БИО-НЕМАТОЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ, УНИЧТОЖЕНИЯ ИЛИ БОРЬБЫ С НЕМАТОДАМИ В КУЛЬТУРАХ СЕМЕЙСТВА ПАСЛЁНОВЫХ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2017 года по МПК A01N63/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения грибка рода Paecilomyces spp. и дополнительно относится к применениям, способам и биологическим композициям, действующим как нематоцид, для профилактики и/или уничтожения и/или борьбы с гетеродеридами, образующими цисты, растущие на культурах пасленовых.

Настоящее изобретение включает в себя систему внесения упомянутого грибка в сочетании с севооборотом, для того чтобы эффективным и практичным, никогда ранее не известным в технике, способом, поразительно уменьшить выживаемость гетеродеридов, высокотоксичных при производстве культур пасленовых, таких как, среди прочих, картофель, томаты и баклажаны. Настоящее изобретение обладает преимуществом, заключающимся в нетоксичности как для продукта, почвы, так и для производителя и конечного потребителя, поскольку не входит в состав конечного продукта.

Уровень техники

Нематоды в общем смысле представляют собой многоклеточные нитевидные микроскопические паразиты растений с уменьшенным диаметром на краях. Обычно нематоды являются раздельнополыми (имеются самцы и самки) и для их репродукции необходимо перекрестное оплодотворение. Что касается их биологического цикла, он насчитывает шесть стадий: циста, четыре ювенильные стадии (J1, J2, J3 и J4) и взрослая особь. Цисты пребывают в почве, инфицируя корни культур растений в течение последующего цикла выращивания. В нематоде, в зависимости от даты посадки, температуры почвы, продолжительности вегетативного периода, вида хозяина паразита и географической зоны, в течение цикла выращивания растения может смениться до шести поколений. Цисты могут сохранять выживаемость в течение длительного промежутка времени; в некоторых случаях до двадцати лет.

Как правило, после инфицирования культур растений нематоды наносят надпочвенный вред, выражающийся в уменьшении прорастания семян, уменьшении урожайности культуры, пятнистости листьев, гниении и хлорозе, карликовости, деформации листьев и стеблей, внутреннем некрозе стеблей и дефолиации, недостатке жизнеспособности и подпочвенном вреде, например узловатость корней, расслаивание и некроз поверхности корней, зерен и клубеньков, слабое образование семян и почек или побегов, деформация и некроз корней, излишняя пролиферация корней, луковиц, клубеньков и зерена, излишняя пролиферация корней, атрофия кончиков корней или недоразвитость корневой системы.

Инвазия Globodera rostochiensis (Фиг. 2) происходит, когда личинки J2 вылупляются под прикорневыми волосками, прорастающими из корней растения. Упомянутые фазы J2 проникают в верхушечную часть корня, эпидермальные клетки и клеточные стенки через их стилус и начинают поедать перициклические клетки. Таким образом, инвазированные растения приобретают истощенную корневую систему, рахит, карликовость и хлороз, и благодаря уменьшению способности поглощать воду растение может погибнуть.

Золотистая нематода или Globodera rostochiensis представляет собой гетеродерид, инфицирующий пищевые и декоративные растения, и обуславливает каждый год многомиллионные потери, выраженные в долларах. Эта нематода с 1970-х поражала зоны, производящие картофель, и с того времени распространилась в зонах умеренного и/или горного климата, в которых выращивают упомянутый клубень. По консервативным оценкам в Мексике эта нематода приводит к ежегодным потерям производства картофеля приблизительно 800000 тонн, что эквивалентно 3000 миллионам мексиканским песо ежегодно. В штате Веракрус ежегодные потери картофеля оценивают приблизительно в 50000 тонн, что эквивалентно около 415 миллионам мексиканских песо ежегодно, с тех пор как в штате Веракрус наблюдали уменьшение производства картофеля (OEIDRUS, 2008).

Сообщалось, что в течение 2008г. всемирное производство картофеля составило 300 миллионов тонн, причем основным его поставщиком и потребителем является Китайская Республика. Этот пищевой продукт показывает большую питательную ценность, представляет собой универсальный и замечательный продукт, обладает множеством применений в промышленности в производстве крахмала, мальтозы, декстрозы, мелассы и глюкозы.

По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации OOH (FAO), в 2007 году мировое производство картофеля составило 32530 миллионов тонн, причем основными производителями являются Китай, Российская Федерация, Индия, Соединенные Штаты, Украина, Польша, Беларусь, Нидерланды и Франция. С другой стороны, основными потребителями этих клубней являются европейские страны, в то время как в Африке и Латинской Америке его потребляют меньше.

По данным Министерства сельского хозяйства, животноводства, развития сельских районов, рыболовства и продовольствия (SAGARPA), в Мексике по посевным площадям картофель находится на 35 месте; однако по продовольственному значению картофель находится на девятом месте. В 12 штатах страны картофелеводством занимается более чем 8700 производителей, что обеспечивает непосредственную занятость 17500 человек, косвенную занятость 51600 и 6,3 миллиона человеко-дней трудозатрат каждый год (2008).

В штате Веракрус горные зоны, такие как склоны Кофре де Пероте и Пика Орисаба, являются идеальными местами для выращивания картофеля. В соответствии с официальным документом «Долговременный внутренний карантин номер 17 против золотистой нематоды картофеля Globodera rostochiensis», опубликованным в 1987 и остающимся в силе в настоящее время, согласно мексиканскому государственному стандарту NOM040-FITO-2002, в котором приводятся требования и технические условия производства и национальной мобилизации коммерческого картофеля, с 1987 во всей продуктивной зоне (6000 Га) штата Веракрус введен карантин, запрещающий применение указанного клубня для посадки, поскольку это может являться разносчиком распространения нематод, в особенности Globodera rostochiensis. Данным запретом пренебрегали, что приводило к большему распространению этой вредоносной эпидемии. Эта тенденция привела к тому, что в течение более чем 30 сельскохозяйственных циклов проблема оставалась нерешенной.

В основном золотистая нематода или Globodera rostochiensis поражала мексиканские картофелеводческие зоны приблизительно с 1972 г., поскольку именно тогда она была рассеяна по горным зонам выращивания данного клубня. Подсчеты наличия паразита показывает, что были достигнуты его популяции, в 100 раз превышающие рекомендованную максимальную плотность, которая, согласно Европейской и Средиземноморской организации защиты растений, как ожидается, позволяет избежать вред коммерческому картофелеводству (то есть 40 цист на кг почвы).

Наиболее общеупотребительными способами борьбы с Globodera rostochiensis является внесение нематоцидов, таких как карбофуран, который кроме того, что токсичен, не является радикальным решением. В уровне техники известны способы борьбы с нематодами вида Globodera посредством применения синтетических белков (WO 01/94601 A2), применения 2R,5R-дигидроксиметил-3R,R-дигидроксипирролидина (WO 1999/05941; химического агента, полученного из растений семейства пасленовых, (WO 1999/059414); посредством применения ингибиторов протеиназы (WO 1992/015690) и применением Bacillus thuringiensis (WO 1993/019604); композиций, содержащих одно или более эфирных масел из Tagetes erecta, Ocimum basilicium или Cymbopongon martini; носителя и эмульгатора (WO 2007/13222); композиций на основе коры Afrostyrax lepidephyllus (WO 1995/010187), добавления цистеинпротеиназы (WO 2008/087555) и конкретно для борьбы с Globodera rostochiensis, способы с применением биологического вида Arthrobotrys (KR 20030094540), слишком чувствительного к факторам окружающей среды, и неприменимого в деструктурированных почвах; химических агентов, полученных из пасленовых, (JP 3190807) и химического агента эмпирической формулы C₂₇H₃₀O₉ (WO 1993/002083). Эти способы борьбы с паразитами в совокупности со стратегией севооборота в основном применяются спонтанно, в слабой связи с пониманием жизненного цикла нематод. Это, а также употребляемые дозы, вызывает загрязнение и повреждение поверхностных покровов, загрязнение продукта и в некоторых случаях создает резистентность к упомянутым нематодам, вследствие этого затрудняя их уничтожение.

Известны следующие применения рода Paecilomyces: Paecilomyces tenuipes в борьбе с летучими насекомыми у растений (патент США №US 7,033,586 B2, US 20030124098 и US 20070141032); композиция, содержащая Paecilomyces lilacinus, применяемая для борьбы с почвенными паразитами (US 7,435,411 B2, CN 101418264 и US 20050008619); Paecilomyces fumosoroseus или Paecilomyces javanicus в борьбе с подземными термитами (US 7,390,480); Paecilomyces javanicus в сочетании с имидаклопридом в борьбе с сосущими насекомыми (CN 101502270); Paecilomyces javanicus в сочетании с азадирахтином (CN 101331880 и CN 101331884); Paecilomyces fumosoroseus в сочетании с азадирахтином (CN 101273728 и WO 1991/011856); белок, полученный из Paecilomyces farinosus в качестве инсектицида (WO 2001/000841); и наиболее часто, в борьбе с нематодами, паразитами растений, среди которых: Paecilomyces lilacinus (патент США № US 5,989,543, патент КНР № CN 101422168, патент Германии № DE 102005024783, патент КНР № CN 101081982 и патент Канады 2059642); Paecilomyces fumosoroseus (US 5,360,607); Paecilomyces lilacinus 251, Paecilomyces lilacinus 252, Paecilomyces lilacinus 253 и Paecilomyces lilacinus 254 (US 5,989,543); и Paecilomyces cicadae (CN 101518265), ни в одном из которых не содержится какое-либо упоминание о применении Paecilomyces carneus в борьбе с нематодами в сельскохозяйственных культурах.

Согласно вышеприведенной характеристике и в качестве отклика на проблему такого важного мирового рынка, как рынок картофеля, настоящее изобретение было разработано с целью создания оптимизированного способа продуцирования Paecilomyces carneus, равно как и создания применений, способов и композиций, с легкостью применимых для профилактики и/или уничтожения и/или борьбы с нематодами у пасленовых, при этом без отрицательного влияния на почву, на продукт или конечного потребителя.

Настоящее новое изобретение относится к грибку Paecilomyces carneus, не ограничиваясь, к штамму IE-4 31 грибка Paecilomyces carneus; способам его продуцирования и распространения, и из этого его применения в качестве нематоцида на растениях пасленовых для борьбы с нематодами семейства Heteroderidae, не ограничиваясь, Globodera rostochiensis.

Кроме того, с целью ликвидации вреда, наносимого сельскохозяйственной культуре, описаны композиции и способы профилактики и/или уничтожения и/или борьбы с нематодами у пасленовых, характеризуемые их воздействием, начиная с первого севооборота (что является неожиданным, и о чем не было сведений в уровне техники), не воздействующие на конечное качество продукта, но улучшающие биологические и химические характеристики почвы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Сравнительное исследование воздействия Paecilomyces carneus и Paecilomyces lilacinus на Globodera rostochiensis.

Фиг. 2. Микрофотография штамма IE-431 Paecilomyces carneus.

Фиг. 3. Микрофотография Globodera rostochiensis.

Фиг. 4. Цисты Globodera rostochiensis.

Фиг. 5. J2 стадии Globodera rostochiensis, инфицированные Paecilomyces carneus штамма IE-431, внутри яйца.

Осуществление изобретения

Описанное ниже в настоящем документе новое изобретение содержит применения, способы и биологические композиции Paecilomyces carneus для профилактики и/или уничтожения и/или борьбы с паразитами растений в культурах пасленовых.

Paecilomyces carneus штамма IE-431 представляет собой грибок, продуцируемый способами, раскрытыми в настоящем изобретении. Упомянутый штамм в настоящее время сохраняется и зарегистрирован в коллекции грибков Института экологии (INECOL) и зарегистрирован во Всемирной федерации коллекций культур (WFCC) под № IEWDCM782. Выделение и/или сохранение штамма IE-431 Paecilomyces carneus осуществляют в одном или более твердом средстве культурирования, состоящем из по меньшей мере источника азота и/или из по меньшей мере источника углерода, и/или из одной или более минеральных солей, и/или из по меньшей мере пригодного носителя, и/или из по меньшей мере антибиотика, и/или из по меньшей мере ускорителя роста. Упомянутую культуру инкубируют при температуре в интервале от 12°C до 35°C в течение времени, достаточного для получения подходящей концентрации.

Массовую репродукцию грибка проводят инокуляцией живых клеток Paecilomyces carneus в жидкой среде, содержащей одну или более аминокислоту и/или один или более углевод, и/или одну или более минеральную соль, и/или по меньшей мере один подходящий носитель, и/или по меньшей мере один антибиотик, и/или по меньшей мере ускоритель роста. Упомянутую культуру инкубируют при температуре в диапазоне от 12°C до 35°C за время, достаточное для получения подходящей концентрации (Фиг. 3).

Упомянутый штамм IE-431 Paecilomyces carneus, полученный описанным в настоящем изобретении новым способом выделения и/или сохранения, и/или массового воспроизводства, демонстрирует ряд генетических характеристик, сохраняющихся при отсутствии репрезентативных структурных изменений, отличающих его от любого другого вида рода Paecilomyces и никогда ранее не наблюдавшихся у любого другого вида, принадлежащего к роду Paecilomyces, характеризующихся наличием колоний диаметром между 15 и 21 мм за 10 дней в среде овсяного агара (OA), между 15 и 19 мм в агаре декстрозы картофеля (PDA), в то время как в картофельно-морковном агаре (PCA) рост составляет от 15 до 17 мм. По цветовой диаграмме Farver и Faver и Wanscher и Kornerup (1961) их мицелий имеет цвет от белого до стекловидного (1А1); он не окрашивает культуральную среду при испытаниях агаровой пластинки, как прямо, так и на просвет. Его структура является нитевидной, особенно на PCA (агар питательный для определения микробного числа); он вырастает очень близко к поверхности среды (рассеянно) и становится пылеобразным при спорулировании. Упомянутый мицелий деформирует PDA (агар декстрозы картофеля) с появлением отчетливых желобков, если глядеть на обратную сторону. Он оформлен в виде прямых, макронематозных, простых конидиофоров при отсутствии ветвей с цепочковидными и взаимно пересекающимися конидиями формы, близкой к сферической, и некоторые из них (конидий) имеют окончания, слегка наклоненные к концам, размером 2,4-4 мкм × 2-3,2 мкм.

В твердой культуральной среде 86% конидий прорастают за 16 часов, зародышевая трубка по длине варьирует между 6 и 54 мкм. Через 24 часа 100% спор прорастают, и мицелий по длине превышает 30 мкм и не доходит до 110 мкм.

В свете описанного выше технического знания, полученного в настоящем изобретении, мы строим в определенном порядке раскрытую в конце настоящего документа цепочку нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующего геном Paecilomyces carneus штамма IE-431.

Согласно настоящему новому изобретению было неожиданно обнаружено, что жизнеспособные клетки Paecilomyces carneus IE-431, приведенные в контакт с цистами нематоды Globodera rostochiensis, вызывают значительное повреждение цист, так что предотвращается распространение данного паразита. В ходе исследований было обнаружено, что взаимодействие между Paecilomyces carneus и Globodera rostochiensis происходит путем прорастания грибка, что при контакте с цистами (Фиг. 4) приводит к колонизации внутренней части упомянутых цист мицелием (Фиг. 5), таким образом неожиданно влияя на общее количество яиц и личинок J1 и J2, находящихся внутри упомянутой цисты. Заражение цист начинается ферментативным процессом проникновения Paecilomyces carneus через стенку цисты; после этого мицелий растет на поверхности яиц и внутри ювенильных J1 и J2, поэтому распространение упомянутого мицелия становится инвазивным до полного разрушения яиц и/или ювенильных J1 и J2.

В процессе исследования проводили изучение нематоцидного эффекта Paecilomyces carneus штамма IE-431 на цисты Globodera rostochiensis в сравнении с эффектом Paecilomyces lilacinus штамма IE-430 и неожиданно обнаружили, что Paecilomyces carneus IE-431 против цист упомянутой нематоды действует более быстро и пагубно, чем Paecilomyces lilacinus штамма IE-430; то есть существует значимая разница между патогенностями одного и другого вида против упомянутой нематоды. Данное изучение проводили в лабораторных условиях, оценивая степень зараженности упомянутых цист в зависимости от концентрации живых клеток каждого грибка 1×10⁶ живых клеток/мл, а третью, контрольную группу обрабатывали добавлением только дистиллированной стерильной воды. Упомянутую патогенность оценивали в течение 14 суток по макроскопическому и микроскопическому аспектам цист, и была обнаружена значимая неожиданная разница в эффекте грибка Paecilomyces carneus штамма IE-431, по сравнению с таковым Paecilomyces lilacinus. Результаты показаны на Фиг. 5.

На следующем этапе применения в качестве нематоцида грибок Paecilomyces carneus штамма IE-431 вносили раздельно (TP) или совместно с лимскими бобами (HP) и горохом (ChP) в севообороте, с абсолютным контролем (TA), в котором не задействовали ни контроль, ни культуру. Упомянутые сельскохозяйственные культуры лимских бобов и гороха, не обрабатываемые упомянутым грибком, рассматривали как контрольные (H) и (Ch). Когда плотность популяции превышает 200 цист/100 г почвы (выживаемость в среднем 10-40 и до 100 яиц/г почвы), с целью уменьшить популяцию золотистой нематоды картофеля практически до нуля (Таблица 1 и Таблица 2) выполняют первую обработку перед посевом; вторую обработку делают в течение посева и третью обработку проводят после сбора урожая лимских бобов и гороха.

Как видно из вышеприведенного, Paecilomyces carneus штамма IE-341 обладает нематоцидным эффектом на цисты золотистой нематоды картофеля, но не влияет на свободноживущие нематоды, присутствующие в обрабатываемых почвах. В настоящем исследовании мы обнаружили синергическое поведение, выражающееся в уменьшении плотности популяции золотистой нематоды, если внесение Paecilomyces carneus сочетается с севооборотом сельскохозяйственных культур, неблагоприятствующих выведению Globodera rostochiensis.

Следует упомянуть, что применение севооборота лимских бобов и гороха без внесения в качестве бионематоцида Paecilomyces carneus является эффективным в уменьшении плотности цист, но требует затрат времени более четырех лет.

В результате обстоятельного изучения предложен способ выделения, поддержания, массовой репродукции Paecilomyces carneus штамма IE-431, а также их применения в профилактике и/или уничтожении и/или борьбе с нематодами, создающими цисты, или обладающих характеристиками, аналогичными Globodera rostochiensis, на культурах семейства пасленовых или в культурах семейства пасленовых, таких как картофель, красный стручковый перец, томаты, баклажаны, среди других растений, на которых растет этот тип паразита, таких как Avena sativa (овес) и Vicia vollosa (вика мохнатая), и табак.

В качестве дополнения к продукту согласно настоящему изобретению предложены композиции нематоцид, содержащие живые клетки Paecilomyces carneus штамма IE-431, и по меньшей мере носитель живых клеток и при необходимости устройство для внесения упомянутых нематоцид. Предпочтительно композиция для внесения на культивируемые растения или почву имеет форму суспензии; однако данные композиции могут разрабатываться и вноситься в форме таблеток, порошка, капсул, эмульсии, микроэмульсии, раствора или любой другой формы внесения, известной в уровне техники.

ПРИМЕРЫ

Ниже с целью описания, но не ограничения, описаны композиции, которые могут применяться в разведении грибка Paecilomyces carneus штамма IE-431 и полученные нематоцидные композиции.

Пример 1: Композиция А для массового разведения Paecilomyces carneus штамма IE-431.

Пример 2: Композиция В для массового разведения Paecilomyces carneus штамма EI-431.

Пример 3: Композиция С для выделения и сохранения Paecilomyces carneus штамма IE-431.

Пример 4: Нематоцидная композиция А-1

Пример 5: Нематоцидная композиция В-1

Пример 6: Нематоцидная композиция С-1

Настоящее изобретение обеспечивает в общем следующие преимущества:

1. Способ борьбы с сельскохозяйственными паразитами, основанный на чистых и поддерживающих технологиях.

2. Упомянутый способ обеспечивает улучшение качества почвы, поскольку он позволяет рекультивировать почвы, занимаемые культурами пасленовых.

3. Время, необходимое для уничтожения нематод, занимает один посадочный цикл, что может исключить постоянный внутренний карантин номер 17 против золотистой нематоды Globodera rostochiensis.

4. Происходит непосредственное улучшение качества полученного продукта, благодаря чему продлевается срок его хранения.

5. Полученные нематоцидные композиции являются безвредными как для человека, так и для животных.

6. Популяция золотистой нематоды уменьшается после самого первого внесения.

7. Цисты поражаются непосредственно, вследствие чего после самого первого внесения получают сельскохозяйственные продукты улучшенного качества.

8. Нематоцид можно сочетать с другими способами борьбы с паразитами, такими как севооборот.

Группа изобретений относится к био-нематоцидной композиции для профилактики или уничтожения или борьбы с нематодами в культурах, пораженных нематодами Globodera spp, образующими цисты, и ее применению. Указанная композиция содержит суспензию живых клеток Paecilomyces carneus, полученных в результате перманентного или статичного процесса и при непрерывной оксигенации с содержанием кислорода в диапазоне от 40% до 90%, в диапазоне концентраций от 3000000 клеток/мл до 30000000 клеток/мл и композиции в количестве 1000 мл, содержащей 80-100 мл морковного сока, q.s. (достаточного количества) 1000 мл воды и 500 мг ампициллина, либо 50-150 мл/л морковного сока, q.s. 1000 мл воды, 20-50 г/л овса, 0,1-0,5 г/л дрожжей и 1000 мг хлорамфеникола, либо 50-160 г/л моркови, q.s. 1000 мл воды, 20-50 г/л овса и 1000 мг хлорамфеникола. Применение указанной композиции для профилактики или уничтожения или борьбы с нематодами, отдельно или в сочетании с по меньшей мере одним носителем, осуществляют одновременно с севооборотом и/или химическими методами борьбы с паразитами, и/или биологическими методами борьбы с паразитами. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 6 пр.

1. Био-нематоцидная композиция для профилактики или уничтожения или борьбы с нематодами в культурах, пораженных нематодами Globodera spp, образующими цисты, содержащая суспензию живых клеток Paecilomyces carneus, полученных в результате перманентного или статичного процесса и при непрерывной оксигенации с содержанием кислорода в диапазоне от 40% до 90%, в диапазоне концентраций от 3000000 клеток/мл до 30000000 клеток/мл и композиции в количестве 1000 мл, содержащей 80-100 мл морковного сока, q.s. (достаточного количества) 1000 мл воды и 500 мг ампициллина, либо 50-150 мл/л морковного сока, q.s. 1000 мл воды, 20-50 г/л овса, 0,1-0,5 г/л дрожжей и 1000 мг хлорамфеникола, либо 50-160 г/л моркови, q.s. 1000 мл воды, 20-50 г/л овса и 1000 мг хлорамфеникола.

2. Био-нематоцидная композиция по п. 1, содержащая 5000000 живых клеток Paecilomyces carneus/мл, 80-100 мл морковного сока, q.s. 1000 мл воды и 500 мг ампициллина.

3. Био-нематоцидная композиция по п. 1, содержащая 30000000 живых клеток Paecilomyces carneus/мл, 50-150 мл/л морковного сока, q.s. 1000 мл воды, 20-50 г/л овса, 0,1-0,5 г/л дрожжей и 1000 мг хлорамфеникола.

4. Био-нематоцидная композиция по п. 1, содержащая 3000000 живых клеток Paecilomyces carneus/мл, 50-160 г/л моркови, q.s. 1000 мл воды, 20-50 г/л овса и 1000 мг хлорамфеникола.

5. Био-нематоцидная композиция по п. 1, причем культурой, пораженной нематодами Globodera spp, образующими цисты, является пасленовая культура.

6. Применение композиции по п. 1, отдельно или в сочетании с по меньшей мере одним носителем, осуществляемое одновременно с севооборотом и/или химическими методами борьбы с паразитами, и/или биологическими методами борьбы с паразитами.

7. Применение по п. 6, в котором по меньшей мере одно применение осуществляют до начала цикла выращивания и/или во время цикла выращивания, и/или после каждого цикла выращивания.