СПОСОБЫ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОГО МЕДИЦИНСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ EX VIVO НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ НОВООБРАЗОВАНИЯ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 G01N33/574 

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно американской патентной заявке US №61/179685, поданной 19 мая 2009, которая полностью включена в настоящий документ в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается применения платформы для скрининга для определения профиля чувствительности цитотоксического лекарственного средства для множества лекарственных средств и комбинаций лекарств, используя пробы от больных злокачественными заболеваниями. В настоящей заявке описывается платформа для скрининга на основе клеток, включающая как автоматическую подготовку образца, так и автоматическую оценку с помощью проточной цитометрии, пригодная в качестве персонализированного медицинского теста благодаря экспресс-обработке данных, анализа данных и сообщения результатов даже для очень большого количества лекарств и лекарственных комбинаций. Также раскрываются конкретные лекарственные комбинации, пригодные для лечения пролиферативного лимфоидного заболевания.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Существует множество способов оценки профиля чувствительности цитотоксического препарата ex vivo к опухолевым клеткам, взятым от больных злокачественным заболеванием. Исследования ех vivo для обнаружения гибели клеток в гематологических новообразованиях развивались течение последних 40 лет, что привело к созданию множества способов определения чувствительности к химиотерапии. Для этих методов был недавно предложен термин Тест на Персонализированный Ответ Опухоли/Пробы (ITRT) для описания "эффекта противоопухолевой терапии на целых живущих опухолевых клетках, недавно выделенных от больных злокачественным заболеванием" (Bosanquet et al., G. J. Kaspers, В. Coiffier, М. С.Heinrich and E.H. Estey. New York, NY, 2008, Informa Healthcare: 23-44). Один из первых ITRTs, разработанный для изучения способности лекарственного средства замедлять или угнетать рост клеточных новообразований (например, оценка клоногенности), не дает хороших результатов. Однако в 1980-е годы было разработано множество ITRTs гибели клеток, которые систематически показывали хорошие сравнительные результаты между результатами исследований и исходом болезни (то есть клинические корреляции).

Даже при очень хорошей клинической корреляции доступные в настоящее время ITRTs гибели клеток имеют нежелательные недостатки, которые ограничивают их использование в качестве персонализированных медицинских тестов. Например, оценка клоногенности вообще требует недель, а не дней до получения результатов, что ограничивает их клиническую ценность (Hamburger et al., Science 1977,197:461-463; Marie et al., Br J Haematol 1983, 55:427-437; Selby et al., New Engi J Med 1983, 308:129-134). Кроме того, большинство ITRTs при оценке эффекта инкубации образцов с лекарственными средствами ex vivo измеряют гибель всех клеток. Исследование гибели всех клеток ограничивает способность ITRT различить эффект действия препарата на опухолевые клетки против нормальных клеток. Доступные в настоящее время ITRTs отличаются друг от друга, главным образом, методиками, используемыми для определения процента живых клеток или живых опухолевых клеток в конце исследования.

В то время как некоторые ITRTs определяют непосредственно клетки, большинство оценивает гибель клеток косвенно, используя суррогатные маркеры. Например, МТТ (метил-тиазолил тетразолий) метод оценивает число живых клеток путем измерения митохондриального снижения МТТ к формазану, выявляя изменение в цвете, что может быть количественно определено с помощью спектрофотометра (Pieters et al., Blood 1990, 76:2327-2336; Sargent et al., Br j Cancer 1989, 60:206-210; Carmichael et al., Cancer Res 1987, 47:936-942). Другие ITRTs используют гидролиз флуоресциендиацетата (например, флуорометрический анализ цитотоксичности микрокультур (FMCA)) или клеточные уровни АТР как косвенные маркеры клеточной жизнеспособности (Rhedin et al., LeukRes 1993, 17:271-276; Larsson et al., Int J Cancer 1992, 50:177-185). DiSC (цитотоксичность с дифференциальной окраской) испытание и позже, TRAC (Ответ опухоли на Противоопухолевые Составы) оценивают красящие методы использования, чтобы определить живые опухолевые клетки микроскопией (Bosanquet и др., J Haematol 2009, 146:384-395; Bosanquet и др., Leuk Res 1996, 20:143-153; Weisenthal и др., Cancer Res 1983, 43:749-757).

Вышеупомянутые ITRTs нуждаются в выдерживании опухолевых клеток пациента совместно с цитотоксичными лекарственными препаратами в течение, по крайней мере, 4-5 дней. Однако гематологические клетки начинают терять важнейшие свойства после всего-навсего 24-48 часов нахождения вне человеческого тела. Более короткие периоды выдержки позволят проводить исследования цитотоксичных профилей вне тела до начала лечения пациента, таким образом увеличится их клиническая польза и будет создана возможность для более эффективного их применения в качестве персонализированных медицинских тестов.

Упомянутые цитотоксичные лекарственные препараты уничтожают болезнетворные клетки стимулированием апоптоза (Aragane и др. / Cell Biol 1998, 140:171-182; Han-nun и др. Blood 1997, 89:1845-1853). Апоптоз является типом клеточной гибели, главным образом, называемым в уровне техники «программируемой гибелью клеток», которую уровень техники определяет в соответствии с морфологическими и антигенными характеристиками. Апоптоз обычно начинается в течение часов, после того как лекарственные препараты приводят в контакт с целевыми клетками (Del Bino и др., Cell Prolif 1999, 32:25-37). Существует множество анализов для апоптоза, основанных на показателях, которые отражают различные аспекты процесса апоптоза, таких как: 1) изменения в митохондриальном потенциале оболочки с использованием DiOC6 или JC-I (Tabrizi и др., Leukemia 2002, 16:1154-1159; Liu и др., Leukemia 2002, 16:223-232); 2) распад внутриядерных DNA, определяемый Т dt в заключительной деоксинуклеотидной трансферазе (TUNEL) анализа (Liu и др., Leukemia 2002, 16:223-232), использующего электрофорез или мечение акридином оранжевым (Tabrizi и др., Leukemia 2002, 16(6): 1154-9; Kirn и др., Exp Mol Med 2000, 32:197-203; Konstantinov и др. / Cancer Res Clin Oncol 2002, 128:271-278; Ofir и др. Cell Death Differ 2002, 9:636-642); или 3) распознование протеолитических фрагментов эфира поли-ADP-рибозы полимеразы (PARP) или капсазы-3 с использованием специфических антител (Konstantinov и др. / Cancer Res Clin Oncol 2002, 128(5):271-8; Ofir и др., Cell Death Differ 2002, 9(6):636-42; Byrd и др. Blood 2002, 99:1038-1043; Hasenjager и др., Oncogene 2004, 23:4523-4535; Prokop и др., Oncogene 2003, 22:9107-9120).

Другие методы исследования апоптоза основываются на его обнаружении посредством проточной цитометрии Анексина V, конъюгированного с флуоресцентным маркером (т.е. флуорохромом). Анексин V связывается со сформированными остатками фосфатидилсерина, которые только появились на поверхности оболочки клеток, подвергающихся апоптозу (Tabrizi и др., Leukemia 2002, 16(6); 1154-9; Nimmanapalli и др. Cancer Res 2002, 62:5761-5769). Количественно апоптоз может быть оценен соответственно процентному содержанию клеток, связавшихся с конъюгатом Анексин V-флуоресцентный агент, определенному с помощью проточной цитометрии. Дополнительно известно несколько комбинаций моноклональных антител, используемых для идентификации опухолевых клеток (для того, чтобы отличить их от нормальных клеток). Таблица 1 обобщает различные комбинации моноклональных антител, которые, будучи конъюгированы с флуорохромом, могут быть использованы для идентификации гематологических опухолевых клеток с использованием различных спектроскопических методов обнаружения.

Таблица 1 Комбинации моноклональных антител для определения опухолевых клеток Гематологические новообразования Флюорохром С-конъюгат ALL, CLL, NHL, CD19-PE.CD45-APC MM CD38-PE, CD45-APC AML CD34-PE, CD45-APC ALL=острый лимфоцитарный лейкоз; ХЛЛ=хронический лимфоцитарный лейкоз; НХЛ=неходжкинская лимфома; ММ=множественная миелома; AML=острая миелобластная лейкемия.

Некоторые ITRTs, в частности DiSC и TRAC анализы, допускают одновременное исследование цитотоксичности в опухолевых клетках и нормальных клетках и определение терапевтического индекса (Bosanquet и др., Leuk. Res. 1996; 20: 143-53; Bosanquet и др., J Exp Ther Oncol 2004; 4: 145-54).

Исследования, приведенные в нескольких научных обзорах, показали способность ITRTs давать прогнозы. Обзор 1929 клинических корреляций гематологических злокачественных опухолей (Bosanquet и др. in Kaspers и др. (eds.), 2008) и другие обзоры (например, Kaspers G.J., Methods Mol Med. 2005; 110:49-57) показывает высокий процент положительной прогнозирующей эффективности, в частности в отношении сопротивляемости лекарственным препаратам. Объединив результаты многочисленных статей (Таблица 2), Nagoumey обнаружил, что положительная прогнозирующая эффективность в отношении чувствительности к лекарственным препаратам составляла 81,8%, а отрицательная прогнозирующая эффективность в отношении сопротивляемости лекарственным препаратам составляла 83,3% (обработав данные http://www.rationaltherapeutics.com/phy-sicians/contentl. aspx?rid=35 и приведенных там ссылок (посещено 7 May 2010)).

Таблица 2 Список опубликованных клинических корреляций, подтверждающих способность ITRTs к прогнозам

Гематологический рак N ТР TN FP FN Ref. ALL 3 2 1 0 0 1 ALL 17 14 2 1 0 2 ALL 25 16 3 5 1 3 ALL 130 90 18 20 2 4 ALL 58 40 6 0 12 5 ALL 4 1 2 1 0 6 ALL 4 3 1 0 0 7 ALL 29 18 5 2 4 8 ALL 2 2 0 0 0 9 ALL/ХЛЛ 55 38 7 10 0 10 AML 4 0 1 2 1 2 AML 11 6 5 0 0 11 AML 21 11 8 2 0 6 AML 83 74 9 0 0 12 AML 27 6 13 0 8 13 AML 21 10 9 2 0 14 AML 33 11 8 4 10 15 AML/ALL/НХЛ 73 45 16 9 3 16 AML 12 7 3 2 0 17 AML 14 9, 1 2 2 3 AML 14 9 2 1 2 4 AML 17 11 4 1 1 7 AML 27 12 12 2 1 18 AML 34 20 11 2 1 19 ХЛЛ 80 12 48 18 2 2 ХЛЛ 34 26 6 2 0 20 ХЛЛ 1 1 0 0 0 6 ХЛЛ 15 11 3 0 1 21 ХЛЛ 15 9 4 1 1 8 ХЛЛ 3 2 1 0 0 9 ХЛЛ/ALL/HXn 226 102 76 41 7 22 ХЛЛ (бластная) 9 2 6 1 0 8

НХЛ 1 1 0 0 0 17 НХЛ 10 3 3 3 1 2 НХЛ 3 2 0 1 0 1 НХЛ 50 27 10 11 2 23 НХЛ 10 6 3 1 0 8 НХЛ 3 0 3 0 0 9 Итого 1178 659 310 147 62

N=номер случая; ТР=Истинно Положительные; TN=Истинно Отрицательные; FP=Ложно положительные; FN=Ложно отрицательные; Ref.=Использованый источник (см. ссылки и конец описания); ALL=острый лимфоцитарный лейкоз; ХЛЛ=хронический лимфоцитарный лейкоз; AML=острый миелобластный лейкоз; НХЛ=неходжкинская лимфома.

В настоящий момент в Великобритании проводится рандомизированное контролируемое клиническое исследование с участием большого числа пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (UK LRF ХЛЛ4 trial, Catovsky и др., Lancet 2007, 370:230-39). Исследование включает оценку ITRT как внешнего фактора, связанного с реакцией пациента на лечение (Bosanquet и др.: ASH Annual Meeting Abstracts Blood, 2006 108:94a: Abstract 303). Испытание началось в 1999 и включает 777 пациентов с предварительно не леченным ХЛЛ. Пациенты были подвергнуты лечению хлорамбуцилом (Chl) или флударабином+/-циклофосфамид (Flu or FluCy). До лечения пациента в этом испытании использовался TRAC метод анализа для ex vivo оценки чувствительности к лекарственным препаратам. Для проведения анализов пациенты были разделены на три группы в зависимости от их ITRT результатов: Устойчивый к лекарственным препаратам (DR), чувствительный к лекарственным препаратам (DS) или нейтральный к лекарственным препаратам (DI). В таблице 3 содержатся обобщенные результаты.

Таблица 3 Корреляция между ITRT результатами (DS, DI, и DiL) и реакцией на те же лекарственные препараты пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией Результат Chl Flu FluCy Итого DS 85.1(94) 90.7(54) 95.7(70) 89.9(218) DI 66.3(92) 79.2(53) 97.3(37) 76.4(182) DR 37.6(24) 21.4(14) 25.0(4) 31.0(42) Итого 71.5(210) 77.7(121) 93.7(111) 78.7(442)

Результаты выражены в виде % пациентов, отреагировавших (с числом пациентов в круглых скобках) на каждый из лекарственных препаратов (Chl and Flu) и на комбинацию лекарственных препаратов (FluCy).

Как показано в таблице 3, ITRT результаты хорошо соотносятся с клиническими ответными реакциями пациентов. Среди 49% пациентов со статусом DS большинство (90%) реагирует на химеотерапию, тогда как среди 9,5% пациентов со статусом DR только 31% реагирует на химиотерапию. Среди 24 пациентов со статусом DR к Chl 71% были со статусом DS или DI к Flu и все имели статус DS или DI к комбинации FluCy. Среди 14 пациентов со статусом DR к Flu только 36% имели статус DS или DI к комбинации FluCy. Эти результаты означают, что, используя результаты ITRT, можно более эффективно управлять лечением, что в результате приводит к лучшим исходам заболевания.

Принимая во внимание огромный терапевтический потенциал персонализированных медицинских тестов, в данной области техники существует крайняя необходимость в разработке ITRT, использующих более короткие интервалы выдержки. Использование таких исследований для помощи в выборе лечения может потенциально повысить показатель ответа, время выживания без прогрессирования заболевания и общее время выживания пациентов, страдающих злокачественным заболеванием. Предпочтительно, анализ будет использовать проточную цитометрию для того, чтобы сделать возможным определение гибели индивидуальной опухолевой клетки и снизить время выдержки для того, чтобы получить цитотоксичный профиль в короткий срок. Также предпочтительными являются ITRT, которые будут предоставлять подробную информацию в отношении большего числа лекарственных средств и концентраций лекарственных средств, которые могут быть действующими поодиночке или в комбинации.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается разработки персонализированного медицинского теста для пациента. В наиболее общем воплощении, настоящее изобретение относится к композициям, способам и системам для исследования клеточного ответа на лекарственные средства, использующим анализ ex vivo. Описанное в настоящей заявке представляет собой способы исследования образцов цельной крови, манипулирующие большим числом переменных, и быстро завершающиеся анализы.

В конкретном воплощении, настоящее изобретение предоставляет способ исследования клеточного ответа на воздействие лекарственных средств, включающий; получение образца ткани гематологического новообразования, извлеченного из пациента; разделение образца ткани на, по меньшей мере, 35 аликвот; комбинирование каждой из имеющихся, по меньшей мере, 35 аликвот с лекарственной композицией и измерение апоптоза в, по меньшей мере, одной клеточной популяции в каждой из, по меньшей мере, 35 аликвот. В одном из воплощений настоящего изобретения, ткань гематологического новообразования является тканью, выбранной из группы, состоящей из периферической крови, костного мозга, лимфоузла и селезенки. В другом воплощении образец является замороженным или криосохраненным образцом и перед разделением на, по меньшей мере, 35 аликвот замороженный или криосохраненный образец размораживается. В дополнительном воплощении, исследование завершается в течение 72 часов комбинирования аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, исследование завершается в течение около 48 часов комбинирования аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, исследование завершается в течение около 24 часов комбинирования аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, исследование осуществляется с использованием проточного цитометра. В дополнительном воплощении, число аликвот с единой лекарственной композицией, по меньшей мере, около 96. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, две лекарственные композиции содержат одно и то же лекарственное средство в различной концентрации. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция содержит множество лекарственных средств. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция содержит множество лекарственных средств, которые нецитотоксичны. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция содержит то же лекарственное средство или лекарственное средство из той же терапевтической категории, что и лекарственное средство, которое уже введено пациенту. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция комбинирует нецитотоксичное и цитотоксичное лекарственное средство. В дополнительном воплощении, апоптоз селективно определяется для конкретной клеточной популяции. В дополнительном воплощении, измеряется апоптоз популяции клеток, указывающих на наличие гематологического новообразования. В дополнительном воплощении, гематологическое новообразование выбрано из группы, состоящей из: хронического лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза взрослых, детского острого лимфобластного лейкоза, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, острого не-М3 миелобластного лейкоза, острого миелобластного лейкоза М3, неходжкинской лимфомы, лимфомы Ходжкина и хронического миелоидного лейкоза. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция включает флударабин и хлорамбуцил в комбинации с сертралином, пароксетином или флуоксетином. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция включает флударабин и циклофосфамид. В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает инъекцию клеток образца ткани гематологического новообразования в организм мыши; выдержку в течение времени, достаточного для того, чтобы введенные инъекцией клетки размножились в организме мыши, и удаление размножившихся клеток из организма мыши, где инъекция, размножение и удаление клеток происходит перед комбинированием аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает подготовку отчета, объединяющего результаты стадии измерения. В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает подготовку отчета по группе подвергнутых лечению пациентов. В дополнительном воплощении, лекарственная композиция включает соединение, выбранное из группы, состоящей из: 5-азацитидина; алемтузумаба; аминоптерина; амонафида; амсакрина; CAT-8015; бевацизумаба; ARR Y520; триоксида мышьяка; AS1413, ATRA; AZD 6244; AZD1 152; баноксантрона; бегеноил-ара-С; бендамустина; блеомицина; блинатумомаба; бортезомиба; бусульфана; карбоплатина; СЕР-701; хлорамбуцила; хлородеоксиаденозина; кладрибина; клофарабина; СРХ-351; циклофосфамида; циклоспорина; цитарабина; цитозин-арабинозида; дазатиниба; даунорубицина; децитабина; дегликозилированной рициновой цепи, конъюгированной анти-CD19/анти-CD22 иммунотоксинами; дексаметазона; доксорубицина; элацитарабина; энтиностата; эпратузумаба; эрвиназы; этопозида; эверолимуса; экзатекана мезилата; флавопиридола; флударабина; фородесина; гемцитабина; гемтузумаба-озогамицина; гомохарингтонина; гидрокортизона; гидрокискарбамида; идарубицина; ифосфамида; иматиниба; интерферона альфа 2а; йодного 1131 моноклонального антитела ВС8; ифосфамида; изотретиноина; ларомустина; L-аспарагиназы; леналидомида, лестауртиниба, мафосфамида, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата; метилпреднизолона; метилпреднизона; мидостаурина; митоксантрона; неларабина; нилотиниба; облимерсена; паклитаксела; панобиностата; пэгаспаргазы; пентостатина; пирарубицина; РКС412; преднизолона; преднизона; PSC-833; рапамицина; ритуксимаба; ривабирина; сапацитабина; динациклиба; сорафениба; STA-9090; такролимуса; танеспимицина; темсиролимуса; тенипозида; терамепрокола; талидомида; тиогуанина; тиотепа; типифарниба; топотекана; треосульфана; троксоцитабина; винбластина; винкристина; виндезина; винорелбина; ворелоксина; вориностата; этопозида; цозуквидара. В дополнительном воплощении, лекарственная композиция включает соединение, выбранное из группы, состоящей из: гидрата оксида алюминия, лоразепама, амикацина, меропенема, цефепима, ванкомицина, тейкопланина, ондастерона, дексаметазона, амфотерицина В (липосомального), каспофугина, итраконазола, флуконазола, вориконазола, триметоприма, сульфаметоксазола, G-CSF, ранитидина, расбуриказы, парацетамола, метамизола, хлорида морфина, омепразола, пароксетина, флуоксетина, сертралина.

В другом воплощении, настоящее изобретение предоставляет способ исследования ответа опухолевых клеток на лекарственное средство, включающий: получение образца ткани гематологического новообразования, извлеченного из пациента; разделение образца ткани на, по меньшей мере, 35 аликвот; комбинирование каждой из имеющихся, по меньшей мере, 35 аликвот с лекарственной композицией, где лекарственная композиция для каждой аликвоты отличается от лекарственных композиций для всех прочих аликвот, по меньшей мере, одним видом лекарственного средства, одной из концентраций или комбинацией этих признаков, и где все лекарственные композиции включают, по меньшей мере, одно нецитотоксичное лекарственное средство; выдержку аликвот, скомбинированных с лекарственной композицией, и определение восприимчивости к лекарственной композиции, по меньшей мере, одного типа опухолевых клеток для каждой из подвергнутых выдержке аликвот. В одном из воплощений настоящего изобретения, ткань выбрана из группы, состоящей из периферической крови, костного мозга, лимфоузла и селезенки. В другом воплощении образец является замороженным или криосохраненным образцом и перед разделением на, по меньшей мере, 35 аликвот замороженный или криосохраненный образец размораживается. В дополнительном воплощении, исследование завершается в течение 72 часов комбинирования аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, исследование завершается в течение 48 часов комбинирования аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, исследование завершается в течение 24 часов комбинирования аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает подготовку отчета, объединяющего результаты стадии измерения. В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает подготовку отчета по группе подвергнутых лечению пациентов. В дополнительном воплощении, число аликвот с единой лекарственной композицией, по меньшей мере, около 96. В дополнительном воплощении, исследование осуществляется с использованием проточного цитометра. В дополнительном воплощении, опухолевые клетки являются характерными для гематологического новообразования. В дополнительном воплощении, гематологическое новообразование выбрано из группы, состоящей из: хронического лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза взрослых, детского острого лимфобластного лейкоза, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, острого не-М3 миелобластного лейкоза, острого миелобластного лейкоза М3, неходжкинской лимфомы, лимфомы Ходжкина и хронического миелоидного лейкоза. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна лекарственная композиция включает флударабин и циклофосфамид. В дополнительном воплощении, способ дополнительно включает инъекцию опухолевых клеток образца в организм мыши; выдержку в течение времени, достаточного для того, чтобы введенные инъекцией опухолевые клетки размножились в организме мыши, и удаление размножившихся клеток из организма мыши, где инъекция, размножение и удаление клеток происходит перед комбинированием аликвот с лекарственной композицией. В дополнительном воплощении, лекарственная композиция включает соединение, выбранное из группы, состоящей из: 5-азацитидина; алемтузумаба; аминоптерина; амонафида; амсакрина; CAT-8015; бевацизумаба; ARR Y520; триоксида мышьяка; AS 1413, ATRA; AZD 6244; AZD1 152; баноксантрона; бегеноил-ара-С; бендамустина; блеомицина; блинатумомаба; бортезомиба; бусульфана; карбоплатина; СЕР-701; хлорамбуцила; хлородеоксиаденозина; кладрибина; клофарабина; СРХ-351; циклофосфамида; циклоспорина; цитарабина; цитозин-арабинозида; дазатиниба; даунорубицина; децитабина; дегликозилированной рициновой цепи, конъюгированной анти-CD19/анти-CD22 иммунотоксинами; дексаметазона; доксорубицина; элацитарабина; энтиностата; эпратузумаба; эрвиназы; этопозида; эверолимуса; экзатекана мезилата; флавопиридола; флударабина; фородесина; гемцитабина; гемтузумаба-озогамицина; гомохарингтонина; гидрокортизона; гидрокискарбамида; идарубицина; ифосфамида; иматиниба; интерферона альфа 2а; йодного 1 131 моноклонального антитела ВС8; ифосфамида; изотретиноина; ларомустина; L-аспарагиназы; леналидомида, лестауртиниба, мафосфамида, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата; метилпреднизолона; метилпреднизона; мидостаурина; митоксантрона; неларабина; нилотиниба; облимерсена; паклитаксела; панобиностата; пэгаспаргазы; пентостатина; пирарубицина; РКС412; преднизолона; преднизона; PSC-833; рапамицина; ритуксимаба; ривабирина; сапацитабина; динациклиба; сорафениба; сорафениба; STA-9090; такролимуса; танеспимицина; темсиролимуса; тенипозида; терамепрокола; талидомида; тиогуанина; тиотепа; типифарниба; топотекана; треосульфана; троксоцитабина; винбластина; винкристина; виндезина; винорелбина; ворелоксина; вориностата; этопозида; цозуквидара. В дополнительном воплощении, лекарственная композиция включает соединение, выбранное из группы, состоящей из: гидрата оксида алюминия, лоразепама, амикацина, меропенема, цефепима, ванкомипина, тейкопланина, ондастерона, дексаметазона, амфотерицина В (липосомального), каспофугина, итраконазола, флуконазола, вориконазола, триметоприма, сульфаметоксазола, G-CSF, ранитидина, расбуриказы, парацетамола, метамизола, хлорида морфина, омепразола, пароксетина, флуоксетина, сертралина.

В дополнительном воплощении, настоящее изобретение предоставляет способ содействия лечению у пациента гематологического новообразования, включающий: заготовление полученного от пациента образца ткани, содержащего опухолевые клетки; выдержку каждой из, по меньшей мере, 6 порций образца совместно с различным лекарственным средством или лекарственной комбинацией; исследование каждой из порций образца для установления степени апоптоза опухолевых клеток в данной порции и создание в печатном или электронном виде отчета о результатах стадии исследования, указывающих на, по меньшей мере, порцию, лекарственное средство или лекарственную комбинацию, имеющую наибольшую степень апоптоза. В еще одном воплощении, в стадии исследования и выдержки дополнительно включены порции, в которых концентрация лекарственного средства отличается от концентраций других порций.

В дополнительном воплощении, настоящее изобретение представляет устройство для исследования ответа опухолевых клеток на возможные схемы лечения, включающее множество камер, а в каждой из множества камер - различное лекарственное средство или лекарственную комбинацию, где все камеры содержат: по меньшей мере, одну камеру, содержащую множество лекарственных средств; по меньшей мере, одну камеру, содержащую цитотоксичное лекарственное средство и всего, по меньшей мере, 10 различных лекарственных средств в общих камерах. В еще одном воплощении, устройство дополнительно включает, по меньшей мере, одну камеру, содержащую нецитотоксичное лекарственное средство. В дополнительном воплощении, устройство дополнительно включает, по меньшей мере, две камеры, содержащие одно и то же лекарственное средство в различных концентрациях. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна камера содержит флударабин или хлорамбуцил в комбинации с сертралином, пароксетином или флуоксетином. В дополнительном воплощении, по меньшей мере, одна камера содержит флударабин и циклофосфамид. В дополнительном воплощении, одна или более из, по меньшей мере, 10 различных лекарственных композиций выбрана из группы, состоящей из: 5-азацитидина; алемтузумаба; аминоптерина; амонафида; амсакрина; CAT-8015; бевацизумаба; ARR Y520; триоксида мышьяка; AS1413, ATRA; AZD 6244; A2D1 152; баноксантрона; бегеноил-ара-С; бендамустина; блеомицина; блинатумомаба; бортезомиба; бусульфана; карбоплатина; СЕР-701; хлорамбуцила; хлородеоксиаденозина; кладрибина; клофарабина; СРХ-351; циклофосфамида; циклоспорина; цитарабина; цитозин-арабинозида; дазатиниба; даунорубицина; децитабина; дегликозилированной рициновой цепи, конъюгированной анти-CD19/анти-CD22 иммунотоксинами; дексаметазона; доксорубицина; элацитарабина; энтиностата; эпратузумаба; эрвиназы; этопозида; эверолимуса; экзатекана мезилата; флавопиридола; флударабина; фородесина; гемцитабина; гемтузумаба-озогамицина; гомохарингтонина; гидрокортизона; гидрокискарбамида; идарубицина; ифосфамида; иматиниба; интерферона альфа 2а; йодного 1131 моноклонального антитела ВС8; ифосфамида; изотретиноина; ларомустина; L-аспарагиназы; леналидомида, лестауртиниба, мафосфамида, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата; метилпреднизолона; метилпреднизона; мидостаурина; митоксантрона; неларабина; нилотиниба; облимерсена; паклитаксела; панобиностата; пэгаспаргазы; пентостатина; пирарубицина; РКС412; преднизолона; преднизона; PSC-833; рапамицина; ритуксимаба; рива-бирина; сапацитабина; динациклиба; сорафениба; сорафениба; STA-9090; такролимуса; танеспимицина; темсиролимуса; тенипозида; терамепрокола; талидомида; тиогуанина; тиотепа; типифарниба; топотекана; треосульфана; троксоцитабина; винбластина; винкристина; виндезина; винорелбина; ворелоксина; вориностата; этопозида; цозуквидара. В дополнительном воплощении, одна или более из, по меньшей мере, 10 различных лекарственных композиций выбрана из группы, состоящей из: гидрата оксида алюминия, лоразепама, амикацина, меропенема, цефепима, ванкомицина, тейкопланина, ондастерона, дексаметазона, амфотерицина В (липосомального), каспофугина, итраконазола, флуконазола, вориконазола, триметоприма, сульфаметоксазола, G-CSF, ранитидина, расбуриказы, парацетамола, метамизола, хлорида морфина, омепразола, пароксетина, флуоксетина, сертралина. В дополнительном воплощении, опухолевые клетки характерны для множественной миеломы (ММ), и, по меньшей мере, одна камера содержит, по меньшей мере, одну лекарственную комбинацию, выбранную из группы, состоящей из: идарубицин+цитарабин+VP-16; даунорубицин+цитарабин; идарубицин+цитарабин; дауноксом+цитарабин; митоксантрон+цитарабин+VP-16; ATRA+идарубицин; цитарабин+митоксантрон+ATRA. В дополнительном воплощении, опухолевые клетки характерны для хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), и, по меньшей мере, одна камера содержит, по меньшей мере, одну лекарственную комбинацию, выбранную из группы, состоящей из: циклофосфамид + доксорубицин + винкристин + преднизолон; циклофосфамид + доксорубицин + преднизолон; флударабин + циклофосфамид + ритуксимаб; пентостатин + циклофосфамид + ритуксимаб; флударабин + циклофосфамид + офатумумаб; пентостатин + циклофосфамид + офатумумаб; флударабин + циклофосфамид + афутузумаб; пентостатин + циклофосфамид + афутузумаб. В дополнительном воплощении, опухолевые клетки характерны для острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), и, по меньшей мере, одна камера содержит, по меньшей мере, одну лекарственную комбинацию, выбранную из группы, состоящей из: винкристин + даунорубицин + преднизон; винкристин + преднизон + митоксантрон + цитарабин; метотрексат + цитарабин + гидрокортизон; дексаметазон + винкристин + метотрексат + цитарабин + L-аспарагиназа + 6-меркаптопурин; циклофосфамид + доксорубицин + винкристин + дексаметазон; дексаметазон + даунорубицин + циклофосфамид + L-аспарагиназа; винкристин + преднизон; метотрексат + этопозид + цитарабин + тиогуанин; метотрексат + 6-меркаптопурин; винкристин + даунорубицин + L-аспарагиназа + циклофосфамид + преднизон; тенипозид + цитарабин; винкристин + даунорубицин + циклофосфамид + L-аспарагиназа + дексаметазон; винкристин + L-аспарагиназа; винкристин + даунорубицин + цитарабин + L-аспарагиназа + иматиниб + преднизон; митоксантрон + цитарабин + иматиниб; метотрексат + иматиниб + 6-меркаптопурин; тенипозид + цитарабин + иматиниб; винкристин + даунорубицин + циклофосфамид + L-аспарагиназа + дексаметазон + иматиниб. В дополнительном воплощении, опухолевые клетки характерны для неходжкинской лимфомы (НХЛ), и, по меньшей мере, одна камера содержит, по меньшей мере, одну лекарственную комбинацию, выбранную из группы, состоящей из: циклофосфамид + доксорубицин + винкристин + преднизон; циклофосфамид + доксорубицин + винкристин + преднизон + ритуксимаб; циклофосфамид + доксорубицин + виндезин + преднизон; циклофосфамид + доксорубицин + виндезин + преднизон + интерферон альфа; циклофосфамид + винкристин + преднизон; циклофосфамид + винкристин + преднизон + ритуксимаб; митоксантрон + хорамбуцил + преднизолон; митоксантрон + хлорамбуцил + преднизолон + ритуксимаб; флударабин + ритуксимаб; циклофосфамид + доксорубицин + виндезин + преднизон + блеомицин; метотрексат + этопозид + ифосфамид + цитарабин; метотрексат + винкристин + преднизон; доксорубицин + циклофосфамид + преднизон + винкристин + блеомицин + преднизон + дексаметазон + цитарабин + цисплатин; флударабин + циклофосфамид + митоксантрон; циклофосфамид + доксорубицин + винкристин + дексаметазон; метотрексат + гидрокортизон + цитарабин + дексаметазон 4-циклофосфамид; бендамустин + митоксантрон; ифосфамид + карбоплатин + этопозид + ритуксимаб; этопозид + преднизон + винкристин + циклофосфамид + доксорубицин + ритуксимаб. В дополнительном воплощении, опухолевые клетки характерны для острого миелоидного лейкоза (AML), и, по меньшей мере, одна камера содержит, по меньшей мере, одну лекарственную комбинацию, выбранную из группы, состоящей из: идарубицин + цитарабин + VP-16; даунорубицин + цитарабин; идарубицин + цитарабин; дауноксом + цитарабин; митоксантрон + цитарабин + VP-16; ATRA + идарубицин; цитарабин + митоксантрон + ATRA; даунорубицин + цитарабин + тиогуанин; даунорубицин + цитарабин + VP-16; флударабин + идарубицин + цитарабин + G-CSF; флударабин + цитарабин + G-CSF; высокая доза цитарабина + VP-16 + даунорубицин; гемтузумаб-озогамицин + идарубицин + цитарабин; гемтузумаб-озогамицин + цитарабин; клофарабин + цитарабин; клофарабин + цитарабин + идарубицин; амсакрин + цитарабин + VP-16; митоксантрон + VP-16; идарубицин + цитарбин + ингибиторы FLT3; цитарбин + ингибиторы FLT3; цитарабин + ингибиторы аврора киназы; идарубицин + цитарабин + панобиностат; флударабин + идарубицин + цитарабин + G-CSF + гемтузумаб; кладрибин + идарубицин + цитарабин; децитабин + вальпроевая кислота; генесенс + флударабин + цитарабин; генасенс + даунорубицин + цитарабин; генасенс + цитарабин; генасенс + гемтузумаб-озогамицин; PSC833 + даунорубицин + цитарабин; PSC833 + идарубицин + цитарабин; PSC833 + даунорубицин + цитарабин + VP-16; бортезомиб + идарубицин + цитарабин.

В дополнительном воплощении композиция для лечения хронического лимфоидного лейкоза (ХЛЛ) включает флударабин или его фармацевтически приемлемую соль и сертралин или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном из воплощений обеспечивается способ для определения клеточной восприимчивости к лекарственным средствам, включающий: получение образца ткани гематологического новообразования, извлеченного из пациента; разделение образца ткани на, по меньшей мере, 35 аликвот; комбинирование каждой из, по меньшей мере, 35 имеющихся аликвот с лекарственной композицией и измерение апоптоза в, по меньшей мере, одной клеточной популяции в каждой из, по меньшей мере, 35 аликвот.

Другим воплощением обеспечивается способ определения ответа ткани новообразования на лекарственные средства, включающий получение образца ткани гематологического новообразования, извлеченного из пациента, отличающееся тем, что образец ткани содержит опухолевые клетки; разделение образца ткани на, по меньшей мере, 35 аликвот; комбинирование, по меньшей мере, 35 аликвот с лекарственной композицией, отличающееся тем, что лекарственная композиция в каждой из аликвот отличается от лекарственных композиций во всех прочих аликвотах, по меньшей мере, одним видом лекарственного средства, одной из концентраций или комбинацией этих признаков, и при этом все лекарственные композиции содержат, по меньшей мере, одно нецитотоксичное лекарственное средство; выдержку скомбинированных с лекарственной композицией аликвот и определение для каждой выдержанной аликвоты восприимчивости к лекарственной композиции, по меньшей мере, одного типа опухолевых клеток.

Ткань гематологического новообразования может различаться. Например, ткань может быть выбрана из группы, состоящей из периферической крови, костного мозга, лимфоузла и селезенки. Описание настоящей заявки для простоты относится к образцам крови, хотя специалист в данной области техники будет осведомлен, что те же принципы применимы к любому образцу ткани, затронутой гематологическим новообразованием, содержащим опухолевые клетки.

В одном из воплощений, способ для определения клеточной восприимчивости к лекарственным средствам включает: получение образца крови, забранной у пациента на начальный момент времени; комбинирование отдельных аликвот образца крови с несколькими лекарственными композициями и определение апоптоза в, по меньшей мере, одной клеточной популяции, в каждой из аликрот. В некоторых воплощениях образец крови получается одной группой, которая направляет образец другой группе на анализ. В предпочтительном воплощении способ для определения ответов опухолевых клеток крови на цитотоксичные лекарственные средства, нецитотоксичные лекарственные средства и их комбинации включает стадии: а) получения образца крови, отобранной у пациента в начальный момент времени; б) разделения образца на, по меньшей мере, 5, 10, 15, 20, 35, 50 или 100 аликвот; в) комбинирования каждой аликвоты с отдельной лекарственной композицией; г) выдерживания аликвот совместно с лекарственными композициями; д) определения восприимчивости, по меньшей мере, одного типа опухолевых кровяных клеток, содержащегося в аликвоте, к лекарственной композиции, содержащейся в аликвоте; и е) завершения способа в течение 48 часов с момента получения образца крови у пациента. В другом воплощении, лекарственные композиции, комбинируемые с каждой из аликвот, отличаются друг от друга, по меньшей мере, одним из видов лекарственного средства, одной из концентраций или комбинацией этих признаков.

Для клинической действенности такой разновидности способа как персонализированный медицинский тест предпочтительным является то, что способ завершается в короткий интервал времени. В частности, метод завершается в короткий интервал времени в отношении времени выдержки образца. В одном из воплощений, анализ завершается в течение 120 часов с того момента, как образец был отобран у пациента. В другом воплощении, анализ завершается в течение 96 часов с того момента, как образец был отобран у пациента. В дополнительном воплощении, анализ завершается в течение 72 часов с того момента, как образец был отобран у пациента. В дополнительном воплощении, анализ завершается в течение 48 часов с того момента, как образец был отобран у пациента. В дополнительном воплощении, анализ завершается в течение 24 часов с того момента, как образец был отобран у пациента. Однако прочие методы, например, где образец замораживается или где клетки вводятся инъекцией в организм мыши для размножения, могут выходить за указанные интервалы времени, в которые анализ завершается. В одном из воплощений, измерение завершается в течение 120 часов с момента комбинирования аликвот с лекарственным средством. В другом воплощении, измерение завершается в течение 96 часов с момента комбинирования аликвот с лекарственным средством. В дополнительном воплощении, измерение завершается в течение 72 часов с момента комбинирования аликвот с лекарственным средством. В дополнительном воплощении, измерение завершается в течение 48 часов с момента комбинирования аликвот с лекарственным средством. В дополнительном воплощении, измерение завершается в течение 24 часов с момента комбинирования аликвот с лекарственным средством.

Методы получения образцов клеток у пациентов известны из уровня техники. В одном из воплощений, образец клеток получается из цельной крови. В другом воплощении, образец клеток представляет собой цельную кровь. В другом воплощении образец клеток представляет собой удельную периферическую кровь. В другом воплощении образец получается из костного мозга. В другом воплощении образец клеток получается из лимфоузлов. В другом воплощении, образец клеток получается из селезенки. В другом воплощении, образец клеток получается из любой другой ткани, затронутой гематологической злокачественной опухолью. Образцы клеток могут быть быстро проанализированы после того, как они получены, или они могут быть обработаны химическим реактивом для предотвращения коагуляции и проанализированы в более поздний момент времени. В одном из воплощений, образец крови обрабатывается гепарином для предотвращения коагуляции. В другом воплощении, образец костного мозга обрабатывается гепарином для предотвращения коагуляции. В другом воплощении, образец крови или костного мозга обрабатывается ЭДТА для предотвращения коагуляции. В другом воплощении, образец крови или костного мозга обрабатывается для предотвращения коагуляции антикоагулянтом, включая, но не ограничиваясь: ингибитором тромбина. Предпочтительно, чтобы образец использовался без стадий очистки и разделения, так чтобы клеточная среда являлась более близкой к среде in vivo.

Могут быть испытаны тысячи лекарственных композиций. Способы, описанные в настоящей заявке, способны проанализировать большое число комбинаций лекарственных средств в различных концентрациях в форме аликвот для того, чтобы оценить вариации персонализированных схем лечения. В одном из воплощений, способ анализирует около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 500 или более аликвот (необязательно - на лекарственную композицию) или диапазон, определенный любыми двумя предшествующими значениями. В другом воплощении, метод анализирует около 96 или более аликвот. Дополнительно, число лекарственных композиций может варьироваться в зависимости от числа аликвот. В одном из воплощений, и число аликвот, и число различных лекарственных композиций больше чем около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 или находится в диапазоне, определенном любыми двумя предшествующими значениями. В другом воплощении, и число аликвот, и число различных лекарственных композиций больше чем около 50. В другом воплощении, и число аликвот, и число различных лекарственных композиций больше чем около 96.

Авторы изобретения неожиданно открыли, что значительное число нецитотоксичных соединений может вызывать клеточный апоптоз. Хотя известно, что в некоторых случаях нецитотоксичные лекарственные средства способны вызвать апоптоз опухолевых клеток, это считалось очень редким событием. Изобретатели открыли, что значительные дозы нецитотоксичных лекарственных средств вызывают апоптоз злокачественных клеток указанных гематологических новообразований. Кроме того, способы, раскрытые в настоящей заявке, неожиданно указывают на то, что конкретные нецитотоксичные соединения способны усиливать способность цитотоксичных препаратов вызывать апоптоз. Таким образом, различные типы политерапии комбинациями множества лекарственных средств могут иметь благоприятный терапевтический эффект.

В одном из воплощений, способы, описанные в настоящей заявке, анализируют клеточные ответы на лекарственные композиции, включающие одно или более цитотоксичное соединение. В другом воплощении, способы, описанные в настоящей заявке, анализируют клеточные ответы на лекарственные композиции, включающие одно или более нецитотоксичное соединение. В другом воплощении, способы, описанные в настоящей заявке, анализируют клеточные ответы на лекарственные композиции, включающие одно или более цитотоксичное соединение и включающие одно или более нецитотоксичное соединение. В другом воплощении, способы, описанные в настоящей заявке, анализируют одну или более лекарственную композицию, включающую одно или более нецитотоксичное лекарственное средство, которое является тем же лекарственным средством или лекарственным средством из той же группы, что и лекарственные средства, которые уже вводились пациенту. В другом воплощении, способы, описанные в настоящей заявке, анализируют одну или более лекарственную композицию, включающую одно или более нецитотоксичное лекарственное средство из иной группы, чем лекарственные средства, которые уже вводились пациенту. В одном из воплощений, лекарственные композиции включают несколько композиций, включающих одно и то же лекарственное средство в различных концентрациях. В другом воплощении, лекарственные композиции включают несколько различных смесей лекарственных средств. В другом воплощении, все лекарственные композиции включают, по меньшей мере, 5 различных лекарственных средств.

Возможная схема лечения перед введением для пациента может быть оптимизирована по цитотоксической эффективности. Кривые доза-ответ, созданные с помощью описанных в настоящей заявке методов для различных комбинаций лекарственных средств, показывают, что оптимальная эффективность может быть достигнута при использовании более низких доз высокотоксичных лекарственных средств, а также показывают синергизм этих лекарственных средств. Неожиданно некоторые комбинации двух цитотоксичных лекарственных средств были менее эффективны, одно из лекарственных средств индивидуально, что указывает на то, что эти цитотоксичные лекарственные средства могут вести себя как цитопротекторные лекарственные средства в определенных комбинациях (т.е. негативный суммарный эффект). В одном из воплощений, способы, описанные в настоящей заявке, используют оптимум для выбора концентрации лекарственного средства для пациента. В другом воплощении, способы, описанные в настоящей заявке, используют ЭК90 и ЭК50 для выбора концентрации лекарственного средства для пациента.

В дополнении к индивидуальным эффектам лекарственных средств, детально анализируются взаимодействия лекарственных средств, включая комбинационный индекс и индекс снижения дозы, которые могут быть использованы для определения эффективных политерапевтических схем. Оценки точности обоих индексов могут быть подсчитаны с помощью точных алгебраических оценочных алгоритмов (т.е. моделирования методом Монте Карло), основанных на методах среднего эффекта, описанных Chou and Talalay (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55). Индекс комбинации (CI) представляет собой количественный показатель степени взаимодействия лекарственного средства в зависимости от суммарного эффекта, где на синергизм указывает CI<1; на аддитивный эффект CI=1; а на антагонизм указывает CI>1.

Индекс снижения дозы (DRI) представляет собой показатель того, насколько доза каждого из лекарственных средств в синергической комбинации может быть снижена при данном уровне эффекта по сравнению с дозой каждого из лекарственных средств, взятых поодиночке. В недавнем времени для оценки показателей взаимодействия лекарственных средств в качестве альтернативы методу среднего эффекта Chou and Talalay (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55) был предложен метод MixLow (Boik et al., BMC Pharmacol 2008, 8:13; Boik, Stat Med 2008, 27(7): 1040-61). Одним из преимуществ метода MixLow является то, что используемая для оценки параметров кривых концентрация-ответ нелинейная модель эффектов смесей может обеспечить более точные оценки параметров, чем логарифмическая линеаризация и анализ методом наименьших квадратов, используемые в методе среднего эффекта. Специалист в данной области будет осведомлен, что эти подсчеты и связанные с ними методы могут быть использованы для анализа взаимодействий лекарственных средств для описанных в настоящей заявке смешанных медикаментозных терапий. В некоторых воплощениях, комбинация более чем одного лекарственного средства оценивается на предмет потенцирования, синергизма или способности к снижению дозы. В некоторых воплощениях, комбинация, указанная как демонстрирующая лекарственное взаимодействие, выбирается для лечения.

Число лекарственных композиций, которое может быть проанализировано персонализированным медицинским тестом, ограничивается ограниченным числом образцов, которое может быть получено от пациента. Однако современные разработки представляют модели на мышах, которые позволяют прорастить первичные клетки пациентов со злокачественными гематологическими новообразованиями в организмах множества мышей, становящихся непрерывным источником клеток пациентов (Pearson et al., Curr Top Microbiol Immunol. 2008, 324:25-51; Ito et al., Curr Top Microbiol Immunol. 2008, 324:53-76). Эти модели могут позволить исследовать ex vivo намного больше лекарственных композиций и, в частности, лекарственных комбинаций, чем образцы, недавно извлеченные из пациентов. Предполагается, что эти модели могут быть использованы в описанных в настоящей заявке способах. Например, образцы могут быть извлечены из животной модели, такой как мышиная модель. В частности, эти модели могут дать возможность исследовать эффективность сопутствующих или адъювантных лекарственных препаратов, вводимых пациентам для смягчения эффектов химиотерапии. Эти модели также могут дать возможность исследования потенциальной эффективности одобренных безопасных нецитотоксичных лекарственных средств, которые в будущем могут быть дополнены терапией для конкретных пациентов с целью повысить вероятность терапевтической эффективности. Кроме того, эффективность любой комбинации лекарственных композиций, определенная в ех vivo тестировании с использованием человеческих клеток пациентов непосредственно из образцов, полученных от пациента, или пророщенных с помощью мышиных моделей, может быть протестирована на мышиных моделях in vivo.

Помимо персонализированных медицинских тестов, желательно обеспечить пациентов и лиц, осуществляющих за ними уход, итоговыми отчетами о клеточных ответах на лекарственные средства и лекарственные комбинации. В одном из воплощений, способ включает подготовку отчета, обобщающего результаты стадии исследования. В другом воплощении, способ включает предоставление отчета пациенту. В другом воплощении, способ включает предоставление отчета группе, ответственной за лечение пациента. В другом воплощении, способ включает предоставление отчета группе, ответственной за интерпретацию стадии исследования.

Настоящее раскрытие также включает, в частности, лекарственные комбинации, пригодные, например, для лечения AML, ALL, ХЛЛ, и НХЛ, и применение этих комбинаций для лечения лимфопролиферативных заболеваний.

Одно из воплощений настоящего изобретения предоставляет устройство для определения ответа опухолевых клеток на возможные схемы лечения, включающее множество камер и различные лекарственные средства или лекарственные комбинации в каждой из множества камер. В одном из воплощений, все камеры содержат, по меньшей мере, одну камеру, содержащую множество лекарственных средств, по меньшей мере, одну камеру, содержащую цитотоксичное лекарственное средство, и, по меньшей мере, 10 различных лекарственных средств во всех камерах вместе взятых. В одном из воплощений, по меньшей мере, одна камера содержит нецитотоксичное лекарственное средство. В одном из воплощений, по меньшей мере, одна камера содержит цитотоксичное лекарственное средство и нецитотоксичное лекарственное средство. В одном из воплощений, по меньшей мере, две камеры содержат одно и то же лекарственное средство в различных концентрациях.

Любой признак или комбинация признаков, описанные в настоящей заявке, включены в объем притязаний настоящего изобретения, при условии, что признаки, включенные в любую такую комбинацию, не являются взаимно несовместимыми, что будет следовать из контекста, настоящего описания и знаний специалиста в данной области. Дополнительные усовершенствования и аспекты настоящего изобретения следуют из дальнейшего подробного описания,

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 изображает проточно-цитометрическое обнаружение экспрессии фосфатидилсерина на апоптозных клетках с использованием Анексина V, помеченного флуоресцеином.

Фигура 2 изображает предшественника B-ALL взрослых, отображающего BCR/-ABL генные реаранжировки, и обнаружение лейкозных и нормальных клеток среди CD 19 положительных клеток с использованием количественной проточной цитометрии.

Фигура 3 иллюстрирует протокол ex vivo анализа периферической крови (РВ) или костного мозга (ВМ) в образце, полученном от пациента с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ).

Фигура 4 изображает ех vivo ответ у девяти различных пациентов на несколько лекарственных средств, в настоящий момент одобренных для лечения ХЛЛ.

Фигура 5 изображает число лекарственных композиций, которые желательно оптимизировать персонализированным медицинским тестом лечения для индивидуального пациента.

Фигура 6 изображает несколько нецитотоксичных лекарственных средств (т.е. пароксетин, флуоксетин, сертралин, гуанабенз и астемизол), вызывающих апопотоз в образцах злокачественного ХЛЛ с той же эффективностью, что и цитотоксичные лекарственные средства, одобренные для лечения ХЛЛ (т.е. флударабин, хлорамбуцил и митоксантрон).

Фигура 7 изображает кривую доза-ответ для пароксетина на образце цельной крови, полученной от пациента с ХЛЛ, и сравнивает эффекты апоптоза пароксетина на лейкозных, Т и NK клетках.

Фигура 8 изображает кинетическое различие в индупцировании апоптоза сертралином и тремя лекарственными средствами, в настоящий момент используемыми для лечения ХЛЛ, в образцах цельной крови пациентов с ХЛЛ.

Фигура 9 изображает дифференциальную эффективность индуцирования апоптоза в ХЛЛ образцах соединениями из того же фармакологического класса, что и пароксетин (т.е. селективные ингибиторы обратного захвата серотонина).

Фигура 10 изображает частоту попадания, выраженную в виде числа образцов пациентов, из общего числа образцов пациентов, равного 23, для которых нецитотоксичные лекарственные средства уничтожают лейкозные ХЛЛ клетки с той же эффективностью, что и одобренные цитотоксичные лекарственные средства, и иллюстрирует то, что большинство нецитотоксичных лекарственных средств являются эффективными для очень малого количества пациентов.

Фигура 11 изображает усиление эффективности одобренного цитотоксичного лекарственного средства хлорамбуцила нецитотоксичным лекарственным средством сертралином.

Фигура 12 изображает процент Анексин-V-положительных клеток, появление которых вызвано цитотоксичными лекарственными средствами винкристином, митоксантроном и циклофосфамидом (которые используются для лечения ХЛЛ) и процент Анексин-V-положительных клеток, появление которых вызвано нецитотоксичными лекарственными средствами омепразолом и ацикловиром (которые часто назначаются для лечения побочных эффектов, вызванных химиотерапией).

Фигура 13 А-С иллюстрирует исполнения 96-луночного планшета для персонализированного медицинского тестирования пациентов с ХЛЛ.

Фигура 14 A-F иллюстрирует исполнения 96-луночного планшета для персонализированного медицинского тестирования пациентов с множественной миеломой.

Фигура 15 иллюстрирует исполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского тестирования пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), включающее цитотоксичное и нецитотоксичное лекарственные средства, вводимые в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА. МТХ: метотрексат; 6МР: 6-меркаптопурин; ARA-C: цитарабин; DNR: даунорубицин; ADRIA: адриамицин; М: митоксантрон; VP-16: этопозид; VM-26: тенипозид; CF: циклофосфамид; IFOS: ифосфамид; V: винкристин; VIND: виндезин; L-ASA: аспарагиназа; EVIAT: иматиниб; R: ритуксимаб; Р: преднизон; НС: гидрокортизон; DXM: дексаметазон; Foli: лейковорин; Mesna: месна; Om: омепразол; О: ондастерон; Allop: аллопуринол; GCSF: филграстим.

Фигура 16 иллюстрирует исполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского тестирования пациентов с миелодиспластическим синдромом, включающее цитотоксичное и нецитотоксичное лекарственные средства, вводимые в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА.

Фигура 17 иллюстрирует исполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского тестирования пациентов с острым миелобластным лейкозом (не М3), включающее цитотоксичное и нецитотоксичное лекарственные средства, вводимые в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА. Dauno: даунорубицин; Ida: идарубицин; ARA-C: цитарабин; Mitox: митоксантрон; VP16: этопозид; Fluda: флударабин; GCSF: филграстим; Ondans: ондастерон; Cotri: котримаксозол; AcF: фолиевая кислота; Alop: аллопуринол; Оm: омепразол; Carbop: карбоплатин; Dauno Про: липосомальный даунорубицин (Дауноксом®); AMSA: амсакрин; GO: гемтузумабозогамицин.

Фигура 18 иллюстрирует исполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского тестирования пациентов с острьм миелобластным лейкозом М3 (промиелоцитарным), включающее цитотоксичное и нецитотоксичное лекарственные средства, вводимые в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА. ATRA (полный трансизомер ретиноевой кислоты): третиноин; Ida: идарубицин; Mitox: митоксантрон; ARA-C: цитарабин; 6-МР: 6-меркаптопурин; МТХ: метотрексат; Ondans: ондастерон; Alop: аллопуринол; Оm: омепразол; Dexa: дексаметазон; VP-16: этопозид; Fluda: флударабин; Carbop: карбоплатин; Dauno lipo: липосомальный даунорубицин; Dauno: даунорубицин; Cotri: котримаксозол; FAc: фолиевая кислота.

Фигура 19 изображает воздействие сертралина на индукцию апоптоза в клеточных линиях ТОМ-1 и MOLT-4.

Фигура 20 изображает воздействие сертралина на индукцию апоптоза в клеточных линиях ТОМ-1 и MOLT-4 по прошествии 24 часов.

Фигура 21 изображает воздействие сертралина на индукцию активной каспазы-3 в клеточных линиях ТОМ-1 и MOLT-4 по прошествии 24 часов.

Фигура 22 изображает ex vivo эффективность индивидуальных лекарственных средств (т.е. ритуксимаба, флударабина, митоксантрона и циклофосфамида (мафосфамида)) и наиболее устойчивые и чувствительные политерапии с использованием комбинаций этих индивидуальных лекарственных средств в отношении ХЛЛ образцов.

Фигура 23 изображает результаты того же эксперимента, что и на фигуре 22, в виде 5-точечной кривой доза-ответ, характеризующей ех vivo эффективность флударабина, циклофосфамида (мафосфамида) и их комбинаций.

Фигура 24 изображает результаты того же эксперимента, что и на фигуре 24, в виде 5-точечной кривой доза-ответ, характеризующей ех vivo эффективность флударабина, циклофосфамида (мафосфамида), митоксантрона и их комбинаций.

Фигура 25 изображает результаты того же эксперимента, что и на фигуре 24, в виде 5-точечной кривой доза-ответ, характеризующей ех vivo эффективность флударабина, циклофосфамида (мафосфамида), ритуксимаба и их комбинаций.

Фигура 26 изображает воздействие флударабина и мафосфамида поодиночке и в комбинации при пяти различных концентрациях в клиническом протоколе для двух пациентов, значение 2,0144 (слева) и значение 2,0149 (справа).

Фигура 27 показывает вычисление синергизма между флударабином и мафосфамидом (циклофосфамидом), обнаруженного у пациентов с ХЛЛ Р2.0149 с Фигуры 26, используя метод Chou и Talalay (Chou et al., Eur J Biochem 1981, 115(0:207-16; Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984,22:27-55).

Фигура 27 изображает расчет синергетического взаимодействия между флударабином и мафосфамидом (циклофосфамидом), обнаруженного для пациентов с ХЛЛ, с использованием значения 2,0149, взятого из фигуры 26, и метода Chou и Talalay (Chou et al., Eur J Biochem 1981, 115(1):207-16; Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984,22:27-55).

Фигура 28 изображает воздействие времени выдержки (для обоих лекарственных средств время воздействия 0,5; 4 и 8 часов) и общего времени выдержки (24 или 48 часов) на способность флударабина и сертралина вызывать апоптоз злокачественных клеток в ХЛЛ образцах.

Фигура 29 изображает матрицу для 2 лекарственных комбинаций.

Фигура 30 изображает матрицу для 3 лекарственных комбинаций.

Фигура 31 изображает матрицу для 4 лекарственных комбинаций.

Фигура 32 изображает 3-цветное разделение лейкоцитов периферической крови с использованием отслеживающих клеточных красителей.

Фигура 33 изображает флуорохромные красители, используемые для разделения в ХЛЛ образцах, позволяющие отличить злокачественные клетки и обнаружить апоптоз с помощью Анексина V.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ИСПОЛНЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет композиции, системы и способы для того, чтобы оценить ex vivo эффективность множества лекарственных комбинаций вызывать апоптоз, использующие скрининговую платформу. В частности, настоящее изобретение предоставляет способ для осуществления основанного на исследовании клеток скрининга, включающего и автоматизированное приготовление образцов, и автоматизированный анализ с помощью проточной цитометрии, которые используются совместно для быстрого получения данных, анализа и подготовки ответа о результатах. Использование методов проточной цитометрии позволяет определять индивидуальную гибель клетки, которая в масштабах одной клетки может позволить сократить время выдержки ех vivo анализов, и тем самым обеспечить анализ профиля цитотоксичности с более быстрым рабочим циклом. Основанная на анализе клеток скрининговая платформа также может быть использована для завершения всех скрининговых и проверочных анализов в пределах 24-72 часов с момента забора образца. Эти временные рамки позволяют после осуществления диагностических исследований на гематологических новообразованиях и до начала лечения сообщить о результатах доктору. Следовательно, способы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для индивидуального подбора терапии и для определения возможных новых показаний одобренных лекарственных средств.

Для того чтобы настоящее изобретение было более легко понято, вначале определены конкретные признаки. Дополнительные определения приведены на протяжении всего подробного описания.

Использованные в настоящей заявке термины «ЭК50» и «ЭК90» касаются концентраций лекарственного средства, необходимых для того, чтобы вызвать максимальный апоптоз у 50% и 90% клеток соответственно.

Использованный в настоящей заявке термин «ex vivo» касается первичных человеческих клеток пациента in vitro, где клетки могут быть недавно извлеченными, криосохраненными или замороженными для сохранения их состояния. В некоторых исполнениях, эти клетки размораживаются для исследования воздействия лекарственных средств in vitro.

Использованный в настоящей заявке термин «терапевтический показатель ex vivo» касается соотношения между гибелью злокачественных клеток и гибелью здоровых клеток.

Использованный в настоящей заявке термин «Exvitech» касается интегрированной платформы, включающей автоматизированное приготовление образцов, систему с электромагнитным датчиком положения для автоматизированного ввода в проточный цитометр и автоматизированный биоинформационный анализ.

Использованный в настоящей заявке термин «гематологические новообразования» также называемые «гематологические злокачественные новообразования» касаются группы заболеваний, определенных в соответствии с классификацией Всемирной Организации Здравоохранения (Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri S, Stein H, Thiele J, Vardiman JW (Eds): WHO Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. International Agent for Research of Cancer (IARC), Lyon. 4th Edition. Lyon 2008).

Использованный в настоящей заявке термин Тест/тестирование на Персонализированный Ответ Опухоли/Пробы (ITRT) касается способов, описывающих эффект противоопухолевого лечения на примере цельных живых опухолевых клеток, недавно извлеченных из пациентов, подверженных злокачественному заболеванию.

Использованный в настоящей заявке термин «политерапия» касается лечения пациента множеством лекарственных средств.

Использованный в настоящей заявке термин «нецитотоксичное» соединение или лекарственное средство касается соединения или лекарственного средства, не одобренного контрольным органом в качестве цитотоксичного, химиотерапевтического или противоопухолевого агента.

Использованный в настоящей заявке термин «аликвота» касается образца или его части, которые могут находиться в отдельных контейнерах или лунках, или могут быть расфасованы в трубки или иное устройство хранения, в котором может быть сохранена разница в содержании лекарственного средства, виде лекарственного средства или концентрации лекарственного средства даже в совпадающих образцах, вне зависимости от того, являются ли эти образцы непрерывными или разделенными газом или несмешивающейся жидкостью (например, маслом).

Использованный в настоящей заявке термин «лекарственная композиция» касается единственного лекарственного средства и его различных концентраций или комбинаций лекарственных средств и их различных концентраций, добавляемых к аликвотам для анализа или вводимых пациенту для лечения.

Использованный в настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к форме соединения, в котором данное соединение не оказывает значимого раздражающего действия на организм, в который оно вводится, и не теряет своих свойств и биологической активности. Фармацевтические соли могут быть получены с помощью рутинного проведения экспериментов.

Использованный в настоящей заявке термин «ячейка» или «камера» касается любого устройства со способностью к удержанию образца, достаточной для осуществления методов, описанных в настоящей заявке. Специалист в данной области будет осведомлен, что термин «ячейка» или « камера» может включать, например, углубление в планшете, пятно на стеклянной пластине, созданное поверхностным натяжением, или область микроструйного устройства.

Далее в деталях будут приведены ссылки на предпочтительные в настоящий момент исполнения изобретения, примеры которых сопровождаются чертежами. Там, где возможно, одни и те же или близкие номера ссылок используются в чертежах и описании в отношении одних и тех же или подобных частей. Следует заметить, что чертежи выполнены в упрощенной форме и не содержат точной шкалы. Хотя раскрытое здесь относится к конкретно проиллюстрированным исполнениям, понятно, что эти исполнения представлены для примера и не служат для ограничения настоящего изобретения. Назначение последующего подробного описания, хотя оно и обсуждает типичные исполнения, состоит в том, чтобы объяснить и охватить все модификации, альтернативы и эквиваленты исполнений, которые могут подпадать под объем и сущность изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. Раскрытые способы могут быть использованы совместно с различными медицинскими процедурами, широко используемыми в уровне техники.

Раскрытые способы имеют несколько усовершенствований по сравнению с тем уровнем техники, который описан в настоящей заявке. Одним из усовершенствований является то, что способы могут исследовать клеточные ответы в большом числе вариаций, включающих множество лекарственных композиций и различные интервалы выдержки. Другим усовершенствованием является скорость, с которой способы анализируют клеточный ответ на лекарственные средства. Другим усовершенствованием является способность анализировать цельную кровь, тем самым обеспечивается способность более близко имитировать in vivo среду пациента. Кроме того, с помощью настоящих способов можно получить кривые доза-ответ для большого числа лекарственных средств и лекарственных композиций. Сочетая эти способы, можно усовершенствовать разработку политерапевтических схем лечения пациентов. В конкретном воплощении, способы способствуют разработке политерапевтических схем лечения пациентов, страдающих гематологическими расстройствами.

Раскрытые способы допускают использование различных типов оборудования, включая один или более тип готовящих образцы роботов и один или более тип проточных цитометров для определения клеточной восприимчивости к лекарственным композициям. Проточная цитометрия позволяет проводить анализы на одной клетке на скоростях, удивительно далеких от скоростей любых прочих технологий анализа на одной клетке, известных из уровня техники. Это позволяет проанализировать статистически значимое число клеток быстрее, чем при использовании другой альтернативной методики. В одном из воплощений, проточная цитометрия используется для определения клеточной восприимчивости к лекарственным композициям. В одном из воплощений, анализ завершается в течение около 96 часов с того момента, как был получен образец. В другом воплощении, анализ завершается в течение около 72 часов с того момента, как был получен образец. В другом воплощении, анализ завершается в течение около 48 часов с того момента, как был получен образец. В другом воплощении, анализ завершается в течение около 24 часов с того момента, как был получен образец.

Один из примеров проточного цитометра, пригодного для использования в раскрытых в настоящей заявке методах, приводится в патенте США №7459126, содержание которого включается сюда путем ссылки полностью и для всех назначений, включая, без ограничения, описание проточного цитометра.

Роботы для подготовки образцов и проточные цитометры могут быть интегрированы или не интегрированы друг с другом. В одном из вариантов осуществления, проточный цитометр используется без робота для подготовки образцов. В конкретном исполнении без робота для подготовки образцов используется цитометр CYAN™ (Beck-man Coulter, Fullerton, CA). Существует много различных типов роботов для подготовки образцов, известных из уровня техники. В одном из вариантов осуществления, проточный цитометр используется с любым приемлемым роботом для подготовки образцов или жидкостным манипулятором, известным из уровня техники. В другом варианте осуществления, цитометр CYAN™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) интегрирован с малым жидкостным манипулятором для автоматизации доставки образцов в цитометр, называемым EPS. В конкретном исполнении, EPS является жидкостный манипулятор Tecan 360 (Tecan, Mannedorf, Switzerland). В другом варианте осуществления EPS изготавливается по специальному заказу, оснащенной шприцевыми насосами и интерфейсом, переключающим клапан, позволяющий аспирировать содержимое каждой из ячеек через фиксированный наконечник, передать его по замкнутому контуру и ввести в цитометр. В другом варианте осуществления, приготовление образцов и нанесение на планшет композиций может быть осуществлено с помощью жидкостного манипулятора BIOMEK® 3000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Могут быть использованы планшеты с любым количеством лунок. Одним из приемлемых планшетов, в частности, является 96-луночный планшет. Предполагаются также другие различные размеры планшетов, включая 24-, 48-, 384-, 1536-, 3456- или 9600-луночные. Устройства для подготовки образцов могут быть размещены в вытяжном шкафу, позволяющем сохранить стерильность образцов и композиций во время манипуляций. После завершения настройки процесса анализа планшеты загружаются на анализирующую установку.

Цитометр CYAN™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) является трехлазерным прибором с девятью детекторами. Методики, известные из уровня техники, разработаны специально для того, чтобы полностью использовать усовершенствования, предоставляемые многолазерным исполнением, и, следовательно, многопараметрической измеряющей способностью таких современных проточных цитометров. В одном из вариантов осуществления, для стадии исследования используется однолазерный цитометр. В другом варианте осуществления, для стадии исследования используется многолазерный цитометр. Разработка и оптимизация соединений из обширного класса флуорохромов и конъюгирующих химических соединений предоставляют различные вариации лигандов, таких как иммуноглобулины и малые молекулы, присоединяемых к флуорохромным соединениям. Следовательно, для мечения клеток, производимого для проведения исследований с использованием измерительной аппаратуры, использующей флуоресценцию, таких как проточная цитометрия, может быть использовано большое число спектрально различных реагентов. Эти реагенты известны из уровня техники. В одном из вариантов осуществления, в процессе стадии исследования используется одно или более флуорохромное соединение. В некоторых вариантах осуществления, для определения клеточных ответов на лекарственные композиции используется один или более краситель.

Из уровня техники известно несколько способов, минимизирующих самопроизвольное перемешивание образца в трубке до анализа. Одним таким способом, известным своей способностью минимизировать нежелательное перемешивание образца в процессе проведения ex vivo анализа, является использование поршневого насоса прямого вытеснения, позволяющего промыть трубку между лунками для того, чтобы устранить перенос клеток. Другим способом, пригодным для минимизации нежелательного перемешивания образца, является выполнение исследования. Выполнение исследования является усовершенствованием, поскольку переноса клеток не происходит. В одном из вариантов осуществления анализ включает выполнение исследования.

Из уровня техники известно несколько способов для сбора и хранения данных, полученных в исследованиях с использованием проточных цитометров. В одном из вариантов осуществления, программное обеспечение, установленное в EPS, регистрирует временную информацию о времени инъекции и времени выдержки для каждой лунки. Когда выполняется скрининговый анализ, могут быть получены два файла сбора данных. В одном из вариантов осуществления, один файл, находящийся в программном обеспечении цитометра, содержит актуальные данные о каждой клетке, проанализированной прибором. В другом варианте осуществления, второй файл является временным файлом, находящимся в программном обеспечении EPS или в программном обеспечении цитометра, содержащим данные о каждой клетке, проанализированной прибором. Каждый из этих файлов может быть назван в соответствии со штрихкодом, сосканированным с луночного планшета, например 96-луночного планшета, в начале выполнения анализа.

Пользователь может загрузить все файлы с обоих приборов в анализирующую программу, такую как EPS Analyzer. Эта программа разработана для разделения полученных цитометром данных на группы и присвоения номерам ячеек названий соединений, с которыми были смешаны клетки в каждой группе. Другое применение программы предусматривает селекцию индивидуальных популяций, основанную на считывании флуоресценции таким образом, что каждая индивидуальная популяция может быть проанализировано отдельно. Маркер для анализа, включаемый в установки программного обеспечения анализа, также определяется. В одном из вариантов осуществления для скрининговых и проверочных анализов, для того чтобы отличить живые клетки от клеток, в которых начался апоптоз, используется маркер апоптоза Анексин V FITC, присоединенный к флуорофору.

После завершения анализа файлы передаются в базу данных. В одном из вариантов осуществления, базой данных является ACTIVITYBASE™ от IDBS (Guildford, UK). Передача файлов в базу данных позволяет быстро исследовать данные, для того чтобы определить для каждого обследуемого пациента соединения, являющиеся активными. По мере того как данные аккумулируются, могут быть сконструированы и разработаны биоинформационные инструменты, облегчающие интерпретацию данных. В качестве примера, фармакологические критерии, такие как ЭК50, ЭК90, максимальный апоптоз и т.д., содержащиеся в полученных данных, могут быть перекрестно сравнены для множества образцов пациентов, и для них может быть установлена взаимосвязь с иммунофенотипичными результатами и генетической информацией. Ввиду большого количества получаемых данных для процесса скрининга важна гибкая система управления базами данных.

Эта система может с помощью измерения способности лекарственной композиции вызывать апоптоз, определить ex vivo терапевтический индекс. Фигуры 1 и 2 изображают возможность обнаруживать апоптозные клетки и отличать нормальные и опухолевые фенотипы с помощью проточной цитометрии. В одном из вариантов осуществления, в способе используется проточная цитометрия для того, чтобы отличить нормальный и опухолевые фенотипы. В другом варианте осуществления, в способе используется проточная цитометрия для того, чтобы определить апоптозные клетки. В конкретном варианте осуществления, в способе для определения экспрессии фосфатидилсерина на апоптозных клетках используется Анексин V, связанный с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC).

Одновременное использование соответствующих известных из уровня техники комбинаций моноклональных антител совместно с многопараметрической стратегией анализа позволяет отличить лейкозные клетки от остатков нормальных клеток, представленных в образцах пациентов с гематологическими расстройствами. В одном из вариантов осуществления, способ позволяет отличить злокачественные клетки от нормальных клеток и в образцах крови, и в образцах костного мозга. В другом варианте осуществления, возможность отличить злокачественные клетки от нормальных и в крови, и в костном мозге обеспечивается в соответствии с недавно разработанной методологией с помощью норматива Euroflow (EuroFlow Consortium, Cytometry A. 2008 Sep;73(9):834-46; van Dongen et al., 14th EHA Congress, Berlin, DE 4 June 2009: опубликовано в Leukemia 2010 (в прессе)).

Процесс ex vivo скрининга лекарственных композиций схематично изображен на фигуре 3. На фигуре 3 образец срабатывается гепарином для предотвращения коагуляции, для него определяется иммунофенотип, и он учитывается. Затем образец разбавляется до достижения концентрации лейкозных клеток около 4000 клеток/мкл. 45 мкл клеточной суспензии наносится на 96-луночный планшет, содержащий фармакологические агенты в 5 различных концентрациях. После выдержки образцов совместно с лекарственными средствами и лекарственными комбинациями в течение приблизительно 48 часов, красные кровяные клетки подвергаются лизису и вымываются для концентрирования лейкоцитов, содержащих злокачественные клетки. Это ускоряет процесс скрининга за счет резкого снижения объема и числа клеток, подлежащих исследованию на проточном цитометре. Для того чтобы отличить злокачественные клетки от нормальных, добавляются флуоресцентно помеченные антитела, а для того, чтобы измерить уровень апоптоза в каждой клеточной популяции, в которой имеются злокачественные клетки, добавляется флуоресцентно помеченный Анексин V. Затем осуществляется скрининг и определяется активность для каждой лекарственной композиции, а результаты анализируются и сводятся в отчет.

В одном из вариантов осуществления, способ включает разделение образца на аликвоты и распределение акликвот по луночным планшетам. Эти планшеты содержат индивидуальные лекарственные средства или лекарственные комбинации в различных концентрациях. В одном из вариантов осуществления, луночные планшеты содержат индивидуальные лекарственные средства или лекарственные комбинации в различных концентрациях до введения клеточных образцов. В другом варианте осуществления, клеточные образцы вводятся в лунки до введения индивидуальных лекарственных средств или комбинаций в различных концентрациях. В другом варианте осуществления может быть использована обширная библиотека соединений, включающая около 20, 30, 50, 75, 100, 200, 300, 500, 700, 1000 или 2000 соединений, диапазон определяется любыми двумя предшествующими значениями или большим числом соединений.

В некоторых вариантах осуществления аликвоты содержат определяемое число пораженных клеток на лунку. В одном из вариантов осуществления аликвоты содержат около 500 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления аликвоты содержат около 5000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления, аликвоты содержат около 10000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления аликвоты содержат около 20000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления аликвоты содержат около 40000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку. Тестирование образцов может осуществляться параллельно. В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, две аликвоты тестируются параллельно, с возможностью определения иммунофенотипа. Дополнительно, для определения уровня самопроизвольного апоптоза, не связанного с воздействием лекарственного средства, могут быть включены контрольные лунки без какого-либо лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления в способе для определения самопроизвольного апоптоза в образце используются контрольные ячейки.

Временной интервал выдержки различных лекарственных композиций с аликвотами может варьироваться. В одном из вариантов осуществления временной интервал составляет вплоть до около 24 часов. В другом варианте осуществления временной интервал составляет вплоть до около 72 часов. В другом варианте осуществления временной интервал составляет вплоть до около 120 часов. После выдержки в течение определенного времени аликвоты образцов, подвергнутые воздействию лекарственных композиций, могут быть обработаны буфером для того, чтобы лизировать популяцию эритроцитов и сконцентрировать популяцию лейкоцитов. В одном из вариантов осуществления, для лизирования популяции эритроцитов используется буфер, известный из уровня техники. После этого каждая лунка выдерживается совместно с реагентом для обнаружения апоптоза с использованием проточной цитометрии. В одном из вариантов осуществления, реагентом является Анексин V.

С использованием проточной цитометрии возможно оценить эффект каждого лекарственного средства в отношении каждого типа клеток, и количественно определить уровень селективной гибели клетки, вызванной каждым из лекарственных средств. После этого результаты могут быть проанализированы, и, если желательно, может быть начат новый анализ с использованием дополнительных образцов или аликвот для того, чтобы более подробно подтвердить наиболее релевантные результаты, такие как 10 ранее определенных лучших лекарственных композиций или концентраций. Отбор соответствующего лекарственного средства или лекарственной композиции, селективно вызывающих апоптоз опухолевых клеток, таких как лейкозные клетки, может быть произведен после того, как проведен анализ образца пациента. В одном из вариантов осуществления, с использованием свежего образца определяются и повторно анализируются около 5-20 лекарственных композиций. В конкретном варианте осуществления, с использованием свежего образца определяются и повторно анализируются десять лучших лекарственных композиций. В другом конкретном варианте осуществления, с использованием свежего образца определяются и повторно анализируются 20 лучших лекарственных композиций.

Способы, приведенные в настоящей заявке, использовались для того, чтобы проанализировать на различных пациентах несколько лекарственных средств, в настоящее время одобренных для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ). Например, на Фигуре 4 приводится эффективность индуцирования апоптоза злокачественных клеток в ex vivo образцах пациентов индивидуально одобренных цитотоксичных лекарственных средств. Фигура 4 демонстрирует, что в ответах на лекарственные средства имеется высокая вариабельность от человека к человеку, подчеркивающая возможность использования описанных в настоящей заявке способов в качестве персонализированных медицинских тестов.

В одном из вариантов осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие более чем 90% апоптоз в образцах пациентов. В другом варианте осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие более чем 75% апоптоз в образцах пациентов. В другом варианте осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие более чем 50% апоптоз в образцах пациентов.

Фигура 4 демонстрирует, что описанные в настоящей заявке способы также могут определять лекарственные композиции, практически не вызывающие апоптоз в образцах пациентов. Неспособность вызывать апоптоз может быть результатом генетической предрасположенности пациента к устойчивости к лекарственному средству или присущей новообразованию устойчивости к лекарственному средству. И по той, и по другой причине способность выявлять композиции, неспособные вызывать апоптоз, является желательной. В одном из вариантов осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие менее чем 90% апоптоз в образцах пациентов. В другом варианте осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие менее чем 75% апоптоз в образцах пациентов. В другом варианте осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие менее чем 50% апоптоз в образцах пациентов. В другом варианте осуществления, способом определяются лекарственные композиции, вызывающие менее чем 30% апоптоз в образцах пациентов.

Использование цельных образцов, таких как образцы цельной периферической крови или образцы костного мозга, полученных недавно и обработанных гепарином во избежание коагуляции, и разбавленных необходимым образом, является существенным признаком способов, описанных в настоящей заявке, влияющим на достижение технического результата. В одном из вариантов осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, используют образец крови. В другом варианте осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, используют образец цельной периферической крови. В другом варианте осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, используют образец костного мозга. В одном из вариантов осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, используют образец, полученный от животных моделей. В одном из вариантов осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, используют образец, полученный от мышиной модели. Использование цельных образцов является усовершенствованием, поскольку обычные in vitro изолируют только мононуклеарные фракции, содержащие опухолевые клетки и из-за промывки не принимают во внимание соответствующие полинуклеарные лимфоциты, эритроциты, белки и прочие элементы плазмы. Это существенно изменяет биологическую среду, в которой оцениваются эффекты лекарственного средства. В отличие от этого, способы, описанные в настоящей заявке, могут сохранять в плазме эритроциты, также как и белки, также как и альбумин, которые связываются с около 90-98% каждого лекарственного средства.

Таким образом, концентрации лекарственных средств, используемые в описанных в настоящей заявке анализах, могут быть приняты более близкими к реальным концентрациям лекарственных средств, существующим в плазме пациента. Использование цельных образцов является важным еще и потому, что только оно облегчает обнаружение воздействия на вызов апоптоза в опухолевых клетках таких антител, как кампат или ритуксимаб. Также важной может быть иная размерность, такая как процент элиминации вместо процента апоптоза. Хотя апоптоз измеряется в обеих размерностях, элиминация клеток учитывает клетки, которые уже погибли, по отношению к клеткам в контрольных аликвотах без лекарственного средства. Прямое обнаружение апоптоза, учитывает клетки, которые подвергаются апоптозу на момент измерения. Разницу составляет число клеток, которые после апоптоза вошли в фазу некроза и больше не могут быть обнаружены проточным цитометром. В зависимости от времени измерения, эти два анализа могут давать разные результаты. Например, при более коротких периодах обнаружения (т.е. 24 часа), клеточная элиминация и клеточный апоптоз схожи. Однако при более долгих периодах обнаружения (т.е. 48-72 часа), эти измерения расходятся, так как число клеток, вначале подвергшихся апоптозу и ставших необнаруживаемыми, увеличивается. Для оценки способности ритуксимаба вызывать апоптоз требуется дополнительное обнаружение в мононуклеарной фракции, удаленной в обычных in vitro анализах. Следовательно, способы, описанные в настоящей заявке, позволяют сохранить первоначальные условия клеточной микросреды для большого объема анализируемых образцов. В одном из вариантов осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, в большой степени сохраняют первоначальную клеточную микросреду.

Автоматизированная проточная цитометрическая платформа, описанная в настоящей заявке, является первой такой платформой, способной к проведению скрининга большого числа вариаций лекарственных композиций на ex vivo гематологических образцах пациентов. Данная платформа позволяет исследовать множество лекарственных комбинаций для индуцирования апоптоза в отношении индивидуального пациента. Поскольку гематолог в основном использует лекарственные средства и лекарственные комбинации, формально принятые в протоколе лечения (т.е. прошедшие клинические испытаний), способы и устройства, описанные в настоящей заявке, предпочтительно включают оценку лекарственных средств и лекарственных комбинаций, включенных в протоколы лечения. Эти протоколы лечения могут включать протоколы, признанные в конкретных странах. Эти протоколы могут также включать утвержденные в прошлом протоколы, даже если они уже больше не являются предпочтительными. Новейшие экспериментальные протоколы (т.е. по-прежнему находящиеся в стадии клинических исследований) также включаются, включая новые лекарственные композиции утвержденных лекарственных средств или лекарственных средств, все еще находящихся на фазах II и HI клинических исследований.

ITRT ех vivo тесты, использовавшиеся ранее для выбора персонализированного лечения пациента, были ограничены индивидуальными лекарственными средствами или очень малым числом лекарственных комбинаций. Значительный положительный эффект, достигаемый за счет оценки множества лекарственных комбинаций, т.е. за счет использования платформы ExviTech, демонстрируются на фигуре 22. Для образцов пациентов с ХЛЛ на фигуре 22 индивидуальные лекарственные средства для лечения ХЛЛ были неэффективны, что наводит на мысль о том, что лечение будет неэффективным. Однако те же самые лекарственные средства образуют три комбинации, которые были очень эффективны при элиминации всех лейкозных клеток, что наводит на мысль о возможности их применения для чувствительного лечения. Таким образом, по результатам оценки только индивидуальных лекарственных средств или только лекарственных комбинаций, использованных в настоящих протоколах лечения, были бы сделаны противоположные прогнозы. На Фигуре 22 продемонстрирована информация, которая может быть очень важна для эффективного лечения гематологических новообразований - устойчивые протоколы, вероятно, предсказывающие отсутствие клинического ответа (в центре) и высокочувствительные протоколы, вероятно предсказывающие, желательный клинически ответ (справа).

В некоторых вариантах осуществления, персонализированные медицинские тесты, описанные в настоящей заявке, оценивают каждое лекарственное средство или каждую лекарственную комбинацию в пяти различных концентрациях. Это позволяет определить минимальную кривую доза-ответ, обеспечивающую более точное фармакологическое определение эффективности, чем данные о единственной дозе. Это также облегчает качественный контроль с помощью исследования - соответствуют ли эти пять точек 8-образной кривой доза-ответ. Те же самые данные для ХЛЛ образцов, описанные на Фигуре 22 выше, показываются на 5-точечных кривых доза - ответ на фигурах 23-25.

При ex vivo оценке лекарственных комбинаций является важным определить, имеется ли положительный или негативный эффект от совместного действия комбинируемых лекарственных средств, называемый также синергетическим взаимодействием. Такое совместное действие ех vivo, скорее всего, предсказывает совместное действие in vivo в организме пациента. Положительное синергетическое взаимодействие между лекарственными средствами указывает на вероятное увеличение эффективности по отношению к токсичности, а именно - на больший терапевтический индекс. Принимая во внимание высокотоксичный характер цитотоксичных лекарственных средств, повышение их терапевтических индексов может быть терапевтически важным. В связи с этим, было сделано несколько попыток количественно оценить синергизм лекарственных средств, и наиболее широко используемым способом является способ Chou и Talalay (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55). На фигуре 26 показана синергетическая комбинация флударабина и мафосфамида (метаболит и активный ингредиент циклофосфамида) на примере двух образцов пациентов с ХЛЛ, где индекс взаимодействия (Cl), рассчитанный с использованием программы Calcusyn (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55), характеризует возможное синергетическое взаимодействие для этой комбинации. На фигуре 27 изображен более подробный расчет с использованием способа Chou и Talalay синергического взаимодействия, обнаруженного для пациента Р2.0149.

Эффективность лекарственных средств и лекарственных комбинаций может также сказываться на их кинетике. На фигуре 28 показаны различные кинетические свойства одобренного лекарственного средства флударабина и нецитоксичного лекарственного средства - антидепрессанта сертралина в отношении ХЛЛ образца. Сертралин (изображения справа) уничтожает все злокачественные клетки в течение 24 часов (верхнее изображение справа), в то время как флударабину требуется 48 часов (нижнее изображение слева). Однако для обоих лекарственных средств требуется только 30 минут выдержки совместно с образцом, чтобы вызвать максимальный апоптоз. Это указывает на то, что, хотя для того, чтобы измеряемый с помощью Анексина V апоптоз был полностью определен, требуется 24 или 48 часов, злокачественные клетки программируются на апоптоз в течение короткого периода выдержки. В одном из вариантов осуществления, лекарственные композиции выдерживаются в течение временного интервала около 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 4 часов, 8 часов или диапазона временных интервалов, определенного любыми двумя предшествующими значениями. В другом варианте осуществления, апоптоз измеряется в моменты времени около 24 часов, 48 часов или 72 часов после начала выдержки или в диапазоне моментов, определенном любыми двумя предшествующими значениями.

Как демонстрирует описанная в настоящей заявке методика, настоящая платформа позволяет оценивать от нескольких сотен до нескольких тысяч индивидуальных лунок, содержащих гематологические образцы, смешанные с лекарственными средствами, представленными в различных лекарственных композициях и концентрациях. Ограничение на число лекарственных композиций накладывают объем и количество клеток гематологического образца, полученного из организма пациента, а не пропускная способность платформы. Поскольку для каждой лекарственной композиции используется малый объем, такой как около 20000 клеток на лунку, возможно оценить вплоть до около 10000 или более лекарственных композиций на полученный образец, или вплоть до около 20000 или более лекарственных средств на образец для образцов, чей объем больше, чем обычные объемы образцов. Такое количество комбинаций является достаточным для того, чтобы определить альтернативные политерапевтические лекарственные композиции, которые могут быть введены индивидуальному пациенту. В одном из вариантов осуществления, скрининги осуществляются с использованием минимум около 500 опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления, скрининги осуществляются с использованием около 1000 опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления, скрининги осуществляются с использованием около 20000 опухолевых клеток на лунку. В другом варианте осуществления, скрининги осуществляются с использованием около 50000 опухолевых клеток на лунку. Число злокачественных клеток в образце пациента может варьироваться от практически нуля до свыше миллиарда и поэтому его отношение к общему числу клеток также может варьироваться.

На Фигуре 5 изображено число возможных лекарственных композиций, которые могут быть исследованы для того, чтобы определить оптимальное политерапевтическое лечение для индивидуального пациента. Гипотетически, в первом столбце на левой стороне Фигуры 5 рассматриваются вплоть до 15 лекарственных средств, одобренных для конкретных показаний. В источниках информации о гематологических новообразованиях указывается много лекарственных средств, в том числе несколько наиболее новых лекарственных средств, ожидающих одобрения в ближайшие годы. Имеется также ряд нецитотоксичных лекарственных средств, вводимых пациентам с гематологическими новообразованиями для того, чтобы смягчить эффекты цитотоксичного лечения (т.е. сопутствующие лекарственные средства), чей диапазон колеблется обычно в пределах от 5 до 10 лекарственных средств на пациента. Эти лекарственные средства могут варьироваться от гастропротекторов для предотвращения рвоты до антибиотиков и противовирусных средств для предотвращения инфекций. 15 лекарственных средств, выбранных на Фигуре 5, представлены в виде большого числа одобренных цитотоксичных лекарственных средств, которые были рассмотрены для данных показаний и которые могут рассматриваться как типичные для конкретных клинических практик. Выбор 15 лекарственных средств на Фигуре 5 является всего лишь иллюстративным и ни в коем случае не должен рассматриваться как ограничивающий настоящее изобретение. На Фигуре 5, комбинирование вплоть до 4 различных лекарственных средств (2-я колонка) рассматривалось в качестве репрезентативного среднего воплощения, несмотря на то что существуют протоколы, комбинирующие 5 и 6 лекарственных средств. Исполнение луночных планшетов, описанных в настоящей заявке, иллюстрирует использование вплоть до 22 различных лекарственных средств в единственном 96-луночном планшете. Кроме того, с использованием планшетов с различным числом лунок может быть проанализировано различное число лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления, для анализа выбирается около 5 лекарственных средств. В другом варианте осуществления, для анализа выбирается около 10 лекарственных средств. В другом варианте осуществления, для анализа выбирается около 20 лекарственных средств. В другом варианте осуществления, для анализа выбирается около 40 лекарственных средств.

Как показано на Фигуре 5 во второй колонке, число различных комбинаций 15 лекарственных средств - 1940, для 14 лекарственных средств оно будет 1470 и т.д. Поскольку результаты этих исследований могут использоваться для принятия решений о лечении, они предпочтительно осуществляются в пяти различных концентрациях на лекарственное средство или на лекарственную комбинацию (3-я колонка). Кроме того, определение при, по меньшей мере, 2 периодах выдержки, может позволить оценить кинетические параметры (4-я колонка). Однако исполнение анализа для пяти дозировок и/или более чем одного периода выдержки не должно рассматриваться как ограничение.

Даже учитывая все варианты, рассмотренные в предыдущем параграфе (т.е. число различных лекарственных средств, множество измерений, варьирующиеся концентрации лекарственных средств и варьирующиеся периоды выдержки), автоматизированная платформа способна исследовать вплоть до 10000 или 20000 лекарственных композиций, включая в себя все гипотетические сценарии, изображенные на Фигуре 5 как незаштрихованная область. Область терапевтического применения, которую можно определить имеющимися в настоящий момент методами, заштрихована на фигуре 5 серым. Лекарственные композиции, которые могут быть исследованы имеющимися в настоящий момент методами, вплоть до 30 или 35, заштрихованы серым. Оставшаяся часть таблицы представляет новую область применения лекарственных композиций, которая может быть исследована с помощью платформы ExviTech.

Поскольку доступные в настоящий момент управляемые вручную платформы способны исследовать вплоть до около 35 индивидуальных условий, возможность их использования в качестве персонализированных медицинских тестов ограничена. Из этого следует, что автоматизация ex vivo исследований воздействия лекарственных средств на гематологические образцы, является и желательной, и инновационной для персонализированного медицинского применения. В одном из вариантов осуществления, способом исследуется менее чем 1000 лекарственных композиций. В другом варианте осуществления, способом исследуется около 10000 лекарственных композиций. В другом варианте осуществления, способом исследуется менее чем 20000 лекарственных композиций. В некоторых вариантах осуществления, способом исследуется около 20000 лекарственных композиций, которые включают в себя 1-, 2-, 3- или 4-лекарственные комбинации из вплоть до 15 лекарственных средств. В некоторых вариантах осуществления, периоды выдержки также варьируются. Например, как показано на фигуре 5 (4-я колонка), включение более чем одного периода выдержки повышает число тестируемых комбинаций. В некоторых вариантах осуществления, использование ExviTech позволяет исследовать незаштрихованную область Фигуры 5, представляющую большинство лекарственных композиций, требующихся для индивидуализации лечения пациента.

Платформа ExviTech также может быть использована для скрининга нескольких тысяч лекарственных средств, в частности, около 1000 одобренных лекарственных средств на образец пациента, для поиска лекарственных средств, селективно вызывающих апоптоз в злокачественных клетках. Неожиданно, значительное число одобренных нецитотоксичных лекарственных средств проявило способность вызывать апоптоз в злокачественных клетках в каждом из назначений с такой же эффективностью, что и одобренные цитотоксичные лекарственные средства. На Фигуре 6 показано, что 5 нецитотоксичных лекарственных средств (слева), не одобренных для лечения гематологических злокачественных новообразований, уничтожают злокачественные клетки ХЛЛ с эффективностью, близкой к эффективности 3 цитотоксичных лекарственных средств, одобренных для лечения ХЛЛ (справа). На фигуре 7 показаны ответы на дозы одного из этих лекарственных средств, антидепрессанта пароксетина; продемонстрировано, что это лекарственное средство вызывает апоптоз преимущественно в злокачественных В клетках, а не в здоровых Т и NK клетках. На Фигуре 8 показано, что одно из этих нецитотоксичных лекарственных средств, сертралин, уничтожает злокачественные клетки ХЛЛ быстрее, чем цитотоксичные лекарственные средства, одобренные для лечения ХЛЛ (24 по сравнению с 48 часами) (слева). Три из пяти наиболее эффективных нецитотоксичных лекарственных средств - это антидепрессанты пароксетин, флуоксетин и сертралин - лекарственные средства, относящиеся к одной и той же фармакологической группе. На Фигуре 9 показано, что только 3 из 6 ингибиторов обратного захвата серотонина являются эффективными для индуцирования апоптоза в злокачественных клетках ХЛЛ. Это демонстрирует, что эти эффекты необязательно относятся к фармакологическому классу лекарственных средств и что предложенный в настоящей заявке персонализированный медицинский тест может быть использован для определения этих эффектов.

Неожиданное обнаружение этого множества безопасных, одобренных нецитотоксичных лекарственных средств, способных быть эффективными для борьбы с опухолевыми клетками, влечет за собой обширное исследование. Во-первых, только несколько таких лекарственных средств были эффективными в отношении любого рассмотренного образца, исключая неселективное воздействие. На Фигуре 10, полученной в результате скрининга 2000 лекарственных средств на 23 образцах ХЛЛ, показано, как сильно может варьироваться эффективность этих одобренных нецитотоксичных лекарственных средств от пациента к пациенту. Лекарственные средства определялись как эффективные, если они уничтожали более чем 80% злокачественных клеток - стандарт, близкий к наиболее эффективным цитотоксичным лекарственным средствам. В то время, как только 3 лекарственных средства были эффективными для более чем 80% пациентов, 229 лекарственных средства были эффективными для менее чем 20% образцов пациентов. Это указывает на то, что нецитотоксичные лекарственные средства могут быть эффективными для борьбы со злокачественными клетками ex vivo, но они проявляют очень большую степень вариабельности от пациента к пациенту. Тем не менее, почти для каждого образца пациента с ХЛЛ, было найдено 5-10 нецитотоксичных лекарственных средств, эффективных против злокачественных клеток ех vivo. Несмотря на это возможность прогнозирования этого эффекта in vivo неизвестна. Воздействие 5-10 таких нецитотоксичных лекарственных средств, введенных пациенту, совместно с фармакокинетикой и другими факторами, возможно играющими роль, такими как лекарственная форма, могут представлять значительный терапевтический эффект.

Некоторые из этих нецитотоксичных лекарственных средств, являющихся эффективными ех vivo, являются лекарственными средствами, применяемыми для смягчения эффектов цитотоксичных лекарственных средств, которые вводятся пациентам с гематологическими новообразованиями (т.е. сопутствующие лекарственные средства). На Фигуре 12 показан пример образца ХЛЛ, для которого ингибитор протонного насоса омепразол и противовирусное средство ацикловир проявляют значительную эффективность против злокачественных клеток ех vivo, сравнимую с эффективностью цитотоксичных лекарственных средств. В таблице 4 приведен список некоторых из этих сопутствующих лекарственных средств.

Таблица 4 Сопутствующие лекарственные средства. Дексаметазон - противовоспалительное средство, иммуносупрессор, глюкокортикоид Амфотерицин В (липосомальный) - противогрибковое средство Каспофунгин - противогрибковое средство Итраконазол - противогрибковое средство Флуконазол - противогрибковое средство Вориконазол - противогрибковое средство Триметоприм и бактериостатический сульфаметоксазол G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор Ранитидин - антагонист гистаминого рецептора Н2 Расбуриказа - лечение гиперурекемии Парацетамол - нестероидное противовоспалительное средство Метамизол - нестероидное противовоспалительное средство Хлорид морфина - опиатный анальгетик Омепразол - ингибитор протонного насоса Пароксетин - антидепрессант Флуоксетин - антидепрессант Сертралин - антидепрессант

Некоторые из одобренных нецитотоксичных лекарственных средств могут быть терапевтически полезны для потенцирования воздействия цитотоксичных лекарственных средств (т.е. хемосенсибилизирующие агенты). Пример показан на фигуре 11, где низкими концентрациями антидепрессанта сертралина потенцируется эффективность низких концентраций цитотоксичного лекарственного средства хлорамбуцила.

Поскольку настоящие способы предназначены для исследования большого числа вариаций, был разработан 96-луночный планшет для того, чтобы исследовать возможные вариации для политерапевтического лечения. Другие планшеты, включая планшеты с большим или меньшим числом лунок, также могут быть использованы. В одном из вариантов осуществления используется 1536-луночный планшет. В другом варианте осуществления используется 384-луночный планшет. В другом варианте осуществления используется 96-луночный планшет.

Фигуры 13-18 и примеры 9-14 иллюстрируют применение планшета с форматом в 96 лунок для исследования образцов пациентов на следующие показания к применению: хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, множественная миелома, миелодиспластический синдром, острый миелобластный лейкоз (не М3) и острый миелобластный лейкоз М3. Исполнение планшета для каждого показания к применению включает лекарственные средства, встречающиеся в настоящий момент в лечебных протоколах для этих показаний к применению Испанской программы для лечения гематологических злокачественных новообразований (Programa para el Tratamiento de Hemopatias Malignas (PETHEMA)).

В одном из вариантов осуществления способом анализируются лекарственные средства, выбранные из протоколов, одобренных клинической организацией. В конкретном варианте осуществления, способом анализируются лекарственные средства, выбранные из протокола лечения РЕТНЕМА. Лунки исполнены таким образом, чтобы использовать лекарственные средства, предписанные в соответствии с протоколом лечения РЕТНЕМА для монотерапии, а также для того, чтобы использовать комбинации лекарственных средств для монотерапии. Дополнительно, лунки исполнены таким образом, чтобы использовать лекарственные средства, предназначенные для смягчения побочных эффектов протокола лечения РЕТНЕМА, а также для того, чтобы использовать комбинации этих лекарственных средств.

В одном из вариантов осуществления, способом анализируются цитотоксичные лекарственные средства, включая лекарственные средства, одобренные и еще неодобренные клиническими исследованиями. В другом варианте осуществления, способом анализируются комбинации цитотоксичных лекарственных средств. В дополнительном варианте осуществления, способом исследуются лекарственные средства, предназначенные для лечения побочных эффектов цитотоксичных лекарственных средств. В дополнительном варианте осуществления, способом исследуются комбинации лекарственных средств, предназначенных для лечения побочных эффектов цитотоксичных лекарственных средств. Дополнительно, лунки исполнены таким образом, чтобы использовать комбинации цитотоксичных лекарственных средств и лекарственных средств, предназначенных для лечения побочных эффектов цитотоксичных лекарственных средств. В другом варианте осуществления, способом анализируются все без исключения нецитотоксичные лекарственные средства, одобренные или находящиеся на стадии клинических испытаний, предназначенные для любых показаний к применению. В дополнительном варианте осуществления, способом анализируются комбинации нецитотоксичных лекарственных средств. Например, в исполнении планшета могут использоваться комбинации цитотоксичных лекарственных средств и нецитотоксичных лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления, способом анализируются комбинации цитотоксичных лекарственных средств и нецитотоксичных лекарственных средств.

Схемы лечения гематологических новообразований продиктованы определенным ограниченным числом общепринятых среди гематологов протоколов лечения. Эти протоколы определяют политерапевтические режимы и для цитотоксичных лекарственных средств, и для дополнительных комбинаций лекарственных средств, включая дозировку и время проведения терапии каждым лекарственным средством. Протоколы отличаются в зависимости от таких переменных, как возраст, самочувствие и стадия заболевания каждого пациента. Протоколы также могут варьироваться от страны к стране, но обычно в пределах страны придерживаются одних и тех же протоколов. Внутри этих протоколов по-прежнему значительно варьируются диапазоны доз и предлагаются к использованию различные лекарственные композиции, что требует того, чтобы были исследованы десятки и сотни условий. В одном из вариантов осуществления, для того, чтобы исследовать клеточный апоптоз, используются клинически исследованные препараты. В другом варианте осуществления, клинически исследованные препараты используются в комбинации с антителами для определения подтипов опухолевых клеток. В другом варианте осуществления, препараты, используемые для определения подтипов опухолевых клеток, определяются в соответствии с действующим в настоящий момент нормативом Euroflow (van Dongen et al., EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes, 14th EHA Congress, Berlin, DE 4 June 2009: опубликовано в Leukemia 2010 (в прессе)). В другом варианте осуществления, лекарственные композиции выбраны из протокола гематологического лечения, применяемого в конкретной стране. В другом варианте осуществления, лекарственные композиции выбраны из прежнего протокола гематологического лечения, используемого в конкретной стране. В другом варианте осуществления, лекарственные композиции выбраны из экспериментального протокола, используемого в конкретной стране, определенного как новая комбинация лекарственных средств, одобренных для гематологического лечения. В другом варианте осуществления, лекарственные композиции выбраны из протоколов, включающих лекарственные средства, проходящие клинические испытания для определения возможности применения для гематологического лечения.

Эффект каждого лекарственного средства, применяемого в лечебном протоколе, предпочтительно, должен быть оценен индивидуально. Однако эта оценка не должна рассматриваться как ограничение. С использованием способов, описанных в настоящей заявке, индивидуально оцениваться должны не только монотерапевтические лекарственные средства, но также и лекарственные средства, вводимые обычно только в комбинациях. Например, индивидуальный скрининг лекарственных средств, обычно вводимых только в комбинации, может предоставить данные, позволяющие определить индивидуальные эффекты этих лекарственных средств.

В одном из вариантов осуществления индивидуально анализируются монотерапевтические лекарственные средства. В другом варианте осуществления, индивидуально анализируются лекарственные средства, обычно вводимые только в комбинации. Нецитотоксичные лекарственные средства, часто используемые совместно с цитотоксичными лекарственными средствами, также должны быть оценены (т.е. как на Фигуре 12). Эти лекарственные средства включают антибиотики, противорвотные средства, антациды, противовирусные средства и т.д. В одном из вариантов осуществления, способом анализируется способность омепразола вызывать апоптоз в образце пациента. В другом варианте осуществления, способом анализируется способность ацикловира вызывать апоптоз в образце пациента.

На самом деле, способы, описанные в настоящей заявке, использовались для того, чтобы продемонстрировать то, что некоторые нецитотоксичные лекарственные средства, такие как пароксетин и сертралин, могут модулировать эффект цитотоксичных лекарственных средств, таких как флударабин и хлорамбуцил, соответственно потенцируя их эффективность (т.е. как показано на Фигуре 11). Как показано на Фигуре 6, некоторые из этих нецитотоксичных лекарственных средств, вводимые поодиночке, могут ex vivo вызывать апоптоз в злокачественных клетках с эффективностью, близкой к эффективности одобренных цитотоксичных лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления, для того чтобы вызвать апоптоз в образце пациента, в способе используются нецитотоксичные лекарственные средства. В другом варианте осуществления, для того чтобы вызвать апоптоз в образце пациента, в способе используются комбинации нецитотоксичных лекарственных средств. В другом варианте осуществления, для того чтобы вызвать апоптоз в образце пациента, в способе используются комбинации цитотоксичных и нецитотоксичных лекарственных средств.

Неожиданно, конкретные нецитотоксичные лекарственные средства уничтожают злокачественные клетки без повреждения здоровых клеток, что указывает на то, что такие лекарственные средства селективно атакуют злокачественные клетки (т.е. как показано на Фигуре 12). Такой неожиданный результат может иметь далеко идущие последствия для лечения гематологических новообразований. В одном из вариантов осуществления, в способе используются нецитотоксичные лекарственные средства, селективно вызывающие апоптоз в злокачественных клетках. В одном из вариантов осуществления, терапевтический индекс ех vivo примерно больше 1. В другом варианте осуществления, терапевтический индекс ех vivo примерно больше 5. В другом варианте осуществления, терапевтический индекс ех vivo примерно больше 10. В некоторых вариантах осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, предусматривают избирательность между лейкозными клетками и нормальными клетками в тканях, содержащихся в гематологических новообразованиях, таких как образцы крови, костного мозга, лимфоузла или селезенки.

Дополнительно, способность нецитотоксичных лекарственных средств вызывать апоптоз варьирует в пределах фармакологических классов лекарственных средств (т.е. как показано на Фигуре 9), также как и между фармакологическими классами лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления, способом анализируются лекарственные средства, выбранные из того же фармакологического класса, что и лекарственные средства, введенные пациенту для лечения по конкретному показанию к применению или для смягчения побочных эффектов лечения по конкретному показанию к применению. В конкретном варианте осуществления, способом анализируются селективные ингибиторы обратного захвата серотонина. Кроме того, способы, описанные в настоящей заявке, не ограничиваются анализом только цитотоксичных или только нецитотоксичных лекарственных средств. На самом деле, существуют примеры, в которых комбинация нецитотоксичного лекарственного средства и цитотоксичного лекарственного средства является желательной, поскольку комбинация может иметь большую способность вызывать апоптоз в образце пациента, чем способность цитотоксичного лекарственного средства в одиночку (т.е. как показано на Фигуре 11).

Настоящая система полностью способна анализировать комбинации двух классов лекарственных средств, таких как цитотоксичные и нецитотоксичные лекарственные средства, которые обычно вводятся вместе. В одном из вариантов осуществления анализируются нецитотоксичные лекарственные средства, назначенные пациентам, кому вводятся цитотоксичные лекарственные средства. Например, способы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для того, чтобы проанализировать образец пациента, обработанный цитотоксичным лекарственным средством флударабином и нецитотоксичным селективным ингибитором обратного захвата серотонина. В конкретном варианте осуществления, способ используется для того, чтобы проанализировать образец пациента, обработанный цитотоксичным лекарственным средством флударабином и нецитотоксичным лекарственным средством пароксетином. Для гематологических новообразований режимы приема лекарственных средств пациентом могут включать множество лекарственных комбинаций. В одном из вариантов осуществления, лекарственные средства, назначенные для гематологических показаний к применению, анализируются в различных комбинациях. Например, каждому пациенту в среднем может быть введено от 8 до 10 лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления, анализируется 5 или более лекарственных композиций. Предпочтительные исполнения планшетов для некоторых из большинства показаний к применению показаны в Примерах ниже.

Текущая стратегия основанных на протоколах схем лечения гематологических новообразований является следствием стагнации разработки лекарственных средств. Эта стагнация позволила гематологам самостоятельно ознакомиться с конкретными лекарственными средствами и разработать обоснованную оценку лучших комбинаций каждого из лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления способы, описанные в настоящей заявке, используются для проверки имеющихся в настоящих момент научных ожиданий в отношении лекарственных композиций. Однако два фактора очень сильно меняют существующую в настоящий момент стратегию основанных на протоколах схем лечения. Первый, как изображено на Фигуре 4, - осознание того, что каждый пациент по-разному отвечает на химиотерапию, в недавнем времени привело к выдвижению на передний план медицинских исследований индивидуально подобранной терапии. Революция, к которой привели технологии молекулярной биологии и расшифровка генома человека, сфокусировали основное внимании на генном анализе образцов пациентов с гематологическими новообразованиями. Однако 10-15 лет генных исследований, позволивших разделить пациентов на подгруппы риска, не были способны персонализировать лечение для индивидуальных пациентов. Как следствие, это осознание пробудило желание подобрать индивидуальному пациенту подходящее ему оптимальное лечение с использованием персонализированного медицинского теста. Однако существующие в настоящий момент протоколы позволяют исследовать менее чем 1-5% области терапевтического применения, которую может исследовать описанная в настоящей заявке платформа (как изображено на Фигуре 5). Второй - существует значительное число новых лекарственных средств, недавно одобренных для лечения гематологических новообразований, а также существует несколько кандидатов, находящихся на поздней стадии клинических испытаний. Следовательно, для этих расстройств наблюдается быстрый переход от сценария с одними и теми же старыми лекарственными средствами, назначаемыми в течение многих лет, к сценарию с множеством новых лекарственных средств, одобренных в течение нескольких лет. В одном из вариантов осуществления, способы, описанные в настоящей заявке, используются для того, чтобы оценить старые лекарственные средства, новые лекарственные средства, кандидатов, находящихся на поздней стадии клинических исследований, и их комбинации.

Способы, описанные в настоящей заявке, пригодны для выбора лекарственных средств на индивидуализированном пациентном базисе и для определения направлений для лечебных протоколов, которые будут пригодными для выбора лекарственных средств для пациентов, обладающих близкими показаниями к применению и ответами на текущие режимы приема лекарственных средств. Каждый пациент будет принимать эти соединения в количествах, достаточных для достижения выбранных концентраций в его крови и костном мозге для того, чтобы уничтожить злокачественные клетки. Одним из усовершенствований политерапевтического персонализированного медицинского теста, описанного в настоящей заявке, является способность исследовать много различных лекарственных композиций, иногда достигающая 8-10 лекарственных средств, вводимых параллельно. В одном из вариантов осуществления, пациенту параллельно вводится множество лекарственных средств. В другом варианте осуществления, множество лекарственных средств вводится пациенту сериями. Много из лекарственных средств, приведенных в настоящей заявке, еще не было исследовано на возможность введения в комбинации. Как показано ниже в примерах, для этих лекарственных средств могут быть обнаружены ясные и неожиданные способности вызывать апоптоз.

Другим усовершенствованием является способность определять оптимальные лекарственные композиции на персональной основе. Как показано на Фигуре 10, существует большое число вариаций ответов пациентов на конкретные лекарственные композиции. Фактически, только три лекарственных средства вызывают апоптоз более чем у 80% злокачественных клеток в более чем 80% из 23 образцов пациентов. Для сравнения, 229 различных лекарственных средств вызывает апоптоз более чем у 80% злокачественных клеток в менее чем 20% образцов пациентов (1-4). Это позволяет предположить, что большинство нецитотоксичных лекарственных средств являются эффективными для очень малого числа пациентов и проявляют большую степень вариабельности от пациента к пациенту, чем цитотоксичные лекарственные средства. Однако пациентам с гематологическими новообразованиями обычно вводится 5-10 нецитотоксичных сопутствующих лекарственных средств для смягчения воздействия цитотоксичных лекарственных средств. Таким образом, дополнительный эффект от выбора среди этих сопутствующих препаратов подгруппы, проявляющей значительную эффективность индуцирования апоптоза у злокачественных клеток, может быть значительным.

В дополнение к определению для индивидуального пациента потенциально наиболее эффективных лекарственных средств, эти результаты также позволяют разделить пациентов на подгруппы, дают возможность разработать новые лечебные протоколы для этих подгрупп, включающие цитотоксичные и нецитотоксичные лекарственные средства. В одном из вариантов осуществления, протокол лечения лекарственным средством выбирается на индивидуальном пациентном базисе. В другом варианте осуществления, протокол лечения лекарственным средством выбирается на основе его эффективности для 1-4 образцов пациентов. В другом варианте осуществления, протокол лечения лекарственным средством выбирается на основе его эффективности для 5-9 образцов пациентов. В другом варианте осуществления, протокол лечения лекарственным средством выбирается на основе его эффективности для 10-14 образцов пациентов. В другом варианте осуществления, протокол лечения лекарственным средством выбирается на основе его эффективности для 15-19 образцов пациентов. В другом варианте осуществления протокол лечения лекарственным средством выбирается на основе его эффективности для более чем 20 образцов пациентов. Способы, описанные в настоящей заявке, позволяют выбрать большее число протоколов лечения, чем доступные в настоящий момент способы.

Одним из усовершенствований персонализированного медицинского теста является способность оптимизировать конкретный режим приема лекарственного средства на индивидуальном базисе. В политерапевтаческом режиме, где пациенту вводится несколько различных лекарственных средств в комбинации, фармакокинетики и типичные кривые доза-ответ индивидуальных лекарственных средств могут быть нетипичными. С использованием способов, описанных в настоящей заявке, могут быть обнаружены оптимальные дозировки и для злокачественных, и для нормальных клеток исходя из оптимума кривой доза-ответ для конкретного пациента.

В способах и устройствах, описанных в настоящей заявке, могут быть использованы различные лекарственные средства и лекарственные комбинации. Например, может быть использована лекарственная комбинация, содержащая цитотоксичные лекарственные средства. Также может быть использована лекарственная комбинация, содержащая нецитотоксичные лекарственные средства. Кроме того, может быть использована лекарственная комбинация, содержащая цитотоксичные и нецитотоксичные лекарственные средства.

Некоторые примеры цитотоксичных соединений, которые могут быть использованы поодиночке или в комбинации с другими соединениями, включают флударабин (обозначенный как "1"), хлорамбуцил (обозначенный как "2"), митоксантрон (обозначенный как "3"), винкристин (обозначенный как "4"), митоксантрон (обозначенный как "5"), циклофосфамид (обозначенный как "6"), адриамицин (обозначенный как "7") и доксорубицин (обозначенный как "8").

Некоторые примеры нецитотоксичных соединений, которые могут быть использованы поодиночке или в комбинации с другими соединениями, включают 5-азацитидин (обозначенный как "1"), алемтузумаб (обозначенный как "2"), аминоптерин (обозначенный как "3"), амонафид (обозначенный как "4"), амсакрин (обозначенный как "5"), CAT-8015 (обозначенный как "6"), бевацизумаб (обозначенный как "7"), ARR Y520 (обозначенный как "8"), триоксид мышьяка (обозначенный как "9"), AS1413 (обозначенный как "10"), ATRA (обозначенная как "II"), AZD 6244 (обозначенный как "12"), AZD1 152 (обозначенный как "13"), баноксантрон (обозначенный как "14"), бегеноил-ара-С (обозначенный как "15"), бендамустин (обозначенный как "16"), блеомицин (обозначенный как "17"), блинатумомаб (обозначенный как "18"), бортезомиб (обозначенный как "19"), бусульфан (обозначенный как "20"), карбоплатин (обозначенный как "21"), СЕР-701 (обозначенный как "22"), хлорамбуцил (обозначенный как "23"), хлордеоксиаденозин (обозначенный как "24"), кладрибин (обозначенный как "25"), клофарабин (обозначенный как "26"), СРХ-351 (обозначенный как "27"), циклофосфамид (обозначенный как "28"), циклоспорин (обозначенный как "29"), цитарабин (обозначенный как "30"), цитозинарабинозид (обозначенный как "31"), дазатиниб (обозначенный как "32"), даунорубицин (обозначенный как "33"), децитабин (обозначенный как "34"), дегликозилированную цепь рицина А, конъюгированную иммунотоксинами анти-CD19/анти-СВ22 (обозначенная как "35"), дексаметазон (обозначенный как "36"), доксорубицин (обозначенный как "37"), элацитарабин (обозначенный как "38"), энтиностат (обозначенный как "39"), эпратузумаб (обозначенный как "40"), эрвиназу (обозначенную как "41"), этопозид (обозначенный как "42"), эверолимус (обозначенный как "43"), экзатеканмезилат (обозначенный как "44"), флавопиридол (обозначенный как "45"), флударабин (обозначенный как "46"), фородесин (обозначенный как "47"), гемцитабин (обозначенный как "48"), гемтузумабозогамицин (обозначенный как "49"), гомохаррингтонин (обозначенный как "50"), гидрокортизон (обозначенный как "51"), гидроксикарбамид (обозначенный как "52"), идарубицин (обозначенный как "53"), ифосфамид (обозначенный как "54"), иматиниб (обозначенный как "55"), интерферон альфа 2а (обозначенный как "56"), йодное 1131 моноклональное антитело ВС8 (обозначенное как "57"), ифосфамид (обозначенный как "58"), изотретиноин (обозначенный как "59"), ларомустин (обозначенный как "60"), L-аспарагиназа (обозначенная как "61"), леналидомид (обозначенный как "62"), лестауртиниб (обозначенный как "63"), мафосфамид (обозначенный как "64"), мелфалан (обозначенный как "65"), меркаптопурин (обозначенный как "66"), метотрексат (обозначенный как "67"), метилпреднизолон (обозначенный как "68"), метилпреднизон (обозначенный как "69"), мидостаурин (обозначенный как "70"), митоксантрон (обозначенный как "71"), неларабин (обозначенный как "72"), нилотиниб (обозначенный как "73"), облимерсен (обозначенный как "74"), паклитаксел (обозначенный как "75"), панобиностат (обозначенный как "76"), пэгаспаргаза (обозначенная как "77"), пентостатин (обозначенный как "78"), пирарубицин (обозначенный как "79"), РКС412 (обозначенный как "80"), преднизолон (обозначенный как "81"), преднизон, PSC-833 (обозначенный как "82"), рапамицин (обозначенный как "83"), ритуксимаб (обозначенный как "84"), ривабирин (обозначенный как "85"), сапацитабин (обозначенный как "86"), динациклиб (обозначенный как "87"), сорафениб (обозначенный как "88"), сорафениб (обозначенный как "89"), STA-9090 (обозначенный как "90"), такролимус (обозначенный как "91"), танеспимицин (обозначенный как "92"), темсиролимус (обозначенный как "93"), тенипозид (обозначенный как "94"), терамепрокол (обозначенный как "95"), талидомид (обозначенный как "96"), тиогуанин (обозначенный как "97"), тиотепа (обозначенный как "98"), типифарниб (обозначенный как "99"), топотекан (обозначенный как "100"), треосульфан (обозначенный как "101"), троксацитабин (обозначенный как "102"), винбластин (обозначенный как "103"), винкристин (обозначеный как "104"), виндезин (обозначенный как "105"), винорелбин (обозначенный как "106"), ворелоксин (обозначенный как "107"), вориностат (обозначенный как "108"), этопозид (обозначенный как "109") и цозуквидар (обозначенный как "110").

Некоторые примеры нецитостатических соединений, которые могут быть использованы поодиночке или в комбинации с другими соединениями, включают гидрат оксида алюминия (обозначенный как "111"), лоразепам (обозначенный как "112"), амикацин (обозначенный как "113"), меропенем (обозначенный как "114"), цефепим (обозначенный как "115"), ванкомицин (обозначенный как "116"), теикопланин (обозначенный как "117"), ондансетрон (обозначенный как "118"), дексаметазон (обозначенный как "119"), амфотерицин В (липосомальный) (обозначенный как "120"), каспофугин (обозначенный как "121"), итраконазол (обозначенный как "122"), флуконазол (обозначенный как "123"), вориконазол (обозначенный как "124"), триметоприм (обозначенный как "125"), сульфаметоксазон (обозначенный как "126"), G-CSF (обозначенный как "127"), ранитидин (обозначенный как "128"), расбуриказу (обозначенную как "129"), парацетамол (обозначенный как "130"), метамизол (обозначенный как "131"), хлорид морфина (обозначенный как "132"), омепразол (обозначенный как "133"), пароксетин (обозначенный как "134"), флуоксетин (обозначенный как "135") и сертралин (обозначенный как "136").

Дополнительно, в большинстве стран конкретные лекарственные комбинации представляют собой предпочтительные или стандартные цитотоксичные методы лечения ОМЛ, ОЛЛ, ХЛЛ и НХЛ. Эти существующие методы лечения могут быть обозначены цифровыми кодами и в следующих комбинациях могут быть использованы для дальнейшего объединения с дополнительными лекарственными средствами.

Ниже списком, с использованием цифровых обозначений, приведенных выше, в формате #.# приводятся примеры комбинаций из двух соединений, содержащих, по меньшей мере, одно цитотоксичное соединение, которые дополнительно могут содержать или могут не содержать другие соединения в комбинации (см. Приложение №1).

Ниже списком, с использованием цифровых обозначений, приведенных выше, в формате #.# приводятся примеры комбинаций из двух соединений, содержащих, по меньшей мере, два нецитотоксичных соединения, которые дополнительно могут содержать или могут не содержать другие соединения в комбинации (см. Приложение №2).

Как показано на Фигуре 7, способы, описанные в настоящей заявке, обеспечивают соблюдение оптимума кривых доза-ответ. В одном из вариантов осуществления, в способах, описанных в настоящей заявке, для выбора концентраций лекарственного средства для пациента используется кривая доза-ответ. В другом варианте осуществления, выбираются те концентрации лекарственного средства, которые вызывают апоптоз в более чем 75% клеток в образце. В другом варианте осуществления, выбираются те концентрации лекарственного средства, которые вызывают апоптоз в более чем 50% клеток в образце. В другом варианте осуществления, выбираются те концентрации лекарственного средства, которые вызывают апоптоз в более чем 25% клеток в образце. Кроме того, стандартные концентрации лекарственного средства, такие как значение ЭК50 лекарственного средства, могут не совпадать с дозой, желательной для применения в политерапевтической схеме лечения. В другом варианте осуществления, в способах, описанных в настоящей заявке, для выбора концентраций лекарственного средства для пациента используется оптимум. В другом варианте осуществления, в способах, описанных в настоящей заявке, для выбора концентраций лекарственного средства для пациента используется ЭК50. В другом варианте осуществления, в способах, описанных в настоящей заявке, для выбора концентраций лекарственного средства для пациента используется ЭК90. В другом варианте осуществления, в способах, описанных в настоящей заявке, для выбора желательной лекарственной композиции и концентрации для лечения состояний, связанных с новообразованиями, используются клеточные ответы нормальных клеток.

Способы, описанные в настоящей заявке, также могут быть использованы для оценки кинетического профиля и цитотоксичных, и нецитотоксичных лекарственных композиций. Как показано на Фигуре 8, кинетики для различных лекарственных композиций могут варьироваться для индивидуального пациента. В одном из вариантов осуществления, способами, описанными в настоящей заявке, определяется кинетический профиль лекарственного средства для конкретного показания к применению. В другом варианте осуществления, способами, описанными в настоящей заявке, определяется кинетический профиль лекарственной композиции для конкретного показания к применению. В некоторых из вариантов осуществления, схема приема лекарственного средства выбирается исходя из кинетического профиля лекарственного средства для конкретного показания к применению.

Также на Фигуре 8 показано, что способы, описанные в настоящей заявке, пригодны для измерения способности различных лекарственных композиций вызывать апоптоз в различные периоды времени. Кроме того, способы, описанные в настоящей заявке, пригодны для определения разницы в индуцировании апоптоза разными лекарственными композициями после истечения различных интервалов времени. В одном из вариантов осуществления, индуцирование апоптоза определяется заявленным способом через 10, 12, 16, 18, 20, 22 или 24 часа или в диапазоне, определенном любыми двумя предшествующими значениями. В другом варианте осуществления, индуцирование апоптоза определяется заявленным способом примерно через 36 или 48 часов. В другом варианте осуществления, индуцирование апоптоза определяется заявленным способом примерно через 72 часа.

Как показано на Фигуре 28, время, соответствующее измерению, является минимальным временем, в течение которого необходимо выдержать лекарственное средство совместно с клетками, чтобы эффективно вызвать программирование на клеточную гибель (т.е. апоптоз). Для этого измерения может быть проведен похожий анализ путем выдержки лекарственной композиции в течение 15 минут, последующего вымывания лекарственного средства и ожидания 48 часов до того, как измерить апоптоз. В одном из вариантов осуществления, апоптоз определяется заявленным способом после выдержки, предшествующей отмывке лекарственного средства, в течение 30 минут, 45 минут, 1 часа, 2 часов или 4 часов или в диапазоне, определенном любыми двумя предшествующими значениями. В другом варианте осуществления, индуцирование апоптоза определяется заявленным способом примерно через 24 или 48 часов. В другом варианте осуществления, индуцирование апоптоза определяется заявленным способом примерно через 72 часа.

В некоторых вариантах осуществления, обеспечиваются устройства, пригодные для осуществления способов, описанных в настоящей заявке. Например, до введения клеточных образцов могут быть заготовлены планшеты, уже содержащие индивидуальные лекарственные средства или комбинации лекарственных средств в различных концентрациях. Альтернативно, до введения индивидуальных лекарственных средств или лекарственных комбинаций в различных концентрациях могут быть заготовлены планшеты с уже введенными в лунки образцами клеток.

Способы, описанные в настоящей заявке, могут иметь преимущество за счет использования мышиных моделей, в которых можно вырастить и размножить первичные человеческие клетки гематологических злокачественных новообразований пациента (Pearson et al. Curr Top Microbiol Immunol. 2008; 324:25-51; Ito et al. Curr Top Microbiol Immunol. 2008; 324:53-76). Использование этих мышиных моделей может увеличить число клеток пациента, доступных для ex vivo тестирования, т.е. с использованием платформы ExviTech. Это позволит протестировать ех vivo на пророщенных в мышиных моделях клетках пациента значительно большее число лекарственных средств и лекарственных комбинаций и позволит протестировать in vivo на тех же мышиных моделях лучшие лекарственные средства и лекарственные комбинации. В одном из вариантов осуществления, определенные ех vivo на образце пациента эффективности и токсичности лекарственных композиций проверяются на мышиных моделях, которые используются для выращивания клеток пациента. В другом варианте осуществления, на образцах, полученных от мышиных моделей, ех vivo тестируются лучшие композиции цитотоксичных лекарственных средств, определенные на мышиных моделях in vivo. В другом варианте осуществления, на образцах, полученных от мышиных моделей, ех vivo тестируются лучшие композиции цитотоксичных лекарственных средств, объединенных с нецитотоксичными лекарственными средствами (т.е. адъювантными и одобренными лекарственными средствами), определенные на мышиных моделях in vivo. В другом варианте осуществления, на образцах, полученных от мышиных моделей, ех vivo тестируются лучшие композиции нецитотоксичных лекарственных средств (т.е. и адъювантных, и одобренных лекарственных средств), определенные на мышиных моделях in vivo.

Другим усовершенствованием настоящих способов является их способность предоставлять индивидуализированный отчет о реакции пациента на различные лекарственные композиции и концентрации. В одном из вариантов осуществления, способ включает подготовку отчета, подытоживающего результаты анализа. В другом варианте осуществления, способ включает предоставление отчета пациенту. В другом варианте осуществления, способ включает предоставление отчета группе, ответственной за медицинское обслуживание пациента. В другом варианте осуществления, способ включает предоставление отчета группе, ответственной за интерпретацию стадии анализа. В одном из вариантов осуществления, отчет содержит первичные данные. В другом варианте осуществления, отчет содержит кривые доза-ответ. В другом варианте осуществления, отчет содержит заключение об ответе пациента на лекарственные композиции и концентрации лекарственных средств.

Хотя точные дозировки будут определены на базе исследований от лекарства к лекарству, в большинстве случаев могут быть сделаны некоторые обобщения. Например, дозировка лекарственного средства для взрослого пациента-человека может быть, например, дозой от около 1 мг в день до около 500 мг в день или, предпочтительно, от около 10 мг в день до около 100 мг в день. Лекарственные формы могут быть пероральными, но предпочтительными являются внутривенные лекарственные формы. Например, композиции согласно изобретению могут быть введены непрерывной внутривенной инфузией альтернативно. В некоторых вариантах осуществления, лекарственные средства изготавливаются в форме, пригодной для подкожного или внутримышечного введения. Диапазоны дозировок для цитотоксичных и нецитотоксичных лекарственных средств в основном будут близкими. Любая из фармацевтических композиций, описанных в настоящей заявке, включает фармацевтически приемлемые соли описанных соединений. Соединения могут быть введены в курсе непрерывной терапии, например, в течение недели, месяца или более. Дополнительно, специалист в данной области будет знать, что конкретные формы, пути введения и дозировки лекарственных средств и лекарственных композиций настоящего изобретения могут быть выбраны каждым врачом индивидуально исходя из состояния пациента. Например, количество вводимого лекарственного средства или лекарственной комбинации может зависеть от состояния субъекта, подвергающегося лечению, массы субъекта, тяжести заболевания, способа введения или решения лечащего врача.

Специалисту в данной области будет понятно, могут быть сделаны многочисленные и различные модификации без отступления от сущности настоящего изобретения. Поэтому должно быть отчетливо понятно, что воплощения настоящего изобретения, раскрытые в настоящей заявке, являются только иллюстративными и не предназначаются для ограничения объема настоящего изобретения. Любые ссылки, содержащиеся в настоящей заявке, включаются в обсуждаемые в настоящей заявке материалы во всем их объеме путем ссылки.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Проточное цитометрическое определение подвергшихся апоптозу нормальных и опухолевых клеток

Терапевтический индекс ex vivo может быть определен с помощью определения способности лекарственной композиции вызывать апоптоз. На Фигурах 1 и 2 изображена возможность обнаруживать подвергшиеся апоптозу клетки и производить их разделение на нормальный и опухолевый фенотип, используя проточную цитометрию. На фигуре 1 для обнаружения экспрессии фосфатидилсерина на подвергшихся апоптозу клетках был использован препарат Анексин V, связанный с флуоресцеин изотиоционатом (FITC). Интенсивность свечения флуоресцеина отображается на оси у, а размер клетки отображается на оси х. На Фигуре 1 иллюстрируется возможность обнаруживать подвергшиеся апоптозу клетки (левая верхняя ячейка) и живые клетки (нижняя правая группа ячеек) и демонстрируется, что одновременное использование соответствующих комбинаций моноклональных антител и многопараметрической стратегии анализа может позволить выбрать лейкозные клетки из оставшихся нормальных клеток, представленных в образцах, полученных от пациента с гематологическими расстройствами. На Фигуре 2 изображен предшественник В-клеток ОЛЛ взрослых, отражающий BCR/ABL генные реанжировки [t(9;22) положительную]. Две клеточных подгруппы, лейкозная (светло-серая) и нормальная (темно-серая), были обнаружены среди CD 19-положительных клеток с помощью множественного помутнения моноклонального антитела, проанализированного с помощью количественной проточной цитометрии. Лейкозные клетки проявляют уникальный фенотип (гомогенная экспрессия CD 34, но низкая и относительно гомогенная экспрессия CD 38), обусловленный транслокацией.

ПРИМЕР 2. Протокол ex vivo исследования лекарственных композиций

Процесс ех vivo скрининга лекарственных композиций схематично показан на Фигуре 3. Образец крови может быть разделен на малые аликвоты, которые распределяются по луночным планшетам любого приемлемого размера. Эти луночные планшеты содержат индивидуальные лекарственные средства или лекарственные комбинации, каждая в различных концентрациях. Для обеспечения оптимального проведения анализа образец разбавляется RPMI средой и концентрируется до состояния 20000 лейкозных клеток на ячейку. Параллельно другая аликвота тестируется в целях определения иммунофенотипа с помощью проточной цитометрии для определения нормальных и патогенных клеток и определения спонтанного апоптоза. Контрольные ячейки без какого-либо лекарственного средства могут быть включены (не показано) для определения уровня спонтанного апоптоза, не связанного с обработкой лекарственным средством.

После приблизительно 48 часов каждая лунка с образцом, подвергшимся воздействию лекарственными средствами, обрабатывают буфером для лизирования популяции эритроцитов и концентрирования популяции лейкоцитов. Затем каждая лунка выдерживается с Анексином V для обнаружения апоптоза и с комбинацией антител для точного обнаружения и определения опухолевых клеток и нормальных клеток. С использованием проточной цитометрии возможно оценить эффект каждого лекарственного средства на каждый тип клетки и количественно определить уровень селективной клеточной смерти, вызванной каждым лекарственным средством.

Затем результаты могут быть исследованы и может быть начат новый тест с дополнительными аликвотами для того, чтобы подтвердить наиболее релевантные результаты, такие как 10 лучших лекарственных композиций и концентраций, определенных в более раннем исследовании. Выбор соответствующего лекарственного средства или лекарственной композиции, селективно вызывающих апоптоз в злокачественных клетках, таких как лейкозные клетки, может быть осуществлен после того, как осуществлен анализ на образце пациента.

ПРИМЕР 3. Ответы индивидуальных пациентов, демонстрирующие цитотоксичные эффекты различных лекарственных средств, в настоящий момент одобренных для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза

Настоящие методы использовались для исследования воздействий на различных пациентов хлорамбуцила, циклофосфамида, винкристина, митоксантрона, и доксорубицина - пяти лекарственных средств, в настоящий момент одобренных для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), взятых в концентрации 30 мкМ. Результаты по эффективности индуцирования апоптоза в злокачественных клетках индивидуально подобранных цитотоксичных лекарственных средств для 9 ex vivo образцов пациентов приведены на Фигуре 4. На Фигуре 4 демонстрируется, что в ответах на лекарственное средство существует высокая вариабельность от пациента к пациенту, подчеркивающая важность использования персонализированных медицинских тестов, описанных в настоящей заявке.

Что касается ответов пациентов на лечения индивидуальными лекарственными средствами при концентрации 30 мкМ, несколько лекарственных средств имели в основном слабые ответы пациентов, определенные как индуцирование менее чем 60% апоптоза в образцах пациентов, измеренное по Анексин V-положительным клетками. Дополнительно, на Фигуре 4 показано, что некоторые пациенты (в особенности Р1.0105, Р2.0019 и P2.035) проявляют очень сильную устойчивость ех vivo к митоксантрону. Альтернативно, для двух пациентов, отмеченных звездочкой, только доксорубицин является очень эффективным, а к другим 3 лекарственным средствам они устойчивы, что указывает на то, что этот тип тестирования может очень сильно помочь в выборе лечения для этих пациентов. Несмотря на то, что результаты получены при проведении ех vivo анализов, они могут более точно предсказать устойчивость к лекарственному средству, чем его эффективность (т.е. как показано в Таблице 2), поскольку если лекарственное средство не убивает злокачественные клетки ех vivo, маловероятно, что оно убьет те же самые клетки in vivo.

ПРИМЕР 4. Индуцирование апоптоза цитотоксичными и нецитотоксичными лекарственными средствами в образцах ХЛЛ

Способность нецитотоксичных лекарственных средств вызывать апоптоз в ех vivo образцах оценивалась с использованием образцов периферической крови, полученной от пациентов с ХЛЛ (хроническим лимфолейкозом). Скринингу ех vivo на 23 образцах пациентов один за другим подверглись приблизительно 900 имеющихся в продаже лекарственных средств. На Фигуре 6 показаны эффективности уничтожения гематологических новообразований в этих ех vivo образцах ХЛЛ для нескольких клинически одобренных цитотоксичных лекарственных средств и нескольких нецитотоксичных лекарственных средств. Результаты изображаются в виде % апоптоза. Как показывают результаты, клинически одобренные лекарственные средства вызывают апоптоз в 75% злокачественных клеток. Слева направо, исследуемыми нецитотоксичными лекарственными средствами были пароксетин, флуоксетин, сертралин, гуанабенц и астемизол. Слева направо, исследуемыми цитотоксичными лекарственными средствами были флударабин, хлорамбуцил и митоксантрон. На Фигуре 6 демонстрируется, что нецитотоксичные лекарственные средства селективно убивали те же злокачественные клетки с эффективностью ex vivo, близкой к эффективности одобренных цитотоксичных лекарственных средств. Этот неожиданный результат указывает на то, что эти нецитотоксичные лекарственные средства могут иметь значительный благоприятный терапевтический эффект для пациентов, исследуемых на Фигуре 6.

Были проведены дополнительные проверочные исследования индуцирования апоптоза нецитотоксичными лекарственными средствами. На фигуре 7 сравниваются отличия цитотоксичных воздействий пароксетина на злокачественные лейкозные клетки и незлокачественные Т и NK клетки. При концентрации приблизительно 30 мкМ пароксетин вызывает апоптоз у приблизительно 100% лейкозных клеток. Однако при той же концентрации приблизительно 30 мкМ пароксетин вызывает апоптоз только у 15% Т и NK клеток. Следовательно, на Фигуре 7 показывается, что пароксетин селективно вызывает апоптоз в злокачественных клетках ХЛЛ ех vivo и минимально воздействует на незлокачественные Т и NK клетки.

Нецитотоксичные лекарственные средства, обычно назначаемые в лечебных протоколах, могут иметь высокоселективную апоптотическую эффективность для борьбы против злокачественных клеток. Один из таких случаев показывается на Фигуре 12 для пациента с ХЛЛ, которая отображает процент Анексин-V-положительных клеток, появление которых вызвано различными лекарственными средствами. Была обнаружена высокая вариабельность цитотоксических эффектов различных лекарственных средств, использованных для лечения ХЛЛ (т.е. винкристина, митоксантрона и циклофосфамида). Неожиданно, два нецитотоксичных соединения, которые обычно включаются для лечения побочных эффектов, вызванных химиотерапией (т.е. омепразол и ацикловир), показывают интенсивности апоптоза, близкие к интенсивностям цитотоксичных препаратов. Таким образом, персонализированные медицинские тесты, включающие нецитотоксичные лекарственные средства, как описано в настоящей заявке, включенные в представленные в настоящей заявке образцы, могут обеспечить пациентам неожиданные возможные благоприятные терапевтические эффекты. Например, добавление нецитотоксичных лекарственных средств к ex vivo тестам может предоставить новые неожиданные схемы лечения, являющиеся дополняющими стандартные схемы лечения.

ПРИМЕР 5. 24-часовой и 48-часовой анализы способности выбранных лекарственных средств вызывать апоптоз

Кинетики индуцирования апоптоза исследовались с помощью определения процента клеток, подвергшихся апоптозу в моменты времени 24 часа и 48 часов. На Фигуре 8 показано, что нецитотоксичное лекарственное средство сертралин уничтожает злокачественные клетки ХЛЛ быстрее, чем одобренные цитотоксичные препараты. На Фигуре 8 проанализированы образцы цельной крови, полученной от пациентов, которым диагностирован ХЛЛ, на предмет их ответа на лечение лекарственным средством. Образцы цельной крови выдерживались совместно с сертралином или с одним из трех лекарственных средств (флударабином, хлорамбуцилом или митоксантроном), которые в настоящий момент являются одобренными для лечения ХЛЛ. После добавления лекарственных средств образцы цельной крови выдерживались в течение 24 и 48 часов, перед тем как подвергнуться анализу.

Как показывают результаты на Фигуре 8, кинетика индуцирования апоптоза быстрее для сертралина (более чем 90% индуцирование апоптоза спустя 24 часа), чем для других трех клинически одобренных лекарственных средств (приблизительно 40%, 45% и 50% индуцирование апоптоза спустя 24 часа соответственно). Таким образом, сертралин вызывает почти полный апоптоз в течение 24 часов, в то время как другие лекарственные средства для лечения ХЛЛ требуют 48 часов для достижения оптимальной эффективности.

Более быстрый апоптоз ех vivo может толковаться как лучшая эффективность in vivo. Однако на Фигуре 8 также показано, что эффективности этих четырех лекарственных средств приблизительно эквивалентны спустя 48 часов. Фигура 8 подчеркивает пользу определения множества интервалов выдержки для выбора оптимального лечения для каждого пациента. Кроме того, Фигура 8 показывает, что должно быть исследовано несколько вариаций (т.е. лекарственных композиций и интервалов выдержки) для того, чтобы разработать оптимальное политерапевтическое лечение.

ПРИМЕР 6. Дифференциальное индуцирование апоптоза лекарственными средствами из одного и того же фармакологического класса

Пароксетин является селективноьм ингибитором обратного захвата серотонина (SSRI). Прочие представители SSRI класса соединений тестировались для того, чтобы определить, обладает ли фармакологический класс SSRI лекарственных средств универсальными свойствами вызывать апоптоз. На Фигуре 9 сведены способности 6 SSRI (пароксетина, флуоксетина, сертралина, циталопрама, флувоксамина и цимелидина) вызывать апоптоз в злокачественных клетках ХЛЛ. Как демонстрируют результаты на Фигуре 9, из 6 лекарственных средств только 3 (пароксетин, флуоксетин и сертралин) вызывают апоптоз приблизительно так же, как и клинически одобренные цитотоксичные лекарственные средства. Эти различия для лекарственных средств со сходными механизмами действия и из одного и того же фармакологического класса подчеркивают необходимость описанной в настоящей заявке методики проведения ex vivo теста для выбора лекарственного средства среди фармакологических аналогов. Эти различия также показывают необходимость ех vivo тестирования каждого лекарственного средства безотносительно фармакологического класса. Кроме того, эти различия подчеркивают важность способности исследовать большое число вариаций для разработки персонализированного медицинского теста.

ПРИМЕР 7. Частота проявления у пациентов 80% индуцирования апоптоза при лечении одним и тем же лекарственным средством

Эффективность индуцирования апоптоза для нецитотоксичных лекарственных средств варьировалась сильнее от пациента к пациенту, чем для цитотоксичных лекарственных средств (т.е. как показано на Фигуре 4). Эти вариации также иллюстрируются на Фигуре 10. Первоначальный скрининг 23 образцов (комбинации из образцов цельной крови и костного мозга) пациентов с диагностированным ХЛЛ проводился с использованием приблизительно 2000 соединений (некоторых образцов было недостаточно для проведения скрининга всех соединений). В скрининге измерялась способность каждого соединения селективно вызывать апоптоз в лейкозной популяции клеток каждого пациента. Соединение признавалось «подходящим» для конкретного пациента, если оно вызывало апоптоз в лейкозной популяции на уровне, большем чем 80%, и в тоже время слабо или вообще не воздействовало на нормальную клеточную популяцию.

Результаты на Фигуре 10 показывают, что только малое число лекарственных средств было эффективно для большинства образцов пациентов (80-100%). Приблизительно только 10 дополнительных соединений были эффективными для 60-80% образцов пациентов. 45 лекарственных средств были эффективными для 40-60% образцов, 66 лекарственных средств были эффективными для 20-40% образцов и 229 дополнительных лекарственных средств были эффективными для менее чем 20% образцов. Суммирование этих лекарственных средств означает, что 353 лекарственных средства были эффективны для индуцирования ех vivo апоптоза в этих 23 образцах. Эти лекарственные средства в большинстве своем являются лекарственными средствами, ранее не предназначенными для лечения гематологических новообразований, что указывает на то, что разработка персонализированного медицинского теста будет требовать проведения скрининга большого числа лекарственных средств, и цитотоксичных, и нецитотоксичных, для определения оптимальной схемы приема лекарственных средств. Такие неожиданные данные могут иметь значительные клинические показания к применению для лечения гематологических новообразований.

Регулирующие органы обычно одобряют использование на пациентах с гематологическими новообразованиями только малой подгруппы нецитотоксичных лекарственных средств, предназначенных для смягчения эффектов цитотоксических схем лечения. Тем не менее, обнаруженная и заявленная в настоящей заявке потенциальная эффективность большинства других нецитотоксичных лекарственных средств, может, со временем, сделать их частью этих схем лечения в качестве концепции дальнейших улучшений персонализированного лечения. Политерапевтические персонализированные медицинские тесты, описанные в настоящей заявке, могут определять потенциально пригодные нецитотоксичные лекарственные средства для каждого пациента, что представляет собой ранее недоступные новый и обладающий терапевтически благоприятными эффектами подход.

ПРИМЕР 8. Потенцирование эффективности одобренного цитотоксичного лекарственного средства нецитотоксичным лекарственным средством

В качестве примера потенциальных благоприятных эффектов персонализированого медицинского скринингового теста соединение сертралин, определенное как подходящее для лечения ХЛЛ по образцу пациента, может потенцировать ответ на хлорамбуцил. Это показано на Фигуре 11. Хлорамбуцил является наиболее часто назначаемым лекарственным средством, применяемым для терапии ХЛЛ первой линии для около 25% пациентов, не переносящих схемы лечения на основе флударабина. Поскольку хлорамбуцил является высокоцитотоксичным и вызывает множество серьезных побочных эффектов, обнаружение способа ограничить его дозировку имело бы весьма благоприятный эффект для пациентов. В данном конкретном тесте сертралин является антидепрессантом, который доступен в дженериковой лекарственной форме и был на рынке на протяжении многих лет. Хлорамбуцил в одиночку при показанных концентрациях не вызывал сильного апоптоза (нижняя кривая), но присутствие субмаксимальной дозы сертралина сильно повышает уровень апоптоза (верхняя кривая). Такой пример демонстрирует потенциальные варианты сопутствующей терапии, которые могут обладать способностью усиливать ответы на назначенное химиотерапевтическое лечение.

Эти результаты демонстрируют необходимость разработки персонализированных медицинских тестов с использованием скрининга с высокой пропускной способностью, такого как способ, использующий проточную цитометрию, которые позволят оценить эффект возможных лекарственных средств и лекарственных комбинаций, включающих все одобренные лекарственные средства и, в частности, нецитотоксичное сопутствующее средство, применяемое для смягчения побочных эффектов химиотерапевтических стратегий.

ПРИМЕР 9. Проведение политерапевтического персонализированного медицинского (ПМ) теста для ХЛЛ в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА

Выполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского теста для пациентов с ХЛЛ (хроническим лимфоцитарным лейкозом) показано на Фигуре 13 без рассмотрения нецитотоксичных лекарственных средств. В каждом планшете колонка 1 содержит 0,34% раствор ДМСО в качестве негативного контроля, а колонка 12 содержит 50 мкМ раствор пароксетина и 50 мкМ раствор стауроспорина (лунки Е-Н) в качестве позитивных контролей. Лекарственные средства и лекарственные комбинации в планшетах являются одобренными для этого показания к применению в традиционных протоколах лечения. В каждом ряду лунки 2-6 и 7-11 включают 5 точек дозы-ответа каждого из этих лекарственных средств и лекарственных комбинаций с фактором разбавления 2:3. Колонки 2 и 7, таким образом, содержат наивысшие концентрации лекарственных средств, которые были установлены для каждого лекарственного средства в соответствии с его терапевтическим диапазоном. Хлорамбуцил (СН); флударабин (Fl); мафосфамид (МА); доксорубицин (DO); винкристин (VI); преднизолон (Pr); митоксантрон (MI); 2-хлородеокиаденозин (2-CDA); флавопиридол (FL); мелфалан (ME); ме-преднизолон (MEPR); бендамустин (BE); пентостатин (РЕ); ритуксимаб (RIT); алемтузумаб (ALE).

ПРИМЕР 10. Проведение ПМ теста для ММ в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА

Выполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского теста для пациентов с ММ (множественной миеломой) показано на Фигуре 14 на шести снимках A-F без рассмотрения нецитотоксичных лекарственных средств. Планировка планшета была создана в соответствии с текущими протоколами лечения, включающими индивидуальные лекарственные средства. В каждом планшете колонка 1 содержит 0,34% раствор ДМСО в качестве негативного контроля, а колонка 12 содержит 50 мкМ раствор пароксетина и 50 мкМ раствор стауроспорина (лунки Е-Н) в качестве позитивных контролей. Лекарственные средства и лекарственные комбинации в планшетах являются одобренными для этого показания к применению в традиционных протоколах лечения. В каждом ряду лунки 2-6 и 7-11 включают 5 точек дозы-ответа каждого из этих лекарственных средств и лекарственных комбинаций с фактором разбавления 2:3. Колонки 2 и 7, таким образом, содержат наивысшие концентрации лекарственных средств, которые были установлены для каждого лекарственного средства в соответствии с его терапевтическим диапазоном. Дополнительно, планшеты 4-6 содержат все возможные двойные комбинации одобренных протоколов для того, чтобы уточнить наличие синергизма между всеми этими лекарственными средствами. Дексаметазон (D); преднизон (P); мелфалан (М); циклофосфамид (С); доксорубицин (А); винкристин (Vi); кармустин (BCNU-B); бортезомиб (V); талидомид (Т); леналидомид (L); панабиностат (Ра); танеспимицин (Tn); перифосин (Ре); вориностат (Vo); рапамицин (Ra); эверолимус (Ev); темсиролимус (Те); типифамиб (Ti); цисплатин (сР); этопозид (Е).

ПРИМЕР 11. Проведение ПМ теста для ОЛЛ в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА

Выполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского теста для пациентов с ОЛЛ (острым лимфобластным лейкозом) показано на Фигуре 15. Планировка планшета была создана в соответствии с текущими протоколами лечения, включающими индивидуальные лекарственные средства. Планировка планшета была создана в соответствии с текущими протоколами лечения, включающими лекарственные средства, применяемые в монотерапии. Вариант исследования предназначен для того, чтобы определить способность следующих лекарственных средств вызывать апоптоз в образцах пациентов: метотрексат (МТХ), 6-меркаптопурин (6МР), цитарабин (ARA-C), даунорубицин (DNR), адриамиацин, митоксантрон (М), этопозид, тенипозид (VM-26), циклофосфамид (CF), ифосфамид (IFOS), винкристин (V), виндезин (VIND), аспарагиназа (L-ASA), иматиниб (IMAT), ритуксимаб (R), преднизон (Р), гидрокортизон (НС), дексаметазон (DXM), лейковорин (Foil), месна, омепразол (Om), ондастерон (О), аллопуринол (Allop) и филграстим (ОСЗР). Исполнение этого 96-луночного планшета дает возможность одновременно сравнивать многочисленные химиотерапевтические стратегии. Исполнение также позволяет тестировать эффекты адъювантных лекарственных средств и лекарственных средств, использующихся для смягчения побочных эффектов, взятых поодиночке или в комбинации с лекарственными средствами для монотерапии.

ПРИМЕР 12. Проведение ППМ теста для МДС в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА

Выполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского теста для пациентов с МДС (миелодиспластическим синдромом) показано на Фигуре 16.

Планировка планшета была создана в соответствии с текущими протоколами лечения, включающими лекарственные средства, применяемые в монотерапии. Вариант исследования предназначен для того, чтобы определить способность следующих лекарственных средств вызывать апоптоз в образцах пациентов: эритропоэтин (ЕРО), филграстим (GCSF), талидомид, циклоспорин (CsA), тимоглобулин (ATG), триоксид мышьяка, азацитидин, децитабин, флударабин (Fluda), этопозид (VP-16), цитарабин (ARA-C), идарубицин (Ida), карбоплатин (Carbop), преднизон (Pred), ондастерон (Ondans), омепразол (Оm), аллопуринол (Alop), котримоксазол (Cotri) и фолиевая кислота (AcF). Исполнение этого 96-луночного планшета дает возможность одновременно сравнивать многочисленные химиотерапевтические стратегии. Исполнение также позволяет тестировать эффекты адъювантных лекарственных средств и лекарственных средств, использующихся для смягчения побочных эффектов, взятых поодиночке или в комбинации с лекарственными средствами для монотерапии.

ПРИМЕР 13. Проведение ПМ теста для ОМЛ в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА

Выполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского теста для пациентов с ОМЛ (острым миелобластным лейкозом не М3) показано на Фигуре 17. Планировка планшета была создана в соответствии с текущими протоколами лечения, включающими лекарственные средства, применяемые в монотерапии. Вариант исследования предназначен для того, чтобы определить способность следующих лекарственных средств вызывать апоптоз в образцах пациентов: даунорубицин (Dauno), идарубицин (Ida), цитарабин (ARA-C), митоксантрон (Mitox), этопозид (VP16), флударабин (Fluda), филграстим (GCSF), омепразол (Om), ондастерон (Ondans), аллопуринол (Alop), ко-тримоксазол (Cotri), фолиевая кислота (AcF), амсакрин (AMSA), карбоплатин (Carbop), липосомальный даунорубицин (Dauno Про), гемтузумаб озогамицин (GO) и гидроксимочевина. Исполнение этого 96-луночного планшета дает возможность одновременно сравнивать многочисленные химиотерапевтические стратегии. Исполнение также позволяет тестировать эффекты адъювантных лекарственных средств и лекарственных средств, использующихся для смягчения побочных эффектов, взятых поодиночке или в комбинации с лекарственными средствами для монотерапии.

ПРИМЕР 14. Проведение ПМ теста для ОМЛ-М3 в соответствии с протоколами лечения РЕТНЕМА

Выполнение 96-луночного планшета для персонализированного медицинского теста для пациентов с ОМЛ-М3 (острым миелобластным лейкозом М3) показано на Фигуре 18. Планировка планшета была создана в соответствии с текущими протоколами лечения, включающими лекарственные средства, применяемые в монотерапии. Вариант исследования предназначен для того, чтобы определить способность следующих лекарственных средств вызывать апоптоз в образцах пациентов: третиноин (ATRA), идарубицин (Ida), митоксантрон (Mitox), цитаратин (ARA-C), 6-меркаптопурин (б-МР), метотрексат (МТХ), ондастерон (Ondans), аллопуринол (Alop), омепразол (Om), дексаметазон (Dexa), даунорубицин (Dauno), этопозид (VP-16), флударабин (Fluda), карбоплатин (Carbop), липосомальный даунорубицин (Dauno lipo), котримоксазол (Cotri) и фолиевая кислота (FAc). Исполнение этого 96-луночного планшета дает возможность одновременно сравнивать многочисленные химиотерапевтические стратегии. Исполнение также позволяет тестировать эффекты адъювантных лекарственных средств и лекарственных средств, использующихся для смягчения побочных эффектов, взятых поодиночке или в комбинации с лекарственными средствами для монотерапии.

ПРИМЕР 15. МТТ анализ пролиферации на первичных исходных лейкозных клеточных линиях

ТОМ-1 клетки были получены из клеток костного мозга пациента с Phi-положительным острым лимфоцитарным лейкозом (ОЛЛ). MOLT-4 клетки были получены из клеточной линии острого лимфобластного лейкоза человека. Был осуществлен стандартный МТТ анализ для того, чтобы определить ИК50 для индивидуальных средств, подвергающихся тестированию на специфических клеточных линиях. МТТ анализ основывается на разложении метаболически активными клетками желтой тетразолиевой соли МТТ до пурпурных кристаллов формазана. Формазан затем солюбилизируется, и по оптической плотности при 570 нм определяется концентрация. Шесть из восьми различных концентраций сертралина были исследованы в трех повторениях 24 часа спустя после обработки.

Было оценено 24-часовое воздействие сертралина на ингибирование клеточной пролиферации в ТОМ-1 и MOLT-4 первоначальных исходных клеточных линиях. ИК50 для клеточной линии MOLT-4 составила 40 мМ, а ИК50 для клеточной линии ТОМ-1 составила 50 мкМ (Фигура 19).

ПРИМЕР 16. Определение апоптоза с использованием Апоптоз-ELISA

С использованием клеток ТОМ-1 и MOLT-4 из примера 15 был проведен одностадийный сэндвич-анализ ELISA. Одностадийный сэндвич-анализ ELISA основывается на количественном определении гистон-закомплексованных фрагментов ДНК (моно- и олигонуклеосом) из цитоплазмы клеток после индуцирования апоптоза или высвобожденных из некротизированных клеток.

Было оценено 24-часовое воздействие сертралина на индуцирование апоптоза в ТОМ-1 и MOLT-4 первоначальных исходных клеточных линиях. Сертралин вплоть до 7 раз увеличивает индекс апоптоза в MOLT-4 клетках (Фигура 20).

ПРИМЕР 17. Определение активной каспазы-3

Активация каспазы-3 определялась с использованием вестерн-блоттинга экстрактов из двух клеточных линий острого лимфобластного лейкоза (ТОМ-1 и MOLT-4), подвергнутых воздействию повышенных концентраций сертралина. Экстракты были получены в 24 часа и 48 часов. Активная каспаза-3 является протеазой, служащей маркером апоптоза.

Было оценено 24-часовое воздействие сертралина на индуцирование активации каспазы-3 в ТОМ-1 и MOLT-4 первоначальных исходных клеточных линиях. Сертралин вызывает очень сильную активацию каспазы-3 в MOLT-4 клетках с максимумом, попадающим на 70 мкм концентрацию.

ПРИМЕР 18. Ex vivo эффективность политерапевтических комбинаций в ХЛЛ образцах

Политерапевтические комбинации ритуксимаба, флударабина, митоксантрона и циклофосфамида тестировались на образцах ХЛЛ при максимальных концентрациях. Циклофосфамид тестировался не напрямую, а с использованием его метаболита - мафосфамида (соединения, активного в организме человека). Для четырех главных индивидуальных лекарственных средств (т.е. ритуксимаба, флударабина, митоксантрона и циклофосфамида) была обнаружена устойчивость (Фигура 22, левая сторона). К политерапевтическому протоколу с использованием флударабина и ритуксимаба также была обнаружена устойчивость (Фигура 22, центр). Три политерапевтических протокола (т.е. флударабин и циклофосфамид; флударабин, циклофосфамид и митоксантрон; и флударабин, циклофосфамид и ритуксимаб) были очень чувствительными, уничтожающими фактически все лейкозные клетки (Фигура 22, правая сторона).

Для того чтобы охарактеризовать ех vivo эффективность, для комбинаций флударабин и циклофосфамид; флударабин, циклофосфамид и митоксантрон; и флударабин, циклофосфамид и ритуксимаб были построены 5-точечные кривые доза-ответ (Фигуры 23-25). На этих кривых показан значительный синергетический эффект этих лекарственных комбинаций, подчеркивающий важность исследования лекарственных комбинаций, описанных в настоящей заявке.

ПРИМЕР 19. Воздействие одиночных лекарственных средств при пяти различных концентрациях на двух пациентов

Флударабин, мафосфамид и комбинация флударабина и мафосфамида тестировались на двух пациентах, Р2.0144 (Фигура 26, слева) и Р2.0149 (Фигура 26, справа), при пяти концентрациях. Для того чтобы охарактеризовать синергетическое взаимодействие в этой комбинации при каждой концентрации (указаны вверху рисунков), был рассчитан индекс комбинации (CI) с использованием программы Calcusyn (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984; 22:27-55; Chou et al., Eur J Biochem 1981; 115(1):207-16). CI представляет собой количественное измерение степени взаимодействия лекарственных средств с точки зрения аддитивных эффектов. Синергизм проявляется в тех случаях, где CI<1, аддитивное действие проявляется в тех случаях, где CI=1, а антагонизм проявляется в тех случаях, где CI>1. Индекс снижения дозы (DRI) представляете собой количественное измерение того, насколько для получения данного уровня воздействия может быть снижена доза каждого лекарственного средства в синергетической комбинации по сравнению с дозой каждого лекарственного средства, взятого поодиночке.

На Фигуре 27 показан индекс комбинации по сравнению с долевым эффектом, рассчитанные методом Chou и Talalay (верхний рисунок). Маркерами в виде крестов показаны обнаруженные значения. Черная линия соответствует модельной симуляции. На среднем рисунке показана изоболограмма взаимодействия лекарственных средств, рассчитанная методом Chou и Talalay, при трех уровнях ответа (ЭД50, ЭД75 и ЭД90), основанных на оценках доза-ответ. Точки, отложенные на каждой оси, соответствуют дозам, определенным для этих ответов для каждого из лекарственных средств индивидуально. Прямыми линиями представлена область аддитивного действия комбинаций. Точки для комбинированных дозировок, обнаруженные ниже этих линий, означают синергизм лекарственных средств. На Фигурах 26 и 27 демонстрируется, что комбинация флударабина и мафосфамида обладает повышенной цитотоксичностью в отношении лейкозных В-клеток ХЛЛ по сравнению с эффективностями одиночных лекарственных средств.

ПРИМЕР 20. Действие времени выдержки на эффективность лекарственных средств вызывать апоптоз в злокачественных клетках в образцах ХЛЛ

Было протестировано воздействие времени выдержки на эффективность флударабина и сертралина вызывать апоптоз в злокачественных клетках в образцах ХЛЛ. На Фигуре 28 показаны кривые для флударабина (левый рисунок) и сертралина (правый рисунок), для построения которых апотоз измерялся в 24 часа и в 48 часов. В обоих случаях лекарственные средства выдерживались с образцами в течение 30 минут, 4 часов или 8 часов до отмывки лекарственного средства и выдерживались 24 или 48 часов до измерения апоптоза. Сертралин - нецитотоксичное лекарственное средство, вызывающее апоптоз в злокачественных клетках ХЛЛ, демонстрирует более быструю кинетику, чем флударабин.

ПРИМЕР 21. Число лекарственных комбинаций

Были осуществлены подсчеты количеств 2-лекарственных, 3-лекарственных и 4-лекарственных комбинаций из 15 лекарственных средств.

На Фигуре 29 представлено количество уникальных 2-лекарственных комбинаций, которые могут быть получены из 15 индивидуальных лекарственных средств. Каждое лекарственное средство представлено числом и заштрихованными клетками, представляющими 2-лекарственные комбинации. Всего получается 105 уникальных комбинаций из 2 лекарственных средств.

На Фигуре 30 представлено количество уникальных 3-лекарственных комбинаций, которые могут быть получены из 15 индивидуальных лекарственных средств. Все 2-лекарственные комбинации, приведенные в верхнем ряду каждой матрицы, будут скомбинированы с одиночными лекарственными средствами из ячеек левой колонки, заштрихованных светло-серым. Все 2-лекарственные комбинации, приведенные в нижнем ряду каждой матрицы, будут скомбинированы с одиночными лекарственными средствами из ячеек левой колонки, заштрихованных темно-серым. Всего получается 455 уникальных комбинаций из 3 лекарственных средств.

На Фигуре 31 представлено число уникальных 4-лекарственных комбинаций, которые могут быть получены из 15 индивидуальных лекарственных средств. 3-лекарственные комбинации, приведенные в левой части каждой колонки, будут скомбинированы с индивидуальным лекарственным средством из каждой заштрихованной ячейки вверху колонок. 3-лекарственные композиции, приведенные в правой части каждой колонки, будут скомбинированы с индивидуальным лекарственным средством из каждой ячейки вверху колонок, отмеченной крестом. Всего получается 1365 уникальных комбинаций из 4 лекарственных средств.

ПРИМЕР 22. Проведение ПМ теста с использованием маркировочной системы

Пропускная способность ex vivo персонализированных медицинских тестов может быть дополнительно повышена с помощью маркировки лунок, содержащих различные лекарственные композиции флуоресцентными датчиками. Содержимое промаркированных лунок может быть объединено и может совместно проходить через проточный цитометр, сохраняя время, необходимое для оценки каждой лунки индивидуально. Кратность сэкономленного времени может быть приблизительно равна числу объединенных лунок. Экономия времени позволяет тестировать больше лекарственных композиций за меньшее время, позволяя проводить больше тестов на платформе ExviTech за единицу времени. Это приводит к повышению пропускной способности и снижению стоимости, что может быть весьма значительным.

На Фигурах 32 и 33 показаны примеры мультиплексирования с использованием флуорохромных красителей. В одном из вариантов осуществления, флуорохромные красители применяются в качестве препаратов для маркировки клеток с различными лекарственными композициями, т.е. содержащихся в различных лунках. В другом варианте осуществления, флуорохромные красители применяются для маркировки антител, которые затем используются в качестве препаратов для маркировки клеток, находящихся в присутствии различных лекарственных композиций, т.е. содержащихся в различных лунках. В другом варианте осуществления, флуоресцентные препараты представляют собой квантовые точки, применяемые для маркировки клеток с различными лекарственными композициями, т.е. содержащихся в различных лунках. В одном из вариантов осуществления, число лекарственных композиций, которое может быть исследовано в мультиплексовом режиме, около 2, около 5, около 10, около 20, около 30, около 30, около 40 или около 50 или находится в диапазоне, определяемом любыми двумя предшествующими значениями.

На Фигуре 32 изображено 3-цветное мультиплексирование лейкоцитов периферической крови с использованием различных метящих клетки красителей. Три последовательные лунки, содержащие лизированную периферическую кровь, индивидуально окрашивались различными метящими клетки красителями. Лунка 1 окрашивалась Pacific Blue (Р22652) (Invitrogen, Carlsbad, CA), лунка 2 окрашивалась DiR (D 12731) (Invitrogen, Carlsbad, CA), а лунка 3 окрашивалась DiD (V-22889) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Затем содержимое этих трех лунок смешивалось и одновременно собиралось. Уникальные спектры возбуждения/излучения каждого метящего клетки красителя позволяют разделить три различных клеточных популяции, представляющих собой содержимое трех различных лунок.

Клетки лунки 1 дают более сильный сигнал на фиолетовом лазерном детекторе, чем клетки из лунок 2 и 3. В свою очередь, клетки из лунок 2 и 3 дают более сильный сигнал на красном лазерном детекторе по сравнению с клетками из лунки 1. Наконец, клетки из лунок 2 и 3 дают различные пики излучения, позволяющие их разделить на двумерной диаграмме обоих красных лазерных детекторов.

Последующие источники путем ссылки включаются в настоящую заявку во всем их объеме (см. Приложение №3).

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для ех vivo определения чувствительности клеток пациента к лекарственным препаратам. Для этого цельный образец (без предварительной очистки и разделения) гематологической опухоли разделяют на 35-100 аликвот, к которым добавляют лекарственные композиции, содержащие цитотоксические и нецитотоксические соединения или их комбинации. С помощью цитометрической платформы измеряют апоптоз или снижение количества злокачественных клеток в клеточной популяции. Показано проявление апоптоза злокачественных клеток при действии нецитотоксических лекарственных средств. Изобретение обеспечивает ех vivo тестирование для любого числа возможных комбинаций лекарственных средств с последующим политерапевтическим лечением. 20 з.п. ф-лы, 4 табл., 33 ил., 22 пр.

1. Способ анализа клеточной чувствительности к лекарственным средствам у пациента, включающий:

получение цельного образца костного мозга без стадий очистки и разделения из гематологической опухоли, которая была извлечена у пациента, причем указанный цельный образец костного мозга, по существу, сохраняет первоначальную клеточную микросреду;

разделение цельного образца костного мозга по меньшей мере на 35 аликвот, причем деление выполняют посредством автоматической подготовки образца и причем аликвоты содержат определенное количество пораженных или опухолевых клеток;

объединение по меньшей мере 35 аликвот цельного образца костного мозга с лекарственной композицией и

измерение апоптоза или снижения количества клеток по меньшей мере в одной клеточной популяции в каждой из по меньшей мере 35 аликвот.

2. Способ по п. 1, где измерение осуществляют в пределах 72 ч объединения аликвот с лекарственной композицией.

3. Способ по п. 1, где измерение осуществляют примерно в пределах 48 ч объединения аликвот с лекарственной композицией.

4. Способ по п. 1, где измерение осуществляют примерно в пределах 24 ч объединения аликвот с лекарственной композицией.

5. Способ по п. 1, где число аликвот, содержащих уникальную лекарственную композицию составляет по меньшей мере примерно 96.

6. Способ по п. 1, где цельный образец костного мозга разделяют по меньшей мере на 100 аликвот.

7. Способ по п. 1, где по меньшей мере две из лекарственных композиций содержат одно и то же лекарственное средство в различных концентрациях.

8. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна из лекарственных композиций содержит множество лекарственных средств.

9. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна из лекарственных композиций содержит множество лекарственных средств, которые не являются цитотоксичными.

10. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна из лекарственных композиций содержит нецитотоксичное лекарственное средство, которое является таким же или находится в той же самой терапевтической категории, что и лекарственное средство, уже вводимое пациенту.

11. Способ по п. 10, где по меньшей мере одна из лекарственных композиций объединяет нецитотоксичное лекарственное средство и цитотоксичное лекарственное средство.

12. Способ по п. 1, где апоптоз или снижение количества клеток измеряют для клеточной популяции, указывающей на гематологическую опухоль.

13. Способ по п. 12, где гематологическая опухоль выбрана из группы, состоящей из хронического лимфолейкоза, острого лимфобластного лейкоза взрослых, острого лимфобластного лейкоза у детей, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, не-М3 острого миелобластного лейкоза, острого миелобластного лейкоза М3, неходжкинской лимфомы, ходжкинской лимфомы и хронического миелолейкоза.

14. Способ по п. 1, дополнительно включающий подготовку отчета, суммирующего результаты стадии измерения.

15. Способ по п. 1, где лекарственная композиция содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из 5-Азацитидина, Алемтузимаба, Аминоптерина, Амонафидина, Амсакрина, САТ-8015, Бевацизумаба, ARR Y520, трехокиси мышьяка, AS 1413, Атры, AZD 6244, AZDl-152, Баноксантрона, Бехеноилара-С, Бендамустина, Блеомицина, Блинатумомаба, Бортезомиба, Бусульфана, Карбоплатина, СЕР-701, Хлорамбуцила, Хлордеоксиаденозина, Кладрибина, Клофарабина, СРХ-351, Циклофосфамида, Циклоспорина, Цитарабина, Цитозин Арабинозы, Дасатиниба, Даунорубицина, Децитабина, дегликозилированного рицина А, сопряженного цепью с анти-CD19/анти-CD22 иммунотоксинами, Дексаметазона, Доксорубицина, Элацитарабина, Энтиностата, Эпратузумаба, Эрвиназа, Этопозида, Эверолимуса, Эксатеканмезилата, Флавопиридола, Флударабина, Фородесина, Гемцитабина, Гемтузумабозогамицина, Хомохаррингтонина, Гидрокортизона, Гидроксикарбамида, Идарубицина, Ифосфамида, Иматиниба, интерферона альфа 2а, иод 1131 моноклонального антитела ВС8, Изотретиноина, Ларомустина, L-Acпарагиназы, Леналидомида, Лестауртиниба, Мафосфамида, Мелфалана, Меркаптопурина, Метотрексата, Метилпреднизолона, Метилпреднизона, Мидостаурина, Митоксантрона, Неларабина, Нилотиниба, Облимерсена, Паклитаксела, Панобиностата, Пегаспаргазы, Пентостатина, Пирарубицина, РКС412, Преднизолона, Преднизона, PSC-833, Рапамицина, Ритуксимаба, Ривабирина, Сапацитабина, Динациклиба, Сорафениба, STA-9090, Такролимуса, Танеспимицина, Темсиролимуса, Тенипозида, Терамепрокола, Талидомида, Тиогуанина, Тиотепа, Типифарниба, Топотекана, Треосульфана, Троксацитабина, Винбластина, Винкристина, Виндезина, Винорелбина, Ворелоксина, Вориностата, Этопозида, Зосукуидара и их комбинаций.

16. Способ по п. 1, где лекарственная композиция включает соединение, выбранное из группы, состоящей из гидрата окиси алюминия, Лоразепама, Амикацина, Меропенема, Цефепима, Ванкомицина, Теикопланина, Ондансетрона, Дексаметазона, Амфотерицина В (липосомальный), Каспофугина, Интраконазола, Флуконазола, Вориконазола, Триметоприма, Сульфаметоксазола, G-CSF, Ранитидина, Расбуриказа, Парацетамола, Метамизола, Морфинхлорида, Омепразола, Пароксетина, Флуоксетина, Сертралина и их комбинаций.

17. Способ по п. 1, где аликвоты содержат примерно 500 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку.

18. Способ по п. 1, где аликвоты содержат примерно 5000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку.

19. Способ по п. 1, где аликвоты содержат примерно 10000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку.

20. Способ по п. 1, где аликвоты содержат примерно 20000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку.

21. Способ по п. 1, где аликвоты содержат примерно 40000 или более пораженных или опухолевых клеток на лунку.