Биопрепарат для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами Российский патент 2017 года по МПК B09C1/10 

Изобретение относится к экологической биотехнологии, а именно, к разработке биопрепарата для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Природа обладает определенным потенциалом самоочищения от нефти и нефтепродуктов, в основе которого лежат микробиологические процессы. Однако скорость природных процессов самоочищения невелика и продолжительность очистки природных и рукотворных объектов может исчисляться годами и даже десятилетиями. Для ликвидации загрязнений экосистем нефтью и нефтепродуктами успешно применяют различные специально созданные биопрепараты.

Известен биопрепарат - консорциум микроорганизмов «Devouroil» для очистки почвенных и солоноватоводных экосистем от загрязнений нефтепродуктами (патент RU 2023686, МПК⁷ C02F 3/34, 1997). Данный биопрепарат имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как наличие в его составе бактерий рода Rhodococcus и дрожжей (дрожжевых клеток). Недостатком данного биопрепарата является его малая эффективность при ликвидации нефтяных загрязнений грунта (почвы) из-за преимущественной деградации используемой микроорганизмами парафиновой фракции нефти.

Известен материал для биологической очистки экосистем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, «ИПК-Н», содержащий твердый инертный носитель - пористую керамику «Редоксид» и консорциум микроорганизмов, содержащий штаммы бактерий рода Rhodococcus sp.367-2 или Rhodococcus maris 367-5, или Pseudomonas stutzeri 367-1 и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 367-3 (патент RU 2104249 C1, МПК⁶ C02F 3/34, 1996). Данный биопрепарат имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как наличие в своем составе бактерий рода Rhodococcus и дрожжей вида Yarrowia lipolytica. Недостатком указанного материала являются сложный способ его получения, связанный с трудоемким процессом получения керамики «Редоксид» с разветвленной открытой пористой структурой, порами размером до 20 мм и общей пористостью 71-95%, осуществляемой при строго определенном технологическом процессе из особого глинистого сырья, обжиг которого осуществляют при регламентированных временных и температурных режимах, с длительным культивированием на керамике по специальной технологии вышеуказанных бактерий и дрожжей, а также то, что данный материал используют для очистки от нефти и нефтепродуктов преимущественно сточных вод.

Известен штамм бактерии Rhodococcus jialingie 1 kp ВКПМ Ac-1957, который может быть использован для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Мялина Л.И., Буданова Е.В., Сазонова Л.П., Колесникова В.В., Чуб Г.Г., Токсикологический вестник, 2015, т. 130, №1, с. 54-56).

Известен штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb ВКПМ В-11685, который может быть использован для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Мялина Л.И., Буданова Е.В., Сазонова Л.П., Колесникова В.В., Чуб Г.Г., Токсикологический вестник, 2015, т. 130, №1, с. 57-59).

Известен штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043, который может быть использован для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Мялина Л.И., Буданова Е.В., Сазонова Л.П., Колесникова В.В., Чуб Г.Г., Токсикологический вестник, 2015, т. 130, №1, с. 60-62).

Однако, биопрепарат, используемый для очистки грунта и содержащий все вышеуказанные микроорганизмы, взятые в экспериментально подобранном массовом соотношении, а также конкретную водорастворимую защитную среду, в научно-технической литературе не описан.

Наиболее близким к заявляемому является известный биопрепарат для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, выполненный в виде сухой формы биопрепарата и включающий водорастворимую защитную среду (вещества, выбранные из группы, включающей сахарозу, тиомочевину, полиглюкин или любую их смесь) и микроорганизмы - деструкторы углеводородов нефти, содержащие бактерии рода Rhodococcus (психротрофные штаммы бактерий Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2532D и Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2533D), (патент RU 2378060 С2, МПК B09C 1/10, 2006/10) - прототип. Данный биопрепарат имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как сухая форма биопрепарата, наличие в нем водорастворимой защитной среды и бактерий рода Rhodococcus.

Недостатком известного препарата является то, что он не обеспечивает высокую скорость очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, определяемую по убыли содержания загрязнителя в грунте (убыли степени загрязнения грунта) за определенный период времени после обработки загрязненного грунта биопрепаратом. Так, например, при степени загрязнения грунта (почвы) нефтью в 2,5% при однократном введении рабочей дисперсии (рабочего раствора) известного биопрепарата, содержащей микроорганизмы в количестве 1×10⁷-1×10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) из расчета 10 л/м² грунта (почвы) и повторного однократного рыхления очищаемого грунта через 7 дней после внесения биопрепарата убыль загрязнителя за 13 дней после обработки биопрепаратом составляет 7% от исходной степени загрязнения, т.е. скорость очистки грунта составляет 0,54%/день. Кроме того, способ очистки грунта с использованием данного препарата достаточно трудоемок и требует неоднократного внесения биопрепарата один раз в две недели в течение первого месяца очистки, а затем один раз в месяц до окончания срока проведения работ по очистке грунта (см. прототип, стр.8, абзац 6 снизу).

Техническая проблема изобретения заключается в разработке биопрепарата для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, лишенного указанных недостатков.

Технический результат изобретения заключаются в повышении скорости очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Предварительно были проведены эксперименты с различными микробными культурами и биопрепаратами для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в биопрепарате для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, выполненном в виде сухой формы биопрепарата и включающим водорастворимую защитную среду и микроорганизмы - деструкторы углеводородов нефти, содержащие бактерии рода Rhodococcus, в качестве бактерии рода Rhodococcus биопрепарат содержит штамм бактерии Rhodococcus jialingie 1 kp, а также дополнительно содержит штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kр, причем высушенные микроорганизмы в биопрепарате взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kp:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=(1-2):(1-1,5):(2-3), а защитная среда содержит обезвоженный дрожжевой автолизат, глюкозу и питательные минеральные соли и микроэлементы, содержащие, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия, магния, марганца, цинка и железа, которые взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=(1-2):(0,5-1):(1-2).

Биопрепарат является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе. Оптимальный качественный и количественный состав предлагаемого биопрепарата был установлен экспериментально.

Предлагаемый биопрепарат может быть использован для очистки от сырой нефти и нефтепродуктов, например, таких как бензин, дизельное топливо, мазут и т.д., различных типов грунта, например, таких как суглинок, супесь, чернозем, торфяная почва и т.д.

Использование сухой формы биопрепарата по сравнению с жидкой формой биопрепаратов позволяет существенно увеличить длительность хранения биопрепарата без снижения его активности и упрощает доставку препарата к месту использования, расположенному не всегда в легко доступной местности, и исключает необходимость использования для транспортировки громоздких и неудобных термоконтейнеров, необходимых для жидкой формы биопрепаратов.

Биопрепарат должен обязательно содержать микроорганизмы - деструкторы углеводородов нефти, без которых осуществить экологическую биотехнологию очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами невозможно. Предложенный биопрепарат содержит два бактериальных штамма и один штамм дрожжей, взятых в оптимальных экспериментально найденных соотношениях, при которых наблюдается выраженный синергетический эффект на скорость очистки грунта, загрязненного нефтью и нефтепродуктами, по сравнению с использованием каждого штамма микроорганизмов по отдельности или биопрепарата, выполненного на основе только двух любых вышеописанных штаммов микроорганизмов.

Кроме того, для сохранения биомассы сухого препарата в активном состоянии биопрепарат, кроме микроорганизмов, содержит сухую защитную среду, состав которой оригинален и экспериментально подобран. Оптимальное массовое соотношение компонентов в защитной среде также было установлено экспериментально. Следует отметить, что дрожжевой автолизат является источником витаминов и биологически активных веществ, а глюкоза на первом этапе служит основным элементом питания для микроорганизмов. Питательные минеральные соли и микроэлементы также необходимы для жизнедеятельности и размножения микроорганизмов. При этом массовое соотношение между питательными минеральными солями и микроэлементами в используемой защитной среде, а также качественное и количественное соотношение микроэлементов в ней являются традиционными для биологии.

В качестве питательных минеральных солей и микроэлементов в защитной среде можно использовать известные водорастворимые коммерчески доступные комплексные удобрения с микроэлементами или смесь, состоящую из нескольких удобрений.

Обезвоженный дрожжевой автолизат коммерчески доступен или может быть получен с помощью распылительной сушки жидкого автолизата или его лиофильной сушки.

Если сухой биопрепарат не будет содержать в своем составе водорастворимой защитной среды, то биопрепарат не сможет быть использован для очистки грунта из-за резкого снижения окислительной активности биомассы препарата в процессе хранения и, как следствие, малой эффективности препарата.

Экспериментально было показано, что если в биопрепарате вместо заявленной в предлагаемом техническом решении защитной среды использовать другую известную защитную среду, например, используемую в прототипе смесь сахарозы, тиомочевины и полиглюкина, то скорость очистки грунта оказывается ниже по сравнению с предлагаемым препаратом. Таким образом, экспериментально подобранная защитная среда оптимальна для предлагаемого препарата.

Предлагаемый биопрепарат может быть получен смешением необходимых массовых количеств разных видов высушенных (лиофилизированных) микроорганизмов, индивидуально выращенных в инокуляторах (ферментерах) на специально подобранных питательных средах, с последующим добавлением необходимого количества сухой защитной среды. Используемая в предлагаемом препарате сухая защитная среда также может быть получена смешением сухих составляющих, взятых в необходимых массовых соотношениях. Содержание жизнеспособных микроорганизмов в 1 г сухого биопрепарата в КОЕ/г устанавливают экспериментально традиционными для микробиологии способами.

Срок годности предлагаемого сухого биопрепарата составляет не менее года. Биопрепарат компактен, его легко перевозить, в том числе и на большие расстояния, в традиционной для перевозки биопрепаратов таре крафт-мешки, полипропиленовые контейнеры и т.д.

Используемые в предлагаемом биопрепарате штаммы микроорганизмов были депонированы во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика с регистрационными номерами: штамм бактерии Rhodococcus jialingie 1 kp Ас-1957 (2014 г), штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb В-11685 (2014 г) и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kр Y-4043 (2014 г).

Rhodococcus jialingie 1 kp является природным изолятом из нефтезагрязненных торфяных почв Западной Сибири.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Грамположительные кокковидные клетки, встречаются палочки размером (0,7-0,8)×(0,8-1,3) мкм. Культура неподвижна. Колонии кремовые, слизистые, блестящие. Консистенция мягкая, легко снимается с поверхности агара, легко размазывается. Рост очень хороший - при 25°C на глюкозо-пептонном агаре образует колонии через 24 часа.

Физиологические признаки штамма.

Аэробный микроорганизм, хорошо растет в температурном диапазоне от 10°C до 35°C при оптимуме 28°C, pH среды 6,0-8,0. Активно ассимилирует углеводороды нефти. Растет в присутствии 5% NaCl. Каталазный тест положительный.

Хранение штамма.

Хранение штамма осуществляют на твердой среде следующего состава (г/л): пептон 20,0 г, глюкоза 10,0 г, хлорид натрия 5,0 г, агар-агар 15,0 г, дистиллированная вода 1000 мл или на стандартной глюкозо-пептонной среде (размешать 50,0 г порошка М649 (торговая марка фирмы HiMedia) в 1000 мл дистиллированной воды). Пересев проводят через каждые 3-4 месяца. Культивирование штамма ведут на бульоне (HiMedia) или глюкозо-минеральной среде.

Штамм бактерий Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb - природный изолят из нефтезагрязненных торфяников Западной Сибири.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Грамположительные кокковидные клетки. Колонии блестящие с небольшим желтовато-палевым оттенком. Рост умеренно-хороший - через 48 часов при 25°C образует колонии на глюкозо-пептонном агаре. Образует внутриклеточные споры.

Физиологические признаки штамма.

Аэробный микроорганизм (факультативный анаэроб), хорошо растет в температурном диапазоне от 15°C до 30°C при оптимуме 25°C, pH среды 6,0-7,0. Ассимилирует углеводороды нефти. Способен расти в присутствии до 5% NaCl.

Хранение штамма

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверку жизнеспособности штамма проводят 1 раз в 12 месяцев высевом на глюкозо-пептонный агар, готовые среды марок М9 или LB1.

При хранении на косяках с этими средами при 5°C - пересев 1 раз в 3 месяца. Состав сред для размножения штамма (г/л): среда пептон 20,0 г, глюкоза 10,0 г, хлорид натрия 5,0 г, агар-агар 15,0 г, дистиллированная вода 1000 мл или стандартная глюкозо-пептонная среда (размешать 50,0 г порошка М649 (HiMedia) в 1000 мл дистиллированной воды). Можно культивировать в бульоне (HiMedia) или глюкозо-минеральной среде.

Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kр выделен из загрязненных стоков промышленного предприятия (Московская обл.).

Культурально-морфологические признаки штамма.

Хорошо растет на глюкозо-пептонном агаре, колонии образуются через 24 часа при 25°C, клетки в основном одиночные, овальные, реже округлые 5-8 мкм. Колонии белые, матовые, круглые, легко снимаются с поверхности агара.

Физиологические признаки штамма.

Аэробный микроорганизм, хорошо растет в температурном диапазоне от 5°C до 30°C при оптимуме 25°C, pH среды 5,0-7,0. Активно ассимилирует углеводороды нефти. Галотолерантен способен расти в присутствии 8% NaCl.

Хранение штамма.

Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (2-4 раза в год) на средах следующего состава (г/л): пептон 20,0 г, глюкоза 10,0 г, хлорид натрия 5,0 г, дрожжевой экстракт 0,5 г, агар-агар 15,0 г, дистиллированная вода 1000 мл или на стандартной глюкозо-пептонной среде (размешать 50,0 г порошка М649 (HiMedia) в 1000 мл дистиллированной воды).

Предлагаемый биопрепарат при его внесении в сухом виде на загрязненный грунт утрачивает работоспособность. Поэтому перед применением сухой биопрепарат подлежит обязательной активации с получением готовой к применению его водной дисперсии, для приготовления которой необходимо использовать несколько рассчитанных параметров. Приводим пример их расчета.

Пусть с помощью предлагаемого сухого биопрепарата с известным значением А (КОЕ/г) препарата (например, 2,5×10¹¹ КОЕ/г) предстоит очистить от загрязнения S (м²) грунта (например, 100 м²) с нанесением на загрязненный грунт готовой к применению дисперсии биопрепарата в количестве Р (л/м²) грунта (например, 10 л/м² грунта) и разбавления концентрированной дисперсии биопрепарата, имеющей объем V₁ (л), водой в N раз (например, в 20 раз) путем введения в концентрированную дисперсию дополнительного объема воды V₂ (л) с получением готовой к применению дисперсии биопрепарата. Тогда общий объем готовой к применению дисперсии биопрепарата V (л) составит

V (л)=Р (л/м²)×S (м²),

(например, V (л)=10 л/м²×100 м²=1000 л) и

V₁ (л)=V (л)/N=Р (л/м²)×S (м²)/N,

(например, 1000 л/20=50 л). При этом для приготовления готовой к применению дисперсии биопрепарата в концентрированную дисперсию необходимо внести V₂ (л) воды, (например, 950 л).

В способе очистки грунта с использованием предлагаемого препарата значения V₁ (л) и V₂ (л) могут варьироваться в зависимости от значения N, равного 20-40, однако всегда

V (л)=V₁ (л)+V₂ (л),

Из уравнений следует, что

V (л) = N×V₁ (л),

(например, V (л)=20×V₁ (л)) и

V₂ (л)=V₁ (л)-V₁ (л)=(N-1)×V₁ (л)=(N-1)×V (л)/N,

(например, V₂ (л)=20×V₁ (л)-V₁ (л)=19 V₁ (л)=(19/20)×1000 л=950 л).

При использовании предлагаемого биопрепарата приготовление готовой к применению его водной дисперсии, имеющей объем V (л), осуществляют путем диспергирования рассчитанного количества сухого биопрепарата М (г) в рассчитанном объеме V₁ (л) 0,4-0,6%-ного водного раствора полного минерального удобрения (например, 0,5%-ного) с получением исходной дисперсии, содержащей микроорганизмы препарата в количестве, равном К (КОЕ/л) (например, 2×10⁹ КОЕ/л) с последующей двухстадийной продувкой через полученную дисперсию воздуха и разбавлением полученной концентрированной дисперсии в N раз путем введения V₂ (л) воды. Из этого следует, что

М (г)×А (КОЕ/г)=К (КОЕ/л)×V₁ (л)

и М (г)=К (КОЕ/л)×V₁ (л)/А (КОЕ/г),

(например, М (г)=2×10⁹ КОЕ/л×50 л/(2,5×10¹¹ КОЕ/г)=0,4 (г)

При этом для приготовления требуемого объема V₁ (л) раствора удобрения необходимо растворить рассчитанное количество M₁ (кг) удобрения, равное произведению массы воды в кг, имеющей объем V₁ (л), на концентрацию удобрения в растворе, т.е. растворить V₁ (кг)×(0,004-0,006) удобрения в V₁ (л) воды, (например, растворить 50 кг × 0,005=0,25 кг удобрения в 50 л воды).

Приготовление исходной дисперсии биопрепарата осуществляют следующим образом. В емкость с рассчитанным объемом воды V₁ (л) с температурой 20-25°C добавляют рассчитанное количество M₁ (кг) комплексного (полного) водорастворимого минерального удобрения, полученную смесь перемешивают до полного растворения удобрения с получением 0,4-0,6% раствора удобрения. В случае, присутствия в удобрениях конгломератных образований (слежавшихся комков, возникших при перевозке удобрений), перед засыпкой удобрений в воду их дробят до получения однородной массы. Далее в указанную емкость добавляют рассчитанное количество М (г) сухого биопрепарата с известным значением A (КОЕ/г). В случае наличия в препарате слежавшихся комков, возникших при его транспортировке, перед засыпкой препарата в емкость их также дробят до получения однородной массы. После внесения биопрепарата содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии биопрепарата, содержащей микроорганизмы в экспериментально установленном оптимальном количестве 2×10⁹-4×10¹¹ КОЕ/л. Через полученную дисперсию с помощью компрессора продувают воздух в течение 12-14 ч с последующим введением в нее рассчитанного количества дизельного топлива или загрязнителя грунта в количестве 0,05-0,20% от массы дисперсии и повторной продувки через полученную дисперсию, являющуюся коллоидной системой, содержащей как диспергированные микроорганизмы, так и капли введенного жидкого углеводорода, воздуха в течение 12-14 ч.

После активации исходной дисперсии двукратной продувкой воздуха полученную концентрированную водную дисперсию биопрепарата необходимо хранить при температуре от +5 до +25±5°C и использовать в течение суток после приготовления.

Перед применением концентрированную дисперсию разбавляют в N раз рассчитанным объемом V₂ (л) воды, приводящим к получению нужного объема V (л) готовой к применению дисперсии биопрепарата, которая при внесении ее по всей площади загрязненного грунта в количестве 10-20 л/м² грунта обеспечивает с учетом увеличения численности микроорганизмов биопрепарата в процессе активации препарата на порядок интродукцию (внесение) в загрязненный грунт вышеописанных жизнеспособных микроорганизмов биопрепарата в количестве 1×10¹⁰-1×10¹³ КОЕ/м² грунта.

Необходимость диспергирования сухого предлагаемого биопрепарата не в воде, а в водном растворе полного удобрения, обусловлена тем, что такое минеральное удобрение нужно для обеспечения оптимальных условий жизнедеятельности и размножения используемых микробных культур биопрепарата, поскольку одна только водорастворимая защитная среда сухого биопрепарата даже при ее высоком содержании в сухом биопрепарате не способна обеспечить такие условия. В качестве такого удобрения можно использовать любое водорастворимое полное минеральное удобрение, содержащее, по крайней мере, соединения азота, фосфора и калия, например, нитроаммофоску, удобрения с торговыми марками «КЕМИРА ПЛЮС», «Созревай-ка», «Новоферт Универсал» и т.д.

При использовании биопрепарата необходимость двухстадийной продувки воздуха через дисперсию связана с тем, что на первом этапе происходит «пробуждение» используемых в биопрепарате культур от «сна», в котором они находятся в сухом препарате. Вторая продувка воздуха в присутствии дизельного топлива или загрязнителя грунта настраивает «проснувшиеся» микроорганизмы на биодеструкцию углеводородов как элементов их питания. При этом оптимальные концентрация водного раствора полного минерального удобрения (0,4-0,6 массовых %), количество жизнеспособных микроорганизмов биопрепарата в исходной дисперсии до ее активации, равное 2×10⁹-4×10¹¹ КОЕ/л, продолжительность первой и второй продувки воздуха через дисперсию 12-14 ч, оптимальные количества вносимого в дисперсию дизельного топлива или загрязнителя грунта (0,05-0,20% от массы дисперсии) и степень разбавления концентрированной дисперсии водой N, равная 20-40 раз, были установлены экспериментально.

Если в процессе приготовления готовой к применению дисперсии биопрепарата продувки воздуха вообще не осуществлять или ограничиться только одной первой или только одной второй 12-14 часовой продувкой воздуха или даже увеличить их продолжительность, например, до 24 ч, но после этого до начала второй продувки воздуха не вводить в систему дизельное топливо или загрязнитель грунта, или внести дизельное топливо, или загрязнитель грунта сразу в исходную дисперсию препарата перед первой продувкой через нее воздуха, то активность готовой к применению дисперсии биопрепарата, полученной в таких условиях, неизбежно снизится и скорость очистки грунта также снизится.

При использовании предлагаемого биопрепарата для очистки от загрязнений в грунт вносят не сухой исходный биопрепарат, а его готовую к применению водную дисперсию. При этом количество интродуцированных (вносимых) в грунт микроорганизмов определяется произведением количества готовой к применению дисперсии биопрепарата в л, наносимого на 1 м² загрязненного грунта, и содержания в ней жизнеспособных (нативных) микроорганизмов. Варьируя численные значения параметров М (г), V₁ (л) и V₂ (л) можно получить одну и туже готовую к применению дисперсию препарата из разных исходных сухих биопрепаратов, известное значение КОЕ/г которых может варьироваться в широких пределах. Поэтому массовое соотношение между биомассой микроорганизмов и защитной средой в используемом биопрепарате может также варьироваться в широких пределах и составлять, например, 1:(1-1000), что позволяет использовать серию сухих биопрепаратов с различным исходным содержанием КОЕ/г препарата (см. примеры).

Использование предлагаемого препарата предполагает внесение в загрязненный грунт полного минерального удобрения, необходимого для создания благоприятных условия для жизнедеятельности и размножения используемых в биопрепарате микроорганизмов. При этом количество вносимого минерального удобрения в г/м² грунта зависит от типа грунта, типа загрязнителя и, главное, от глубины проникновения загрязнителя в грунт. Это обусловлено тем, что для достижения технического результата необходимо обеспечить оптимальную концентрацию удобрения во всем объеме загрязненного грунта. Экспериментально было установлено, что при относительно малой глубине проникновения загрязнителя в грунт (порядка 2-4 см) высокая скорость очистки грунта достигается уже при внесении удобрения в количестве 20 г/м² грунта. При высоком содержании загрязнителя в грунте (например, выше 15%), сопровождающемся, как правило, большей глубиной проникновения загрязнителя в грунт (например, 15 см и глубже) количество вносимого минерального удобрения может быть увеличено, например, до 80 г/м² грунта. Внесение большего количества минерального удобрения за один раз нецелесообразно.

Вносить минеральное удобрение на загрязненный участок грунта можно в виде его водного раствора, например, растворив его в готовой к применению суспензии препарата. Также возможно внесение удобрения в сухом виде. Если перед нанесением готовой к применению дисперсии биопрепарата минеральное удобрение в загрязненный грунт вообще не вносить, то технический результат изобретения не достигается.

При использовании предложенного биопрепарата вносить его готовую к применению дисперсию необходимо в количестве 10-20 л/м² грунта. При расходе рабочей дисперсии биопрепарата менее 10 л/м² грунта ее невозможно равномерно распределить по поверхности грунта, что неизбежно приведет к тому, что скорость очистки грунта в разных точках окажется неодинаковой. Внесение в грунт более 20 л/м² нецелесообразно с технической точки зрения, поскольку требует приготовления большого объема готовой суспензии.

Перед внесением биопрепарата также целесообразно определить степень загрязнения подлежащего очистке грунта нефтью и нефтепродуктами с использованием традиционных и описанных в научно-технической литературе методов, например, таких как гравиметрия, инфракрасная спектроскопия, газовая хроматография и т.д. для определения правильной стратегии очистки. Пробы грунта для анализов изначально и в процессе очистки отбирают на разной глубине по пятиточечной схеме стандартным пробоотборником.

Предлагаемый биопрепарат наносят на загрязненную поверхность грунта в виде рабочей дисперсии один раз, т.е. повторной или последующих обработок грунта биопрепаратом не требуется, что существенно упрощает известный способ очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами с использованием биопрепарата, выбранного в качестве прототипа.

Экспериментально было установлено, что при использовании предложенного биопрепарата, необходимо поддерживать влажность грунта на уровне 60-70% от величины его полной влагоемкости, что создает наиболее благоприятные условия для жизнедеятельности и размножения вносимых микроорганизмов биопрепарата и повышает скорость очистки грунта. При других значениях влажности грунта скорость очистки грунта от загрязнений углеводородами снижается.

При необходимости это достигается путем периодического полива или дождевания очищаемой территории. В дождливую погоду дополнительные увлажнения грунта не производят. Следует отметить, что при исходной влажности грунта ниже 60% увлажнение грунта проводят до, одновременно или после внесения в грунт предлагаемого биопрепарата и минерального удобрения, но до первого рыхления или перепахивания грунта. Это дает возможность обеспечить равномерную влажность по всему объему очищаемого грунта, и, как результат, получить более достоверные данные по скорости очистки грунта на всей загрязненной территории. При этом определение влажности грунта проводят в зависимости от погодных условий 2-3 раза в неделю и осуществляют традиционными описанными в научно-технической литературе методами.

Если при использовании биопрепарата влажность грунта поддерживать на уровне ниже 60% или выше 70%, то скорость очистки грунта снижается.

При использовании предложенного препарата загрязненный грунт периодически рыхлят или перепахивают на глубину, как правило, не превышающую глубину проникновения загрязнителя в грунт, поскольку запахивать загрязнитель в незагрязненные им слои грунта нецелесообразно. При этом в отличие от прототипа первое рыхление или перепахивание грунта проводят не до, а после внесения в грунт минерального удобрения и рабочей дисперсии биопрепарата. Это позволяет более равномерно распределить вносимые биопрепарат и минеральное удобрение по всему объему загрязненного грунта и положительно влияет на скорость очистки грунта. Осуществлять рыхление или перепахивание грунта можно с помощью известных используемых для этих целей средств и механизмов, например, с помощью культиватора или трактора. Для обеззараживания малых территорий можно использовать и немеханизированные средства, например, лопату или мотыгу.

При использовании предложенного биопрепарата повторные рыхления и перепахивания грунта можно проводить не только 1 раз в неделю, но и чаще, например, 2-3 раза в неделю. Они необходимы для увеличения объема грунта с целью его аэрации и улучшения его структуры, что благоприятно влияет на скорость очистки грунта. При этом выбор между перепахиванием и рыхлением грунта зависит от типа грунта, размера загрязненного участка и наличия на очищаемой территории труднопреодолимых препятствий, например, деревьев, древесных пней, камней и т.д. Если первое или повторные рыхления или перепахивания грунта не проводить, то это неизбежно снизит скорость очистки грунта.

Очистка грунта, загрязненного нефтью и нефтепродуктами, с помощью предлагаемого биопрепарата может включать следующий этап. Не впитавшийся в грунт загрязнитель целесообразно удалить механическим способом, а не запахивать его в грунт перед первой обработкой биопрепаратом. Механическое удаление углеводородов с загрязненной территории необходимо в случае сильного разлива, когда имеются участки грунта с не впитавшимся загрязнителем. Следует отметить, что в сырой нефти или в чистых нефтепродуктах в отсутствии грунта биопрепарат не работает, но он эффективно очищает загрязненный ими грунт.

Если не впитавшийся в грунт загрязнитель не удалять, то скорость очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами с использованием предлагаемого биопрепарата также будет высокой, но общая продолжительность очистки грунта и расход биопрепарата при этом увеличится, что нецелесообразно.

Дополнительно увеличить скорость очистки грунта с помощью предложенного препарата можно путем равномерного распределения перед первым рыхлением или перепахиванием грунта по его поверхности полуперепревшего конского навоза и/или навоза крупного рогатого скота в количестве 1-5 кг/м² грунта и/или органического структуратора грунта, выбранного из группы, включающей древесные опилки, древесную стружку, опавшую листву, скошенную траву, торф или любого их сочетания, вносимого в количестве 0,01-0,03 м³ на 1 м² грунта.

Внесение в грунт органического удобрения, а также внесение органического структуратора грунта увеличивает активность микробной популяции и активизирует процессы биодеструкции нефтепродуктов, что дополнительно повышает скорость очистки грунта.

Очистку грунта с помощью предлагаемого биопрепарата проводят в летне-осенний период, при этом оптимальная температура для обеззараживания грунта составляет 20-25°C. Очистку проводят до тех пор, пока содержание загрязнителя в грунте не окажется ниже его предельно допустимой концентрации. На конечном этапе очистки грунта возможна его фиторемедиация путем засева грунта семенами однолетних и многолетних трав. Продолжительность полной очистки грунта зависит от типа грунта, вида загрязнителя, его содержания в грунте, глубины его проникновения в грунт и погодных условий.

Преимущества предлагаемого биопрепарата иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

Используемый в примере препарат получают следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 0,10 кг Rhodococcus jialingie lkp, с 0,15 кг Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb к с 0,30 кг Yarrowia lipolytica 2kp и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 0,55 кг микробной массы, микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kp:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=1:1,5:3.

В другой емкости смешивают 25,00 кг комплексного водорастворимого минерального удобрения с микроэлементами КЕМИРА ПЛЮС с 0,75 кг растворимого в воде сульфата магния. Получают 25,75 кг водорастворимого неорганического препарата, питательные минеральные соли и микроэлементы в котором содержатся в массовом количестве общий азот 16%, фосфор в пересчете на P₂O₅ 17%, калий в пересчете на K₂O 30%, магний 0,6%, марганец 0,1%, цинк 0,01% и железо 0,11%. В третьей емкости смешивают 7,5 кг обезвоженного дрожжевого автолизата, 7,5 кг глюкозы и 15,0 кг полученного неорганического препарата, содержащего питательные минеральные соли и микроэлементы, и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 30,0 кг водорастворимой защитной среды, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=1:1:2.

Для получения сухого препарата в четвертой емкости смешивают 0,55 кг полученной микробной смеси с 0,55 кг полученной защитной среды. Получают 1,10 кг предлагаемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:1 и содержание жизнеспособных микроорганизмов в биопрепарате составляет 1,2×10¹¹ КОЕ/г препарата.

С помощью предложенного биопрепарата предстоит очистить часть территории железнодорожного депо площадью 1 га, супесчаный грунт которого загрязнен смесью сырой нефти и дизельного топлива при содержании загрязнителя в поверхностном слое грунта 5%. При этом влажность грунта равна 50% и глубина проникновения загрязнителя в грунт достигает 6 см. На загрязненный грунт необходимо внести готовую к применению дисперсию биопрепарата в количестве 10 л/м² грунта.

Перед приготовлением суспензии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 20 раз.

После этого в емкости диспергируют 830 г полученного сухого биопрепарата в 5000 л 0,5%-ного водного раствора нитроаммофоски, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии биопрепарата, содержание микроорганизмов в которой составляет 2×10¹⁰ КОЕ/л. Через полученную дисперсию в течение 12 ч продувают воздух, после чего туда вводят 5 кг сырой нефти (0,1% от массы дисперсии), диспергируют ее и через полученную дисперсию повторно продувают воздух в течение 12 ч. Затем систему разбавляют 95000 л воды. После перемешивания получают 1×10⁵ л готовой к применению дисперсии препарата.

По всей площади загрязненного участка равномерно распределяют полное минеральное удобрение нитроаммофоску в количестве 30 г/м² грунта, затем наносят готовую к применению дисперсию препарата, грунт увлажняют путем полива до влажности 65% и рыхлят с помощью культиватора на глубину 6 см. После этого проводят повторные рыхления грунта один раз в неделю и поддерживают влажность грунта на уровне 65%о в течение всего процесса очистки.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 2

Используемый в примере биопрепарат получают следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 1 г Rhodococcus jialingie 1 kp, с 1 г Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и с 3 г Yarrowia lipolytica 2kр и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 5 г микробной смеси, микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kр:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=1:1:3.

В другой емкости смешивают 14,29 г обезвоженного дрожжевого автолизата, 7,14 г глюкозы и 28,57 г неорганического препарата на основе КЕМИРА ПЛЮС и сульфата магния, используемого в примере 1. Полученную смесь также перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 50 г водорастворимой защитной среды, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=1:1:2.

Для получения сухого биопрепарата в третьей емкости смешивают 5 г полученной микробной смеси с 50 г полученной защитной среды. Получают 55 г предлагаемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:10 и содержание жизнеспособных микроорганизмов в препарате составляет 2×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

С помощью предложенного биопрепарата предстоит очистить 200 м² супесчаной грунтовой дороги в сельской местности после аварии на ней грузового автотранспорта, перевозившего дизельное топливо. Содержание дизельного топлива в грунте составляет 4%, глубина проникновения загрязнителя в грунт достигает 4 см, влажность грунта равна 40%. На загрязненный грунт необходимо внести готовую к применению дисперсию биопрепарата в количестве 15 л/м² грунта.

Перед приготовлением суспензии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 30 раз.

После этого в емкости диспергируют 50 г полученного сухого биопрепарат в 100 л 0,4%-ного водного раствора КЕМИРА ПЛЮС, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии, содержащей микроорганизмы препарата в количестве 1×10¹⁰ КОЕ/л. Через полученную дисперсию в течение 13 ч продувают воздух, после чего туда вводят 50 г дизельного топлива (0,05% от массы дисперсии), диспергируют его и повторно через полученную дисперсию продувают воздух в течение 12 ч. Затем туда вводят рассчитанный объем воды, равный 2900 л. После перемешивания получают 3000 л готовой к применению дисперсии биопрепарата.

Для совмещения внесения полного минерального удобрения в грунт с нанесением на него готовой дисперсии биопрепарата в готовую дисперсию добавляют 6 кг легко растворимого удобрения КЕМИРА ПЛЮС, что эквивалентно прямому внесению в грунт этого удобрения в количестве 30 г/м² грунта.

На всю площадь загрязненного участка равномерно наносят готовую к применению дисперсию биопрепарата, содержащую дополнительно введенное в нее полное минеральное удобрение, после чего грунт увлажняют путем полива до влажности 70% и рыхлят на глубину 4 см путем боронования, затем проводят повторные рыхления грунта один раз в 6 дней и поддерживают влажность грунта на уровне 70% в течение всего процесса очистки грунта.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 3

Используемый в примере биопрепарат получают следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 0,334 кг Rhodococcus jialingie 1 kp, с 0,167 кг Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и с 0,501 кг Yarrowia lipolytica 4043 и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 1,002 кг микробной смеси, микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kр:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2k=2:1:3.

В другой емкости смешивают 3,00 кг обезвоженного дрожжевого автолизата, 0,75 кг глюкозы и 3,00 кг водораствоимого комплексного минерального удобрения с микроэлементами марки «Созревай-ка», питательные минеральные соли и микроэлементы в котором содержатся в массовом количестве общий азот 17%, фосфор в пересчете на P₂O₅ 17%, калий в пересчете на K₂O 17%, магний 1,00%, марганец 0,01%, цинк 0,01% и железо 0,02%. Полученную смесь также перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 6,75 кг водорастворимой защитной среды, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=2:0,5:2.

Для получения используемого сухого биопрепарата в третьей емкости смешивают 67,5 г полученной микробной смеси с 6,75 кг полученной защитной среды. Получают 6,82 кг используемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:100 и содержание жизнеспособных микроорганизмов в биопрепарате составляет 3×10⁹ КОЕ/г препарата.

С помощью предложенного биопрепарата предстоит очистить 500 м² лесной дороги и прилегающей к ней территории после аварии автотранспорта, перевозившего бензин. Содержание загрязнителя в подзолистом грунте составляет 4%, глубина проникновения бензина в грунт достигает 5 см и влажность грунта равна 70%. На загрязненный грунт необходимо нанести готовую к применению дисперсию биопрепарата в количестве 12 л/м² грунта.

Перед приготовлением дисперсии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 30 раз.

После этого в емкости диспергируют 6,67 кг полученного сухого биопрепарата в 200 л 0,4%-ного водного раствора минерального удобрения КЕМИРА ПЛЮС, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии биопрепарата, содержание жизнеспособных микроорганизмов в которой составляет 1×10¹¹ КОЕ/л. Через полученную дисперсию в течение 12 ч продувают воздух, после чего туда вводят 300 г бензина (0,15% от массы дисперсии), диспергируют его и через полученную дисперсию повторно продувают воздух в течение 14 ч. Затем в систему вводят рассчитанный объем воды, равный 5800 л. После перемешивания получают 6000 л готовой к применению дисперсии биопрепарата.

По всей площади загрязненного участка равномерно распределяют полное минеральное удобрение нитроаммофоску в количестве 25 г/м² грунта, затем наносят готовую к применению дисперсию препарата и грунт рыхлят на глубину 5 см. Повторные рыхления грунта проводят один раз в 5 дней и поддерживают влажность грунта путем полива на уровне 70% в течение всего процесса очистки.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 4

Используемый биопрепарат получают следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 16 г Rhodococcus jialingie 1 kp, с 8 г Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и с 16 г Yarrowia lipolytica 2kр и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 40 г микробной смеси, микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 кр:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=2:1:2.

В другой емкости смешивают 22,86 кг обезвоженного дрожжевого автолизата, 5,71 кг глюкозы и 11,43 кг водорастворимого минерального удобрения Акварин, питательные минеральные соли и микроэлементы в котором содержатся в массовом количестве общий азот 14%, фосфор в пересчете на Р₂O₅ 10%, калий в пересчете на K₂O 28%, магний 1,5%, марганец 0,042%, цинк 0,014%) и железо 0,054%). Полученную смесь также перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 40 кг защитной среды, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=2:0,5:1.

Для получения сухого биопрепарата в третьей емкости смешивают 40 г полученной микробной смеси с 40 кг полученной защитной среды. Получают 40,04 кг используемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:1000 и содержание жизнеспособных микроорганизмов в препарате составляет 3×10⁸ КОЕ/г препарата.

С помощью предложенного биопрепарата предстоит очистить 400 м² лесной дороги и прилегающей к ней территории после аварии автотранспорта, перевозившего мазут. Содержание загрязнителя в подзолистом грунте составляет 5%, глубина проникновения мазута в грунт достигает 4 см и влажность грунта равна 65%. На загрязненный грунт необходимо нанести готовую к применению дисперсию биопрепарата в количестве 20 л/м² грунта.

Перед приготовлением дисперсии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 40 раз.

После этого в емкости диспергируют 40 кг полученного сухого биопрепарата в 200 л 0,6%-ного водного раствора удобрения, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии биопрепарата, содержащей микроорганизмы препарата в количестве 6×10¹⁰ КОЕ/л. Через полученную дисперсию в течение 14 ч продувают воздух, после чего туда вводят 400 г мазута (0,20%) от массы дисперсии), диспергируют его и через полученную дисперсию повторно продувают воздух в течение 14 ч. Затем туда вводят рассчитанный объем воды, равный 7800 л. После перемешивания получают 8000 л готовой к применению дисперсии биопрепарата.

По всей площади загрязненного грунта равномерно распределяют минеральное удобрение нитроаммофоску в количестве 25 г/м² грунта, затем наносят готовую к применению дисперсию биопрепарата и грунт рыхлят на глубину 4 см. После этого проводят повторные рыхления грунта на туже глубину один раз в 6 дней и поддерживают влажность грунта на уровне 65% на протяжении всего процесса очистки грунта.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 5

Используемый в примере препарат получают следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 10 г Rhodococcus jialingie 1 kp, с 15 г Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и с 20 г Yarrowia lipolytica 2kр и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 45 г микробной массы, высушенные микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kр:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=1:1,5:2.

В другой емкости смешивают 0,15 кг обезвоженного дрожжевого автолизата с 0,15 кг глюкозы и с 0,15 кг неорганического препарата, используемого в примере 1. Полученную смесь также перемешивают до получения внешне однородной массы, являющейся защитной средой, и имеющей массу 0,45 кг, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=1:1:1.

Для получения сухого биопрепарата в третьей емкости смешивают 45 г полученной микробной смеси с 45 г полученной защитной среды. Получают 90 г предлагаемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:1 и содержание жизнеспособных микроорганизмов биопрепарата составляет 2,5×10¹¹ КОЕ/г препарата.

Полевые испытания биопрепарата проводят на экспериментальном участке нефтеперерабатывающего завода, расположенного в Омской области. В ходе испытаний предстояло очистить 100 м² супесчаного грунта, имеющего влажность 60% и содержащего в поверхностном слое толщиной 3 см сырую нефть в количестве 2,5 массовых % путем внесения готовой к применению дисперсии биопрепарата в количестве 10 л/м² грунта.

Перед приготовлением дисперсии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 20 раз.

В емкости диспергируют 0,4 г полученного препарата в 50 л 0,5%-ного водного раствора Акварина, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии препарата, содержащей микроорганизмы препарата в количестве 2×10⁹ КОЕ/л. Через полученную дисперсию в течение 12 ч продувают воздух, после чего туда вводят 50 г сырой нефти (0,1%) от массы дисперсии), диспергируют ее и через полученную дисперсию повторно продувают воздух в течение 12 ч. Затем туда вводят рассчитанный объем воды, равный 950 л, и после перемешивания получают 1000 л готовой к применению дисперсии препарата.

По всей площади загрязненного грунта равномерно распределяют полное минеральное удобрение нитроаммофоску в количестве 20 г/м² грунта, затем равномерно наносят дисперсию биопрепарата в количестве 10 л/м² грунта, грунт рыхлят на глубину проникновения загрязнителя в грунт (3 см), затем проводят повторные рыхления грунта два раза в неделю и путем полива поддерживают влажность грунта на уровне 60% на протяжении всего процесса очистки грунта.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 6

Используемый в примере препарат получают следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 20 г Rhodococcus jialingie 1 kp, с 15 г Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и с 20 г Yarrowia lipolytica 2kр и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 55 г микробной смеси, микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kр:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=2:1,5:2.

В другой емкости смешивают 250 г обезвоженного дрожжевого автолизата, 125 г глюкозы и 125 г неорганического препарата, используемого в примере 1. Полученную смесь также перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 500 г защитной среды, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=2:1:1.

Для получения сухого биопрепарата в третьей емкости смешивают 50 г полученной микробной смеси с 500 г полученной защитной среды. Получают 550 г используемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:10 и содержание жизнеспособных микроорганизмов в биопрепарате составляет 2,4×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

С помощью предлагаемого биопрепарата предстоит очистить 2000 м² временной грунтовой автостоянки в сельской местности. Содержание загрязнителя - смеси бензина и дизельного топлива в суглинистом грунте составляет 6%, глубина проникновения загрязнителя в грунт достигает 5 см и влажность грунта равна 50%. В загрязненный грунт необходимо внести готовую к применению дисперсию биопрепарата в количестве 15 л/м² грунта.

Перед приготовлением дисперсии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 30 раз.

Затем в емкости диспергируют 457 г полученного сухого биопрепарата в 1000 л 0,5%-ного водного раствора удобрения КЕМИРА ПЛЮС, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии биопрепарата, содержание жизнеспособных микроорганизмов в которой составляет 1,1×10¹⁰ КОЕ/л. Через полученную дисперсию с помощью компрессора в течение 12 ч продувают воздух, после чего туда вводят 1,0 кг дизельного топлива (0,1%) от массы дисперсии), диспергируют ее и повторно через полученную дисперсию продувают воздух в течение 12 ч. После этого в систему вводят рассчитанный объем воды, равный 29000 л. После перемешивания получают 30000 л готовой к применению дисперсии препарата.

По всей площади загрязненного грунта равномерно распределяют полное минеральное удобрение Акварин в количестве 30 г/м² грунта, затем наносят готовую к применению дисперсию биопрепарата, грунт увлажняют путем полива до влажности 65%, затем рыхлят с помощью культиватора на глубину 5 см. После этого проводят повторные рыхления грунта один раз в неделю и поддерживают влажность грунта путем полива на уровне 65% на протяжении всего процесса очистки.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 7

В опыте используют биопрепарат, полученный следующим образом. В емкости смешивают лиофильно высушенные культуры микроорганизмов: 1,95 кг Rhodococcus jialingie 1 kp, с 1,04 кг Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и с 2,21 кг Yarrowia lipolytica 2kp и полученную смесь перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 5,20 кг микробной смеси, высушенные микроорганизмы в которой взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1 kp:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=1,5:0,8:1,7.

В другой емкости смешивают 20,8 кг обезвоженного дрожжевого автолизата, 10,4 кг глюкозы и 20,8 кг неорганического препарата, использованного в примере 1. Полученную смесь также перемешивают до получения внешне однородной массы. Получают 52,0 кг защитной среды, компоненты которой взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=1,50:0,75:1,50.

Для получения сухого биопрепарата в третьей емкости смешивают 3,4 кг полученной микробной смеси с 34,0 кг защитной среды. Получают 37,4 кг используемого биопрепарата, в котором биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:10 и содержание жизнеспособных микроорганизмов в биопрепарате составляет 2,7×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

С помощью предлагаемого биопрепарата предстоит очистить 10⁴ м² территории, прилегающей к законсервированной нефтяной скважине. Содержание нефти в суглинистом грунте составляет 16%, глубина проникновения загрязнителя в грунт достигает 12 см и влажность грунта равна 60%. На загрязненный грунт необходимо внести готовую к применению дисперсию биопрепарата в количестве 10 л/м² грунта.

Перед приготовлением дисперсии проводят расчет количества вносимого сухого биопрепарата и необходимого объема водного раствора полного минерального удобрения, а также количества удобрения для получения такого раствора и объема воды, необходимого для разбавления концентрированной дисперсии после активации препарата в 40 раз.

После этого в емкости диспергируют 37 кг полученного сухого биопрепарата в 2500 л 0,5%-ного водного раствора нитроаммофоски, содержимое емкости перемешивают до получения внешне однородной исходной дисперсии биопрепарата, содержащей микроорганизмы препарата в количестве 4×10¹¹ КОЕ/л. Через полученную дисперсию в течение 12 ч продувают воздух, после чего туда вводят 2,5 кг сырой нефти (0,1% от массы дисперсии), диспергируют ее и через полученную дисперсию повторно продувают воздух в течение 12 ч. После этого систему разбавляют рассчитанным объемом воды, равным 9,75×10⁴ л. После перемешивания получают 1×10⁵ л готовой к применению дисперсии биопрепарата.

По всей площади загрязненного грунта равномерно распределяют полное минеральное удобрение нитроаммофоску в количестве 80 г/м² грунта, затем наносят готовую к применению дисперсию биопрепарата и грунт перепахивают на глубину 12 см. После этого проводят повторные перепахивания грунта один раз в неделю и поддерживают влажность грунта путем полива на уровне 60% в течение всего процесса очистки.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 8 (контрольный, с использованием биопрепарата на основе только штамма Rhodococcus jialingie 1 kp и защитной среды)

Опыт проводят аналогично примеру 5, однако вместо описанного биопрепарата используют биопрепарат на основе только штамма Rhodococcus jialingie 1 kp и защитной среды, описанной в примере 5, взятых в массовых соотношениях 1:1 с содержанием жизнеспособных микроорганизмов 3,5×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 9 (контрольный, с использованием биопрепарата на основе только штамма Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и защитной среды)

Опыт проводят аналогично примеру 5, однако вместо описанного биопрепарата используют биопрепарат на основе только штамма Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и защитной среды, описанной в примере 5, взятых в массовых соотношениях 1:1 с содержанием жизнеспособных микроорганизмов 5×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 10 (контрольный, с использованием биопрепарата на основе только штамма Yarrowia lipolytica 2kр и защитной среды)

Опыт проводят аналогично примеру 5, однако вместо описанного биопрепарата используют биопрепарат на основе только штамма Yarrowia lipolytica 2kр и защитной среды, описанной в примере 5, взятых в массовых соотношениях 1:1 с содержанием жизнеспособных микроорганизмов 5×10⁸ КОЕ/г препарата.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 11 (контрольный, с использованием биопрепарата на основе защитной среды и только смеси штаммов Rhodococcus jialingie 1 kp и Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb)

Опыт проводят аналогично примеру 5, однако вместо описанного биопрепарата используют биопрепарат на основе защитной среды, описанной в примере 5, и только смеси штаммов Rhodococcus jialingie 1 kp и Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb, взятых в массовом соотношении 1:1,5. При этом биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:1 и содержание жизнеспособных микроорганизмов составляет 4×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 12 (контрольный, с использованием биопрепарата на основе защитной среды и только смеси штаммов Rhodococcus jialingie 1kp и Yarrowia lipolytica 2kp)

Опыт проводят аналогично примеру 5, однако вместо описанного биопрепарата используют биопрепарат на основе защитной среды, описанной в примере 5, и только смеси штаммов Rhodococcus jialingie 1kp и Yarrowia lipolytica 2kp, взятых в массовом соотношении 1:2. При этом биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:1 и содержание жизнеспособных микроорганизмов составляет 3,5×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Пример 13 (контрольный, с использованием биопрепарата на основе защитной среды и только смеси штаммов Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и Yarrowia lipolytica 2kp)

Опыт проводят аналогично примеру 5, однако вместо описанного биопрепарата используют биопрепарат на основе защитной среды, описанной в примере 5, и только смеси штаммов Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и Yarrowia lipolytica 2kр, взятых в массовом соотношении 1,5:2. При этом биомасса микроорганизмов и защитная среда взяты в массовом соотношении 1:1 и содержание жизнеспособных микроорганизмов составляет 4×10¹⁰ КОЕ/г препарата.

Убыль загрязнителя в грунте в процессе очистки показана в таблице.

Из таблицы видно, что скорость очистки грунта с помощью предлагаемого биопрепарата (пример 5), равная 3,15%/день, превышает в 1,5-2 раза скорость очистки грунта с использованием любого биопрепарата, содержащего только один вышеописанный микроорганизм (примеры 6-8), а также биопрепаратов, содержащих любые сочетания только двух вышеописанных микроорганизмов (примеры 9-11), что свидетельствует о наличии выраженного синергетического эффекта при использовании предлагаемого препарата.

Из таблицы также видно, что предлагаемый биопрепарат более чем в пять раз повышает скорость очистки грунта от загрязнений углеводородами по сравнению с известным техническим решением, выбранным в качестве прототипа.

Изобретение относится к экологической биотехнологии, а именно к разработке биопрепарата для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Изобретение позволяет увеличить скорость очистки грунта от загрязнений углеводородами в 5 раз. Биопрепарат для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами выполнен в виде сухой формы биопрепарата и включает водорастворимую защитную среду и микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти, содержащие бактерии рода Rhodococcus, в качестве бактерии рода Rhodococcus биопрепарат содержит штамм бактерии Rhodococcus jialingie 1kp, а также дополнительно содержит штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kр. Высушенные микроорганизмы в биопрепарате взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1k:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=(1-2):(1-1,5):(2-3), а защитная среда содержит обезвоженный дрожжевой автолизат, глюкозу и питательные минеральные соли и микроэлементы, которые содержат, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия, магния, марганца, цинка и железа, которые взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=(1-2):(0,5-1):(1-2). 1 табл., 13 пр.

Биопрепарат для очистки грунта от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, выполненный в виде сухой формы биопрепарата и включающий водорастворимую защитную среду и микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти, содержащие бактерии рода Rhodococcus, отличающийся тем, что в качестве бактерии рода Rhodococcus биопрепарат содержит штамм бактерии Rhodococcus jialingie 1kp, а также дополнительно содержит штамм бактерии Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb и штамм дрожжей Yarrowia lipolytica 2kp, причем высушенные микроорганизмы в биопрепарате взяты в массовом соотношении Rhodococcus jialingie 1kp:Lysinibacillus xylanilyticus 5 rb:Yarrowia lipolytica 2kp=(1-2):(1-1,5):(2-3), а защитная среда содержит обезвоженный дрожжевой автолизат, глюкозу и питательные минеральные соли и микроэлементы, содержащие, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия, магния, марганца, цинка и железа, которые взяты в массовом соотношении обезвоженный дрожжевой автолизат:глюкоза:питательные минеральные соли и микроэлементы=(1-2):(0,5-1):(1-2).