СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИСКУССТВЕННОГО ЗАЧАТКА ЗУБА IN VITRO И ПОЛУЧЕННЫЙ ИМ ИСКУССТВЕННЫЙ ЗАЧАТОК ЗУБА Российский патент 2017 года по МПК A61K35/32 A61L27/38 G01N33/50 

ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Стоматологическая помощь является наилучшим способом сохранения здорового зубного ряда. Тем не менее даже при оптимальной стоматологической помощи может происходить повреждение, разрушение или потеря зубов. Такое повреждение, разрушение или потеря зубов могут быть, например, связаны с болезнью, гормонами, лечением или быть следствием несчастного случая. В настоящее время в таком случае используют зубные имплантаты, которые, как правило, созданы из материалов, содержащих металл (например, титан), керамику и/или композиты. Эти методы имплантации являются чрезвычайно сложными и с медицинской и косметической точки зрения уже достигают высоких уровней. Однако эти методы замены зубов требуют существенной хирургической процедуры и в итоге трудоемкого последующего ухода. Кроме того, эти синтетические имплантаты не отвечают всем требованиям по отношению к зубу, таким как, например, "абсорбция" с помощью естественной периодонтальной связки, которая фиксирует зуб внутри челюстной кости.

Таким образом, целью в области регенеративной медицины является обеспечение средств, которые позволяют получать или индуцировать ткань или органы, подобные соответствующим природным тканям и органам по функции и морфологии. Одним из подходов является обеспечение искусственной ткани или органов, которые могут быть использованы для регенерации зубов in vitro и/или in vivo. Такая искусственная ткань включает ткань, которая была получена с помощью биотехнологических средств.

Помимо проблемы получения ткани, способной формировать in vivo зуб, который в существенной степени подобен природным зубам по функции и морфологии, другой целью является получение ткани, которая может быть изготовлена без необходимости в эмбриональных стволовых клетках, и которая использует клетки, происходящие от пациента, подлежащего лечению.

В многочисленных подходах первые попытки и успехи были сделаны в отношении ткани, которая служит этой цели. Примеры таких подходов описаны в EP 1 905 459 A1, EP 2 130 909 A1, US 2007/0231275 A1, US 2011/0212414 и WO 2005/051436 A2. Однако в большинстве из этих подходов используют эмбриональные клетки, эти клетки культивируют в нефизиологических условиях адгезивного культивирования, и требуется присутствие синтетического каркаса или носителя.

Таким образом, предметом выбора настоящего изобретения является обеспечение средств для преодоления одной или нескольких проблем известного уровня техники. В частности, предметом выбора настоящего изобретения является обеспечение усовершенствованного способа получения искусственного зачатка зуба in vitro, который может быть выполнен из неэмбриональных первичных клеток.

РАСКРЫТИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения искусственного зачатка зуба in vitro, включающему этапы:

a) получения выделенных мезенхимальных клеток пульпы зуба и

b) культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в неадгезивных условиях для формирования клеточного агрегата, представляющего собой искусственный зачаток зуба.

Неожиданно было обнаружено, что выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба способны формировать трехмерный клеточный агрегат, представляющий собой искусственный зачаток зуба, без влияния эмбриональных эпителиальных клеток. Этот эффект достигается путем культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в неадгезивных условиях. Может быть показано, что в таких неадгезивных условиях культивирования мезенхимальные клетки пульпы зуба свободно располагаются относительно друг друга и конденсируют в клеточный агрегат, проявляющий экспрессию маркеров, специфичных для структур зубного зачатка, и которые, таким образом, указывают на зачаток зуба.

В дальнейшем различные аспекты настоящего изобретения представлены более подробно. Каждый аспект, определенный таким образом, может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если четко не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как часть настоящего изобретения или указанными как предпочтительные или преимущественные.

Способ по настоящему изобретению направлен на получение искусственного зачатка зуба in vitro. Искусственный зачаток зуба представляет собой зачаток зуба, который был получен и собран de novo и in vitro.

Для целей настоящего изобретения термин "зачаток зуба" относится к функциональному клеточному агрегату из одного или более чем одного типа клеток, который проявляет по меньшей мере одну функцию, являющуюся специфичной для зубной ткани или функционального зубного зачатка. Предпочтительно зачаток зуба по настоящему изобретению проявляет большинство или по существу все функции органа или ткани зубной ткани или функционального зубного зачатка или зуба. В частности, зачаток зуба по настоящему изобретению может вести себя как функциональный индуктивный зубной зачаток и способен индуцировать развитие органов зуба или развитие полного зуба in vitro и/или in vivo. Зачаток зуба по настоящему изобретению может быть охарактеризован повышенной экспрессией маркерных генов или белков, которые связаны с развитием или дифференцировкой зубной ткани. Предпочтительно зачаток зуба по настоящему изобретению может быть охарактеризован повышенной экспрессией ВМР4, HGF, РАХ9, MSX1, коллагена типа I, DSPP и/или предентина по сравнению с выделенными мезенхимальными клетками пульпы зуба непосредственно перед воздействием неадгезивных условий культивирования. Кроме того, формирование базальной мембраны, характеризующееся главным образом экспрессией коллагена типа IV, может происходить в агрегате. Формирование агрегата и условия культивирования могут привести к минерализации полученной ткани.

Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению формируют с помощью способа по настоящему изобретению. Искусственный зачаток зуба может иметь клеточный агрегат по существу сферической формы и со средним диаметром от 0,3 мм до 2 мм, предпочтительно со средним диаметром от 0,5 мм до 1,5 мм. Искусственный зачаток зуба может включать клеточный агрегат, содержащий внутреннее ядро, сформированное из мезенхимальных клеток пульпы зуба, и внешний слой, сформированный из эпителиальных клеток, тогда как эпителиальные клетки могут инвагинировать внутреннее ядро в более поздние моменты времени совместного культивирования. Инвагинация клеток эпителиального происхождения может привести к амелобластической дифференцировке этих клеток. Эта дифференцировка может быть охарактеризована по морфологическому признаку (столбчатое расположение), а также по повышенной экспрессии амелобластических маркерных генов или белков (например, ВМР7, SHH и/или амелогенина). Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению свободен от какого-либо искусственного биологического или небиологического каркаса или носителя, который не происходит из клеток, использованных при получении указанного искусственного зачатка зуба. Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению предпочтительно состоит из клеточного агрегата, сформированного с помощью способа по настоящему изобретению, где способ был проведен без применения какого-либо искусственного биологического или небиологического каркаса или носителя, который не происходит из клеток, использованных в указанном способе.

В способе по настоящему изобретению используют выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба. Термин "выделенный" означает, что мезенхимальные клетки пульпы зуба представляют собой клетки, которые были выделены из природного источника, или их потомство, которое, например, было получено путем пролиферации клеток. Используемые мезенхимальные клетки пульпы зуба предпочтительно получают из ткани пульпы зуба донорского зуба или ткани. Предпочтительно мезенхимальные клетки пульпы зуба являются первичными клетками, которые не были трансформированы или иммортализованы. Эти клетки могут быть охарактеризованы позитивностью относительно CD90, CD73, CD44, CD29 и HLA I и негативностью относительно CD34 и CD45. Они проявляют веретенообразную морфологию в 2D-культуре и прилипают к пластику. В частности, мезенхимальные клетки пульпы зуба могут включать или состоять из взрослых мезенхимальных клеток пульпы зуба. Такие взрослые мезенхимальные клетки пульпы зуба получают из неэмбриональной ткани пульпы зуба донорского зуба или ткани. Мезенхимальные клетки пульпы зуба могут быть получены из ткани пульпы зуба любого донорского зуба или ткани, которые дифференцированы, чтобы содержать ткань пульпы зуба. Предпочтительно мезенхимальные клетки пульпы зуба получают из ткани пульпы зуба, более предпочтительно из третьего моляра донора. Мезенхимальные клетки пульпы зуба, используемые в способе по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой клетки пульпы зуба человека. Мезенхимальные клетки пульпы зуба человека получают из ткани пульпы зуба человеческого происхождения.

В способе по настоящему изобретению мезенхимальные клетки пульпы зуба могут быть подвергнуты культивированию в неадгезивных условиях на любом этапе после выделения. Тем не менее формирование клеточных агрегатов дополнительно усиливается, если мезенхимальные клетки пульпы зуба прошли по меньшей мере некоторое культивирование в адгезивных условиях 2D-монослоя. Предпочтительно мезенхимальные клетки пульпы зуба были культивированы в 2D-монослойной культуре в течение по меньшей мере 1 пассажа до того, как подвергнуться культивированию в неадгезивных условиях. Высокую эффективность формирования клеточных агрегатов поддерживают в широком диапазоне пассажей. Тем не менее было обнаружено, что наилучшие результаты достигаются, если мезенхимальные клетки пульпы зуба были культивированы в 2D-монослойной культуре в течение по меньшей мере 1 пассажа и не более чем 15 пассажей. Предпочтительно мезенхимальные клетки пульпы зуба подвергают неадгезивному культивированию после культивирования в 2D-монослое в течение по меньшей мере 2 пассажей и не более чем 8 пассажей после выделения.

В способе по настоящему изобретению после обеспечения выделенных мезенхимальных клеток пульпы зуба мезенхимальные клетки пульпы зуба подвергают неадгезивным условиям культивирования для формирования клеточных агрегатов.

Формирование клеточных агрегатов является особенно эффективным, если мезенхимальные клетки пульпы подвергают неадгезивным условиям культивирования при определенной концентрации. Если концентрация слишком низкая, клетки редко контактируют друг с другом и конденсация в клеточные агрегаты является менее эффективной. С другой стороны, если концентрация мезенхимальных клеток пульпы зуба является слишком высокой, клетки являются менее гибкими или мобильными и, таким образом, формирование клеточных агрегатов является менее эффективным. Предпочтительно мезенхимальные клетки пульпы зуба подвергают неадгезивным условиям культивирования в концентрации от 5×10⁴ до 5×10⁷ на мл. Еще лучшие результаты достигаются, если мезенхимальные клетки пульпы зуба подвергают неадгезивным условиям культивирования в концентрации от 1×10⁵ до 1×10⁷ на мл, предпочтительно от 5×10⁵ до 5×10⁶ на мл и наиболее предпочтительно от 9×10⁵ до 1,1×10⁶ на мл.

В способе по настоящему изобретению выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в неадгезивных условиях культивирования. Это означает, что мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в условиях, при которых клетки не принимают плоскую, вытянутую форму, указывающую на сильное прикрепление и адгезию к поверхности для культивирования. Предпочтительно мезенхимальные клетки пульпы зуба остаются округлыми непосредственно после посева, и, если вообще, слабо связаны с поверхностью для культивирования. Подходящие средства для неадгезивного культивирования клеток хорошо известны из данного уровня техники. Условия неадгезивного культивирования могут включать культивирование мезенхимальных клеток пульпы зуба в сосудах для культивирования с поверхностью для культивирования, которая не поддерживает адгезию мезенхимальных клеток пульпы зуба. Например, могут быть использованы сосуды для культивирования с поверхностями для культивирования, проявляющими ультранизкое прикрепление клеток. Для этой цели могут быть использованы сосуды для культивирования с нейтральной или положительно заряженной поверхностью для культивирования. Предпочтительно поверхность для культивирования может быть покрыта слоем материала, который дополнительно уменьшает взаимодействие мезенхимальных клеток пульпы зуба и поверхности для культивирования. Поверхность для культивирования может быть покрыта гидрофильным гидрогелем.

Очевидно, что при неадгезивных условиях культивирования мезенхимальные клетки пульпы зуба объединяются и конденсируют в клеточные агрегаты довольно быстро. Уже через 24 часа неадгезивного клеточного культивирования мезенхимальные клетки пульпы зуба агрегировали в один большой комплекс. Однако для того, чтобы получить клеточные агрегаты, которые представляют собой искусственный зачаток зуба с прогрессивным развитием, дифференцировкой и/или функцией, выгодно проводить неадгезивное культивирование в течение периода времени, который превышает 24 часа. В способе по настоящему изобретению мезенхимальные клетки пульпы зуба можно культивировать в неадгезивных условиях в течение по меньшей мере 48 часов, предпочтительно в течение по меньшей мере 72 часов, более предпочтительно в течение по меньшей мере 2 недель, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 4 недель, наиболее предпочтительно в течение по меньшей мере 8 недель. Таким образом, мезенхимальные клетки пульпы зуба можно культивировать в неадгезивных условиях в течение от 48 часов до 10 недель, предпочтительно в течение от 1 недели до 9 недель, более предпочтительно в течение от 4 недель до 8 недель.

В способе по настоящему изобретению мезенхимальные клетки пульпы зуба предпочтительно культивируют в неадгезивных условиях по меньшей мере до тех пор, пока не сформируется клеточный агрегат, который обладает округлой формой со средним диаметром от 0,3 мм до 2 мм, более предпочтительно со средним диаметром от 0,5 мм до 1,5 мм.

Пригодность искусственного зачатка зуба, созданного способом по настоящему изобретению, зависит от его способности индуцировать или обеспечивать дифференцированную зубную ткань. Таким образом, предпочтительно культивировать выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба в неадгезивных условиях до тех пор, пока полученный клеточный агрегат не начнет проявлять свойства и/или функции частично или полностью дифференцированной зубной ткани. Ход дифференцировки можно контролировать по относительной экспрессии соответствующих маркерных генов, белков или структур. Предпочтительно выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в неадгезивных условиях по меньшей мере до тех пор, пока сформированный клеточный агрегат не проявит повышенную экспрессию ВМР4, HGF, РАХ9, MSX1, коллагена типа I, DSPP и/или предентина по сравнению с выделенными мезенхимальными клетками пульпы зуба непосредственно перед тем, как подвергнуться неадгезивным условиям культивирования. Предпочтительно сформированный агрегат проявляет характеристики так называемой стадии "шапки" в развитии зуба, что касается морфологии и экспрессии генов. Относительная экспрессия генов может быть легко определена хорошо известными способами, такими как, например, количественная или полуколичественная ПЦР в реальном времени, транскриптомное секвенирование (RNA-Seq) или нозерн-блоттинг. Относительная экспрессия белков также может быть определена хорошо известными способами, такими как, например, вестерн-блоттинг, технология суспензионных матриц и методы ИФА. Локализация дифференциальной экспрессии белков может быть определена с помощью гибридизации in situ и/или иммуногистохимии.

Одним из недостатков, с которыми сталкиваются большинство из способов известного уровня техники, является то, что в этих способах необходимо присутствие искусственного биологического или небиологического каркаса или носителя, на поверхности или внутри которого культивируют клетки, чтобы сформировать зачаток зуба или зубной зачаток. Биологический или небиологический каркас или носитель рассматривается как искусственный, если указанный каркас или носитель добавлен или предоставлен извне и не сформирован клетками, используемыми в способе по настоящему изобретению в процессе формирования клеточных агрегатов. В способе по настоящему изобретению применение или присутствие такого искусственного биологического или небиологического каркаса или носителя не требуется. Способ по настоящему изобретению дает искусственный зачаток зуба согласно настоящему изобретению без применения любого такого искусственного биологического или небиологического каркаса или носителя, который не происходит из клеток, используемых в производстве указанного искусственного зачатка зуба. В предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению выполняют таким образом, что не используют никакого искусственного биологического или небиологического каркаса при формировании клеточных агрегатов.

Способ по настоящему изобретению является особенно предпочтительным, так как искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению может быть получен, начиная с одного типа клеток, а именно, начиная с выделенных мезенхимальных клеток пульпы зуба. Однако создание еще более сложного искусственного зачатка зуба может быть достигнуто, если настоящий способ дополнительно включает этап совместного культивирования предварительно конденсированных мезенхимальных клеток пульпы зуба с эпителиальными клетками. Совместное культивирование выполняют предпочтительно в неадгезивных условиях культивирования. Очевидно, что особенно полезно культивировать выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба в неадгезивных условиях в течение по меньшей мере 48 часов, чтобы сформировать предварительно агрегированные мезенхимальные клетки пульпы зуба, затем добавить эпителиальные клетки и совместно культивировать смесь предварительно агрегированных мезенхимальных клеток пульпы зуба и эпителиальных клеток в неадгезивных условиях. Совместное культивирование может быть выполнено в течение периодов времени, определенных и предложенных выше для неадгезивного культивирования выделенных мезенхимальных клеток пульпы зуба.

Предпочтительно эпителиальные клетки, используемые в способе по настоящему изобретению, представляют собой первичные эпителиальные клетки, особенно предпочтительны первичные эпителиальные клетки человека. Первичные эпителиальные клетки могут быть получены из взрослой или неэмбриональной ткани, такой как, например, кожная ткань или ткань десен. В предпочтительном варианте осуществления эпителиальные клетки являются кератиноцитами, например кератиноцитами человека, более предпочтительно первичными кератиноцитами, полученными из неэмбриональных тканей, таких как, например, кожа или десна. Особенно предпочтительными являются кератиноциты человека, полученные из десны, например из неэмбриональной десны.

В способе по настоящему изобретению с этапом совместного культивирования эпителиальные клетки добавляют для совместного культивирования таким образом, что количество мезенхимальных клеток пульпы зуба, первоначально используемых для формирования предварительно агрегированных мезенхимальных клеток пульпы зуба, равно или больше, чем количество эпителиальных клеток. Предпочтительно эпителиальные клетки добавляют для совместного культивирования при относительном содержании от 1:1 до 1:10 относительно исходного количества клеток мезенхимальных клеток пульпы зуба, предпочтительно при относительном содержании от 1:2 до 1:8, более предпочтительно при относительном содержании от 1:3 до 1:5.

Способ по настоящему изобретению с этапом совместного культивирования дает искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению, в котором ранний клеточный агрегат, формирующий зачаток зуба, содержит ядро, сформированное из агрегированных мезенхимальных клеток пульпы зуба, и наружный слой, сформированный из эпителиальных клеток. Длительно культивированный агрегат может проявлять инвагинацию эпителиальных клеток во внутреннее ядро мезенхимальных клеток.

В способе по настоящему изобретению мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в адгезивных или неадгезивных условиях в стандартной среде. Нет необходимости в специализированной культуральной среде для индукции надлежащей агрегации клеток в неадгезивных условиях. Специалист хорошо осведомлен о подходящей среде. Как правило, используют стандартную DMEM с определенным содержанием фетальной телячьей сыворотки (FCS), предпочтительно FCS присутствует в концентрации от 5% до 15%, более предпочтительно в концентрации 10% FCS. В случае совместного культивирования предварительно агрегированных мезенхимальных клеток пульпы зуба и эпителиальных клеток в неадгезивных условиях культуральная среда может содержать определенное количество культуральной среды, обычно используемой при культивировании эпителиальных клеток в адгезивных условиях.

Настоящее изобретение также относится к трансплантату, включающему или состоящему из искусственного зачатка зуба по настоящему изобретению, или из ткани или структуры, полученной из него.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению, ткань или структуру, полученную из него, или трансплантат по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению, трансплантат по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть использованы при лечении зубного повреждения и/или разрушения или потери зубов.

Поскольку способ по настоящему изобретению работает с выделенными мезенхимальными клетками пульпы зуба, полученными из неэмбриональных источников, настоящий способ позволяет получать искусственные зачатки зуба, начиная с клеток, полученных от конкретного донора или пациента. Таким образом, можно обеспечить искусственные зачатки зуба, которые были получены из клеток человека, подлежащего лечению, с помощью искусственного зачатка зуба, фармацевтической композиции или трансплантата по настоящему изобретению. Таким образом, представляется возможным обеспечить трансплантат, который в основном по существу или полностью получен из клеток реципиента самого трансплантата, так что реакции отторжения будут сведены к минимуму или будут полностью отсутствовать.

Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению может быть использован для создания in vitro зубной ткани или целых зубов.

Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению, трансплантат по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве исследовательского инструмента, который может быть использован in vitro и in vivo.

Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению, трансплантат по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть использованы в способе скрининга in vitro или in vivo веществ, которые модулируют свойства зубной ткани.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ скрининга веществ in vitro, которые модулируют свойства зубной ткани, включающий этапы:

- получения образца искусственного зачатка зуба по настоящему изобретению или клеточного агрегата, полученного по способу настоящего изобретения, или ткани, полученной из него;

- деления соответствующего образца на части;

- инкубации по меньшей мере одной части с веществом, подлежащим скринингу, и

- сравнения параметров, измеренных для обработанной части, с другой частью, которую не инкубировали с веществом, подлежащим скринингу.

В предпочтительном варианте осуществления часть подвергают действию автономной системы циркуляции до инкубации этой части с веществом, подлежащим скринингу.

Кратко, способ по настоящему изобретению делает возможной идентификацию и анализ веществ, которые оказывают влияние на зуб или зубную ткань, с помощью искусственного зачатка зуба по настоящему изобретению. Образец, который следует понимать как содержащий определенное количество объектов продукта в соответствии с настоящим изобретением, разделяют на несколько частей. Получают по меньшей мере два подмножества; одно используют для скрининга, в то время как другое служит в качестве отрицательного контроля. Предпочтительно количество частей для скрининга превышает количество контрольных частей. Как правило, множество частей подвергают высокопроизводительному скринингу. Вещества, которые подлежат скринингу в способе по настоящему изобретению, не ограничены в любом случае. В одном варианте осуществления настоящего изобретения вещества выбирают из группы нуклеиновых кислот, включая RNAi, рибозимы, аптамеры, антитела, пептиды, углеводы, полимеры, малые молекулы, имеющие молекулярную массу от 50 до 1000 Да, и белков, предпочтительно антител, цитокинов и липокалинов. Эти вещества часто доступны в библиотеках. Предпочтительно инкубировать одно соединение в пределах отдельной части образца. Однако также можно исследовать совместный эффект веществ путем инкубации по меньшей мере двух веществ в одной порции. Дополнительное подмножество объектов одновременно инкубируют в отсутствие веществ. Процесс инкубации зависит от различных параметров, например от типов клеток и чувствительности обнаружения, оптимизация которых следует общепринятым процедурам, известным специалистам в данной области техники. Выявление эффективных веществ в контексте настоящего изобретения предпочтительно выполняют опосредованно, например путем определения паттернов экспрессии и/или жизнеспособности клеток, которые изменены. Определение может быть выполнено в указанное время и сопоставлено с уровнем сигнала в начале эксперимента и у отрицательного контроля. Подходящие тесты известны специалистам в данной области техники или могут быть легко разработаны в обычном порядке.

Так как искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению можно рассматривать как орган или предшественник органа, или его часть, может быть особенно полезно применять тест-систему, в которой искусственный зачаток зуба может быть получен и/или культивирован в течение длительного времени в условиях, имитирующих естественную перфузию. Очевидно особенно подходит объединение способа по настоящему изобретению и/или искусственного зачатка зуба по настоящему изобретению в аналитической системе на основе автономного орган-на-чипе устройства, описанного в заявке на европейский патент с номером подачи ЕР 10 008 244 или в заявке PCT с номером публикации WO 2009/146911 А2.

Настоящее изобретение предоставляет впервые искусственный зачаток зуба и способ его получения, который характеризуется отсутствием потребности в каком-либо искусственном биологическом или небиологическом каркасе или носителе, который получают из взрослых клеток таким образом, что нет необходимости в эмбриональных клетках или тканях, и который требует клетки только одного типа клеток, а именно выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба, или клетки двух типов клеток, а именно выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба и кератиноциты.

Искусственный зачаток зуба по настоящему изобретению представляет собой функциональный индуктивный зубной зачаток, который способен к развитию органов зуба in vitro и in vivo. Полученный в результате орган зуба характеризуется верифицируемым наличием структур, обычно формирующих часть развивающегося зуба, которые расположены в физиологическом порядке зуба:

- эмаль, т.е. амелобласты;

- дентин;

- пульпа зуба, вкл. одонтобласты и недифференцированные клетки пульпы зуба;

- цемент, т.е. цементобласты;

- периодонт и

- альвеолярная кость.

ФИГУРЫ

На Фигуре 1 показана трехмерная с низким прикреплением культура мезенхимальных клеток пульпы зуба человека; масштабные линейки: 500 мкм.

На Фигуре 2 показаны клетки пульпы зуба человека в совместном культивировании с кератиноцитами; масштабные линейки: 500 мкм. Данные временные точки указывают часы после добавления кератиноцитов.

На Фигуре 3 показана самоорганизующаяся компартментализация типов клеток зачатка, описанная в способе настоящего изобретения; масштабные линейки: A: 100 мкм; B, C: 500 мкм; D: 300 мкм. Данные временные точки указывают время после добавления кератиноцитов.

На Фигуре 4 показана экспрессия интра- и экстраклеточных молекул для характеристики сконструированного зачатка зуба.

ПРИМЕРЫ

Общие способы

Выделение мезенхимальных клеток пульпы зуба

Выделение клеток пульпы зуба выполняют в соответствии с модифицированным протоколом из Gronthos et. al. (A method to isolate and culture expand human dental pulp stem cells. Methods Mol Biol. 2011; 698: 107-21).

1. Извлеченные третьи моляры от пациентов после информированного согласия собирают в DMEM, содержащую 10% FCS и пенициллин и стрептомицин (100 мкг/мл каждого), и хранят при 4°C в течение не более чем 24 часа.

2. Биопсии обрабатывают в стерильных условиях на протяжении всей процедуры извлечения клеток. Коронку зуба и корень, если присутствует, протирают 100% этанолом. Чтобы открыть пульповую полость, зуб разбивают путем механического раскалывания молотком.

3. Пульпозную ткань удаляют пинцетом и помещают в содержащую PBS чашку Петри.

4. Затем ткань разрезают на небольшие фрагменты, которые затем дважды промывают PBS для удаления осколков и крови.

5. Позднее выполняют этап расщепления с помощью смеси ферментов коллагеназы (3 мг/мл) / диспазы II (4 мг/мл) в течение 2 ч при 37°C.

6. Раствор после расщепления фильтруют через клеточное сито 70 мкм и дважды промывают PBS путем центрифугирования (400 × г в течение 5 мин). Оставшийся осадок клеток ресуспендируют в среде DMEM вес/ 10% FCS и пенициллина и стрептомицина (100 мкг/мл каждого).

Культивирование клеток

Культивирование и рост мезенхимальных клеток пульпы зуба достигаются за счет поддержания клеток в монослойной культуре на поверхностях для адгезивных клеток колбы для культивирования в DMEM вес/ 10% FCS и пенициллина и стрептомицина (100 мкг/мл каждого) в стандартных условиях культивирования (5% CO₂, 37°C). Адгезивные фибробластоподобные мезенхимальные клетки выращивают до 90% слияния, а затем пассируют.

Способ агрегации/конденсации для формирования искусственного зачатка зуба

Для культивирования в неадгезивных условиях мезенхимальные клетки пульпы зуба из прибл. 2-го по 8-й пассаж пассировали два дня до применения, собирали и ресуспендировали в DMEM + 10% FCS, чтобы получить в суспензии отдельных клеток 10⁶ клеток на мл. Клеточную суспензию (1 мл на лунку) наносили в 24-луночный планшет с низким прикреплением (Ultra Low Cluster Plate, Corning, Германия). В отличие от отрицательно заряженной гидрофильной поверхности стандартных чашек для культивирования тканей планшеты с ультранизким прикреплением обладают нейтральной, покрытой гидрофильным гидрогелем поверхностью, что существенно минимизирует связывание белков прикрепления. При использовании этих специализированных чашек для культивирования мезенхимальные клетки пульпы зуба не оседают из-за клеточной адгезии, как при культивировании микромассы. Формирование 2D-монослойной культуры предотвращали, и клетки, сохранившие округлую форму при данном суспензионном культивировании, поддерживали неадгезивные условия. Кроме того, в отличие от способов, полагающихся на внешний каркас или носитель, система культивирования с низким прикреплением обеспечивает возможность свободного перемещения клеток и межклеточного взаимодействия во время начального процесса конденсации. Процесс конденсации начинается вскоре после посева и наблюдается макроскопически по клеткам, формирующим агрегаты. Для обеспечения постоянных условий культивирования среду меняли регулярно каждые 3 дня.

Совместное культивирование

Если предполагается совместное культивирование мезенхимальных клеток пульпы зуба и клеток эпителиального происхождения (полученных из кожи или десны кератиноцитов), полученные конденсаты, описанные в настоящем способе выше, переносят в день от 2 до 5 в составную среду, подходящую для обоих типов клеток (например, стандартная DMEM (вес/ FCS) и культуральная среда кератиноцитов, 1:1). Добавляли суспензию отдельных клеток из эпителиальных клеток в соотношении 1:4 относительно исходного количества клеток, используемого для мезенхимальной конденсации, и полученную смесь культивировали в неадгезивных условиях. Для обеспечения постоянных условий культивирования среду меняли регулярно каждые 3 дня.

Результаты

Для того чтобы вырастить клетки пульпы зуба человека (hDPC), используемые для приготовления искусственного зачатка зуба in vitro, выделенные клетки культивировали в течение по меньшей мере 2 пассажей в монослое. Как описано, клетки принимают морфологию фибробластов и экспрессируют поверхностные маркеры MSC (CD90, CD73, CD44, CD29 и HLA I (данные не представлены). Чтобы выполнить индукцию клеточной организации и дифференцировки, hDPC культивируют трехмерным способом. Идея метода культивирования с низким прикреплением, описанная выше, позволяет избежать прикрепления клеток к поверхности чашки для культивирования и позволяет самоорганизацию, опосредованную мобильностью клеток. Таким образом, мезенхимальные клетки пульпы зуба человека (hDPC) высевали с плотностью 1×10⁶ клеток/мл в планшеты для культивирования с низким прикреплением в нормальной DMEM с добавлением 10% FCS и культивировали в стандартных условиях культивирования клеток. Клетки пульпы свободно располагаются относительно друг друга и конденсируют в трехмерный клеточный агрегат. Конденсация начинается вскоре после посева. Уже через 4 часа большинство клеток связаны с формированием клеточного агрегата. В течение 24 часов после посева клеточный агрегат дополнительно конденсируется (Фиг. 1). Этот клеточный агрегат остается жизнеспособным в течение длительного периода времени и затем развивается и дифференцируется в искусственной зачаток зуба по настоящему изобретению с в среднем 0,3 мм в диаметре.

Для оценки, способны ли эти мезенхимальные конденсаты к взаимодействию с кератиноцитами десны человека и может ли быть индуцирована амелобластическая дифференцировка этими конденсатами, конденсаты hDPC и кератиноциты совместно культивировали в трехмерной системе с низким прикреплением. Здесь первичные кератиноциты человека, выделенные из десны, добавляли в виде суспензии отдельных клеток из эпителиальных клеток в соотношении 1:4 относительно исходного количества клеток, используемого для мезенхимальной конденсации, к 48-часовым агрегатам из мезенхимальных hDPC. Полученную смесь затем культивировали в неадгезивных условиях. Кератиноциты организовываются вокруг трехмерного мезенхимального агрегата. Кератиноциты десны присоединяются и быстро собираются вокруг конденсатов (Фиг. 2).

Во время развития зубов наблюдается сильное взаимодействие между мезенхимальными и эпителиальными тканями, ведущее к пролиферации и инвагинации. Для того чтобы проследить взаимодействие между этими двумя типами клеток, индуцированное с помощью способа культивирования, описанного в настоящем изобретении, использованные клетки флуоресцентно пометили. Конститутивно eGFP-экспрессирующие hDPC высеяли с плотностью 1×10⁶ клеток/мл в планшеты для культивирования с низким прикреплением и культивировали, как описано выше, в течение 24 часов. Затем первичные кератиноциты человека, отслеживаемые с помощью CellTracker™ Red СМТРХ (Molecular Probes®), добавляли в виде суспензии отдельных клеток из эпителиальных клеток в соотношении 1:4 относительно исходного количества клеток, использованного для мезенхимальной конденсации, и полученную смесь культивировали в неадгезивных условиях. Через три дня кератиноциты соединены с поверхностью мезенхимального агрегата (Фиг. 3А). Четыре недели совместного культивирования приводят к полностью «переплетенной» структуре в самоорганизующемся конденсате. В этот момент времени кератиноциты могут быть обнаружены под слоем hDPC в пределах сконструированного органоида с помощью флуоресцентной микроскопии (Фиг. 3В). Это наблюдение дополнительно засвидетельствовано с помощью флуоресцентного микроскопического анализа крио-срезов (толщиной 8 мкм) (Фиг. 3С). Комбинированное окрашивание гематоксилином / эозином дополнительно поясняет структурную компартментализацию искусственного зачатка зуба (Фиг. 3D). Кератиноциты, которые имеют отчетливо розовый вид за счет экспрессии кислых белков (например, цитокератина 15 и 18) инвагинированы с одной стороны трехмерного конденсата. Полоса эпителиальной ткани, которая соединяет инвагинированные клетки с окружающим эпителием, имеет сходство с зубной пластинкой во время развития зубов. Мезенхима четко отделена от внешнего эпителия с помощью подобного соединительной ткани слоя и полностью окружает инвагинированную структуру.

Искусственные зачатки зуба, полученные с помощью способа по настоящему изобретению, были подвергнуты всестороннему иммуногистологическому анализу через 8 недель культивирования. Сконструированные органоиды охарактеризовали относительно экспрессии интра- и экстраклеточных молекул. Для обнаружения соответствующих белков использовали первичные антитела против виментина, цитокератина 15, коллагена типа I, коллагена типа IV и Ki67. Вторичные антитела объединили с Alexa Fluor® 594 (красный) для обнаружения под флуоресцентным микроскопом (Фиг. 4). Все срезы контрастировали с Hoechst33258 (синий). Виментин (Фиг. 4А/Аʹ) и цитокератин 15 (Фиг. 4В) четко отметили области мезенхимы и эпителия, соответственно. Коллаген типа I (Фиг. 4С) экспрессируется исключительно в мезенхимальной части агрегата как часть внеклеточного матрикса. Обратите внимание, что коллаген типа I является основным компонентом дентина. Коллаген типа IV (Фиг. 4D) экспрессируется на высоком уровне на границе раздела двух типов клеток, имитируя базальную пластинку. Пролиферативная активность обнаружена исключительно в слоях эпителиальных клеток, как указано с помощью присутствия Ki67 (Фиг. 4E). Обратите внимание на столбчатое расположение инвагинированного эпителия (Фиг. 4Аʹ; см. стрелку). In vivo внутренний эмалевый эпителий также расположен в столбчатом слое на стадии "шапки" и затем дает начало преамелобластам и амелобластам.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно стоматологии. Предлагаемый способ получения искусственного зачатка зуба in vitro включает этапы: a) получения выделенных мезенхимальных клеток пульпы зуба; b) культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в монослое на поверхностях для адгезивных клеток; и c) культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в неадгезивных условиях в культуральных сосудах с культуральной поверхностью, обладающей ультранизким прикреплением клеток, для формирования клеточного агрегата, представляющего собой искусственный зачаток зуба. Вышеуказанный способ позволяет получить искусственный зачаток зуба из взрослых клеток таким образом, что нет необходимости в эмбриональных клетках или тканях, и требуются клетки только одного типа клеток, а именно выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба, или клетки двух типов клеток, а именно выделенные мезенхимальные клетки пульпы зуба и кератиноциты; без применения какого-либо искусственного биологического или небиологического каркаса или носителя, который не происходит из клеток, используемых в производстве указанного искусственного зачатка зуба. Предлагаются также искусственный зачаток зуба, полученный с помощью вышеуказанного способа, трансплантат, содержащий такой искусственный зачаток зуба, и фармацевтическая композиция для лечения разрушения и/или повреждения зуба или потери зуба, содержащая вышеуказанный искусственный зачаток зуба или трансплантат и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель. Кроме того, предлагается способ скрининга веществ in vitro, которые модулируют свойства зубной ткани, включающий этапы: получения образца вышеуказанного искусственного зачатка зуба или клеточного агрегата или ткани, полученных из него; разделения соответствующего образца на части; инкубации по меньшей мере одной части с веществом, подлежащим скринингу, и сравнения параметров, измеренных для обработанной части, с другой частью, которую не инкубировали с веществом, подлежащим скринингу. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 пр., 16 ил.

1. Способ получения искусственного зачатка зуба in vitro, включающий этапы:

a) получения выделенных мезенхимальных клеток пульпы зуба;

b) культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в монослое на поверхностях для адгезивных клеток; и

c) культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в неадгезивных условиях в культуральных сосудах с культуральной поверхностью, обладающей ультранизким прикреплением клеток, для формирования клеточного агрегата, представляющего собой искусственный зачаток зуба.

2. Способ по п. 1, где мезенхимальные клетки пульпы зуба включают первичные взрослые мезенхимальные клетки пульпы зуба или состоят из них.

3. Способ по одному из пп. 1 или 2, где мезенхимальные клетки пульпы зуба получают из ткани пульпы зуба, предпочтительно из ткани пульпы третьего моляра.

4. Способ по п. 1, где мезенхимальные клетки пульпы зуба подвергают неадгезивным условиям культивирования в концентрации от 5×10⁴ до 5×10⁷ на мл.

5. Способ по п. 1, где мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в неадгезивных условиях в течение по меньшей мере 48 часов.

6. Способ по п. 1, где мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в неадгезивных условиях по меньшей мере до тех пор, пока не сформирован клеточный агрегат со средним диаметром от 0,3 мм до 2 мм.

7. Способ по п. 1, где мезенхимальные клетки пульпы зуба культивируют в неадгезивных условиях по меньшей мере до тех пор, пока сформированный клеточный агрегат не проявит повышенную экспрессию ВМР4, HGF, РАХ9, MSX1, коллагена типа I, DSPP и/или предентина по сравнению с выделенными мезенхимальными клетками пульпы зуба непосредственно перед воздействием неадгезивных условий культивирования.

8. Способ по п. 1, где при формировании клеточного агрегата не применяют какой-либо искусственный биологический или небиологический каркас.

9. Способ по п. 1, где после культивирования мезенхимальных клеток пульпы зуба в неадгезивных условиях в течение по меньшей мере 2 дней добавляют эпителиальные клетки и совместно культивируют в неадгезивных условиях.

10. Способ по п. 9, где эпителиальные клетки представляют собой кератиноциты, предпочтительно кератиноциты, полученные из кожи или десны.

11. Искусственный зачаток зуба, полученный с помощью способа по одному из пп. 1-10.

12. Трансплантат, содержащий искусственный зачаток зуба по п. 11.

13. Фармацевтическая композиция для лечения разрушения и/или повреждения зуба или потери зуба, содержащая искусственный зачаток зуба по п. 11 или трансплантат по п. 12 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

14. Способ скрининга веществ in vitro, которые модулируют свойства зубной ткани, включающий этапы:

- получения образца искусственного зачатка зуба по п. 11, или клеточного агрегата, или ткани, полученных из него;

- разделения соответствующего образца на части;

- инкубации по меньшей мере одной части с веществом, подлежащим скринингу, и

- сравнения параметров, измеренных для обработанной части, с другой частью, которую не инкубировали с веществом, подлежащим скринингу.

15. Способ по п. 14, где часть подвергают действию автономной системы циркуляции до инкубации этой части с веществом, подлежащим скринингу.