Способ определения простых сахаров в тонком слое сорбента Российский патент 2018 года по МПК G01N30/90 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в фармацевтическом анализе, в химико-фармацевтической промышленности.

В настоящее время тонкослойная хроматография (ТСХ) в фармацевтическом анализе применяется для идентификации моносахаридов в субстанциях, лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах. ТСХ, обладая всеми преимуществами хроматографических методов, находит широкое применение ввиду своей экспрессности, доступности, достаточной чувствительности, селективности и простоте выполнения анализа. Тем более, что разработанные в последнее десятилетие новые неподвижные фазы, оборудование для нанесения проб, новые методы элюирования пластинок и количественного определения с использованием сканирующих денситометров способны обеспечить более высокое разрешение, лучшее детектирование и воспроизводимость результатов качественного и количественного хроматографического анализа различных групп биологически активных веществ, в т.ч. и простых представителей класса углеводов. Многие из описанных способов позволяют определять только суммарное содержание простых сахаров в составе полисахаридного комплекса, без достоверной информации о присутствии отдельных компонентов.

Широкоизвестными и распространенными методами определения восстанавливающих сахаров являются методы, основанные на реакции Фелинга (метод Бертрана, эбулиостатический метод). Альдегидная группа сахара, окисляясь до карбоксильной, восстанавливает медь (II) до меди (I) и выпадает осадок оксида меди (I) кирпично-красного цвета. Осадок отделяют и растворяют в растворе сульфата железа (III), подкисленном серной кислотой. Количество образовавшегося железа (II) определяют титриметрически. Оба метода, как метод Бертрана, так и эбулиостатический, являются достаточно трудоемкими: первый - главным образом из-за большого числа операций, а второй - из-за строгости поддержания постоянства скорости титрования (Вешняков В.А. Сравнение методов определения редуцирующих веществ: метод Бертрана, эбулиостатический и фотометрический методы / В.А. Вешняков, Ю.Г. Хабаров, Н.Д. Камакина // Химия растительного сырья. - 2008. - №4. - С. 47-50).

Описаны методики количественного определения альдоз методом Вилыптеттера и Шеделя, заключающиеся в окислении альдоз до альдоновых кислот щелочным раствором гипойодита или перйодатом натрия, которые затем определяется методом кислотно-основного титрования в присутствии индикатора (Пат. 2403566 РФ, МКП G01N 3/15. Способ количественного определения восстанавливающих сахаров. / Н.Ш. Кайшев, А.Ш. Кайшев, Т.В. Орловская. - №2008149186; заявл. 12.12.2008; опубл. 10.11.2010, Бюл. №31. - 14 с.). Определению альдоз указанными методами мешает присутствие в растворе сахарозы или фруктозы, что можно отнести к недостаткам способов.

Описаны многочисленные фотометрические методы определения восстанавливающих сахаров. Фотометрический метод основан на измерении светопоглощения при 670 нм медно-щелочного раствора с добавкой анализируемого раствора сахаров до и после проведения реакции в течение 3 мин на кипящей водяной бане.

Широкоизвестны методики, основанные на кислотном гидролизе сложных углеводов до глюкозы, взаимодействии глюкозы с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием пикраминовой кислоты и последующем фотометрическом определении продукта реакции при длине волны 460 нм на фоне раствора сравнения (Чушенко В.Н. Исследование в области анализа полисахаридных препаратов: автореф. дис… канд. фармац. наук. - Харьков, 1980. - 23 с.). Недостатками указанного способа являются: измерение оптической плотности анализируемого конечного раствора при длине волны 460 нм соответствует поглощению не продукта взаимодействия - пикраминовой кислоты, а той избыточной части пикриновой кислоты, которая не вступила в реакцию с глюкозой.

Известен метод определения сахаров с антроновым реактивом, основанный на расщеплении сложных углеводов до моносахаридов в сильнокислой среде с последующей их дегидратацией и образованием оксиметилфурфурола, образующего при реакции с антроном комплексное соединение синевато-зеленого цвета. Измерение оптической плотности испытуемого и стандартного растворов относительно раствора сравнения на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с раствором сравнения при длине волны 625 нм (Самылина И.А. Определение cахаров спектрофотометрическими методами / И.А. Самылина, И.П. Рудакова, Ж.И. Аладышева, С.В. Ковалева // Фармация. - 2009. - №4. - С. 3-5).

Разработан метод определения сахаров с орциновым реактивом, основанный на способности пентоз (или их фосфорных производных) при нагревании в присутствии кислот образовывать фурфурол; при этом в присутствии орцина и железа (III) хлорида развивается зеленое окрашивание. Измерение оптической плотности раствора испытуемого образца препарата при длине волны 670 нм, используя раствор сравнения, содержащий воду вместо раствора испытуемого препарата, обработанный аналогичным образом (Самылина И.А. Определение cахаров спектрофотометрическими методами / И.А. Самылина, И.П. Рудакова, Ж.И. Аладышева, С.В. Ковалева // Фармация. -2009. - №4. - С. 3-5).

Основным недостатком всех указанных выше фотометрических методов количественного определения сахаров является возможность установления только их суммарного содержания без достоверной информации о присутствии отдельных представителей данного класса биологически активных веществ, широко представленных в растительных объектах.

Наиболее часто для количественного определения используется метод осаждения полисахаридов спиртом 95% с последующим гравиметрическим определением выделившегося осадка (Государственная фармакопея СССР. - М.: Медицина, 1990, XI изд., вып. 2, ст. 83). Недостаток способа заключается в том, что при обработке водного экстракта спиртом 95% происходит разбавление последнего, в результате чего низкомолекулярные фракции, входящие в состав полисахаридных препаратов, не осаждаются.

Известны различные методики определения сахаров с применением современных физико-химических методов анализа, таких как хромато-масс-спектрометрия, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография. Недостатком данных способов являются длительная многостадийная пробоподготовка, использование дорогостоящего оборудования, материалов и реактивов.

Описан способ идентификации и количественного денситометрического определения простых сахаров методом высокоэффективной ТСХ в побегах каллизии душистой (Ибрагимов, Т.А. Исследования углеводов в побегах каллизии душистой // Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И.Н. Зилфикаров // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып. 67. - Пятигорск, 2012. - С. 43-44), включающий получение водорастворимой фракции углеводов с последующим кислотным гидролизом и хроматографированием гидролизата, доведенного до рН=7, на пластинках марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-А» в системе этилацетат - спирт изопропиловый - кислота муравьиная (10:7:3); высушивание пластин на воздухе до исчезновения запаха растворителя, обработку свежеприготовленным 0,2% спиртовым раствором карбазола, сканирование пластинки с помощью планшетного сканера; обработку хроматограмм компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer)). Недостатком данного способа - аналога является длительная процедура предподготовки пробы, а также недостаточное разделение зон моносахаридов на хроматограммах в использованной системе, что затруднят количественную оценку содержания сахара в зоне.

Известны способы разделения и идентификации простых сахаров методом ТСХ в извлечениях из растительного сырья, основанные на получении извлечения путем экстракции измельченного сырья горячей водой (1:10), после чего полученные водные извлечения упаривают под вакуумом до 1/10 от первоначального объема и осаждают полисахаридный комплекс 3-кратным количеством 95% спирта (Выделение комплекса полисахаридов каштана конского и изучение его химического состава / В.А. Соболева, В.Н. Чушенко, А.А. Коломиец, О.С. Данькевич // Электронный журнал «Провизор». - 2009. - №16. - URL:http://www.provisor.com.ua (дата обращения 11.12.2015)) с последующим гидролизом комплекса полисахаридов 2М серной кислотой (1:50) от 30 мин до 7 ч, гидролизаты нейтрализуют, осадки отфильтровывают, а из фильтратов осаждают моносахариды 95% спиртом (1:3), упаривают досуха, растворяют в 70% спирте и используют для хроматографирования нейтральных моносахаридов. Количественное соотношение моносахаридов в исследуемом полисахаридном комплексе определяют после разделения моносахаридов методом хроматографии в тонком слое сорбента на Силуфоле в системе н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:5:1) с последующим элюированием с пластины полученных зон и спектральным определением по методу Афанасьевой-Зайцевой по реакции с анилинфталатным реактивом. Данный способ-протопип не лишен недостатков, так как характеризуются многостадийностью, а также большой ошибкой определения, так как включает ошибку хроматографирования, элюирования и последующего фотометрического анализа.

В научной фармацевтической, медицинской и патентной литературе способов, позволяющих проводить разделение, идентифицировать и одновременно количественно определить простые сахара методом ТСХ при совместном присутствии, не обнаружено.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа разделения и количественного определения простых сахаров (на примере глюкозы, ксилозы и рамнозы) методом хроматографии в тонком слое сорбента, разделения сложных смесей и отделение гексоз и пентоз от других биологически активных веществ (в том числе моносахаридов) и стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, биологически активных добавок по содержанию моносахаридов методом ТСХ. В задачи изобретения также входило обоснование возможности применения нового детектирующего реагента для проявления зон моносахаридов в тонком слое и теоретического подхода к выбору оптимальной подвижной фазы, позволяющей разделить простые сахара при совместном присутствии за одну процедуру хроматографирования методом ТСХ.

Техническая задача достигается путем повышения точности, упрощения процедуры выделения простых сахаров из растительных объектов, а также возможностью одновременного определения подлинности и количественного определения моносахаридов (глюкозы, ксилозы и рамнозы), разделения сложных смесей и отделения простых сахаров от других биологически активных веществ. Задача решается тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» с алюминиевой подложкой ПТСХ-АФ-А размером 10×15 см. Элюент (высота пробега не менее 13 см) - н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2). Хроматограмму равномерно обрабатывают раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта, из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. Оптимальный объем пробы - 2,0 мкл водного раствора с содержанием простых сахаров 10 мг/мл; время насыщения камеры парами элюента - 10 мин, время элюирования - 7 часов; время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t=103±2°С - 3-5 минут. Сразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer)). В результате получают треки в координатах R_f - интенсивность (фиг. 2), а содержание глюкозы (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 15 - 35 мкг/мкл рассчитывают по формуле

.

Содержание ксилозы (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 15-30 мкг/мкл рассчитывают по формуле:

.

Содержание рамнозы (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 10-30 мкг/мкл рассчитывают по формуле:

,

где S - значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videoderisitometer».

Изобретение проиллюстрировано графиками, чертежами, схемами, таблицами, где в таблице 1 представлены хроматографические параметры исследуемых моносахаридов в различных элюирующих системах. Пределы обнаружения пятен исследуемых биологически активных веществ с помощью выбранного реагента приведены в таблице 2. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов моносахаридов в диапазоне концентраций от 10,0 до 35,0 мкг/мкл (1-10 мкг; 2-15 мкг; 3-20 мкг; 4-25 мкг; 5-30 мкг; 6-35 мкг) в элюенте н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) приведена на фиг. 1. Фиг. 2 демонстрирует вид денситограммы смеси стандартных растворов исследуемых простых сахаров. Влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность моносахаридов в тонком слое изображено на фиг. 3. Градуировочный график для определения содержания глюкозы в области концентраций (15-35 мкг/мкл) представлен на фиг. 4а. Градуировочный график для определения содержания ксилозы в области концентраций (15-30 мкг/мкл) изображен на фиг. 4б. Градуировочный график для определения содержания рамнозы в области концентраций (10-30 мкг/мкл) приведены на фиг. 4в. Фиг. 5 демонстрирует вид хроматограммы водного извлечения из сырья, подвергнутого кислотному гидролизу (3 мкл извлечения из плодов облепихи крушиновидной высушенных). В таблице 3 приведены результаты идентификации и количественного определения моносахаридов в лекарственном растительном сырье (в пересчете на абсолютно сухое сырье).

Способ определения простых сахаров в тонком слое сорбента реализуется следующим образом.

Навеску исследуемого препарата растворяют в воде или навеску измельченного лекарственного растительного сырья экстрагируют водой с добавлением концентрированной кислоты соляной в соотношении вода-кислота 40:4 по объему при кипячении на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» с алюминиевой подложкой ПТСХ-АФ-А размером 10×15 см в системе растворителей (высота пробега не менее 13 см) - н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) с последующим высушиванием на воздухе в течение 5-7 мин; хроматограмму равномерно обрабатывают раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта, из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления специфически окрашенных хроматографических зон (глюкоза - желто-коричневые зоны; ксилоза - розово-фиолетовые зоны, рамноза - вишнево-коричневые зоны). Оптимальный объем пробы - 2,0 мкл водного раствора с содержанием моносахаридов 10 мг/мл; время насыщения камеры парами элюента - 10 мин, время элюирования - 7 часов.

В способе проведено обоснование возможности теоретического подхода к выбору оптимальной подвижной фазы, позволяющей разделить простые сахара при совместном присутствии за одну процедуру хроматографирования методом ТСХ. Для выбора оптимальных условий хроматографического определения простых сахаров было изучено влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность в тонком слое (фиг. 3). В эксперименте изучено более двадцати типов элюирующих систем с различными значениями полярности, предлагаемые в литературе, а также вновь апробированные элюенты (табл. 1). Для каждой элюирующей системы рассчитаны полярность (Р') и величина относительной скорости перемещения веществ в тонком слое сорбента . Для достижения оптимальных величин R_f, а также четкого разделения исследуемых веществ на хроматограммах необходимо использовать элюенты со значениями полярности в интервале 4,0-6,0 ед. (табл. 1, фиг. 3).

В способе также предложен новый состав детектирующего реагента для идентификации зон моносахаридов на хроматограммах (0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта), который является менее токсичным по составу по сравнению с известным анилинфталатным реактивом (анилин - яд), пары которого ядовиты. Замена в составе анилина на сульфаниламид и бутанола на этанол приводит к снижению токсичности реагента, не нарушая химизма, лежащего в основе детектирования сахаров (образование окрашенных оснований Шиффа).

Сразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer)). В результате получают треки в координатах R_f - интенсивность (фиг. 2).

Установлены линейные зависимости между содержанием изучаемых моносахаридов и площадью хроматографической зоны (фиг. 4а, б и в) в диапазоне изучаемых концентраций. Анализ полученных данных позволил установить линейные зависимости между содержанием глюкозы, ксилозы и рамнозы и интенсивностью окраски хроматографической зоны в диапазонах изучаемых концентраций 15-35 мкг/мкл; 15-30 мкг/мкл и 10-30 мкг/мкл соответственно. Наличие в регрессионных уравнениях коэффициентов b, отличных от нуля (фиг. 4а, б и в), говорит о постоянной систематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фона пластины на оценку яркости окрашенной хроматографической зоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer)).

Способ отличается возможностью проведения идентификации, разделения и количественной интерпретации данных ТСХ моносахаридов на персональном компьютере методом хроматографии в тонком слое сорбента и стандартизировать лекарственные препараты, лекарственное растительное сырье, фитопрепараты и биологически активные добавки по содержанию простых сахаров, а также изучения состава свободных и связанных сахаров в полисахаридном комплексе лекарственных растений; отличается достаточной чувствительностью (2,5-5,0⋅10^-6 г), простотой пробоподготовки, экономичностью, доступностью и экспрессностью.

Способ иллюстрируется следующими конкретными примерами

Пример 1. Разработанный способ идентификации и количественного определения моносахаридов был апробирован на лекарственном растительном сырье листьев крапивы двудомной.

Получение извлечения: около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, помешали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 80 мл воды очищенной и 8 мл концентрированной кислоты соляной. Колбу присоединяли к обратному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым охлаждали под струей холодной воды до комнатной температуры. Извлечение фильтровали через несколько слоев марли, отжимая частицы сырья, в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки водой очищенной. Полученную суммарную вытяжку в количестве 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа на пластинах размером 10×15 см вэлюенте н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) (высота пробега не менее 13 см). Хроматограмму равномерно обрабатывали раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта, из пульверизатора и высушивали в сушильном шкафу при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления хромато-графических зон. На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны простых сахаров характерной окраски, среди которых идентифицированы глюкоза, ксилоза и рамноза по характерному значению величин R_f в сравнении с достоверными стандартными образцами. Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканировали с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer)). Результаты количественного определения моносахаридов в извлечении из листьев крапивы двудомной, а также метрологическая характеристика представлены в табл.3.

Пример 2. Разработанный способ идентификации и количественного определения моносахаридов был апробирован на лекарственном растительном сырье плодов облепихи крушиновидной высушенных.

Получение извлечения: около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 80 мл воды очищенной и 8 мл концентрированной кислоты соляной. Колбу присоединяли к обратному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым охлаждали под струей холодной воды до комнатной температуры. Извлечение фильтровали через несколько слоев марли, отжимая частицы сырья, в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки водой очищенной. Полученную суммарную вытяжку в количестве 3 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходяшим способом в условиях предлагаемого способа на пластинах размером 10×15 см в элюенте н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) (высота пробега не менее 13 см). Хроматограмму равномерно обрабатывали раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта, из пульверизатора и высушивали в сушильном шкафу при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны простых сахаров характерной окраски, среди которых идентифицированы глюкоза, ксилоза и рамноза по характерному значению величин R_f в сравнении с достоверными стандартными образцами. Вид хроматограммы представлен на фиг.5. Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканировали с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения обрабатывали компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения моносахаридов в извлечении из высушенных плодов облепихи крушиновидной, а также метрологическая характеристика представлены в табл. 3.

Пример 3. Разработанный способ идентификации и количественного определения моносахаридов был апробирован на лекарственном растительном сырье плодов облепихи крушиновидной свежих.

Получение извлечения: около 10,0 г (точная навеска) измельченного сырья помешали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 80 мл воды очищенной и 8 мл концентрированной кислоты соляной. Колбу присоединяли к обратному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым охлаждали под струей холодной воды до комнатной температуры. Извлечение фильтровали через несколько слоев марли, отжимая частицы сырья, в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки водой очищенной. Полученную суммарную вытяжку в количестве 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа на пластинах размером 10×15 см в элюенте н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) (высота пробега не менее 13 см). Хроматограмму равномерно обрабатывали раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта, из пульверизатора и высушивали в сушильном шкафу при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны простых сахаров характерной окраски, среди которых идентифицированы глюкоза, ксилоза и рамноза по характерному значению величин R_f в сравнении с достоверными стандартными образцами. Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканировали с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения обрабатывали компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer)). Результаты количественного определения моносахаридов в извлечении из свежих плодов облепихи крушиновидной, а также метрологическая характеристика представлены в табл. 3.

Источники информации

1. Чистякова А.С. ТСХ-анализ свободных сахаров травы горца почечуйного / А.С. Чистякова, А.А. Мальцева, А.С. Ткачева // Материалы междунар. заочной научно-практической конференции «Наука, образование, общество: тенденции и перспективы». (3 февраля 2014 г.) Москва. - С. 152-154.

2. Кириченко Е.Е. Количественное определение восстанавливающих моносахаридов в цветках пижмы обыкновенной / Е.Е. Кириченко, И.А. Сычев, Г.Ю. Чекулаева // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып. 68. - Пятигорск, 2013. - С. 108-109.

3. Ибрагимов Т.А. Исследования по разработке проекта фармакопейной статьи «Каллизии душистой побеги свежие» // Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И.Н. Зилфикаров // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып. 68. - Пятигорск, 2013. - С. 100-102.

4. Исследование полисахаридов некоторых видов рода Sphagnum L. / Л.Г. Бабешина, Я.В. Горина, А.П. Колоколова и др. // Журнал Сибирского федерального университета Химия. - 4 (2010 3). - С. 413-422.

5. Полисахариды в листьях и настое крапивы двудомной / Т.А. Скалозубова, А.И. Марахова, А.А. Сорокина, Н.Н. Федоровский // Фармация. - 2012. - №2. - С. 5-7.

6. Мартынов A.M. Количественная оценка полисахаридов в траве фиалки методом спектрофотометрии / A.M. Мартынов // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып. 67. - Пятигорск, 2012. - С. 76-78.

7. Олейников Д.Н. Методика количественного определения суммарного содержания полисахаридов в семенах льна / Д.Н. Олейников, Л.М. Танхаева // Химия растительного сырья. - 2007. - №4. - С. 85-90.

8. Состав и свойства пектиновых полисахаридов зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L. / А.А. Злобин, Е.А. Мартинсон, И.А. Овечкина и др. // Химия растительного сырья. - 2011. - №1. - С. 33-38.

9. Пектиновые полисахариды рябины обыкновенной Sorbus aucuparia L. / А.А. Злобин, Е.А. Мартинсон, С.Г. Литвинец и др. // Химия растительного сырья. - 2011. - №1. - С. 39-44.

10. О.Б. Рудаков, И.А. Востров, С.В. Федоров и др. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. Воронеж: «Водолей», 2004, 528 с.

11. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. Москва: Мир, 1999, 405 с.

12. Пат. 2403566 РФ, МКП G01N 3/15. Способ количественного определения восстанавливающих сахаров / Н.Ш. Кайшев, А.Ш. Кайшев, Т.В. Орловская. - №2008149186; заявл. 12.12.2008; опубл. 10.11.2010, Бюл. №31. - 14 с.

13. Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи / А.П. Корж, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №5. - С. 62-65.

14. Колосова О.А. Определение свободных и связанных сахаров в подземных органах валерианы сомнительной / О.А. Колосова, Т.А. Горох, Н.С Фурса // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып. 68. - Пятигорск, 2013. - С. 56-57.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья, фитопрепаратов и биологически активных добавок по содержанию моносахаридов (глюкозы, ксилозы и рамнозы), и может быть использовано в фармацевтическом анализе, в химико-фармацевтической промышленности. Способ определения простых сахаров в тонком слое сорбента характеризуется тем, что навеску исследуемого препарата обрабатывают водой в присутствии концентрированной кислоты хлористоводородной при кипячении на водяной бане с последующим хроматографированием в элюенте н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2), детектированием раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта и высушиванием при температуре 103±2°С в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон; после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера, а полученные изображения обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», зоны простых сахаров идентифицируются по характерному значению величины R_f и рассчитывают их количественное содержание в пробе. 3 пр., 5 ил., 3 табл.

Способ определения простых сахаров методом хроматографии в тонком слое сорбента характеризуется тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде или навеску измельченного лекарственного растительного сырья экстрагируют водой с добавлением концентрированной кислоты соляной в соотношении вода-кислота 40:4 по объему при кипячении на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» с алюминиевой подложкой ПТСХ-АФ-А размером 10×15 см в системе растворителей (высота пробега не менее 13 см) - н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) с последующим высушиванием на воздухе в течение 5-7 мин; хроматограмму равномерно обрабатывают раствором, содержащим 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта, из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 103±2°C в течение 3-5 минут до проявления специфически окрашенных хроматографических зон (глюкоза - желто-коричневые зоны; ксилоза - розово-фиолетовые зоны, рамноза - вишнево-коричневые зоны); оптимальный объем пробы - 2,0 мкл водных растворов с содержанием простых сахаров 10 мг/мл; время насыщения камеры парами элюента - 10 мин, время элюирования - 7 часов; после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера, а полученные изображения обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», зоны моносахаридов идентифицируются по характерному значению величины R_f в сравнении с достоверными стандартными образцами, а количественное содержание (с, мкг) глюкозы в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 15-35 мкг/мкл рассчитывают по формуле

содержание ксилозы (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 15-30 мкг/мкл рассчитывают по формуле

содержание рамнозы (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 10-30 мкг/мкл рассчитывают по формуле

где S - значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videodensitometer».