, описаны в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте.

[00130] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, дополнительно содержит и экспрессирует экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT) для обеспечения повышенной вариативности антигенного рецептора. Иллюстративные животные, отличные от человека, экспрессирующие экзогенный TdT, описаны в публикации согласно РСТ WO 2017210586, которая тем самым включена посредством ссылки во всей своей полноте.

[00131] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, содержит и экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу МНС, и экспрессирует антитела, содержащие человеческие вариабельные домены (например, человеческий вариабельный домен, полученный из (например, кодируемый) перегруппированных человеческих сегментов гена вариабельной области), но не содержит антител, которые специфически связывают пустой человеческий или гуманизированный МНС. В некоторых вариантах осуществления человеческий или гуманизированный вариабельный домен представляет собой человеческий или гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитела являются антителами, состоящими только из тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления человеческий или гуманизированный вариабельный домен представляет собой человеческий или гуманизированный вариабельный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитела, продуцируемые животными, отличными от человека, содержат как человеческие или гуманизированные вариабельные домены тяжелой цепи, так и человеческие или гуманизированные вариабельные домены легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат человеческие или гуманизированные константные домены тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат человеческие или гуманизированные константные домены легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления константный домен тяжелой и/или легкой цепи имеет происхождение, отличное от человеческого. Например, в некоторых вариантах осуществления константный домен тяжелой цепи имеет эндогенное видовое происхождение. В некоторых вариантах осуществления константный домен тяжелой цепи имеет мышиное или крысиное происхождение. В некоторых вариантах осуществления константный домен легкой цепи имеет эндогенное видовое происхождение. В некоторых вариантах осуществления константный домен легкой цепи имеет мышиное или крысиное происхождение.

Животные, отличные от человека, ткани и клетки

[00132] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека, по настоящему изобретению может быть выбрано из группы, состоящей из мыши, крысы, кролика, свиньи, бычьих (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, игрунки, макака-резуса). В случае животных, отличных от человека, для которых сложно получить подходящие генетически модифицируемые ES-клетки, для получения животного, отличного от человека, содержащего генетическую модификацию, применяют другие способы. Такие способы включают, например, модификацию генома клеток, отличных от ES-клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки), и применение переноса ядер для перемещения модифицированного генома в подходящую клетку, например, ооцит, и обеспечение вынашивания модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в животном, отличном от человека, в подходящих условиях с образованием эмбриона.

[00133] В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой млекопитающее. В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой мелкое млекопитающее, например из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка. В одном варианте осуществления грызун выбран из представителей надсемейства Muroidea. В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное относится к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомяки), Cricetidae (например, хомяк, крысы и мыши Нового Света, серые полевки), Muridae (истинные мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (рипидомисы, скальные мыши, белохвостые крысы, малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированный грызун выбран из истинной мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В одном варианте осуществления генетически модифицированная мышь является представителем семейства Muridae. В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна. В конкретном варианте осуществления грызун выбран из мыши и крысы. В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой крысу. В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой мышь.

[00134] В конкретном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, который представляет собой мышь линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/01a. В другом варианте осуществления мышь относится к линии 129, выбранной из группы, состоящей из линии, которая представляет собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой гибрид вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой гибрид вышеуказанных линий 129 или гибрид вышеуказанных линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 в гибриде представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии BALB, например линии BALB/c. В еще одном варианте осуществления мышь представляет собой гибрид линии BALB и другой вышеуказанной линии. Животные, отличные от человека, предусмотренные в данном документе, могут представлять собой мышь, полученную из любой комбинации вышеупомянутых линий.

[00135] В последнее десятилетие была установлена трансмиссия зародышевой линии целевого модифицированного аллеля в крысиных ES-клетках. См., например, публикации патентов США №№20140235933 и 20140310828; Tong et al. (2010) Nature 467:211-215, Tong et al. (2011) Nat Protoc. 6(6): doi: 10,1038/nprot.2011.338, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Таким образом, в одном варианте осуществления крыса выбрана из крысы линии Wistar, лини LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. В одном варианте осуществления линия крыс представляет собой гибрид двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из линии Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.

[00136] Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения представлена генетически модифицированная мышь, при этом мышь содержит, например, в своем геноме, например, в своем геноме зародышевой линии,

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, и

(b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, где необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегру ппированным,

при этом у генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируется человеческая или гуманизированная молекула МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающая часть,

при этом у генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируются иммуноглобулины, содержащие человеческий или гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи и/или человеческий или гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, и

при этом животное, отличное от человека, является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле МНС или по меньшей мере ее пептид связывающей части, за счет чего у него вырабатывается специфический В-клеточный ответ при иммунизации комплексом антигенный пептид-МНС (рМНС), который содержит (i) пептид, являющийся гетерологичным в отношении животного, отличного от человека, в комплексе с (ii) человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС, или ее частью.

[00137] В некоторых вариантах осуществления мышь содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС II α), вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС II β), и/или третью нуклеотидную последовательность, кодирующую третий полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС I), и необязательно локус β2-микроглобулина, кодирующий человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, и

(a) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей; или

(vi) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) гибридную последовательность тяжелой цепи, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина; и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи,

при этом необязательно мышь дополнительно содержит:

(i) локус человеческой (гуманизированной) тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий функциональный ген ADAM6, за счет чего мышь проявляет фертильность дикого типа; и/или

(ii) экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) для обеспечения повышенной вариативности антигенного рецептора, необязательно такой, что по меньшей мере 10% перегруппированных генов вариабельной области содержат добавления, не соответствующие матрице.

[00138] Кроме генетически модифицированных животных (например, грызунов, например мышей или крыс) также представлена ткань или клетка, при этом ткань или клетка получена из животного, отличного от человека, по некоторым вариантам осуществления, например, где ткань или клетка содержит (а) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС II α), вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС II β), и/или третью нуклеотидную последовательность, кодирующую третий полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС I), и необязательно локус β2-микроглобулина, кодирующий человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, и (b) при этом, если клетка не является В-клеткой, (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, при этом необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным.

[00139] В некоторых вариантах осуществления ткань или клетка экспрессирует человеческую или гуманизированную молекулу МНС, и человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий белок, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более вариабельных доменов человеческого или гуманизированного антиген связывающего белка, при этом антигенсвязывающий белок специфически связывает комплекс рМНС, который является антигенным для животного, отличного от человека, из которого получена ткань или клетка, например, где комплекс рМНС содержит антигенный пептид в комплексе с человеческим МНС (или его частью), в отношении последнего из которых животное, отличное от человека, как правило, является подвергнутым индуцированию толерантности. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой В-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой гибридому или квадрому, полученную в результате слияния В-клетки, выделенной из животного, отличного от человека, по некоторым вариантам осуществления, и клетки миеломы. В некоторых вариантах осуществления ткань экспрессирует антигенсвязывающий белок или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую его, при этом антигенсвязывающий белок специфически связывает комплекс рМНС, который является антигенным для животного, отличного от человека, из которого получен антигенсвязывающий белок, например, при этом комплекс рМНС содержит антигенный пептид в комплексе с человеческим МНС (или его частью), в отношении последнего из которых животное, отличное от человека, как правило, является подвергнутым индуцированию толерантности.

[00140] В дополнение к генетически сконструированному животному, отличному от человека, также предусмотрен эмбрион, отличный от человеческого (например, грызуна, например эмбрион мыши или крысы), при этом эмбрион, отличный от человеческого, содержит донорную ES-клетку, которую можно применять для получения животного, отличного от человека, (например, грызуна, например мыши или крысы) в иллюстративных вариантах осуществления. В одном варианте осуществления эмбрион, отличный от человеческого, содержит донорную ES-клетку, которая содержит человеческую или гуманизированную нуклеотидную последовательность МНС I (например, МНС I α), человеческую или гуманизированную нуклеотидную последовательность МНС II (например, МНС II α и/или МНС II β), (не)перегруппированный человеческий или гуманизированный локус иммуноглобулина (например, вариабельные локусы тяжелой и/или легкой цепи) и/или человеческую или гуманизированную последовательность гена β2-микроглобулина, и эмбриональные клетки хозяина.

[00141] В некоторых вариантах осуществления для получения животных, отличных от человека, можно применять клетки или геномы животного, отличного от человека (например, грызуна, например крысы или мыши), например плюрипотентные клетки, эмбриональные стволовые (ES) клетки, зародышевые клетки и т.д., при этом клетка или геном содержит

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, и

(b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, где необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегру ппированным,

так что у полученного генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируется человеческая или гуманизированная молекула МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающая часть,

так что у полученного генетически модифицированного животного, отличного от человека, экспрессируются иммуноглобулины, содержащие человеческий или

гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи и/или человеческий или гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, и

так что полученное животное, отличное от человека, является подвергнутым индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле МНС или по меньшей мере ее пептид связывающей части, за счет чего у него вырабатывается специфический В-клеточный ответ при иммунизации антигенным комплексом пептид-МНС (рМНС), который содержит (i) пептид, являющийся гетерологичным в отношении животного, отличного от человека, в комплексе с (ii) человеческой молекулой HLA, из которой получена человеческая или гуманизированная молекула МНС, или ее частью.

[00142] В некоторых иллюстративных вариантах осуществления клетка или геном содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС II α), вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую второй полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС II β), и/или третью нуклеотидную последовательность, кодирующую третий полностью человеческий или химерный человеческий/мышиный полипептид МНС (например, МНС I), и необязательно локус β2-микроглобулина, кодирующий человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, и (а) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей; или

(vi) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) гибридную последовательность тяжелой цепи, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина;

и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом необязательно клетка или геном дополнительно содержит

(i) локус человеческой (гуманизированной) тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий функциональный ген ADAM6, за счет чего мышь проявляет фертильность дикого типа; и/или

(ii) экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) для обеспечения повышенной вариативности антигенного рецептора, такой, что необязательно по меньшей мере 10% перегруппированных генов вариабельной области содержат добавления, не соответствующие матрице.

[00143] Хотя в приведенных ниже примерах описано генетически сконструированное животное, геном которого содержит замену последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиные белки Н-2K, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный человеческий/мышиный HLA-A2/H-2K, специалисту в данной области техники будет понятно, что подобную стратегию можно применять для введения других человеческих (гуманизированных) генов МНС I и II (других HLA-A, HLA-B и HLA-C; и других генов HLA-DR, HLA-DP и HLA-DQ, например, в эндогенные локусы или эктопические локусы, например в локус ROSA26). Также представлены такие животные, содержащие несколько химерных человеческих/отличных от человеческих (например, человеческих/грызуна, например человеческих/мыши) генов МНС I и МНС II в эндогенных локусах МНС. Примеры таких химерных белков МНС I и МНС II описаны в публикациях патентных документов США №№20130111617, 20130185819, 20130185820 и 20140245467 и в патенте США №8847005, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00144] Также представлена клетка, отличная от человеческой, содержащая хромосому или ее фрагмент из животного, отличного от человека, по вариантам осуществления настоящего изобретения. В одном варианте осуществления клетка, отличная от человеческой, содержит ядро животного, отличного от человека, по вариантам осуществления настоящего изобретения. В одном варианте осуществления клетка, отличная от человеческой, содержит хромосому или ее фрагмент в результате ядерного переноса.

Получение генетически модифицированных животных, отличных от человека

[00145] Также представлен способ получения генетически сконструированного животного, отличного от человека (например, генетически сконструированного грызуна, например, мыши или крысы). Как правило, способы включают модификацию генома, например, генома зародышевой линии, животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал (а) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС, вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС, третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую третий химерный человеческий/отличный от человеческого полипептид МНС, и/или локус β2-микроглобулина, кодирующий человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина, и (b) локусы тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, которые кодируют человеческие или гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления модификация включает нацеливание на последовательности, кодирующие эндогенный внеклеточный домен полипептида МНС, весь или часть β2-микроглобулина и вариабельные области иммуноглобулина, и замещение их человеческим(-ими) внеклеточным(-ыми) доменом(-ами) МНС, всем или частью человеческого β2-микроглобулина и человеческой вариабельной областью иммуноглобулина соответственно.

[00146] В некоторых вариантах осуществления модификация может включать скрещивание, например, спаривание, животных того же вида. В других вариантах осуществления модификация включает последовательную гомологичную рекомбинацию в одной или более ES-клетках. В некоторых вариантах осуществления ES-клетки получены из животных, отличных от человека, генетически модифицированных таким образом, чтобы они содержали одну или более, но не все, необходимых генетических модификаций, и гомологичная рекомбинация в таких ES-клетках завершает генетическую модификацию. В других вариантах осуществления модификация может включать комбинацию скрещивания и гомологичной рекомбинации в ES-клетках, например, скрещивание животного с другим (или несколькими) животными того же вида, где некоторые или все животные, отличные от человека, могут быть получены из ES-клеток, генетически модифицированных посредством событий одиночной гомологичной рекомбинации или последовательных гомологичных рекомбинаций, и где некоторая ES-клетка может быть выделена из животного, отличного от человека, содержащего одну или более генетических модификаций, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модификация включает последовательную гомологичную рекомбинацию в одной ES-клетке.

[00147] В некоторых вариантах осуществления в способе применяют нацеливающую конструкцию, полученную с применением технологии VELOCIGENE®, введение конструкции в ES-клетки и введение клонов нацеленных ES-клеток в мышиный эмбрион с применением технологии VELOCIMOUSE® (см., например, патент США №7294754 и Poueymirou et al. (2007) Nature Biotech 25:91-99, каждая из ссылок включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Нацеливающая конструкция может содержать 5'- и/или 3'-плечи гомологии, которые обеспечивают нацеливание на эндогенную последовательность, подлежащую замещению, последовательность вставки (которая замещает эндогенную последовательность) и одну или более кассет для отбора. Кассета для отбора представляет собой нуклеотидную последовательность, вставленную в нацеливающую конструкцию, для облегчения отбора клеток (например, ES-клеток), которые содержат интегрированную представляющую интерес конструкцию. Ряд подходящих кассет для отбора известен из уровня техники. Обычно кассета для отбора обеспечивает положительный отбор в присутствии определенного антибиотика (например, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC и т.д.). Кроме того, кассета для отбора может быть фланкирована сайтами рекомбинации, которые обеспечивают возможность делеции кассеты для отбора при обработке ферментами-рекомбиназами. Обычно применяемые сайты рекомбинации представляют собой loxP и Frt, распознаваемые ферментами Cre и Flp соответственно, но другие таковые известны из уровня техники. Кассета для отбора может быть расположена где-либо в конструкции за пределами кодирующей области. В одном варианте осуществления кассета для отбора расположена на 5'-конце фрагмента ДНК человека. В другом варианте осуществления кассета для отбора расположена на 3'-конце фрагмента ДНК человека. В другом варианте осуществления кассета для отбора расположена во фрагменте ДНК человека. В другом варианте осуществления кассета для отбора расположена в интроне фрагмента ДНК человека. В другом варианте осуществления кассета для отбора расположена в месте соединения фрагмента ДНК человека и фрагмента ДНК мыши. Мыши поколения F0, которые по сути были полностью получены из ES-клеток, нацеленных на донорский ген, обеспечивали возможность проведения прямых фенотипических анализов. VELOCIMICE® (мыши F0, полностью полученные из донорской ES-клетки), независимо несущие человеческий или гуманизированный ген МНС класса I, человеческий или гуманизированный ген β2-микроглобулина и/или человеческий или гуманизированный ген МНС класса II, а также гуманизированные локусы иммуноглобулина, идентифицированы путем генотипирования с применением модификации аллельного анализа (Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659, включенная в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), который обеспечивает выявление наличия этих уникальных последовательностей генов. Гетерозиготных мышей, полученных посредством данного способа, можно скрещивать с гомозиготными.

[00148] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, содержащее человеческие или гуманизированные молекулы МНС I, β2-микроглобулина, МНС II, скрещивают со вторым животным, отличным от человека, того же вида, где второе животное, отличное от человека, содержит локус неперегруппированной человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или локус неперегруппированной человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина. Например, мышь, содержащую человеческие или гуманизированные молекулы МНС I, β2-микроглобулина, МНС II, можно скрещивать со второй мышью, содержащей

(a) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей; или

(vi) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) гибридную последовательность тяжелой цепи, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина; и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи,

при этом вторая мышь необязательно дополнительно содержит

(i) локус человеческой (гуманизированной) тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий функциональный ген ADAM6, за счет чего мышь проявляет фертильность дикого типа; и/или

(ii) экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) для обеспечения повышенной вариативности антигенного рецептора, так что необязательно по меньшей мере 10% перегруппированных генов вариабельной области содержат добавления, не соответствующие матрице.

[00149] В другом варианте осуществления конструкции, обеспечивающие вставку человеческого или гуманизированного МНС I, МНС II и/или β2-микроглобулина, участвуют в гомологичной рекомбинации (в эндогенном локусе МНС I, МНС II и/или β2-микроглобулина или в эктопическом локусе) в ES-клетке животного, отличного от человека, генетически модифицированной таким образом, чтобы она содержала локус неперегруппированной тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина и/или локус неперегруппированной легкой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина. В качестве альтернативы конструкции для вставки содержат локус неперегруппированной тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина и/или локус неперегруппированной легкой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина, участвующие в гомологичной рекомбинации в ES-клетке животного, отличного от человека, генетически модифицированной таким образом, чтобы она содержала нуклеотидные последовательности, кодирующие человеческий или гуманизированный МНС I, МНС II и/или β2-микроглобулин. В одном варианте осуществления конструкции для нацеливания на эндогенные последовательности МНС I, МНС II и/или β2-микроглобулина и замещения таковых последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими химерный человеческий/мышиный МНС I, МНС II и/или β2-микроглобулин; или конструкции для вставки одноцепочечного МНС 1/β2-микроглобулина и/или одноцепочечного белка МНС II участвуют в гомологичной рекомбинации в ES-клетке, которая также может содержать

(a) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область тяжелой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей; или

(vi) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) гибридную последовательность тяжелой цепи, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина;

и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую (гуманизированную) вариабельную область легкой цепи в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи, при этом ES-клетка необязательно дополнительно содержит

(i) локус человеческой (гуманизированной) тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий функциональный ген ADAM6; и/или

(ii) экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) для обеспечения повышенной вариативности антигенного рецептора.

[00150] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность(-и), кодирующая(-ие) химерные человеческие/отличные от человеческих полипептиды МНС I и МНС II, расположена(-ы) в эндогенном локусе МНС, отличного от человеческого (например, локусе мышиного Н-2K и/или Н-2Е). В одном варианте осуществления это приводит к помещению, например, замене, эндогенного(-ых) гена(-ов) МНС или его(их) части последовательностью(-ями) нуклеиновой кислоты, кодирующей(-ими) человеческие или гуманизированные полипептиды МНС I. Поскольку последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды МНС I, МНС II α и МНС II β, расположены близко друг к другу на хромосоме, для достижения наибольшего успеха в гуманизации как МНС I, так и МНС II у одного животного, если необходимо, на локусы МНС I и МНС II следует нацеливаться последовательно. Таким образом, также в данном документе представлены способы получения генетически модифицированного животного, отличного от человека, содержащего последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие химерные человеческие/отличные от человеческих полипептиды МНС I, МНС II α и МНС II β.

[00151] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления представлена нуклеотидная конструкция для получения генетически модифицированных животных, которые содержат химерный человеческий/отличный от человеческого МНС. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии, фрагмент ДНК человека, содержащий последовательности гена МНС человека (например, последовательности гена HLA-A2 или HLA-DR человека), и кассету для отбора, фланкированную сайтами рекомбинации. В одном варианте осуществления фрагмент ДНК человека представляет собой фрагмент генома, который содержит как интроны, так и экзоны гена МНС человека (например, гена HLA-A2 или HLA-DR2 человека). В одном варианте осуществления отличные от человеческих плечи гомологии гомологичны по отношению к локусу МНС, отличного от человеческого (например, локусу МНС I или МНС II).

[00152] В одном варианте осуществления отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии содержат геномную последовательность в 5'- и 3'-положениях, соответственно, эндогенного локуса гена отличного от человеческого (например, мышиного) МНС класса I или класса II (например, в 5' первой лидерной последовательности и 3' экзона α3 гена мышиного МНС I или выше гена мышиного Н-2АЫ и ниже гена мышиного Н-2Еа). В одном варианте осуществления эндогенный локус МНС класса I выбран из мышиных Н-2K, H-2D и H-2L. В конкретном варианте осуществления эндогенный локус МНС класса I представляет собой мышиный Н-2K. В одном варианте осуществления эндогенный локус МНС II выбран из мышиного Н-2Е и Н-2А. В одном варианте осуществления сконструированная конструкция МНС II обеспечивает возможность замены как гена мышиного Н-2Е, так и гена мышиного Н-2А. В одном варианте осуществления мышь не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды МНС из своего локуса H-2D. В некоторых вариантах осуществления мышь сконструирована с отсутствием всего или части эндогенного локуса H-2D. В другом варианте осуществления мышь не экспрессирует какие-либо функциональные эндогенные полипептиды МНС I и МНС II на клеточной поверхности. В одном варианте осуществления только МНС I и МНС II, экспрессируемые мышью на клеточной поверхности, являются химерными человеческими/мышиными МНС I и МНС II.

[00153] В настоящем изобретении также представлены способы получения генетически сконструированного животного, отличного от человека (например, генетически сконструированного грызуна, например, мыши или крысы), геном которого содержит локус β2-микроглобулина, кодирующий человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина. В одном варианте осуществления способы обеспечивают получение генетически сконструированного грызуна, например, мыши, геном которого содержит в эндогенном локусе β2-микроглобулина нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина. В некоторых случаях мышь не экспрессируют функциональный мышиный β2-микроглобулин из эндогенного локуса мышиного β2-микроглобулина.

[00154] Также представлена нуклеотидная конструкция, применяемая для получения генетически сконструированных животных, отличных от человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная конструкция может содержать отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии, фрагмент ДНК человека, содержащий человеческие последовательности β2-микроглобулина, и кассету для отбора, фланкированную сайтами рекомбинации. В одном варианте осуществления фрагмент ДНК человека представляет собой фрагмент генома, который содержит как интроны, так и экзоны человеческого гена β2-микроглобулина. В одном варианте осуществления отличные от человеческих плечи гомологии гомологичны по отношению к отличному от человеческого локусу β2-микроглобулина. Фрагмент генома может содержать экзоны 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина. В одном случае фрагмент генома содержит в направлении от 3'-конца к 3'-концу: экзон 2, интрон, экзон 3, интрон и экзон 4, при этом все из человеческой последовательности β2-микроглобулина. Кассета для отбора может быть расположена где-либо в конструкции за пределом кодирующей области β2-микроглобулина, например, она может быть расположена в направлении 3'-конца от экзона 4 человеческого β2-микроглобулина. Отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии могут содержать геномные последовательности в направлении 5'-конца и 3'-конца эндогенного отличного от человеческого гена β2-микроглобулина соответственно. В другом варианте осуществления отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии содержат геномную последовательность в направлении 5'-конца от экзона 2 и в направлении 3'-конца от экзона 4 эндогенного отличного от человеческого гена соответственно.

[00155] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу модификации локуса β2-микроглобулина животного, отличного от человека (например, грызуна, например, мыши или крысы), таким образом, чтобы он обеспечивал экспрессию человеческого или гуманизированного полипептида β2-микроглобулина. Один способ модификации локуса β2-микроглобулина животного, отличного от человека, например, мыши, таким образом, чтобы он обеспечивал экспрессию человеческого или гуманизированного полипептида β2-микроглобулина, включает замещение в эндогенном локусе β2-микроглобулина нуклеотидной последовательности, кодирующей мышиный β2-микроглобулин, нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина. В одном варианте осуществления такого способа животное, отличное от человека, например, мышь, не экспрессирует функциональный полипептид β2-микроглобулина из эндогенного локуса отличного от человеческого, например, мышиного, β2-микроглобулина. В некоторых конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина, содержит нуклеотидную последовательность, представленную в экзонах 2-4 человеческого гена β2-микроглобулина. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2-микроглобулина, содержит нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 человеческого гена β2-микроглобулина.

[00156] В настоящем изобретении также представлены способы получения генетически сконструированного животного, отличного от человека (например, генетически сконструированного грызуна, например, мыши или крысы), геном которого содержит в эктопическом локусе, например, локусе ROSA26, последовательность, кодирующую комплекс одноцепочечного β2-микроглобулина/МНС, содержащий человеческий (гуманизированный) β2-микроглобулин и человеческий (гуманизированный) α-полипептид МНС класса I, человеческий (гуманизированный) α-полипептид МНС класса I и/или человеческий (гуманизированный) β2-микроглобулин. В одном варианте осуществления способы обеспечивают получение генетически сконструированного грызуна, например, крысы или мыши, геном которого содержит в эндогенном локусе, который не является эндогенным локусом МНС I или β2-микроглобулина, например, в эндогенном локусе ROSA26, нуклеотидную последовательность, кодирующую комплекс одноцепочечного β2-микроглобулина/МНС, включающий комплекс человеческого (гуманизированного) β2-микроглобулина и человеческого (гуманизированного) МНС, человеческий (гуманизированный) α-полипептид МНС класса I и/или человеческий (гуманизированный) β2-микроглобулин. Способы нацеливания на локус ROSA хорошо известны из уровня техники. См., например, Stefano Casola, Mouse Models for miRNA expression: the ROSA26Locus, в Methods in Molecular Biology, том 667:145-163 (под ред. S. Monticelli, 2010), включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00157] Также представлена нуклеотидная конструкция, применяемая для получения генетически сконструированных животных, отличных от человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная конструкция может содержать отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии, нуклеотидную последовательность, кодирующую комплекс одноцепочечного β2-микроглобулина/МНС, содержащий человеческий (гуманизированный) β2-микроглобулин и человеческий (гуманизированный) α-полипептид МНС класса 1(например, комплекс одноцепочечного β2-микроглобулина/HLA-А2, представленный под SEQ ID NO: 23), и кассету для отбора, фланкированную сайтами рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная конструкция может содержать отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии, нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий (гуманизированный) α-полипептид МНС класса I, и кассету для отбора, фланкированную сайтами рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная конструкция может содержать отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии, нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий (гуманизированный) β2-микроглобулин, и кассету для отбора, фланкированную сайтами рекомбинации. Отличные от человеческих 5'- и 3'-плечи гомологии могут содержать геномную последовательность, фланкирующую эндогенный интрон ROSA26.

[00158] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное, отличное от человека (например, мышь), может содержать одну или две копии генов, кодирующих человеческий или гуманизированный МНС I; человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин; человеческий или гуманизированный МНС II (например, МНС IIα и/или МНС Iβ); и человеческие или гуманизированные тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, может быть гетерозиготным или гомозиготным по любому или всем из этих генов. Поскольку не ограничивающая цель модификации животного, отличного от человека, таким образом, чтобы оно содержало человеческий или гуманизированный МНС I, человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин; человеческий или гуманизированный МНС II (например, МНС IIα и/или МНС IIβ), заключается в подвергании индуцированию толерантности у животного, отличного от человека, к человеческой или гуманизированной молекуле МНС, при этом гомозиготность этого гена не требуется. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, может быть гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу МНС. Напротив, поскольку неограничивающая цель модификации локусов иммуноглобулина животного, отличного от человека, заключается в получении человеческих или гуманизированных антител против представляющего интерес антигенного комплекса рМНС, в некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, может быть гомозиготным по модифицированному локусу иммуноглобулина.

[00159] После завершения нацеливания на гены ES-клетки или генетически модифицированных животных, отличных от человека, подвергают скринингу для подтверждения успешных внедрения экзогенной представляющей интерес нуклеотидной последовательности или экспрессии экзогенного полипептида. Многочисленные методики известны специалистам в данной области техники и включают (без ограничения) саузерн-блоттинг, ПЦР длинных фрагментов, количественную ПЦР (например, ПЦР в режиме реального времени с применением TAQMAN®), флуоресцентную гибридизацию in situ, нозерн-блоттинг, проточную цитометрию, анализ с помощью вестерн-блоттинга, иммуноцитохимическое исследование, иммуногистохимическое исследование и т.д. В одном примере животные, отличные от человека (например, мыши), несущие представляющую интерес генетическую модификацию, могут быть идентифицированы путем скрининга в отношении утраты аллеля мыши и/или приобретения аллеля человека с применением модификации аллельного анализа, описанного в Valenzuela et al. (2003), выше. Специалистам в данной области техники известны другие анализы, с помощью которых идентифицируют конкретный нуклеотид или аминокислотную последовательность у генетически модифицированных животных.

Представляющие интерес антигенные комплексы пептид-МНС

[00160] Мыши, подвергнутые индуцированию толерантности в отношении белка МНС, описанного в данном документе, являются иммунизированными антигенным комплексом пептид-МНС для получения рМНС-специфических антигенсвязывающих белков. В некоторых вариантах осуществления МНС, применимые в качестве части антигенного комплекса пептид-МНС (рМНС), включают встречающиеся в природе полноразмерные МНС, а также отдельные цепи МНС (например, а (тяжелую) цепь МНС класса I, β2-микроглобулин, α-цепь МНС класса II и β-цепь МНС класса II), отдельные субъединицы таких цепей МНС (например, субъединицы α1-α3 α-цепи МНС класса I, субъединицы α1-α2 α-цепи МНС класса II, субъединицы β1-β2 β3-цепи МНС класса II), а также их фрагменты, мутанты и различные производные (в том числе слитые белки), при этом такие фрагменты, мутанты и производные сохраняют способность представлять антигенную детерминанту для распознавания антигенспецифическим TCR.

[00161] Встречающиеся в природе МНС кодируются кластером генов на человеческой хромосоме 6. МНС включают без ограничения специфичности HLA, такие как А (например, А1-А74), В (например, В 1-В77), С (например, C1-C11), D (например, D1-D26), DR (например, DR1-DR8), DQ (например, DQ1-DQ9) и DP (например, DP1-DP6). Специфичности HLA включают Al, А2, A3, Al 1, А23, А24, А28, А30, А33, В7, В8, В35, В44, В53, В60, В62, DR1, DR2, DR3, DR4, DR7, DR8 и DR 11.

[00162] Встречающиеся в природе молекулы МНС класса I связывают пептиды, полученные из протеолитически расщепленные белков, особенно эндогенно синтезированных белков, клеткой. Полученные таким образом небольшие пептиды транспортируются в эндоплазматический ретикулум, где они соединяются с образующимися молекулами МНС класса I перед тем, как пройти через аппарат Гольджи и быть представленными на клеточной поверхности для распознавания цитотоксическими Т-лимфоцитами.

[00163] Встречающиеся в природе молекулы МНС класса I состоят из a (тяжелой) цепи, соединенной с β2-микроглобулином. Тяжелая цепь состоит из субъединиц α1-α3. Белок β2-микроглобулина и субъединица α3 тяжелой цепи соединены. В определенных вариантах осуществления β2-микроглобулин и субъединица α3 соединены ковалентной связью. В определенных вариантах осуществления β2-микроглобулин и субъединица α3 соединены нековалентно. Субъединицы α1 и α2 тяжелой цепи сворачиваются с образованием полости для пептида, например, антигенной детерминанты, подлежащего представлению и распознаванию TCR.

[00164] Молекулы класса I, как правило, соединяются, например, связываются, с пептидами длиной приблизительно 8-9 аминокислот (например, 7-11 аминокислот). У всех людей есть от трех до шести различных молекул класса I, каждая из которых может связывать множество различных типов пептидов.

[00165] В некоторых вариантах осуществления комплекс рМНС включает (i) полипептид МНС класса I или его фрагмент, мутант или производное и необязательно (ii) полипептид β2-микроглобулина или его фрагмент, мутант или производное. В одном конкретном варианте осуществления полипептид МНС класса I соединен, например, связан, с полипептидом β2-микроглобулина с помощью пептидного линкера.

[00166] В одном конкретном варианте осуществления полипептид МНС класса I представляет собой человеческий полипептид МНС класса I, выбранный из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В другом конкретном варианте осуществления полипептид МНС класса I представляет собой мышиный полипептид МНС класса I, выбранный из группы, состоящей из Н-2K, H-2D, H-2L, H2-1A, H2-1B, H2-1J, H2-1E и H2-C.

[00167] В некоторых вариантах осуществления тяжелая α-цепь МНС класса I антигенного комплекса рМНС является полностью человеческой. В некоторых вариантах осуществления тяжелая α-цепь МНС класса I антигенного комплекса рМНС является гуманизированной. Гуманизированные тяжелые α-цепи МНС класса I описаны, например, в публикации патента США №№2013/0111617, 2013/0185819 и 2014/0245467. В некоторых вариантах осуществления тяжелая α-цепь МНС класса I содержит человеческий внеклеточный домен (человеческие домены α1, α2 и/или α3) и цитоплазматический домен другого вида. В некоторых вариантах осуществления полипептид тяжелой α-цепи класса I представляет собой HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K или HLA-L. В некоторых вариантах осуществления последовательность HLA-A может представлять собой последовательность HLA-А*0201. В различных вариантах осуществления пептид-МНС может включать все домены тяжелой цепи МНС класса I.

[00168] В некоторых вариантах осуществления антигенный комплекс рМНС содержит β2-микроглобулин. В некоторых вариантах осуществления β2-микроглобулин является полностью человеческим. В некоторых вариантах осуществления β2-микроглобулин является гуманизированным. Гуманизированные полипептиды β2-микроглобулина описаны, например, в публикации патентов США №№2013/0111617 и 2013/0185819, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00169] В некоторых вариантах осуществления молекула МНС класса I антигенного комплекса рМНС содержит мутацию в человеческом (гуманизированном) полипептиде β2-микроглобулина ((β2m или β2М) и в человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I, так что может образоваться дисульфидная связь между человеческим (гуманизированным) В2М и человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепью МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления дисульфидная связь связывает одну из следующих пар остатков: остаток 12 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 236 человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 12 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 237

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 8 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 234

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 10 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 235

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 24 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 236

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 28 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 232

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 98 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 192

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 99 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 234

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 3 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 120

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 31 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 96

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 53 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 35

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 60 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 96

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 60 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 122

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток 63 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток 27

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Arg3 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Gly 120

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток His31 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Gln96

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Asp53 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Arg3 5

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Trp60 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Gln96

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Trp60 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Asp 122

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Tyr63 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Tyr27

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Lys6 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Glu232

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Gln8 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Arg234

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Tyr 10 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Pro235

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Ser11 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Gln242

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Asn24 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Ala236

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Ser28 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Glu232

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Asp98 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток His 192

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I; остаток Met99 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Arg234

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I и/или остаток Arg 12 человеческого (гуманизированного) В2М, остаток Gly237

человеческой (гуманизированной) тяжелой α-цепи МНС класса I. См., например, публикацию патентной заявки WO/2015195531, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00170] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность антигенной детерминанты может представлять собой последовательность пептида, который может быть соединен с молекулой МНС класса I, например, может презентироваться ею. В определенных вариантах осуществления последовательность может содержать от 6 до 20 смежных аминокислот. В определенных вариантах осуществления последовательность пептида может представлять собой последовательность фрагмента белка, где белок получен, например, из части клеточного белка, такого как, например, белок, ассоциированный с аутоиммунным нарушением, и где пептид может быть связан с тяжелой цепью МНС класса I.

[00171] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь МНС и пептид соединены в виде слитого белка. В одном варианте осуществления МНС и пептид соединены с помощью линкерной последовательности. Например, одноцепочечная молекула может содержать от амино- до карбокси-конца антигенную детерминанту, последовательность β2-микроглобулина и последовательность а (тяжелой) цепи класса I. В качестве альтернативы, одноцепочечная молекула может содержать от амино- до карбокси-конца антигенную детерминанту, последовательность а (тяжелой) цепи класса I и последовательность β2-микроглобулина. Получение и применение комплексов рМНС в качестве одноцепочечных тримеров было описано ранее. См., например, патент США №8895020; патент США №8992937; Hansen et al. (2010) Trends Immunol. 31:363-69; Truscott et al. (2007) J. Immunol. 178:6280-89; Mitaksov et al. (2007) ChemBiol 14:909-22, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Комплекс одноцепочечного рМНС может дополнительно содержать последовательность сигнального пептида на амино-конце. В определенных вариантах осуществления между последовательностью пептида и последовательностью β2-микроглобулина может присутствовать линкерная последовательность. В определенных вариантах осуществления между последовательностью β2-микроглобулина и последовательностью а (тяжелой) цепи класса I может присутствовать линкерная последовательность. Одноцепочечная молекула может дополнительно содержать последовательность сигнального пептида на амино-конце, а также первую линкерную последовательность, простирающуюся между последовательностью пептида и последовательностью β2-микроглобулина, и/или вторую линкерную последовательность, простирающуюся между последовательностью β2-микроглобулина и последовательностью тяжелой цепи класса I.

[00172] В некоторых вариантах осуществления комплекс одноцепочечного рМНС может содержать первый гибкий линкер между сегментом пептидного лиганда и сегментом β2-микроглобулина. Например, линкеры могут выходить из карбокси-конца сегмента пептидного лиганда и соединять таковой с амино-концом сегмента β2-микроглобулина. В некоторых вариантах осуществления линкеры структурированы так, чтобы обеспечить возможность связанному пептидному лиганду сворачиваться в связывающую полость, что приводит к образованию функционального МНС-антигенного пептида. В некоторых вариантах осуществления этот линкер может содержать по меньшей мере 3 аминокислоты, вплоть до приблизительно 15 аминокислот (например, 20 аминокислот). В некоторых вариантах осуществления одноцепочечная молекула может содержать второй гибкий линкер, вставленный между β2-микроглобулином и сегментом тяжелой цепи МНС I. Например, линкеры могут выходить из карбокси-конца сегмента β2-микроглобулина и соединять таковой с амино-концом сегмента тяжелой цепи МНС I. В определенных вариантах осуществления β2-микроглобулин и тяжелая цепь МНС I могут сворачиваться в связывающую полость, что приводит к образованию молекулы, которая может функционировать с содействием в размножении Т-клеток.

[00173] Подходящие линкеры, применяемые в комплексах рМНС, могут характеризоваться любыми значениями подходящей длины, такими как от 1 аминокислоты (например, Gly) до 20 аминокислот, от 2 аминокислот до 15 аминокислот, от 3 аминокислот до 12 аминокислот, в том числе от 4 аминокислот до 10 аминокислот, от 5 аминокислот до 9 аминокислот, от 6 аминокислот до 8 аминокислот или от 7 аминокислот до 8 аминокислот и могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот. Иллюстративные линкеры включают полимеры глицина (G)n, полимеры глицин-серин (в том числе, например, (GS)n, (GSGGS) (SEQ ID NO: 1) и (GGGS) (SEQ ID NO: 2), где n представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере один), при этом полимеры глицин-аланин, полимеры аланин-серин и другие гибкие линкеры известны из уровня техники. Можно применять полимеры глицина и глицин-серина; как и Gly, так и Ser относительно не структурированы и поэтому могут служить в качестве нейтрального связывающего элемента между компонентами. Можно применять полимеры глицина; глицин охватывает значительно большее пространство phi-psi, чем даже аланин и гораздо меньше ограничен, чем остатки с более длинными боковыми цепями (см. Scheraga, Rev. Computational Chem. 1 1173-142 (1992), включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Иллюстративные линкеры могут содержать аминокислотные последовательности, в том числе без ограничения GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), GSSSG (SEQ ID NO: 8), GCGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GCGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGASGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) или GGGASGGGGS (SEQ ID NO: 14), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 15), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16), GCGGS (SEQ ID NO: 21) и т.п. В некоторых вариантах осуществления линкерный полипептид содержит остаток цистеина, который может образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим во втором полипептиде.

[00174] В определенных вариантах осуществления комплекс одноцепочечного рМНС может содержать пептид, ковалентно присоединенный к а (тяжелой) цепи МНС класса I посредством дисульфидного мостика (т.е. дисульфидной связи между двумя остатками цистеина). См., например, патенты США №№8992937 и 8895020, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В определенных вариантах осуществления дисульфидная связь предусматривает первый остаток цистеина, который располагается в линкере, выходящем из карбокси-конца антигенного пептида, и второй остаток цистеина, который располагается в тяжелой цепи МНС класса I (например, а (тяжелой) цепи МНС класса I, которая содержит сайт нековалентного связывания для антигенного пептида). В определенных вариантах осуществления второй остаток цистеина может представлять собой мутацию (добавление или замену) в а (тяжелой) цепи МНС класса I. В определенных вариантах осуществления одноцепочечная молекула может содержать одну непрерывную полипептидную цепь, а также дисульфидный мостик. В определенных вариантах осуществления одноцепочечная молекула может содержать две непрерывных полипептидных цепи, которые соединены через дисульфидный мостик в качестве единственной ковалентной связи. В некоторых вариантах осуществления связывающие последовательности могут содержать по меньшей мере одну аминокислоту в дополнение к остатку цистеина, в том числе один или более остатков глицина, один или более остатков аланина и/или один или более остатков серина. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечная молекула содержит от N-конца до С-конца пептид МНС класса I (например, антигенный пептид), первый линкер, который содержит первый остаток цистеина, человеческую (гуманизированную) последовательность β2-микроглобулина, второй линкер и человеческую (гуманизированную) последовательность тяжелой цепи МНС класса I, содержащую второй остаток цистеина, при этом первый остаток цистеина и второй остаток цистеина предусматривают дисульфидный мостик. В некоторых вариантах осуществления второй остаток цистеина представляет собой замену аминокислоты человеческой (гуманизированной) тяжелой цепи МНС класса I, выбранной из группы, состоящей из Т80С, Y84C и N86C (Y84C относится к мутации в положении 108 в зрелом белке, при этом зрелый белок не содержит сигнальной последовательности. В качестве альтернативы, если белок все еще содержит 24 мерную сигнальную последовательность, положение вместо этого обозначается как Y108C).

[00175] В определенных вариантах осуществления дисульфидный мостик может связывать антигенный пептид в полости класса I комплекса рМНС, если комплекс рМНС содержит первый остаток цистеина в линкере Gly-Ser, простирающемся между С-концом пептида и β2-микроглобулином, и второй остаток цистеина в проксимальном положении тяжелой цепи.

[00176] В некоторых вариантах осуществления последовательность β2-микроглобулина может содержать полноразмерную (человеческую или отличную от человеческой) последовательность β2-микроглобулина. В определенных вариантах осуществления в последовательности β2-микроглобулина отсутствует лидерная последовательность пептида. По сути, последовательность β2-микроглобулина может содержать приблизительно 99 аминокислот и может представлять собой человеческую последовательность β2-микроглобулина (Genebank AF072097.1).

[00177] В некоторых вариантах осуществления комплекс рМНС содержит человеческую молекулу HLA класса I, слитую с человеческим β2-микроглобулином. В некоторых вариантах осуществления человеческая молекула HLA класса I, слитая с человеческим β2-микроглобулином, содержит один или более линкеров, например, линкер, связывающий молекулу HLA и β2-микроглобулин, и/или линкер, связывающий пептид с человеческой молекулой HLA класса I, слитой с человеческим β2-микроглобулином. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, которая кодирует комплекс рМНС, может содержать последовательность, кодирующую человеческий HLA и β2-микроглобулин. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, которая кодирует комплекс рМНС, может содержать последовательность, кодирующую человеческий HLA и β2-микроглобулин, и один или более линкеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, которая кодирует комплекс рМНС, может содержать последовательность, которая кодирует человеческий HLA и β2-микроглобулин, и последовательность, кодирующую метку (например, зеленый флуоресцентный белок) или маркер (например, c-myc, гистидиновый маркер и т.д.). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, которая кодирует комплекс рМНС, может содержать последовательность, которая кодирует человеческий HLA и β2-микроглобулин, последовательность, кодирующую линкер, и последовательность, кодирующую метку или маркер. Неограничивающие примеры нуклеотидной последовательности, кодирующей иллюстративный человеческий HLA и β2-микроглобулин, и один или более линкеров, представлены под SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19. Аминокислотные последовательности, кодируемые ими, соответственно представлены под SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20.

[00178] Представляющий интерес пептид может быть присоединен к N-концевой линкерной последовательности GCGGS (SEQ ID NO: 21) под SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, где остаток цистеина линкера образует дисульфидный мостик с аминокислотой Y108C человеческого полипептида HLA-A2. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, иммунизируют и/или стимулируют комплексом рМНС, содержащим аминокислотную последовательность, включающую последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18, или последовательность, представленную под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, иммунизируют с помощью ДНК, кодирующей комплекс рМНС, содержащий аминокислотную последовательность, включающую последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.

[00179] В некоторых вариантах осуществления эпитоп хелперной Т-клетки, например, PADRE, может быть связан с С-концом комплекса одноцепочечного рМНС. См., например, патент США №6413935 и Alexander J. et al. (1994) Immunity 1:751-61, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления PADRE непосредственно связан с С-концом комплекса одноцепочечного рМНС. В вариантах осуществления PADRE связан с С-концом комплекса одноцепочечного рМНС посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления протокол иммунизации, описанный в данном документе, предусматривает введение животному, отличному от человека, комплекса одноцепочечного рМНС, связанного на С-конце с PADRE. В некоторых вариантах осуществления комплекс одноцепочечного рМНС, связанный на С-конце с PADRE, содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 25.

[00180] В некоторых вариантах осуществления комплекс рМНС может быть таким, как раскрытый в патентах США №№447882; 6011146; 8895020; 8992937; WO 96/04314; Mottez et al. J. Exp. Med. 181: 493-502, 1995; Madden et al. Cell 70: 1035-1048, 1992; Matsumura et al., Science 257: 927-934, 1992; Mage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10658 10662, 1992; Toshitani et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. 93: 236 240, 1996; Chung et al, J. Immunol. 163:3699-3708, 1999; Uger and Barber, J. Immunol. 160: 1598-1605, 1998; Uger et al., J. Immunol. 162, ст.6024-6028, 1999; White et al., J. Immunol. 162: 2671-2676, 1999, при этом каждая из публикаций включена посредством ссылки во всей своей полноте.

[00181] В некоторых вариантах осуществления комплекс рМНС содержит полипептид МНС класса II или его фрагмент, мутант или производное. В одном конкретном варианте осуществления МНС содержит полипептиды аир молекулы МНС класса II или их фрагмент, мутант или производное. В одном конкретном варианте осуществления α- и β-полипептиды связаны пептидным линкером. В одном конкретном варианте осуществления МНС содержит α и β-полипептиды человеческой молекулы МНС класса II, выбранной из группы, состоящей из HLA-DP, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DM и HLA-DO.

[00182] Молекулы МНС класса II, как правило, состоят из двух полипептидных α- и β-цепей. Цепи могут происходить из групп генов DP, DQ или DR. Известно около 40 различных человеческих молекул МНС класса II. Все они имеют одинаковую базовую структуру, но слегка различаются по своей молекулярной структуре. Молекулы МНС класса II связывают пептиды длиной 13-18 аминокислот.

[00183] В некоторых вариантах осуществления антигенный комплекс рМНС содержит одну или более α-цепей МНС класса II. В некоторых вариантах осуществления α-цепь МНС класса II является полностью человеческой. В некоторых вариантах осуществления α-цепь МНС класса II является гуманизированной. Гуманизированные α-цепи МНС класса I описаны, например, в патентах США №№8847005 и 9043996, и в публикации патента США №2014/0245467. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный полипептид α-цепи МНС класса II содержит человеческий внеклеточный домен и цитоплазматический домен другого вида. В некоторых вариантах осуществления α-цепь класса II представляет собой HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA или HLA-DRA. В некоторых вариантах осуществления полипептид α-цепи класса II представляет собой гуманизированный HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA и/или HLA-DRA.

[00184] В некоторых вариантах осуществления вирусная частица содержит одну или более β-цепей МНС класса II. В некоторых вариантах осуществления β-цепь МНС класса II является полностью человеческой. В некоторых вариантах осуществления полипептид β-цепи МНС класса II является гуманизированным. Гуманизированные полипептиды β-цепи МНС класса II описаны, например, в патентах США №№8847005 и 9043996, и в публикации патента США №2014/0245467. В некоторых вариантах осуществления гуманизированная β-цепь МНС класса II содержит человеческий внеклеточный домен и цитоплазматический домен другого вида. В некоторых вариантах осуществления β-цепь класса II представляет собой HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB или HLA-DRB. В некоторых вариантах осуществления β-цепь класса II представляет собой гуманизированный HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB и/или HLA-DRB.

[00185] В некоторых вариантах осуществления антигенная детерминанта, например пептид, содержащаяся в антигенном комплексе рМНС, может предусматривать любой пептид, который способен связываться с белком МНС за счет чего комплекс рМНС может связываться с TCR, например, специфическим образом.

[00186] Примеры включают пептиды, полученные путем гидролиза, и, как правило, синтетически полученные пептиды, включая рандомно полученные пептиды, специально сконструированные пептиды и пептиды, в которых по меньшей мере некоторые положения аминокислот являются консервативными среди нескольких пептидов, а остальные положения являются рандомными.

[00187] В природе пептиды, полученные путем гидролиза, подвергаются гидролизу до связывания антигена с белком МНС. МНС класса I обычно представляют собой пептиды, полученные из белков, активно синтезируемых в цитоплазме клетки. Напротив, МНС класса II обычно представляют собой пептиды, полученные либо из экзогенных белков, которые входят в эндоцитозный путь клетки, либо из белков, синтезируемых в ER. Внутриклеточный транспорт обеспечивает пептиду возможность соединяться с белком МНС.

[00188] Связывание пептида с пептидсвязывающей полостью МНС может контролировать пространственное расположение МНС и/или аминокислотных остатков пептида, распознаваемых TCR, или с рМНС-связывающим белком, продуцируемым генетически модифицированным животным, раскрытым в данном документе. Такой пространственный контроль частично обусловлен водородными связями, образованными между пептидом и белком МНС. На основе информации о том, как пептиды связываются с различными МНС, можно определить основные якорные аминокислоты МНС и аминокислоты, экспонируемые на поверхности, которые отличаются у разных пептидов. В некоторых вариантах осуществления длина МНС-связывающего пептида составляет от 5 до 40 аминокислотных остатков, например, от 6 до 30 аминокислотных остатков, например, от 8 до 20 аминокислотных остатков, например, от 9 до 11 аминокислотных остатков, включая пептид любого размера от 5 до 40 аминокислот в длину, с шагом целых чисел (т.е. 5, 6, 7, 8, 9…40). Хотя в естественных условиях пептиды, связанные с МНС класса II, варьируют от приблизительно 9 до 40 аминокислот, почти во всех случаях пептид может быть усечен до ядра из 9-11 аминокислот без потери активности связывания МНС или распознавания Т-клетками.

[00189] Пептиды включают пептиды, содержащие по меньшей мере часть, например, антигенную детерминанту, белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого собственного белка, ассоциированного с аутоиммунным нарушением, белков возбудителей инфекции (например, бактериальных, вирусных или паразитарных организмов), аллергенов и белков, ассоциированных с опухолью. В одном варианте осуществления комплекс рМНС содержит антигенную детерминанту человеческого собственного белка, ассоциированного с аутоиммунными нарушениями. В другом варианте осуществления комплекс рМНС содержит антигенную детерминанту аллергена. В другом варианте осуществления комплекс рМНС содержит антигенную детерминанту бактерии. В другом варианте осуществления комплекс рМНС содержит антигенную детерминанту вируса. В другом варианте осуществления комплекс рМНС содержит антигенную детерминанту паразита.

[00190] Присоединение пептида к молекуле МНС класса I или МНС класса II через гибкий линкер имеет преимущество, заключающееся в гарантии того, что пептид будет занимать МНС и оставаться соединенным с ним во время биосинтеза, транспорта и представления. В качестве альтернативного подхода, в некоторых вариантах осуществления МНС и пептид экспрессируются отдельно.

Антигенсвязывающие белки, которые специфически связывают представляющий интерес антигенный комплекс рМНС, конструкции на основе нуклеиновой кислоты, клетки и способы их получения

[00191] В одном варианте осуществления представлены нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен антигенсвязывающего домена, который специфически связывает антигенный комплекс рМНС, и клетка, экспрессирующая нуклеиновую кислоту.

[00192] В одном варианте осуществления представлено применение последовательности нуклеиновой кислоты от животного, отличного от человека, для создания линии клеток для производства терапевтического средства для человека. В одном варианте осуществления терапевтическое средство для человека представляет собой связывающий белок, содержащий человеческий антиген связывающий домен и человеческую Fc-область.

[00193] В одном варианте осуществления представлена система экспрессии, содержащая клетку-хозяина млекопитающего, содержащую нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, который содержит соматически мутантный человеческий вариабельный домен тяжелой цепи, слитый с человеческой областью C_H, и/или нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, который содержит соматически мутантный человеческий вариабельный домен легкой цепи, слитый с человеческой областью C_L, где домены V_H и V_L являются когнатными.

[00194] В одном варианте осуществления подходящая клетка-хозяин выбрана из В-клетки, гибрид омы, квадромы, клетки СНО, клетки COS, клетки 293, клетки HeLa и клетки сетчатки человека, экспрессирующей вирусную последовательность нуклеиновой кислоты (например, клетки PERC.6™ (Creative Biolabs)).

[00195] В одном варианте осуществления представлен способ получения связывающего белка, выделения клетки или нуклеиновой кислоты из животного, отличного от человека, раскрытого в данном документе, где клетка или нуклеиновая кислота содержит или кодирует антигенсвязывающий белок, который специфически связывает представляющий интерес комплекс рМНС. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает и клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую последовательность вариабельной области тяжелой или легкой цепи (которая может кодировать модифицированный гистидином человеческий вариабельный домен тяжелой цепи и/или модифицированный гистидином человеческий вариабельный домен легкой цепи, который может также или независимо быть универсальным вариабельным доменом легкой цепи) в рамке с геном, кодирующим человеческую область C_H или C_L, область, с образованием человеческой последовательности связывающего белка, и экспрессию человеческой последовательности связывающего белка в подходящей клетке.

[00196] В одном варианте осуществления животное, отличное от человека, было иммунизировано представляющим интерес комплексом рМНС, и человеческий антигенсвязывающий домен специфически связывает (например, K_D в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне) эпитоп представляющего интерес комплекса рМНС. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая домены V_H и/или V_L, является соматически мутантной у животного, отличного от человека.

[00197] В одном варианте осуществления представлен способ получения антиген связывающего белка, который связывает представляющий интерес комплекс рМНС, при этом способ включает

(1) иммунизирование животного, отличного от человека, представляющим интерес комплексом рМНС, при этом животное, отличное от человека, содержит в своем геноме

(а) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую (гуманизированную) молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, и

(ii) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, так что животное, отличное от человека, способно обеспечивать человеческие или гуманизированные антигенсвязывающие белки, содержащие человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий домен, например, человеческие или гуманизированные вариабельные домены,

где необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным;

(2) обеспечение формирования у животного, отличного от человека, иммунного ответа к представляющему интерес комплексу рМНС или представляющему интерес комплексу рМНС, связанному с носителем;

(3) выделение клетки (например, лимфоцита) из иммунизированного животного, отличного от человека, при этом клетка содержит первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты вариабельной области иммуноглобулина, которые кодируют человеческие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (каждая из которых независимо может быть модифицирована гистидином, и вариабельный домен легкой цепи которых может быть вариабельным доменом общей легкой цепи), которые образуют антигенсвязывающий домен, специфически связывающий представляющий интерес комплекс рМНС;

(4) идентифицирование последовательностей нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, которые кодируют вариабельные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, которые при спаривании специфически связывают представляющий интерес комплекс рМНС или представляющий интерес комплекс рМНС, связанный с носителем; и,

(5) обеспечение экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты из (d) в системе экспрессии, подходящей для экспрессии антигенсвязывающего белка, с образованием антигенсвязывающего белка, содержащего димер вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, которые связывают представляющий интерес комплекс рМНС.

[00198] В некоторых вариантах осуществления представлен способ получения антигенсвязывающего белка, который связывает представляющий интерес комплекс рМНС, при этом способ включает

(1) иммунизирование животного, отличного от человека, представляющим интерес комплексом рМНС, при этом животное, отличное от человека, содержит в своем геноме (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую (гуманизированную) молекулу МНС или по меньшей мере ее пептидсвязывающую часть, и

(ii) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, так что животное, отличное от человека, способно обеспечивать человеческие или гуманизированные антигенсвязывающие белки, содержащие человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий домен, например, человеческие или гуманизированные вариабельные домены,

где необязательно по меньшей мере один из (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным;

(2) получение человеческой (гуманизированной) последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческой (гуманизированной) последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, которая кодирует человеческий (гуманизированный) вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческий (гуманизированный) вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, соответственно, антитела, которое специфически связывает представляющий интерес рМНС,

(с) применение человеческой (гуманизированной) последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческой (гуманизированной) последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина для получения антитела, которое связывает рМНС.

[00199] В некоторых вариантах осуществления клетки (такие как В-клетки) извлекают из животного, отличного от человека (например, из селезенки или лимфатических узлов). Клетки могут быть слиты с линией клеток миеломы с получением иммортализированных линий клеток гибридомы, и такие линии клеток гибридомы подвергают скринингу и отбирают для идентификации линий клеток гибридомы, которые продуцируют антитела, содержащие гибридные тяжелые цепи, специфические к антигену, применяемому для иммунизации.

[00200] В одном варианте осуществления иммунизация включает примирование (например, путем введения) животного, отличного от человека, представляющим интерес комплексом рМНС с обеспечением отдыха животного, отличного от человека, в течение периода времени, и повторную иммунизацию (например, стимулирование иммунного ответа) животного, отличного от человека, представляющим интерес комплексом рМНС. В некоторых вариантах осуществления способы включают иммунизацию и/или стимулирование животного, отличного от человека, одновременно эпитопом хелперной Т-клетки, например, пан-DR Т-хелперным эпитопом (PADRE). См., например, патент США №6413935 и Alexander J. et al. (1994) Immunity 1:751-61, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления способ включает примирование животного, отличного от человека, представляющим интерес комплексом рМНС и стимулирование иммунизированного животного представляющим интерес комплексом рМНС, связанным с эпитопом хелперной Т-клетки, например, PADRE. В некоторых вариантах осуществления способ включает как примирование, так и стимулирование животного, отличного от человека, представляющим интерес комплексом рМНС, связанным с эпитопом хелперной Т-клетки. В вариантах осуществления, предусматривающих примирование и/или стимулирование с помощью PADRE, животное, отличное от человека, представляет собой мышь, которая содержит генетический фон С57/В16, например, представляет собой мышь линии C57BL, выбранной из С57ВЕ/А, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10C и C57BL/Ola, или представляет собой смесь вышеупомянутой линии C57BL/6 и другой линии, например, 129, BALB и т.д. В некоторых вариантах осуществления период времени между примированием животного, отличного от человека, и стимулированием животного, отличного от человека, составляет несколько дней, по меньшей мере неделю, по меньшей мере две недели, по меньшей мере три недели, по меньшей мере четыре недели или по меньшей мере один месяц.

[00201] В одном варианте осуществления представлена вариабельная область иммуноглобулина (VR) (например, содержащая перегруппированную человеческую последовательность гена v_h/d_h/j_h или перегруппированную человеческую последовательность гена v_l/j_l, которая соответственно и независимо может представлять собой модифицированную гистидином перегруппированную человеческую последовательность гена v_h/d_h/j_h или перегруппированную человеческую последовательность гена v_l/j_l, последняя из которых также независимо может представлять собой общую перегруппированную человеческую последовательность гена v_l/j_l), полученная в животном, отличном от человека. В одном варианте осуществления перегруппированная последовательность гена v_h/d_h-/j_h слита с одной или более человеческими последовательностями константной области тяжелой цепи (например, выбранными из человеческого или мышиного C_H1, шарнира, C_H2, C_H3 и их комбинации), или перегруппированная последовательность гена v_l/j_l слита с человеческой последовательностью константной области легкой цепи. Также в данном документе представлена аминокислотная последовательность вариабельного домена иммуноглобулина связывающего белка, полученного в животном, отличном от человека, по вариантам осуществления настоящего изобретения и/или кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, выделенной из него.

[00202] В одном варианте осуществления представлен связывающий белок или его антиген связывающий фрагмент (например. Fab, F(ab)₂, scFv), полученный в животном, отличном от человека, по вариантам осуществления настоящего изобретения или полученный из последовательности, полученной в мыши по вариантам осуществления настоящего изобретения.

Биспецифические связывающие белки

[00203] Представлены подобные иммуноглобулину связывающие белки, содержащие человеческие вариабельные домены, которые специфически связывают представляющий интерес комплекс рМНС. Также представлены клетки, экспрессирующие такие связывающие белки, мыши, которые их продуцируют, и родственные способы и композиции.

[00204] В определенном варианте осуществления связывающие белки и кодирующие их нуклеотидные последовательности можно применять для получения полиспецифических связывающих белков, например, биспецифических связывающих белков. В этом варианте осуществления первый полипептид, содержащий первый вариабельный домен тяжелой цепи, может соединяться со вторым полипептидом, содержащим второй вариабельный домен тяжелой цепи. Если первый вариабельный домен тяжелой цепи и второй вариабельный домен тяжелой цепи специфически связывают отличающийся эпитоп, то биспецифическая связывающая молекула может быть получена с применением двух вариабельных доменов тяжелой цепи. Область C_H может быть такой же или отличающейся. В одном варианте осуществления например, одна из областей C_H может быть модифицирована с элиминированием связывающей 6 елок А детерминанты, тогда как другая константная область тяжелой цепи не модифицирована таким образом (см. патент США №8586713 В2, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Это конкретное расположение упрощает выделение биспецифического связывающего белка, например, из смеси гомодимеров (например, гомодимеров первого или второго полипептидов). В некоторых вариантах осуществления биспецифический рМНС-связывающий белок может быть гетеродимерным по отношению к связыванию с белком А и может содержать

а. первый полипептид, содержащий от N-конца до С-конца первую эпитоп-связывающую область, которая селективно связывает первый эпитоп, константную область иммуноглобулина, которая включает первую область СН3 человеческого IgG, выбранного из IgG1, IgG2 и IgG4, где первая область СН3 связывается с белком А; и

b. второй полипептид, содержащий от N-конца до С-конца вторую эпитоп-связывающую область, которая селективно связывает второй эпитоп, константную область иммуноглобулина, которая включает вторую область СН3 человеческого IgG, выбранного из IgG1, IgG2 и IgG4, где вторая область СН3 содержит модификацию, которая снижает или элиминирует связывание второй области СН3 с белком А. В некоторых вариантах осуществления модификация выбрана из группы, состоящей из (a) 95R и (b) 95R и 96F в системе нумерации экзонов IMGT, или (a') 435R и (b') 435R и 436F в системе нумерации ЕС. В некоторых вариантах осуществления вторая область СН3 дополнительно содержит от одной до пяти модификаций, выбранных из группы, состоящей из 16Е, 18М, 44S, 52N, 57М и 82I в системе нумерации экзонов IMGT, или 356Е, 358М, 384S, 392N, 397М и 422I в системе нумерации ЕС.

[00205] В одном варианте осуществления способы и композиции применяют для получения биспецифических связывающих белков. В этом варианте осуществления каждый из первого v_h, который сливается с областью С_н, и второго v_h, который сливается с областью С_н, независимо клонируют в рамке с человеческой последовательностью IgG того же изотипа (например, с человеческим IgG1, IgG2 или IgG4). Первый v_h специфически связывает первый комплекс рМНС, а второй v_h специфически связывает второй комплекс рМНС. Первый и второй эпитопы могут быть в разных рМНС или в одном и том же комплексе рМНС.

[00206] В одном варианте осуществления изотип IgG области С_н, слитой с первым v_h, и изотип IgG области С_н, слитой со вторым v_h, являются одним и тем же изотипом, но отличаются тем, что один изотип IgG содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна аминокислотная замена делает тяжелую цепь, несущую замену, неспособной или по сути неспособной связывать белок А по сравнению с тяжелой цепью, в которой замена отсутствует.

[00207] В одном варианте осуществления первая область C_H содержит первый домен С_н3 человеческого IgG, выбранного из IgG1, IgG2 и IgG4; а вторая область C_H содержит второй домен С_н3 человеческого IgG, выбранного из IgG1, IgG2 и IgG4, при этом второй домен С_н3 содержит модификацию, которая снижает или элиминирует связывание второго домена С_н3 с белком А (см. патент США №8586713 В2, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

[00208] В одном варианте осуществления второй домен С_н3 содержит модификацию 435R, пронумерованную в соответствии с системой нумерации ЕС. В другом варианте осуществления второй домен С_н3 дополнительно содержит модификацию 436F, пронумерованную в соответствии с системой нумерации ЕС.

[00209] В одном варианте осуществления второй домен С_н3 представляет собой домен человеческого IgG1, который содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I, пронумерованных в соответствии с системой нумерации ЕС.

[00210] В одном варианте осуществления второй домен С_н3 представляет собой домен человеческого IgG2, который содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из N384S, K392N и V422I, пронумерованных в соответствии с системой нумерации ЕС.

[00211] В одном варианте осуществления второй С_н3 представляет собой домен человеческого IgG4, содержащий модификацию, выбранную из группы, состоящей из Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I, пронумерованных в соответствии с системой нумерации ЕС.

[00212] В одном варианте осуществления связывающий белок содержит области С_н, имеющие одну или более модификаций, как указано в данном документе, при этом константная область связывающего белка является неиммуногенной или по сути неиммуногенной для человека. В конкретном варианте осуществления области C_H содержат аминокислотные последовательности, которые не представляют иммуногенный эпитоп у человека. В другом конкретном варианте осуществления связывающий белок содержит область С_н, которая не обнаруживается в человеческой тяжелой цепи дикого типа, и область C_H не содержит последовательности, которая обеспечивает получение Т-клеточного эпитопа.

[00213] В одном варианте осуществления Fc-домены могут быть модифицированы для изменения связывания с Fc-рецептором, что, в свою очередь, влияет на эффекторную функцию. Сконструированная константная область тяжелой цепи (С_н), которая включает Fc-домен, является химерной. Как таковая химерная область C_H объединяет домены С_н, полученные из более чем одного изотипа иммуноглобулина. Например, химерная область C_H содержит часть или весь домен С_н2, домен, полученный из молекулы человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4, в комбинации с частью или всем доменом С_н3, полученным из молекулы человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. Химерная область C_H также может содержать химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать «верхнюю шарнирную» аминокислотную последовательность (аминокислотные остатки положений 216-227 согласно нумерации EU), полученную из шарнирного участка человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4, в комбинации с «нижней шарнирной» последовательностью (аминокислотные остатки положений 228-236 согласно нумерации EU), полученной из шарнирного участка человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. В одном варианте осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхней шарнирной последовательности человеческого IgG1 или человеческого IgG4, и аминокислотные остатки, полученные из нижней шарнирной последовательности человеческого IgG2.

[00214] Для некоторых терапевтических средств Fc-домен можно сконструировать для активации всех, некоторых или ни одной из эффекторных функций нормального Fc без влияния на необходимые фармакокинетические свойства Fc-содержащего белка (например, антитела). Примеры белков, содержащих химерные области СН и обладающих измененными эффекторными функциями, см. в патенте США №9359437, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок содержит рекомбинантный полипептид, содержащий константную (СН) область тяжелой цепи, содержащую от N-конца до С-конца домен СН1, химерный шарнир, домен СН2 и домен СН3, при этом (а) домен СН1 содержит аминокислотную последовательность DKKV или DKRV от положения 212 до 215 (нумерация EU), (b) химерный шарнир содержит аминокислотную последовательность верхнего шарнира человеческого IgG1 или человеческого IgG4 от положения 216 до 227 (нумерация EU) и аминокислотную последовательность нижнего шарнира человеческого IgG2 PCPAPPVA (SEQ ID NO: 29) от положения 228 до 236 (нумерация EU), (с) домен СН2 содержит аминокислотную последовательность домена СН2 человеческий IgG4 от положений 237 до 340 (нумерация EU), включающую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, и (d) домен СН3 содержит последовательность домена СН3 человеческого IgG1 или человеческого IgG4 от положения 341 до 447 (нумерация EU)

[00215] В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело может иметь первый v_h и второй v_h, каждый из которых имеет общую легкую цепь, как когнатный ему домен v_l.

Нарушение толерантности к эндогенным пептидам

[00216] Иммунизация животных, отличных от человека (например, грызунов, таких как мыши или крысы) антигенным рМНС для получения специфических рМНС-связывающих белков зависит от дивергенции в последовательности между эндогенными белками у животного, отличного от человека, и презентируемым гетерологичным белком, чтобы иммунная система животного, отличного от человека, могла распознать представляющий интерес комплекс рМНС как отличный от собственного (т.е. чужеродный). Создание антител против рМНС, имеющих высокую степень гомологии с собственным рМНС, может быть сложной задачей из-за иммунологической толерантности к собственному рМНС. Способы нарушения толерантности к аутопептидам, которые гомологичны представляющему интерес пептиду, хорошо известны специалисту в данной области техники, см., например, публикацию патентного документа США №20170332610, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления способ нарушения толерантности к эндогенным пептидам включает модификацию животного, отличного от человека, согласно настоящему документу таким образом, чтобы оно содержало делеции, например, нокаут-мутации, аутопептида, который имеет высокую степень гомологии с представляющим интерес пептидом.

Фармацевтические композиции

[00217] В определенных вариантах осуществления в данном документе представлена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один рМНС-связывающий белок, составленный вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

[00218] Фармацевтические композиции, представленные в данном документе, могут быть специально составлены для введения в твердой или жидкой форме, включая те, которые адаптированы для следующего: (1) пероральное введение, например, жидкие лекарственные формы (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например предназначенные для буккального, сублингвального и системного всасывания, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык; или (2) парентеральное введение, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции в виде, например, стерильного раствора, или суспензии, или состава с замедленным высвобождением.

[00219] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, представленные в данном документе, подходящие для парентерального введения, содержат одно или несколько терапевтических средств по определенным вариантам осуществления настоящего изобретения в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые могут быть восстановлены в стерильные растворы или дисперсии для инъекций непосредственно перед применением, которые могут содержать сахара, спирты, антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства, растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента, или суспендирующие средства, или загустители.

[00220] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях, представленных в данном документе, включают воду, этанол, многоатомные спирты (такие как без ограничения глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения материалов покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.

[00221] В определенных вариантах осуществления композиции содержат рМНС-связывающий белок в концентрации, приводящей к получению соотношения масса/объем, подходящего для необходимой дозы. рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 20 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 35 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 45 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 55 мг/мл, по меньшей мере 60 мг/мл, по меньшей мере 65 мг/мл, по меньшей мере 70 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, по меньшей мере 80 мг/мл, по меньшей мере 85 мг/мл, по меньшей мере 90 мг/мл, по меньшей мере 95 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 105 мг/мл, по меньшей мере 110 мг/мл, по меньшей мере 115 мг/мл, по меньшей мере 120 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл, по меньшей мере 130 мг/мл, по меньшей мере 135 мг/мл, по меньшей мере 140 мг/мл, по меньшей мере 150 мг/мл, по меньшей мере 200 мг/мл, по меньшей мере 250 мг/мл или по меньшей мере 300 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 1 мг/мл до 300 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 5 мг/мл до 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 10 мг/мл до 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 15 мг/мл до 150 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 20 мг/мл до 140 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 25 мг/мл до 135 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 30 мг/мл до 130 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 35 мг/мл до 125 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 40 мг/мл до 120 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 45 мг/мл до 115 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления рМНС-связывающий белок может присутствовать в композиции при концентрации от 50 мг/мл до 110 мг/мл.

[00222] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит одно или несколько активных соединений, необходимых для конкретного показания, подлежащего лечению, как правило, с неконкурирующими активностями, которые не влияют отрицательно друг на друга. Такие дополнительные активные соединения обычно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.

В некоторых вариантах осуществления композиции получают путем смешивания рМНС-связывающего белка с необязательными физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами, включая без ограничения буферные вещества, сахариды, соли, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, многоатомные спирты, разбавители, связующие, стабилизаторы, соли, липофильные растворители, аминокислоты, хелаторы, консерванты и т.п. (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12^th edition, L. Brunton, et al. и Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов с необходимой конечной концентрацией. Приемлемые носители, или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как буферы на основе гистидина, фосфата, цитрата, глицина, ацетата и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептид с низкой молекулярной массой (менее 10-15 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая трегалозу, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полисорбат 80, PLURONICS® или полиэтиленгликоль (PEG).

[00223] В некоторых вариантах осуществления буферное вещество представляет собой гистидин, цитрат, фосфат, глицин или ацетат. Вспомогательное вещество, представляющее собой сахарид, может представлять собой трегалозу, сахарозу, маннит, мальтозу или рафинозу. Поверхностно-активное вещество может представлять собой полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 80 или Pluronic F68. Соль может представлять собой NaCl, KCl, MgCl₂ или CaCl₂.

[00224] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит буферное вещество или регулирующее рН средство для обеспечения улучшенного контроля рН. Такая композиция может характеризоваться значением рН, составляющим от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5, от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0 или от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5. В дополнительном варианте осуществления такая композиция характеризуется значением рН, составляющим приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9, приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4, приблизительно 6,5, приблизительно 6,6, приблизительно 6,7, приблизительно 6,8, приблизительно 6,9, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5 или приблизительно 9,0. В конкретном варианте осуществления композиция характеризуется значением рН, составляющим приблизительно 6,0.

[00225] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит буферное вещество или регулирующее рН средство для обеспечения улучшенного контроля рН. Такая композиция может характеризоваться значением рН, составляющим от 3,0 до 9,0, от 4,0 до 8,0, от 5,0 до 8,0, от 5,0 до 7,0, от 5,0 до 6,5, от 5,5 до 8,0, от 5,5 до 7,0 или от 5,5 до 6,5. В дополнительном варианте осуществления такая композиция характеризуется значением рН, составляющим 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 или 9,0. В конкретном варианте осуществления композиция характеризуется значением рН, составляющим 6,0.

[00226] Специалист в данной области понимает, что значение рН композиции обычно не должно быть равным изоэлектрической точке конкретного рМНС-связывающего белка, подлежащего использованию в композиции. Обычно буферное вещество представляет собой соль, полученную из органической или неорганической кислоты или основания. Типичные буферные вещества включают без ограничения соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; Tris, гидрохлорид трометамина или фосфатные буферы. Кроме того, аминокислотные компоненты также могут выполнять функцию в отношении буферной емкости. Типичные аминокислотные компоненты, которые можно применять в композиции в качестве буферных веществ, включают без ограничения глицин и гистидин. В определенных вариантах осуществления буферное вещество выбрано из гистидина, цитрата, фосфата, глицина и ацетата. В конкретном варианте осуществления буферное вещество представляет собой гистидин. В конкретном варианте осуществления буферное вещество представляет собой цитрат. В следующем варианте осуществления буферное вещество представляет собой глицин. Чистота буферного вещества должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%. Используемый в данном документе термин «чистота» в контексте гистидина и глицина относится к химической чистоте гистидина или глицина, как понимают в уровне техники, например, как описано в The Merck Index, 13-е изд., под ред. O'Neil et al. (Merck & Co., 2001), включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00227] В определенных вариантах осуществления композиция содержит гистидин в качестве буферного вещества. В определенных вариантах осуществления гистидин присутствует в композиции при концентрации по меньшей мере приблизительно 1 мМ, по меньшей мере приблизительно 5 мМ, по меньшей мере приблизительно 10 мМ, по меньшей мере приблизительно 20 мМ, по меньшей мере приблизительно 30 мМ, по меньшей мере приблизительно 40 мМ, по меньшей мере приблизительно 50 мМ, по меньшей мере приблизительно 75 мМ, по меньшей мере приблизительно 100 мМ, по меньшей мере приблизительно 150 мМ или по меньшей мере приблизительно 200 мМ гистидина. В другом варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 1 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ гистидина. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 1 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 60 мМ, приблизительно 70 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 150 мМ или приблизительно 200 мМ гистидина. В конкретном варианте осуществления композиция может содержать приблизительно 10 мМ, приблизительно 25 мМ гистидина или не содержать гистидин.

[00228] В определенных вариантах осуществления композиция содержит гистидин в качестве буферного вещества. В определенных вариантах осуществления гистидин присутствует в композиции при концентрации по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 20 мМ, по меньшей мере 30 мМ, по меньшей мере 40 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 75 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 150 мМ или по меньшей мере 200 мМ гистидина. В другом варианте осуществления композиция содержит от 1 мМ до 200 мМ, от 1 мМ до 150 мМ, от 1 мМ до 100 мМ, от 1 мМ до 75 мМ, от 10 мМ до 200 мМ, от 10 мМ до 150 мМ, от 10 мМ до 100 мМ, от 10 мМ до 75 мМ, от 10 мМ до 50 мМ, от 10 мМ до 40 мМ, от 10 мМ до 30 мМ, от 20 мМ до 75 мМ, от 20 мМ до 50 мМ, от 20 мМ до 40 мМ или от 20 мМ до 30 мМ гистидина. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 60 мМ, 70 мМ, 80 мМ, 90 мМ, 100 мМ, 150 мМ или 200 мМ гистидина. В конкретном варианте осуществления композиция может содержать 10 мМ, 25 мМ гистидина или не содержать гистидин.

[00229] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит вспомогательное вещество, представляющее собой углевод. Вспомогательные вещества, представляющие собой углевод, могут действовать, например, в качестве средств для усиления вязкости, стабилизаторов, объемообразующих средств, солюбилизирующих средств и/или т.п. Вспомогательные вещества, представляющие собой углевод, как правило, присутствуют при концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 99% по массе или объему, например от приблизительно 0,1% до приблизительно 20%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 15%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 5% до приблизительно 15%, от приблизительно 8% до приблизительно 10%, от приблизительно 10% до приблизительно 15%, от приблизительно 15% до приблизительно 20%, от 0,1% до 20%, от 5% до 15%, от 8% до 10%, от 10% до 15%, от 15% до 20%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, от приблизительно 5% до приблизительно 10% или от приблизительно 15% до приблизительно 20%. В других конкретных вариантах осуществления вспомогательное вещество, представляющее собой углевод, присутствует при концентрации, составляющей 1%, или 1,5%, или 2%, или 2,5%, или 3%, или 4%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20%.

[00230] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит вспомогательное вещество, представляющее собой углевод. Вспомогательные вещества, представляющие собой углевод, могут действовать, например, в качестве средств для усиления вязкости, стабилизаторов, объемообразующих средств, солюбилизирующих средств и/или т.п. Вспомогательные вещества, представляющие собой углевод, как правило, присутствуют при концентрации, составляющей от 1% до 99% по массе или объему, например от 0,1% до 20%, от 0,1% до 15%, от 0,1% до 5%, от 1% до 20%, от 5% до 15%, от 8% до 10%, от 10% и 15%, от 15% и 20%, от 0,1% до 20%, от 5% до 15%, от 8% до 10%, от 10% и 15%, от 15% и 20%, от 0,1% до 5%, от 5% до 10% или от 15% до 20%. В других конкретных вариантах осуществления вспомогательное вещество, представляющее собой углевод, присутствует при концентрации, составляющей 1%, или 1,5%, или 2%, или 2,5%, или 3%, или 4%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20%.

[00231] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит вспомогательное вещество, представляющее собой углевод. Вспомогательные вещества, представляющие собой углевод, подходящие для применения в композициях, включают без ограничения моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелецитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; а также альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит) и т.п. В определенных вариантах осуществления вспомогательные вещества, представляющие собой углевод, для применения в композициях, предусмотренных в данном документе, выбраны из сахарозы, трегалозы, лактозы, маннита и рафинозы. В конкретном варианте осуществления вспомогательное вещество, представляющее собой углевод, представляет собой трегалозу. В другом конкретном варианте осуществления вспомогательное вещество, представляющее собой углевод, представляет собой маннит. В еще одном конкретном варианте осуществления вспомогательное вещество, представляющее собой углевод, представляет собой сахарозу. В следующем конкретном варианте осуществления вспомогательное вещество, представляющее собой углевод, представляет собой рафинозу. Чистота вспомогательного вещества, представляющего собой углевод, должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%.

[00232] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит трегалозу. В определенных вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 4%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30% или по меньшей мере приблизительно 40% трегалозы. В другом варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 1% до приблизительно 40%, от приблизительно 1% до приблизительно 30%, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 2% до приблизительно 40%, от приблизительно 2% до приблизительно 30%, от приблизительно 2% до приблизительно 20%, от приблизительно 4% до приблизительно 40%, от приблизительно 4% до приблизительно 30% или от приблизительно 4% до приблизительно 20% трегалозы. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 4%, приблизительно 6%, приблизительно 8%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30% или приблизительно 40% трегалозы. В конкретном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 4%, приблизительно 6% или приблизительно 15% трегалозы.

[00233] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит трегалозу. В определенных вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 40% трегалозы. В другом варианте осуществления композиция содержит от 1% до 40%, от 1% до 30%, от 1% до 20%, от 2% до 40%, от 2% до 30%, от 2% до 20%, от 4% до 40%, от 4% до 30% или от 4% до 20% трегалозы. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 15%, 20%, 30% или 40% трегалозы. В конкретном варианте осуществления композиция содержит 4%, 6% или 15% трегалозы.

[00234] В определенных вариантах осуществления композиция содержит вспомогательное вещество. В конкретном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере одно вспомогательное вещество, выбранное из сахара, соли, поверхностно-активного вещества, аминокислоты, многоатомного спирта, хелатирующего средства, эмульгатора и консерванта. В определенных вариантах осуществления композиция содержит соль, например соль, выбранную из NaCl, KCl, CaCl₂ и MgCl₂. В конкретном варианте осуществления композиция содержит NaCl.

[00235] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит аминокислоту, например лизин, аргинин, глицин, гистидин или соль аминокислоты. Композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 1 мМ, по меньшей мере приблизительно 10 мМ, по меньшей мере приблизительно 25 мМ, по меньшей мере приблизительно 50 мМ, по меньшей мере приблизительно 100 мМ, по меньшей мере приблизительно 150 мМ, по меньшей мере приблизительно 200 мМ, по меньшей мере приблизительно 250 мМ, по меньшей мере приблизительно 300 мМ, по меньшей мере приблизительно 350 мМ или по меньшей мере приблизительно 400 мМ аминокислоты. В другом варианте осуществления композиция может содержать от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 300 мМ или от приблизительно 150 мМ до приблизительно 400 мМ аминокислоты. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 1 мМ, 1,6 мМ, 25 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 350 мМ или приблизительно 400 мМ аминокислоты.

[00236] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит аминокислоту, например лизин, аргинин, глицин, гистидин или соль аминокислоты. Композиция может содержать по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 25 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 150 мМ, по меньшей мере 200 мМ, по меньшей мере 250 мМ, по меньшей мере 300 мМ, по меньшей мере 350 мМ или по меньшей мере 400 мМ аминокислоты. В другом варианте осуществления композиция может содержать от 1 мМ до 100 мМ, от 10 мМ до 150 мМ, от 25 мМ до 250 мМ, от 25 мМ до 300 мМ, от 25 мМ до 350 мМ, от 25 мМ до 400 мМ, от 50 мМ до 250 мМ, от 50 мМ до 300 мМ, от 50 мМ до 350 мМ, от 50 мМ до 400 мМ, от 100 мМ до 250 мМ, от 100 мМ до 300 мМ, от 100 мМ до 400 мМ, от 150 мМ до 250 мМ, от 150 мМ до 300 мМ или от 150 мМ до 400 мМ аминокислоты. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит 1 мМ, 1,6 мМ, 25 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ, 300 мМ, 350 мМ или 400 мМ аминокислоты.

[00237] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит поверхностно-активное вещество. Используемый в данном документе термин «поверхностно-активное вещество» относится к органическим веществам, содержащим амфипатические структуры; а именно, они состоят из групп с противоположными тенденциями в отношении растворимости, обычно из жирорастворимой углеводородной цепи и водорастворимой ионной группы. Поверхностно-активные вещества можно разделить в зависимости от заряда поверхностно-активного фрагмента на анионные, катионные и неионогенные поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активные вещества часто используют в качестве смачивающих, эмульгирующих, солюбилизирующих и диспергирующих средств для различных фармацевтических композиций и препаратов на основе биологических материалов. Фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80); полиоксамеры (например, полоксамер 188); Triton; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсаркозин; линолеил-, миристил- или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеамидопропил-, миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например; лауроамидопропил); миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропилдиметиламин; метилкокоил- или метилолеилтаурат динатрия; а также серии MONAQUA® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль и сополимеры этилена и пропиленгликоля (например, PLURONICS® PF68 и т.д.) необязательно могут быть добавлены в композиции для уменьшения агрегации. В определенных вариантах осуществления композиция содержит полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 или полисорбат 80. Поверхностно-активные вещества особенно применимы, если для введения композиции используют насос или пластиковый контейнер. Присутствие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества снижает склонность белка к агрегации. Композиции могут содержать полисорбат, который присутствует при концентрации в диапазоне от приблизительно 0,001% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1%, или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%. В других конкретных вариантах осуществления композиции содержат полисорбат, который присутствует при концентрации 0,001%, или 0,002%, или 0,003%, или 0,004%, или 0,005%, или 0,006%, или 0,007%, или 0,008%, или 0,009%, или 0,01%, или 0,015%, или 0,02%. Композиции могут содержать полисорбат, который присутствует при концентрации в диапазоне от 0,001% до 1%, или от 0,001% до 0,1%, или от 0,01% до 0,1%. В других конкретных вариантах осуществления композиции содержат полисорбат, который присутствует при концентрации 0,001%, или 0,002%, или 0,003%, или 0,004%, или 0,005%, или 0,006%, или 0,007%, или 0,008%, или 0,009%, или 0,01%, или 0,015%, или 0,02%.

[00238] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит другие вспомогательные вещества и/или добавки, в том числе без ограничения разбавители, связующие, стабилизаторы, лиофильные растворители, консерванты, адъюванты или т.п. Фармацевтически приемлемым вспомогательные вещества и/или добавки можно применять в композициях, представленных в данном документе. Обычно используемые вспомогательные вещества/добавки, такие как фармацевтически приемлемые хелаторы (например, без ограничения EDTA, DTPA или EGTA), необязательно могут быть добавлены к композициям для уменьшения агрегации. Эти добавки особенно применимы, если для введения композиции используют насос или пластиковый контейнер.

[00239] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит консервант.Консерванты, такие как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, нитрит фенилртути, феноксиэтанол, формальдегид, хлорбутанол, хлорид магния (например, без ограничения гексагидрат), алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и т.п.), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал или их смеси, могут быть необязательно добавлены к композициям в любой подходящей концентрации, такой как от 0,001% до 5%, или в любом диапазоне или значении в таковом. Концентрация консерванта, применяемого в композициях, является концентрацией, достаточной для получения эффекта в отношении микроорганизмов. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и легко определяются специалистом в данной области техники.

[00240] В некоторых вариантах осуществления композиция является изотоничной по отношению к человеческой крови, при этом композиции характеризуются по сути таким же осмотическим давлением, что и человеческая кровь. Такие изотоничные композиции обычно характеризуются осмотическим давлением, составляющим от 250 мосмоль до 350 мосмоль. Изотоничность может быть измерена, например, с применением осмометра давления пара или замораживания льда. Тоничность композиции регулируют путем применения модификаторов тоничности. «Модификаторы тоничности» представляют собой такие фармацевтически приемлемые инертные вещества, которые можно добавлять в композицию для обеспечения изотоничности композиции. Модификаторы тоничности, подходящие для композиций, представленных в данном документе, включают без ограничения сахариды, соли и аминокислоты.

[00241] В определенных вариантах осуществления композиция представляет собой апирогенную композицию, которая по сути не содержит эндотоксинов и/или родственных пирогенных веществ. Эндотоксины включают токсины, которые содержатся внутри микроорганизма и высвобождаются только тогда, когда микроорганизмы разрушаются или гибнут. Пирогенные вещества также включают вызывающие лихорадку термостабильные вещества из внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Оба эти вещества могут вызвать лихорадку, гипотонию и шок при введении людям. Из-за потенциальных вредных эффектов даже небольшие количества эндотоксинов должны быть удалены из растворов фармацевтических лекарственных средств, вводимых внутривенно. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов («FDA») установило верхний предел в 5 единиц эндотоксина (ЕЭ) на дозу на килограмм массы тела за один часовой период для внутривенных применений лекарственного средства (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Если терапевтические белки вводят в количестве нескольких сотен или тысяч миллиграммов на килограмм массы тела, как это может быть в случае с представляющими интерес белками (например, антителами), даже следовые количества вредного и опасного эндотоксина должны быть удалены. В некоторых вариантах осуществления уровни эндотоксина и пирогена в композиции составляют менее 10 ЕЭ/мг, или менее 5 ЕЭ/мг, или менее 1 ЕЭ/мг, или менее 0,1 ЕЭ/мг, или менее 0,01 ЕЭ/мг, или менее 0,001 ЕЭ/мг.

[00242] В некоторых вариантах осуществления при использовании для введения in vivo фармацевтическая композиция должна быть стерильной. Композиция может быть стерилизована различными способами стерилизации, включая стерильную фильтрацию, обработку излучением и т.д. В определенных вариантах осуществления композицию стерилизуют фильтрованием с помощью предварительно стерилизованного 0,22-микронного фильтра. Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены в соответствии с обычной фармацевтической практикой, как описано в «Remington: The Science & Practice of Pharmacy», 21-е изд.., Lippincott Williams & Wilkins, (2005), включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00243] Композиции, содержащие рМНС-связывающий белок, такой как раскрытые в данном документе, обычно хранят в лиофилизированной форме или в виде раствора. Предполагается, что стерильные композиции, содержащие рМНС-связывающий белок, помещают в контейнер, содержащий порт для стерильного доступа, например пакет или флакон с раствором для внутривенного введения, имеющий адаптер, который позволяет извлекать композицию, например пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции. В определенных вариантах осуществления композицию обеспечивают в виде предварительно заполненного шприца.

[00244] В определенных вариантах осуществления композиция представляет собой лиофилизированный состав. Термин «лиофилизированный» или «высушенный сублимацией» включает состояние вещества, которое было подвергнуто процедуре сушки, такой как лиофилизация, при которой было удалено по меньшей мере 50% влаги.

[00245] Независимо от выбранного пути введения, средства, представленные в данном документе, которые можно применять в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, представленные в данном документе, составляют в фармацевтически приемлемые лекарственные формы обычными способами, известными специалистам в данной области техники.

[00246] Хотя настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на ряд вариантов осуществления, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что изменения в форме и деталях могут быть внесены в различные варианты осуществления, раскрытые в данном документе, без отступления от сущности и объема настоящего изобретения и что различные варианты осуществления, раскрытые в данном документе, не предназначены для ограничения объема формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

[00247] Следующие примеры предоставлены лишь в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1

[00248] Мышей, которые содержат (1) человеческий или гуманизированный локус МНС I, человеческий или гуманизированный локус β2-микроглобулина и/или человеческий или гуманизированный локус МНС II (в отношении неограничивающих примеров таких гуманизированных локусов см., например, фиг.1-2) и (2) гуманизированные локусы тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина (см., например, Macdonald et al, (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 5147-52; включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), получали с применением одной из методик скрещивания и последовательной гомологичной рекомбинации в ES-клетке или обеих. У таких мышей экспрессируется человеческая или гуманизированная молекула МНС I/β2-микроглобулин и/или человеческая или гуманизированная молекула МНС II, и они являются подвергнутыми индуцированию толерантности к таковым. Мышей иммунизировали представляющим интерес комплексом пептид-МНС (рМНС), который содержит пептид, который является антигенным для мышей, и человеческим или гуманизированным МНС, в отношении которого мышь подвергали индуцированию толерантности. Мышей дополнительно и необязательно стимулировали представляющим интерес комплексом рМНС, при этом средство для стимулирования также необязательно было связано с эпитопом хелперной Т-клетки. Человеческие или гуманизированный антитела, экспрессируемые из гуманизированных локусов тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, выделенные из сыворотки крови иммунизированных мышей, тестировали на предмет специфичности связывания с комплексом рМНС.

[00249] Получали тестируемых мышей; имеющих фон C57BL и содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие гуманизированную молекулу МНС I (HLA-A2 Н-2K), соединенную с гуманизированным β2-микроглобулином (см., например, фиг.1А и 1C; см. также патенты США №№9591835 и 9615550, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте), гуманизированным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина (см., например, Macdonald (2014), выше) и гуманизированным локусом общей легкой цепи (см., например, патенты США №№10143186; 10130081 и 9969814; публикации патентов США №№20120021409, 20120192300,20130045492,20130185821, 20130302836 и 20150313193, при этом каждая из публикаций включена посредством ссылки во всей своей полноте). Этих тестируемых мышей и контрольных мышей, содержащих функциональный (например, мышиный) ген ADAM6 (см., например, патенты США №№8642835 и 8697940; при этом каждая из публикаций включена посредством ссылки во всей своей полноте) и гуманизированные локусы тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, иммунизировали комплексом одноцепочечного рМНС, содержащим гетерологичный пептид (пептид В), презентирующийся в контексте молекулы HLA-A2/β2m, при этом иммуноген вводили в виде иммуногена, представляющего собой белок, представленный под SEQ ID NO:26 (фиг.4), или в виде ДНК, кодирующей одноцепочечный комплекс рМНС, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:27 (фиг.3). Мышей стимулировали различными путями через различные интервалы времени с применением иммуногена, представляющего собой комплекс рМНС, со стандартными адъювантами (фиг.3-4) или с применением иммуногена, представляющего собой комплекс рМНС, связанный с Т-хелперным пептидом (PADRE; фиг.5). Перед началом иммунизации у мышей собирали неиммунную сыворотку крови. У мышей периодически отбирали образцы крови и анализировали в отношении титров антисыворотки на соответствующие антигены.

[00250] Титры антител в сыворотке крови против нерелевантных (пептид А или пептид С) и релевантных антигенов, представленных в контексте HLA-A2, определяли с помощью ELISA. Девяносто шести-луночные микротитрационные планшеты (Thermo Scientific) покрывали антителами против myc в натрий-фосфатном буфере (PBS, Irvine Scientific) в течение ночи при 5 мкг/мл. Планшеты промывали натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich), и блокировали с помощью 250 мкл 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich) в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали с помощью PBS-T и покрывали с помощью 2 мкг/мл одноцепочечных комплексов рМНС, меченных с помощью с-myc, содержащих релевантный пептид В или нерелевантные антигены, пептид А или пептид С, презентирующиеся в контексте HLA-A2.

[00251] Образцы неиммунной и иммунной антисыворотки подвергали серийному трехкратному разведению в 0,5% BSA-PBS и добавляли в планшеты на 1 час при комнатной температуре. Планшеты промывали, добавляли вторичное антитело козы против мышиного IgG-Fc, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson Immunoresearch), и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали и проявляли с применением 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ)/H₂O₂ в качестве субстрата в соответствии с рекомендованной производителем процедурой, и оптическую плотность при 450 нм регистрировали с применением спектрофотометра (Victor, Perkin Elmer). Титры антител рассчитывали с применением программного обеспечения Graphpad PRISM. Титры антител рассчитывали в виде интерполированного коэффициента разбавления сыворотки, сигнал связывания при котором в 2 раза превышает фон.

[00252] Титры антител, которые связывают одноцепочечный рМНС, содержащий пептид В, вызывали у контрольных мышей при иммунизации либо иммуногеном в виде ДНК, кодирующей пептид В в контексте HLA-A, либо иммуногеном, представляющим собой белок, предусматривающий то же, фиг.3-4, при этом контрольные мыши предусматривали когорты, которые не подвергали индуцированию толерантности к химерному полипептиду HLA-A2/H-2K и/или человеческому или гуманизированному β2-микроглобулину. Однако образцы сыворотки крови этих контрольных мышей также содержали титры антител против нерелевантного пептида (пептида А или пептида С), представленного в контексте HLA-A, которые были сопоставимы с титром антител против одноцепочечного рМНС, содержащего пептид В (фиг.3-4). Таким образом, хотя у не подвергнутых индуцированию толерантности животных может вырабатываться иммунный ответ против представляющих интерес комплексов рМНС, такой иммунный ответ можно рассматривать как неспецифический иммунный ответ из-за сопоставимых титров антител против одноцепочечного рМНС, содержащего пептид В, и против одноцепочечного рМНС, содержащего нерелевантный пептид.

[00253] Напротив, образцы сыворотки крови от тестируемых мышей, которые были подвергнуты индуцированию толерантности к молекулам человеческого (гуманизированного) HLA-A и β2-микроглобулина, иммунизировали одноцепочечным комплексом пептид B/HLA-A/β2M, индуцирующим титр антител против одноцепочечного рМНС, содержащего пептид В. (Фиг. 4) Титр антител против комплексов рМНС, содержащих пептид В, превышал титры антител против комплексов HLA-A/β2M, содержащих нерелевантные пептиды А или С (фиг.4). Подобным образом, при применении ДНК, кодирующей комплекс пептид B/HLA-A/β2M, в качестве иммуногена наблюдали более высокие титры антител против одноцепочечного белка, содержащего релевантный пептид В (по сравнению с нерелевантными комплексами рМНС) (фиг.3). Более высокие титры на иммуноген также возникали в третьей когорте, в которой тестируемым мышам в качестве инъекции для обеспечения примирования вводили одноцепочечный комплекс рМНС, содержащий пептид В, с последующими стимуляциями одноцепочечным комплексом рМНС, содержащим пептид В, связанным с PADRE, представляющим собой эпитоп хелперной Т-клетки, по сравнению с титрами антител против нерелевантных комплексов рМНС (фиг.5). Кроме того, мышей, у которых экспрессировался одноцепочечный полипептид HLA-A2/β2M (SEQ ID NO:23) из локуса ROSA26 (см., например, фиг.2), подобным образом подвергали индуцированию толерантности к пустой молекуле HLA-A2/β2M, и у них продуцировались более высокие титры антител против комплекса рМНС, презентирующего пептид В, по сравнению с титрами антител против комплекса рМНС, презентирующего нерелевантный пептид, при иммунизации и стимуляции белком комплекса рМНС/пептид В (в присутствии или в отсутствие PADRE) (данные не показаны).

Пример 2

[00254] Мышей, у которых экспрессировалась молекула МНС класса I, MHC класса II и/или β2М из локуса, отличного от соответствующего эндогенного локуса, например локуса ROSA26, подвергали индуцированию толерантности к пустой молекуле MHC класса I, MHC класса II и/или β2М, и у них продуцировались более высокие титры антител против иммуногена, например ДНК, кодирующей одноцепочечный комплекс рМНС, по сравнению с таковыми у мышей, которых не подвергали индуцированию толерантности к пустой молекуле MHC класса I, MHC класса II и/или β2М.

[00255] Данные в данном документе демонстрируют, что индуцирование толерантности у животного, отличного от человека, к молекулам человеческого HLA класса I и человеческого β2-микроглобулина или их части усиливает способность модифицированного животного, отличного от человека, вырабатывать специфические гуморальные иммунные ответы на представляющий интерес рМНС по сравнению с таковой у контрольных животных, отличных от человека, которых не подвергали индуцированию толерантности к молекулам человеческого HLA класса I и человеческого β2-микроглобулина.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Регенерон Фармасьютикал, Инк.

Мерфи, Эндрю Дж.

<120> ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, ДЛЯ

ВЫРАБОТКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ КОМПЛЕКСОВ ПЕПТИД-MHC,

СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 009108.116WO1/10116WO01

<150> 62/647,720

<151> 2018-03-24

<150> 62/647,724

<151> 2018-03-24

<160> 29

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 1

Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 2

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 3

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 3

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 4

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 5

Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 6

Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 7

Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 8

Gly Ser Ser Ser Gly

1 5

<210> 9

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 9

Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 10

Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 12

Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 14

Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 16

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 16

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 17

<211> 1230

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS+G4Sx2-hB2m-G4Sx4-hHLA-A2 экто Y108C

<400> 17

ggatgcggag gtagtggggg aggtggctcc gggggagggg gatccataca gcggactcca 60

aagatccagg tgtatagtcg ccaccccgca gagaatggaa agtccaactt ccttaactgt 120

tatgtgagcg gatttcaccc ttcagacata gaggtagacc ttctgaaaaa cggagagaga 180

atagagaagg tagagcatag tgatctttct ttttccaagg actggagctt ctacctcctg 240

tactataccg agtttacacc cactgagaag gatgagtacg catgccgcgt gaaccacgta 300

accctttctc aaccaaagat tgtaaaatgg gacagagaca tgggtggcgg cggtagcggc 360

gggggcggaa gcggcggagg aggctccggt gggggtggtt cagggtccca ttctatgaga 420

tattttttta caagcgtgag ccggcctggg aggggggagc cccggtttat cgctgtgggg 480

tacgtggatg atactcaatt cgtgcggttc gactctgacg ccgcctcaca gcgcatggag 540

cctagggcac cctggattga acaggagggc ccggaatact gggacggcga aacccgcaag 600

gtaaaagcgc acagccagac gcatagggtg gatctgggca ccctgcgggg ctgttataac 660

cagtcagagg ctggctcaca cactgtacag cggatgtatg gttgtgacgt cggttccgat 720

tggagatttc ttcgcggcta ccaccaatac gcctacgatg gcaaggacta catcgcactg 780

aaggaagatt tgagatcttg gaccgcggcg gatatggcag cacagactac caaacacaag 840

tgggaagctg ctcatgtggc agaacagctc cgcgcctatc tggagggcac ttgcgtcgag 900

tggttgcgga gatacctgga gaatgggaaa gaaacactgc agcggaccga tgcacctaaa 960

acacatatga cgcaccacgc tgtgtccgac cacgaggcaa cactccggtg ttgggcactc 1020

agcttctacc ctgctgaaat aacgctgacc tggcagcgcg acggcgaaga tcagacgcag 1080

gacacagagc ttgttgaaac tcgccctgct ggcgacggca ccttccaaaa atgggcagca 1140

gtagtcgtcc cctccggaca ggaacagcgg tatacttgcc acgtgcagca tgaaggtctc 1200

cccaagcccc tcactctgag atgggagccg 1230

<210> 18

<211> 410

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS+G4Sx2-hB2m-G4Sx4-hHLA-A2 экто Y108C

<400> 18

Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile

1 5 10 15

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

20 25 30

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

50 55 60

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

85 90 95

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

100 105 110

Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr

130 135 140

Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly

145 150 155 160

Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu

180 185 190

Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His

195 200 205

Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala

210 215 220

Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp

225 230 235 240

Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp

245 250 255

Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met

260 265 270

Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu

275 280 285

Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg

290 295 300

Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys

305 310 315 320

Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg

325 330 335

Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln

340 345 350

Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg

355 360 365

Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro

370 375 380

Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu

385 390 395 400

Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro

405 410

<210> 19

<211> 1511

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS+G4Sx2-hB2m-G4Sx4-HLA-A2 Y108C (G4S)4

<400> 19

ctcctcatgg gaacgctcgg catagtggga tgcggaggta gtgggggagg tggctccggg 60

ggagggggat ccatacagcg gactccaaag atccaggtgt atagtcgcca ccccgcagag 120

aatggaaagt ccaacttcct taactgttat gtgagcggat ttcacccttc agacatagag 180

gtagaccttc tgaaaaacgg agagagaata gagaaggtag agcatagtga tctttctttt 240

tccaaggact ggagcttcta cctcctgtac tataccgagt ttacacccac tgagaaggat 300

gagtacgcat gccgcgtgaa ccacgtaacc ctttctcaac caaagattgt aaaatgggac 360

agagacatgg gtggcggcgg tagcggcggg ggcggaagcg gcggaggagg ctccggtggg 420

ggtggttcag ggtcccattc tatgagatat ttttttacaa gcgtgagccg gcctgggagg 480

ggggagcccc ggtttatcgc tgtggggtac gtggatgata ctcaattcgt gcggttcgac 540

tctgacgccg cctcacagcg catggagcct agggcaccct ggattgaaca ggagggcccg 600

gaatactggg acggcgaaac ccgcaaggta aaagcgcaca gccagacgca tagggtggat 660

ctgggcaccc tgcggggctg ttataaccag tcagaggctg gctcacacac tgtacagcgg 720

atgtatggtt gtgacgtcgg ttccgattgg agatttcttc gcggctacca ccaatacgcc 780

tacgatggca aggactacat cgcactgaag gaagatttga gatcttggac cgcggcggat 840

atggcagcac agactaccaa acacaagtgg gaagctgctc atgtggcaga acagctccgc 900

gcctatctgg agggcacttg cgtcgagtgg ttgcggagat acctggagaa tggaaaagaa 960

acactgcagc ggaccgatgc acctaaaaca catatgacgc accacgctgt gtccgaccac 1020

gaggcaacac tccggtgttg ggcactcagc ttctaccctg ctgaaataac gctgacctgg 1080

cagcgcgacg gcgaagatca gacgcaggac acagagcttg ttgaaactcg ccctgctggc 1140

gacggcacct tccaaaaatg ggcagcagta gtcgtcccct ccggacagga acagcggtat 1200

acttgccacg tgcagcatga aggtctcccc aagcccctca ctttgagatg ggagccctct 1260

tctcaaccca cgatccctat tgttggcatt atcgctggtc tggtgctttt tggagccgtg 1320

attactggag cagtggtggc agctgtgatg tggagacgca agtcttctga taggaagggc 1380

ggatcttatt cccaggctgc gtccagtgac agcgcccagg ggtcagatgt cagcctgacc 1440

gcatgcaagg tgggtggtgg aggatctggc ggcggcggaa gcggaggggg aggatccgga 1500

ggaggcggct c 1511

<210> 20

<211> 494

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS+G4Sx2-hB2m-G4Sx4-HLA-A2 Y108C (G4S)4

<400> 20

Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile

1 5 10 15

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

20 25 30

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

50 55 60

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

85 90 95

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

100 105 110

Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr

130 135 140

Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly

145 150 155 160

Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu

180 185 190

Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His

195 200 205

Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala

210 215 220

Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp

225 230 235 240

Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp

245 250 255

Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met

260 265 270

Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu

275 280 285

Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg

290 295 300

Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys

305 310 315 320

Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg

325 330 335

Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln

340 345 350

Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg

355 360 365

Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro

370 375 380

Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu

385 390 395 400

Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile

405 410 415

Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile

420 425 430

Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp

435 440 445

Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln

450 455 460

Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser

465 470 475 480

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

485 490

<210> 21

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер G4S

<400> 21

Gly Cys Gly Gly Ser

1 5

<210> 22

<211> 1470

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mRORss-B2m-G4Sx4-HLA-A2

<400> 22

atgcacagac ctagacgtcg tggaactcgt ccacctccac tggcactgct cgctgctctc 60

ctcctggctg cacgtggtgc tgatgcaata cagcggactc caaagatcca ggtgtatagt 120

cgccaccccg cagagaatgg aaagtccaac ttccttaact gttatgtgag cggatttcac 180

ccttcagaca tagaggtaga ccttctgaaa aacggagaga gaatagagaa ggtagagcat 240

agtgatcttt ctttttccaa ggactggagc ttctacctcc tgtactatac cgagtttaca 300

cccactgaga aggatgagta cgcatgccgc gtgaaccacg taaccctttc tcaaccaaag 360

attgtaaaat gggacagaga catgggtggc ggcggtagcg gcgggggcgg aagcggcgga 420

ggaggctccg gtgggggtgg ttcagggtcc cattctatga gatatttttt tacaagcgtg 480

agccggcctg ggagggggga gccccggttt atcgctgtgg ggtacgtgga tgatactcaa 540

ttcgtgcggt tcgactctga cgccgcctca cagcgcatgg agcctagggc accctggatt 600

gaacaggagg gcccggaata ctgggacggc gaaacccgca aggtaaaagc gcacagccag 660

acgcataggg tggatctggg caccctgcgg ggctattata accagtcaga ggctggctca 720

cacactgtac agcggatgta tggttgtgac gtcggttccg attggagatt tcttcgcggc 780

taccaccaat acgcctacga tggcaaggac tacatcgcac tgaaggaaga tttgagatct 840

tggaccgcgg cggatatggc agcacagact accaaacaca agtgggaagc tgctcatgtg 900

gcagaacagc tccgcgccta tctggagggc acttgcgtcg agtggttgcg gagatacctg 960

gagaatggga aagaaacact gcagcggacc gatgcaccta aaacacatat gacgcaccac 1020

gctgtgtccg accacgaggc aacactccgg tgttgggcac tcagcttcta ccctgctgaa 1080

ataacgctga cctggcagcg cgacggcgaa gatcagacgc aggacacaga gcttgttgaa 1140

actcgccctg ctggcgacgg caccttccaa aaatgggcag cagtagtcgt cccctccgga 1200

caggaacagc ggtatacttg ccacgtgcag catgaaggtc tccccaagcc cctcactttg 1260

agatgggagc cctcttctca acccacgatc cctattgttg gcattatcgc tggtctggtg 1320

ctttttggag ccgtgattac tggagcagtg gtggcagctg tgatgtggag acgcaagtct 1380

tctgatagga agggcggatc ttattcccag gctgcgtcca gtgacagcgc ccaggggtca 1440

gatgtcagcc tgaccgcatg caaggtgtaa 1470

<210> 23

<211> 489

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mRORss-B2m-G4Sx4-HLA-A2

<400> 23

Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Ile Gln Arg

20 25 30

Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys

35 40 45

Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile

50 55 60

Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His

65 70 75 80

Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr

85 90 95

Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn

100 105 110

His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val

145 150 155 160

Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val

165 170 175

Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg

180 185 190

Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp

195 200 205

Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val

210 215 220

Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser

225 230 235 240

His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg

245 250 255

Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile

260 265 270

Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala

275 280 285

Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu

290 295 300

Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu

305 310 315 320

Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His

325 330 335

Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp

340 345 350

Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp

355 360 365

Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala

370 375 380

Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly

385 390 395 400

Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys

405 410 415

Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile

420 425 430

Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile Thr Gly

435 440 445

Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys

450 455 460

Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser

465 470 475 480

Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val

485

<210> 24

<211> 372

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный полипептид AlHLA-A2/H2-K

<220>

<221> СИГНАЛ

<222> (1)..(24)

<400> 24

Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

20 25 30

Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala

35 40 45

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

50 55 60

Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly

65 70 75 80

Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln

85 90 95

Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

100 105 110

Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly

115 120 125

Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly

130 135 140

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

145 150 155 160

Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val

165 170 175

Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu

180 185 190

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala

195 200 205

Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr

210 215 220

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

225 230 235 240

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

245 250 255

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

260 265 270

Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu

275 280 285

Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Thr

290 295 300

Val Ser Asn Met Ala Thr Val Ala Val Leu Val Val Leu Gly Ala Ala

305 310 315 320

Ile Val Thr Gly Ala Val Val Ala Phe Val Met Lys Met Arg Arg Arg

325 330 335

Asn Thr Gly Gly Lys Gly Gly Asp Tyr Ala Leu Ala Pro Gly Ser Gln

340 345 350

Thr Ser Asp Leu Ser Leu Pro Asp Cys Lys Val Met Val His Asp Pro

355 360 365

His Ser Leu Ala

370

<210> 25

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS-G4Sx2-hB2m-G4Sx4-HLA-A*02:01 экто

(Y108C)-PADRE-myc-myc-6his

<400> 25

Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile

1 5 10 15

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

20 25 30

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

50 55 60

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

85 90 95

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

100 105 110

Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr

130 135 140

Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly

145 150 155 160

Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu

180 185 190

Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His

195 200 205

Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala

210 215 220

Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp

225 230 235 240

Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp

245 250 255

Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met

260 265 270

Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu

275 280 285

Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg

290 295 300

Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys

305 310 315 320

Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg

325 330 335

Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln

340 345 350

Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg

355 360 365

Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro

370 375 380

Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu

385 390 395 400

Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ala Lys Phe Val Ala Ala

405 410 415

Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

420 425 430

Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His

435 440 445

His His His

450

<210> 26

<211> 438

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS-G4Sx2-hB2m-G4Sx4-HLA-A*02:01 экто (Y108C)-myc-myc-6his

<400> 26

Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile

1 5 10 15

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

20 25 30

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

50 55 60

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

85 90 95

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

100 105 110

Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr

130 135 140

Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly

145 150 155 160

Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu

180 185 190

Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His

195 200 205

Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala

210 215 220

Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp

225 230 235 240

Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp

245 250 255

Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met

260 265 270

Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu

275 280 285

Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg

290 295 300

Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys

305 310 315 320

Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg

325 330 335

Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln

340 345 350

Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg

355 360 365

Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro

370 375 380

Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu

385 390 395 400

Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser

405 410 415

Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

420 425 430

His His His His His His

435

<210> 27

<211> 733

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCGGS-G4Sx2-hB2m-G4Sx4-HLA-A*02:01 полноразмерный(Y108C)-G4Sx4-eGFP

<400> 27

Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile

1 5 10 15

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

20 25 30

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

50 55 60

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

85 90 95

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

100 105 110

Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr

130 135 140

Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly

145 150 155 160

Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu

180 185 190

Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His

195 200 205

Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala

210 215 220

Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp

225 230 235 240

Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp

245 250 255

Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met

260 265 270

Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu

275 280 285

Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg

290 295 300

Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys

305 310 315 320

Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg

325 330 335

Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln

340 345 350

Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg

355 360 365

Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro

370 375 380

Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu

385 390 395 400

Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile

405 410 415

Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile

420 425 430

Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp

435 440 445

Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln

450 455 460

Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser

465 470 475 480

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val

485 490 495

Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu

500 505 510

Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly

515 520 525

Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr

530 535 540

Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr

545 550 555 560

Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His

565 570 575

Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr

580 585 590

Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys

595 600 605

Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp

610 615 620

Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr

625 630 635 640

Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile

645 650 655

Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln

660 665 670

Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val

675 680 685

Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys

690 695 700

Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr

705 710 715 720

Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

725 730

<210> 28

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PADRE

<400> 28

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 29

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генетически модифицированному грызуну, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу MHC, которая содержит по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, и (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, а также к способу его получения. Также раскрыто применение вышеуказанного грызуна в способе получения человеческого или гуманизированного антитела, в способе получения нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, в способе получения клетки, которая экспрессирует человеческий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, а также в способе получения человеческого вариабельного домена иммуноглобулина in vitro. Изобретение эффективно для получения антигенсвязывающих белков против антигенных комплексов pMHC. 8 н. и 35 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Генетически модифицированный грызун для получения антигенсвязывающих белков против антигенных комплексов pMHC, где геном зародышевой линии грызуна содержит:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу MHC, которая содержит по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)- или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, и

(b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина,

где генетически модифицированный грызун экспрессирует человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость,

где генетически модифицированный грызун экспрессирует в В-клетке человеческое или гуманизированное антитело, содержащее:

(c) вариабельный домен человеческой или гуманизированной тяжелой цепи, экспрессируемый из перегруппированного локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, образованного из указанного (не)перегруппированного человеческого или гуманизированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина; и/или

(d) вариабельный домен человеческой или гуманизированной легкой цепи, экспрессируемый из перегруппированного локуса вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, образованного из указанного (не)перегруппированного человеческого или гуманизированного локуса легкой цепи иммуноглобулина,

где генетически модифицированный грызун подвергается индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле MHC или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полости, за счет чего у него вырабатывается специфический B-клеточный ответ, который вырабатывает человеческое или гуманизированное антитело, которое:

(i) специфически связывает антигенный комплекс пептид-MHC (pMHC), который содержит

(А) пептид, который является гетерологичным в отношении генетически модифицированного грызуна, в комплексе с

(B) молекулой HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полостью, и

(ii) и не связывает пустую молекулу HLA, из которой получена человеческая пептидсвязывающая полость,

при иммунизации указанным антигенным комплексом pMHC,

при этом генетически модифицированный грызун дополнительно содержит указанное человеческое или гуманизированное антитело, которое специфически связывает указанный антигенный комплекс pMHC и не связывает пустую молекулу HLA, и

где генетически модифицированный грызун представляет собой крысу или мышь.

2. Генетически модифицированный грызун по п. 1, где генетически модифицированный грызун дополнительно содержит указанный антигенный комплекс pMHC, который содержит:

(i) указанный пептид, который является гетерологичным в отношении генетически модифицированного грызуна, в комплексе с

(ii) указанной молекулой HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полостью.

3. Генетически модифицированный грызун по п. 1 или 2, где человеческая или гуманизированная молекула MHC выбрана из группы, состоящей из человеческой или гуманизированной молекулы MHC класса I, человеческой или гуманизированной молекулы MHC класса II α, человеческой или гуманизированной молекулы MHC класс II β или любой их комбинации, и/или

где генетически модифицированный грызун содержит

(a) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь иммуноглобулина;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей; или

(vi) неперегруппированную человеческую или гуманизированную гибридную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина;

и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь иммуноглобулина;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи.

4. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где генетически модифицированный грызун дополнительно содержит функциональный ген ADAM6, где необязательно функциональный ген ADAM6 представляет собой эндогенный ген ADAM6.

5. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где генетически модифицированный грызун дополнительно экспрессирует экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT).

6. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где человеческая или гуманизированная молекула MHC представляет собой человеческую или гуманизированную молекулу MHC класса I, при этом необязательно человеческая пептидсвязывающая полость получена из молекулы HLA класса I, выбранной из группы, состоящей из молекулы HLA-A, молекулы HLA-B и молекулы HLA-C.

7. Генетически модифицированный грызун по п. 6, дополнительно содержащий в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, необязательно в локусе эндогенного β2-микроглобулина,

при этом генетически модифицированный грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, за счет чего генетически модифицированный грызун является подвергнутым индуцированию толерантности к β2-микроглобулину отдельно или в сочетании с человеческой или гуманизированной молекулой MHC класса I.

8. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-5, где человеческая или гуманизированная молекула MHC представляет собой человеческую или гуманизированную молекулу MHC класса II, при этом необязательно человеческая пептидсвязывающая полость получена из α- и/или β-цепи молекулы HLA класса II, выбранной из группы, состоящей из молекулы HLA-DP, молекулы HLA-DQ и молекулы HLA-DR .

9. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, кодирует полностью человеческую молекулу HLA,

при этом необязательно нуклеотидная последовательность, кодирующая полностью человеческую молекулу HLA, не нарушает локус эндогенного MHC грызуна, при этом необязательно нуклеотидная последовательность, кодирующая полностью человеческую молекулу HLA, помещена в эндогенный локус ROSA26.

10. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-8, где нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, кодирует химерную человеческую/грызуна молекулу MHC, содержащую внеклеточные домены молекулы HLA, функционально связанные с трансмембранными и цитоплазматическими доменами эндогенной молекулы MHC, при этом необязательно нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, кодирует:

(a) химерную человеческую/грызуна молекулу MHC класса I, содержащую домены α1, α2 и α3 молекулы HLA класса I, выбранной из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B и HLA-C, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC класса I грызуна, такой как эндогенный мышиный полипептид H-2K, эндогенный мышиный полипептид H-2D или эндогенный мышиный полипептид H-2L, и/или

(b) химерную человеческую/грызуна молекулу MHC класса II, содержащую домен α1 и домен α2 полипептида HLA класса II α, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC класса II α грызуна, такой как эндогенный мышиный полипептид H-2A α или эндогенный мышиный полипептид H-2E α, и/или домен β1 и домен β2 полипептида HLA класса II β, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC класса II β грызуна, такой как эндогенный мышиный полипептид H-2A β или эндогенный мышиный полипептид H-2E β.

11. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость.

12. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где либо:

(i) человеческий или гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина является перегруппированным, и человеческий или гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным, либо

(ii) человеческий или гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным, и человеческий или гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина является перегруппированным.

13. Генетически модифицированный грызун по любому из предыдущих пунктов, где генетически модифицированный грызун представляет собой крысу.

14. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-12, где генетически модифицированный грызун представляет собой мышь.

15. Способ получения генетически модифицированного грызуна по любому из предыдущих пунктов, включающий:

(a) модификацию генома грызуна для содержания:

(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC, которая содержит по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость молекулы HLA или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, и

(ii) (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, и

(b) введение грызуну, антигенного комплекса pMHC, который содержит пептид, гетерологичный в отношении грызуна, соединенный с указанной молекулой HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полостью,

где генетически модифицированный грызун:

подвергается индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле MHC или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полости, за счет чего у него вырабатывается специфический B-клеточный ответ, который вырабатывает человеческое или гуманизированное антитело, которое (A) специфически связывает антигенный комплекс pMHC, который содержит (1) пептид, который является гетерологичным в отношении генетически модифицированного грызуна, в комплексе с (2) молекулой HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полостью, и (B) и не связывает пустую молекулу HLA, из которой получена человеческая пептидсвязывающая полость, при иммунизации указанным антигенным комплексом pMHC, и

способен экспрессировать из В-клетки указанное человеческое или гуманизированное антитело, которое содержит:

(A) вариабельный домен человеческой или гуманизированной тяжелой цепи, экспрессируемый из перегруппированного локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, образованного из указанного (не) перегруппированного человеческого или гуманизированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина; и/или

(B) вариабельный домен человеческой или гуманизированной легкой цепи, экспрессируемый из перегруппированного локуса вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, образованного из указанного (не)перегруппированного человеческого или гуманизированного локуса легкой цепи иммуноглобулина, и

где грызун представляет собой крысу или мышь.

16. Способ по п. 15, где способ включает:

(a)

(1) вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, в первый эктопический локус, или

(2) замещение:

в локусе эндогенного MHC I грызуна, нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид MHC I грызуна, нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческий или гуманизированный полипептид MHC I с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC, и/или

в локусе эндогенного MHC II грызуна, нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид MHC II грызуна, нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческий или гуманизированный полипептид MHC II с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC, и

(b)

(i) вставку (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированного локуса человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина во второй эктопический локус, или

(ii) замещение:

(A) в эндогенном локусе тяжелой цепи грызуна эндогенного вариабельного сегмента гена тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) грызуна неперегруппированным человеческим вариабельным сегментом гена тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), и необязательно замещение эндогенного вариативного сегмента гена тяжелой цепи иммуноглобулина (D_H) грызуна и/или эндогенного соединяющего сегмента гена тяжелой цепи иммуноглобулина (J_H) грызуна неперегруппированным человеческим вариативным сегментом гена тяжелой цепи иммуноглобулина (D_H) и/или неперегруппированным человеческим соединяющим сегментом гена тяжелой цепи иммуноглобулина (J_H) соответственно, при этом неперегруппированный человеческий сегмент гена V_H и необязательный неперегруппированный человеческий сегмент гена D_H и необязательный неперегруппированный человеческий сегмент гена J_H функционально связаны с эндогенной последовательностью гена константной области тяжелой цепи, и/или

(B) в эндогенном локусе легкой цепи грызуна эндогенного вариабельного сегмента гена легкой цепи иммуноглобулина (V_L) грызуна и эндогенного соединяющего сегмента гена легкой цепи иммуноглобулина (J_L) грызуна человеческим вариабельным сегментом гена легкой цепи иммуноглобулина (V_L) и человеческим соединяющим сегментом гена легкой цепи иммуноглобулина (J_L), которые необязательно являются перегруппированными, с образованием последовательности гена V_L/J_L, при этом человеческие сегменты гена V_L и J_L функционально связаны с эндогенной последовательностью гена константной области легкой цепи,

при этом (A) (a)(1) нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее пептидсвязывающую полость, и (b)(i) (не)перегруппированный человеческий или гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный человеческий или гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина

(I) вставлены с помощью последовательной гомологичной рекомбинации в одну эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, или

(II) вставлены в первую и вторую ES-клетку, где указанная первая и вторая ES-клетки используются, соответственно, для получения первого и второго генетически модифицированного грызуна; или

(B) (a)(2) нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид MHC I грызуна и/или нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид MHC II грызуна, и (b)(ii) эндогенные сегменты гена V_H и необязательно D_H и/или J_H грызуна, и/или эндогенные сегменты гена V_L и J_L грызуна:

(I) вставлены посредством замещения с помощью последовательной гомологичной рекомбинации в одну эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, или

(II) вставлены посредством замещения в первую и вторую ES-клетку, где указанная первая и вторая ES-клетки используются, соответственно, для получения первого и второго генетически модифицированного грызуна.

17. Способ по п. 15 или 16, где антигенный комплекс pMHC связывается с эпитопом хелперной Т-клетки, при этом необязательно эпитоп хелперной Т-клетки представляет собой PADRE.

18. Способ по п. 16 или 17, где гуманизированная молекула MHC I содержит домены α1, α2 и α3 молекулы HLA класса I и по меньшей мере трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного полипептида MHC I грызуна, и/или где гуманизированная молекула MHC II содержит домены α1, α2, β1 и β2 молекулы HLA класса II и по меньшей мере трансмембранные и цитоплазматические домены эндогенного полипептида MHC II грызуна.

19. Способ по любому из пп. 16-18, дополнительно предусматривающий нацеливание на последовательности, кодирующие эндогенный внеклеточный домен полипептида MHC, эндогенный β2 микроглобулин и вариабельные области эндогенного иммуноглобулина, и замещение их последовательностями, кодирующими внеклеточный домен полипептида MHC человека, микроглобулин β2 человека и вариабельные области иммуноглобулина человека, соответственно.

20. Способ получения человеческого или гуманизированного антитела, которое специфически связывает представляющий интерес антигенный комплекс pMHC или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей его, включающий содержание генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-14 или полученного способом по любому из пп. 15-19 и 28-40 в условиях, необходимых для того, чтобы у генетически модифицированного грызуна сформировался иммунный ответ на представляющий интерес антигенный комплекс pMHC, при этом представляющий интерес антигенный комплекс pMHC содержит пептид, который является гетерологичным в отношении генетически модифицированного грызуна, и презентируется в контексте молекулы HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полости.

21. Способ по п. 20, дополнительно включающий стимулирование иммунного ответа у генетически модифицированного грызуна, где необязательно стимулирование предусматривают введение генетически модифицированному грызуну, представляющего интерес антигенного комплекса pMHC, связанного с эпитопом хелперной Т-клетки, где необязательно эпитоп хелперной Т-клетки содержит PADRE, представленный под SEQ ID NO:28.

22. Способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, включающий

выделение из генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-14 или полученного способом по любому из пп. 15-19 и 28-40, нуклеиновой кислоты, содержащей перегруппированную последовательность гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина, которая кодирует человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом генетически модифицированного грызуна или гибридомой, полученной из лимфоцита,

где перегруппированная последовательность гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина содержит по меньшей мере одну соматическую гипермутацию,

где человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом или гибридомой, полученной из него, соединяется с его когнатным вариабельным доменом с образованием антигенсвязывающего домена, специфического в отношении антигенного комплекса pMHC.

23. Способ получения клетки, которая экспрессирует человеческий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и/или человеческий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, включающий

выделение лимфоцита из генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-14 или полученного способом по любому из пп. 15-19 и 28-40,

где лимфоцит экспрессирует человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, который образует антигенсвязывающий домен, специфический в отношении антигенного комплекса pMHC.

24. Способ по п. 23, дополнительно включающий получение гибридомы из выделенного лимфоцита.

25. Способ получения человеческого вариабельного домена иммуноглобулина in vitro, включающий

экспрессию в клетке первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность гена перегруппированной человеческой вариабельной области иммуноглобулина, которая кодирует человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-14 или полученного в соответствии со способом по любому из пп. 15-19 и 28-40, или гибридомой, полученную из лимфоцита,

при этом человеческий вариабельный домен иммуноглобулина, экспрессируемый лимфоцитом или гибридомой, полученной из него, соединяется с его когнатным вариабельным доменом с образованием антигенсвязывающего домена, специфического в отношении антигенного комплекса pMHC.

26. Способ по п. 25, где первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность гена человеческой константной области иммуноглобулина, функционально связанную с перегруппированной последовательностью гена человеческой вариабельной области иммуноглобулина.

27. Способ по п. 26, где последовательность гена человеческой константной области иммуноглобулина представляет собой последовательность гена константной области тяжелой цепи и содержит модификацию, которая повышает аффинность области C_H2-C_H3 из аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG в отношении неонатального Fc-рецептора (FcRn) при pH в диапазоне от 5,5 до 6,0, при этом модификация представляет собой мутацию в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи IgG, выбранную из группы, состоящей из M428L, N434S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, T256E, T250Q, H433K, N434Y и их комбинации.

28. Способ получения генетически модифицированного грызуна для выработки антигенсвязывающих белков против комплексов pMHC, включающий иммунизацию генетически модифицированного грызуна антигенным комплексом pMHC,

при этом геном зародышевой линии генетически модифицированного грызуна содержит:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC, которая содержит по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, и

(b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина, где

антигенный комплекс pMHC содержит:

(а) пептид, гетерологичный генетически модифицированному грызуну, в комплексе с

(b) указанной молекулой HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полостью,

при этом грызун представляет собой крысу или мышь.

29. Способ по п. 28, где человеческая или гуманизированная молекула MHC выбрана из группы, состоящей из человеческой или гуманизированной молекулы MHC класса I, человеческой или гуманизированной молекулы MHC класса II α, человеческой или гуманизированной молекулы MHC класс II β или любой их комбинации, и/или

где генетически модифицированный грызун содержит

(a) в эндогенном локусе тяжелой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(ii) рестриктированную неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(iii) последовательность, кодирующую общую тяжелую цепь иммуноглобулина;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью тяжелой цепи;

(v) последовательность, кодирующую иммуноглобулин, состоящий только из тяжелых цепей;

(vi) неперегруппированную человеческую или гуманизированную гибридную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, кодирующую гибридную цепь иммуноглобулина;

и/или

(b) в эндогенном локусе легкой цепи:

(i) неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(ii) последовательность, кодирующую общую легкую цепь иммуноглобулина;

(iii) рестриктированную неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи;

(iv) модифицированную гистидином неперегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи; или

(v) модифицированную гистидином перегруппированную человеческую или гуманизированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в функциональной связи с эндогенной константной областью легкой цепи.

30. Способ по п. 28 или 29, где генетически модифицированный грызун дополнительно содержит функциональный ген ADAM6, где необязательно функциональный ген ADAM6 представляет собой эндогенный ген ADAM6.

31. Способ по любому из пп. 28-30, где генетически модифицированный грызун дополнительно экспрессирует экзогенный ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT).

32. Способ по любому из пп. 28-31, где человеческая или гуманизированная молекула MHC представляет собой человеческую или гуманизированную молекулу MHC класса I, при этом необязательно человеческая пептидсвязывающая полость получена из молекулы HLA класса I, выбранной из группы, состоящей из молекулы HLA-A, молекулы HLA-B и молекулы HLA-C.

33. Способ по п. 32, где генетически модифицированный грызун дополнительно содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, необязательно в локусе эндогенного β2-микроглобулина,

при этом генетически модифицированный грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный β2-микроглобулин, за счет чего генетически модифицированный грызун является подвергнутым индуцированию толерантности человеческому или гуманизированному к β2-микроглобулину отдельно или в сочетании с человеческой или гуманизированной молекулой MHC класса I.

34. Способ по любому из пп. 28-31, где человеческая или гуманизированная молекула MHC представляет собой человеческую или гуманизированную молекулу MHC класса II, при этом необязательно человеческая пептидсвязывающая полость получена из α- и/или β-цепи молекулы HLA класса II, выбранной из группы, состоящей из молекулы HLA-DP, молекулы HLA-DQ и молекулы HLA-DR.

35. Способ по любому из пп. 28-34, где нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, кодирует полностью человеческую молекулу HLA,

при этом необязательно нуклеотидная последовательность, кодирующая полностью человеческую молекулу HLA, не нарушает локус эндогенного MHC грызуна, при этом необязательно нуклеотидная последовательность, кодирующая полностью человеческую молекулу HLA, помещена в эндогенный локус ROSA26.

36. Способ по любому из пп. 28-34, где нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, кодирует химерную человеческую/грызуна молекулу MHC, содержащую внеклеточные домены молекулы HLA, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC, при этом необязательно нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, кодирует:

(a) химерную человеческую/грызуна молекулу MHC класса I, содержащую домены α1, α2 и α3 молекулы HLA класса I, выбранной из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B и HLA-C, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC класса I грызуна, такой как эндогенный мышиный полипептид H-2K, эндогенный мышиный полипептид H-2D или эндогенный мышиный полипептид H-2L, и/или

(b) химерную человеческую/грызуна молекулу MHC класса II, содержащую домен α1 и домен α2 полипептида HLA класса II α, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC класса II α грызуна, такой как эндогенный мышиный полипептид H-2A α или эндогенный мышиный полипептид H-2E α,

и/или домен β1 и домен β2 полипептида HLA класса II β, функционально связанные с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенной молекулы MHC класса II β грызуна, такой как эндогенный мышиный полипептид H-2A β или эндогенный мышиный полипептид H-2E β.

37. Способ по любому из пп. 28-36, где генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость.

38. Способ по любому из пп. 28-37, где, либо:

(i) человеческий или гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина является перегруппированным, и человеческий или гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным, либо

(ii) человеческий или гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина является неперегруппированным, и человеческий или гуманизированный локус легкой цепи иммуноглобулина является перегруппированным.

39. Способ по любому из пп. 28-38, где генетически модифицированный грызун, представляет собой крысу.

40. Способ по любому из пп. 28-38, где генетически модифицированный грызун, представляет собой мышь.

41. Генетически модифицированный грызун для получения антигенсвязывающих белков против антигенных комплексов pMHC, полученный способом по любому из пп. 28-38,

где геном зародышевой линии грызуна содержит:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую или гуманизированную молекулу MHC, которая содержит по меньшей мере человеческую пептидсвязывающую полость молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) или или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость, и

(b) (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной тяжелой цепи иммуноглобулина и/или (не)перегруппированный локус человеческой или гуманизированной легкой цепи иммуноглобулина,

где генетически модифицированный грызун экспрессирует человеческую или гуманизированную молекулу MHC или по меньшей мере ее человеческую пептидсвязывающую полость,

где генетически модифицированный грызун экспрессирует в В-клетке человеческое или гуманизированное антитело, содержащее:

(c) вариабельный домен человеческой или гуманизированной тяжелой цепи, экспрессируемый из перегруппированного локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, образованного из указанного (не) перегруппированного человеческого или гуманизированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина; и/или

(d) вариабельный домен человеческой или гуманизированной легкой цепи, экспрессируемый из перегруппированного локуса вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, образованного из указанного (не) перегруппированного человеческого или гуманизированного локуса легкой цепи иммуноглобулина,

где генетически модифицированный грызун подвергается индуцированию толерантности к человеческой или гуманизированной молекуле MHC или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полости, за счет чего у него вырабатывается специфический B-клеточный ответ, который вырабатывает человеческое или гуманизированное антитело, которое:

(i) специфически связывает антигенный комплекс пептид-MHC (pMHC), который содержит

(А) пептид, который является гетерологичным в отношении генетически модифицированного грызуна, в комплексе с

(B) молекулой HLA или по меньшей мере ее человеческой пептидсвязывающей полостью, и

(ii) и не связывает пустую молекулу HLA, из которой получена человеческая пептидсвязывающая полость,

при иммунизации указанным антигенным комплексом pMHC,

при этом генетически модифицированный грызун дополнительно содержит указанное человеческое или гуманизированное антитело, которое специфически связывает указанный антигенный комплекс pMHC и не связывает пустую молекулу HLA, и

где генетически модифицированный грызун представляет собой крысу или мышь.

42. Генетически модифицированный грызун по п. 41, где генетически модифицированный грызун, представляет собой крысу.

43. Генетически модифицированный грызун по п. 41, где генетически модифицированный грызун, представляет собой мышь.