Заявленное изобретение относится к комбинации факторов роста, цитокинов, антибактериальных/антивирусных факторов, факторов стволовых клеток, белков комплемента C3a/C4a, иммуноглобулинов и хемотаксических факторов. Изобретение также относится к процессу получения упомянутой комбинации из сыворотки, плаценты или молозива и к композиции, содержащей упомянутую комбинацию для применения в лечении заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей, а также в качестве замещения терапии стволовыми клетками.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с данными из современной научной литературы лечебное воздействие стволовых клеток может объясняться двумя механизмами: дифференциацией стволовых клеток в резидентные и высвобождением регенеративных трофических факторов стволовыми клетками. Соответствующие эффекты данных двух механизмов еще нуждаются в объяснении, хотя было выдвинуто предположение, что стволовые клетки не развиваются в зрелые клетки поврежденной ткани, но, скорее, доставляют жизненные факторы в данную ткань, которые затем могут пролиферировать и дифференцироваться, восстанавливая сами себя) AI Caplan and JE Denni, Mesenchymal Stem Cells as Trophic Mediators. Bioch J. Cell 98:1076-1084, 2006).
Лечение стволовыми клетками имеет множество проблем, относящихся не только к ценовому параметру и технико-практическим трудностям, но также к вопросам этического и религиозного характера.
Лечение стволовыми клетками возможно только путем инъекций или, в некоторых случаях, местным введением, но не перорально. Супернатант культивированных стволовых клеток содержит факторы роста, цитокины, хемотаксические факторы и т.п., которые, как считается, отвечают за благоприятное воздействие лечения стволовыми клетками на рост и/или регенерацию ткани.
Использование жизненных факторов, изолируемых от супернатанта стволовых клеток, имеет, тем не менее, не только те же самые этические проблемы, присущие применению стволовых клеток, но и также очень высокую стоимость.
Известно, что некоторые ткани и биологические жидкости млекопитающих, а именн, сыворотка, плацента и молозиво содержат цитокины, факторы роста, хемотаксические факторы и прочие компоненты, как правило, присутствующие в супернатанте культур стволовых клеток. В прошлом или его экстракта или фракций, а также экстракта плаценты.
Например, обзор клинических практик применения молозива можно найти в Alternative Medicine Review 8(4), 2003, page 378 и в Int. J. Clin. Pharmacol and Therap., 46(5), 2008, 211-225, а также в International Dairy Journal, 16, 2006, 1415-1420.
Терапевтическое применение молозива или его фракций также можно найти в заявках EP 743060, WO 98/51316, WO 94/16675, WO 98/36759, WO 95/00155, WO 2007/000648, FR 2487676, WO 98/14473, WO 99/64022, WO 2008/103023 и WO 2006/029494. Последняя раскрывает экстрагирование (выделение) факторов роста и дифференцировки из молозива, но сам раскрываемый процесс обязательно предусматривает потерю важных компонентов чистого молозива.
Ни один из документов, относящихся к предшествующему уровню техники, не раскрывает композиции, полученные из легкодоступных исходных материалов млекопитающих, содержащих большинство, если не все, компонентов супернатанта культур стволовых клеток, в качестве заменителя лечения стволовыми клетками.
Описание изобретения
Было обнаружено, что комбинация факторов роста, цитокинов, антибактериальных/антивирусных факторов, факторов стволовых клеток, белков комплемента C3a/C4a, иммуноглобулинов и хемотаксических факторов особенно эффективно в лечении целого ряда патологий благодаря наличию многофункционального воздействия на различные биологические цели.
Комбинация согласно заявленному изобретению характеризуется содержанием:
цитокинов: примерно от 50 до 300 пкг/мг, предпочтительно от 47.81 до 264.56;
факторов роста: примерно от 650 до 1900 пкг/мг, предпочтительно от 670.80 до 1869.40;
хемотаксических факторов: примерно от 2 до 20 пкг/мг;
факторов стволовых клеток: примерно от 100 до 1200 пкг/мг, предпочтительно от 136 до 1120;
антибактериальных/антивирусных факторов: примерно от 30 до 80 мкг/мг, предпочтительно от 21.30 до 71.50;
белков комплемента C3a/C4a: примерно от 1 до 5 пкг/мг, предпочтительно от 1.10 до 2.70;
иммуноглобулинов: примерно от 0.3 до 0.9 мг/мг, предпочтительно от 0.35 до 0.85.
Цитокины, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, далее именуемые как PMF (мастер-файл на плазму), приведены в таблице 1.
Факторы роста, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, приведены в таблице 2.
Факторы стволовых клеток, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, приведены в таблице 3.
Хемотаксические факторы, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, приведены в таблице 4.
Антибактериальные/антивирусные факторы, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, приведены в таблице 5.
Белки комплемента C3a C4a, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, приведены в таблице 6.
Иммуноглобулины, присутствующие в комбинации согласно заявленному изобретению, приведены в таблице 7.
Данные, приведенные в табл. 1-7, получены при помощи коммерчески доступного твердофазного иммуноферментного анализа, специально предназначенного для бычьих молекул и гибких Bio-Plex® систем (Bio-Rad Lab., Hercules, СА, USA). Термин «примерно» означает отклонение ±10%, предпочтительно ±5% от приведенного значения.
Основные физиологические функции компонентов комбинации приведены далее по тексту.
БЕЛКИ КОМПЛЕМЕНТА C3/C4: комплемент состоит из циркулирующих белков, обладающих способностью взаимодействия с биологическими мембранами и специфическими рецепторами, расположенными на поверхности различных типов клеток, которые индуцируют воспалительные реакции, помогающие бороться с инфекциями.
ФАКТОРЫ РОСТА
TGF-1 - ТРАНСФОРМИРУЮЩИЙ ФАКТОР РОСТА: стимулирует выработку иммуноглобулинов класса А, ответственных за иммунную защиту в слизистых. Модулирует клеточную пролиферацию и стимулирует накопление внеклеточного матрикса.
EGF - ЭПИДЕРМАЛЬНЫЙ ФАКТОР РОСТА: регулирует развитие слизистых. Способствует формированию эпителиальных клеток.
IGF1 - ИНСУЛИНОПОДОБНЫЙ ФАКТОР РОСТА: модулирует клеточную полиферацию, адгезию и миграцию и индуцирует созревание слизистых.
VEGF ФАКТОР РОСТА СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ: стимулирует выработку кровеносных сосудов. Представляет митогенную активность и активирует сосудистую проницаемость.
FGF-b - ФАКТОР РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ - основной: стимулирует пролиферацию клеток мезенхимального происхождения, например, фибробластов, эндотелиальных клеток, астроцитов и кератиноцитов. Также действует как хемотаксический фактор.
OH - ГОРМОН РОСТА: общий фактор роста всех тканей.
GHRF - ФАКТОР, ВЫСВОБОЖДАЮЩИЙ ГОРМОН РОСТА: стимулирует высвобождение OH, необходимого для нормального постнатального развития, роста костей, регуляторных эффектов на белки, углеводород, и жировой метаболизм.
NGF - ФАКТОР РОСТА НЕРВНОЙ ТКАНИ: стимулирует активность и регулирует ост и дифференцировку симпатической системы.
PDGF - ФАКТОР РОСТА ТРОМБОЦИТОВ: рост дифференцировки клеток мезодермального происхождения.
BMP-2 - КОСТНЫЙ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ БЕЛОК 2: рост костей и хрящей, дифференцировка клеток сердечной мышцы.
ХЕМОТАКСИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЭОТАКСИН: связывается с рецепторами хемокина для направления эозинофилов в воспаленные ткани.
MCP-1: Моноцитарный хемотаксический фактор-I: способствует агрегации моноцитов в воспаленные ткани.
ЦИТОКИНЫ
IL-1Ra ингибирует активность интерлейкина 1-альфа и интерлейкина 1-beta, модулируя совокупность связанных с IL 1 иммунных и воспалительных ответов.
IL-2 индуцирует пролиферацию Т лимфоцитов.
IL-4 обладает противовоспалительной способностью.
IL-6 стимулирует врожденный и приобретенный иммунитет.
IL-9 является регулятором гемопоэтических клеток, стимулирует пролиферацию клеток и предотвращает апоптоз.
IL-17 регулирует активность NF-KB и увеличивает выработку оксида азота (NO).
IL-10 оказывает плейотропный эффект на иммунорегуляцию и воспаление. Улучшает выживаемость клеток В и соответственно выработку антител. Исследования, проведенные на нокаут-мышах, показали, что данный белок является незаменимым в иммунорегуляции слизистых.
IL-12 стимулирует Т клетки и естественные клетки-киллеры.
IL-15 регулирует активацию и пролиферацию Т-клеток и естественных клеток-киллеров.
Интерферон-гамма обладает признанными антивирусными, противоопухолевыми и иммунорегуляторными свойствами. Является мощным активатором макрофагов и активирует клеточно-опосредованную активность в отношении бактерий и вирусов.
Интерферон-гамма обладает признанными антивирусными, противоопухолевыми и иммунорегуляторными свойствами. Является мощным активатором макрофагов и активирует клеточно-опосредованную активность в отношении бактерий и вирусов.
TNF-a - фактор некроза опухоли альфа стимулирует миграцию нейтрофилов и моноцитов к месту инфекции.
ФАКТОРЫ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
GM-CSF-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: 1s участвует в стимуляции и периферическом высвобождении иммунных предшественников из костного мозга.
LIF - фактор, ингибирующий лейкемию: плейотропный цитокин с активностью в различных системах, участвует, например, в индукции гематопоэтической дифференцировки в нормальных клетках и клетках, пораженных миелоидной лейкемией, индукции дифференцировки нейронных клеток, регулятор мезенхимально-эпителиальной конверсии во время развития почки.
SCF - фактор стволовых клеток: действует в утробе и гаметах и участвует в развитии нейронных клеток и гематопоэзисе.
SDF-1-стромальный производный фактор-I: действует как хемотаксический фактор предшественников стволовых клеток, экспрессируя лиганд CXCR4.
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Трансферрин: доставляет железо в красные кровяные тельца и предотвращает связывание железа с бактериями и вирусами.
Лактоферрин: удаляет железо из бактерий и вирусов, необходимое для их роста.
Лизоцим: обладает антибактериальными свойствами в аспекте энзимной активности и, как следствие, катионных и гидрофобных свойств.
Лактопероксидаза: блокирует бактериальный метаболизм путем оксидации групп жизненных белков SH.
Комбинация согласно заявленному изобретению может быть приготовлена путем экстрагирования молозива, сыворотки, полученной от млекопитающих в предродовой период, или плаценты в соответствии со способами, описанными далее по тексту.
Сыворотка имеет самый высокий пик факторов в дни, непосредственно предшествующие родам, молозиво в первые часы после родов и не позднее 6-го часа. После 12 часов после родов факторы в молозиве значительно снижаются, а после 24 часов многие из них более не определяются.
Данные факторы генетически запрограммированы в различных родах, и, таким образом, возможно использование факторов, изолированных из других млекопитающих, например, домашнего скота, лошадей, верблюдов, морских млекопитающих и пр.
Факторы контролируются анализом ELISA, специфичны для каждого вида, даже при наличии ярко выраженной кросс-реакции, поскольку факторы филогенетически очень консервированы, и, соответственно, поддаются качественному учету также при помощи ELISA, используемого для различных видов (например, человеко-бычий и наоборот).
Нет необходимости добавлять антибактериальные консерванты к молозиву, сыворотке или плаценте, поскольку процедура экстрагирования позволяет осуществлять подготовку продукта с очень низким числом бактерий (<40 c.f.u), что намного ниже, чем значение, допускаемое для данных продуктов (<1000 c.f.u.). Присутствие пирогенов в препаратах для перорального или местного применения нерелевантно.
Экстрагирование из сыворотки млекопитающих
Сыворотка беременных особей млекопитающих имеет самый высокий пик компонентов согласно заявленному изобретению в дни, непосредственно предшествующие родам, молозиво в первые часы после родов или отела, как правило в последние 5-15 дней.
Описана типичная процедура приготовления комбинации согласно заявленному изобретению.
1 литр крови забирают в течение 4 дней для общего количества образцов 4 для предотвращения повреждения животным, предпочтительно коров или лошадей.
Сыворотку отделяют от крови при комнатной температуре в течение 24 ч и затем центрифугируют для сжатия сгустков.
Сыворотку восстанавливают (примерно 30/40% от общего объема) и добавляют в качестве антисептических агентов феноксиэтанол 2.5% и диазолидинил мочевину 1%. Сыворотку затем подвергают следующим этапам обработки.
Ультрафильтрация 300,000 Да
Образец сыворотки (замороженной при -20°C), полученной коагуляцией и центрифугированием из крови млекопитающих, разморозили при комнатной температуре и разбавили с 2 объемами деионизированной воды. Полученный раствор подвергли ультрафильтрации через плоскую мембрану тангенциального потока Millipore Biomax Pellicon 300,000 Да в полиэтерсульфоне при Pi от 0.5 до 1 бар, в холодном помещении при 4°C.
Ретентат и фракцию, соответствующую примерно 1:10 пермеата, помещают в диализную трубку 1000 Да производства Spectrum SpectraPor в регенерированной целлюлозе и подвергают диализу в деионизированной воде.
Ультрафильтрация 5,000 Да
Оставшийся пермеат ультрафильтруют через мембрану 5000 Да. Пермеат от ультрафильтрации 300,000 Да концентрируют на плоской мембране тангенциального потока 5000 Да производства Millipore Biomax Pellicon в полиэтерсульфоне при Pi от 0.5 до 1 бар, в холодном помещении при 4°C.
Ретентат помещают в диализную трубку 1,000 Да в регенерированной целлюлозе производства Spectrum SpectraPor и подвергают диализу в деионизированной воде (данный диализ также удаляет консерванты). Затем продукт немедленно лиофилизируют.
Экстрагирование из плаценты
Предпочтительно используют бычью, лошадиную или свиную плаценту.
Гомогенизация
Плаценту (замороженную при -20°C) разморозили при комнатной температуре, нарезали на мелкие кусочки, промыли обильным количеством холодного (4°C) физиологического раствора (NaCl 0.9%) и гомогенизировали с использованием комплекса Siramm в лизисном буфере после получения данной композиции: Tris/HCl 50 мМ, EDTA 25 мМ, triton Х-100 0.001% при pH 7.4. NaCl до концентрации 0.9% добавили к полученной суспензии. Суспензию перемешали в магнитной мешалке в течение 2 часов и продержали в статическом состоянии в течение ночи в холодном помещении при 4°C.
Центрифугирование
Суспензию центрифугировали при 13,000 оборотах в минуту с использованием Sorvall RC6 и ротора SLA 15000 в течение 45 мин при 4°C. Супернатант от центрифугирования восстановили, подвергли предварительной фильтрации на Dicalite и регенерированных целлюлозных фильтрах от 0.45 мкм до 0.22 мкм.
Ультрафильтрация 300,000 Да
Продукт фильтруют и ультрафильтруют через плоскую мембрану тангенциального потока 300.000 Да производства Millipore Biomax Pellicon при Pi от 0.5 до 1 бар, в холодном помещении при 4°C.
Ультрафильтрация 5,000 Да
Пермеат от ультрафильтрации 300,000 Да концентрируют на плоской мембране тангенциального потока 5000 Да производства Millipore Biomax Pellicon в полиэтерсульфоне при Pi от 0.5 до 1 бар, в холодном помещении при 4°C. Ретентат помещают в диализную трубку 1,000 Да производства Spectrum SpectraPor в регенерированной целлюлозе и диализуют в деионизированной воде. Затем продукт немедленно лиофилизируют.
Экстрагирование из молозива
Предпочтительно бычье молозиво, в частности от коров пород Holstein (Friesian) и Guernsey. Было доказано, что коровы данной породы вырабатывают молозиво с самым высоким содержанием факторов роста, иммунных модуляторов, хемотаксических факторов и антибактериальных/антивирусных факторов. Предпочтительн, данные коровы имеют второй или третий отел. Молозиво предпочтительно собирают не позднее 5-6 часов после отела, наиболее предпочтительно - в течение одного часа после отела, поскольку самая высокая концентрация активных веществ наблюдается в течение упомянутого периода, в то время как после шестого часа и позднее содержание активных факторов резко падает (только 20% присутствуют в течение 24 часов после отела).
Собранное молозиво проверяют на отсутствие туберкулеза, цитотоксичность на клеточных культурах, микоплазму, прионовые инфекции и вирусы человека и лошадей.
Молозиво из цистерны вымени практически стерильно, но после сцеживания, несмотря на все предосторожности, вследствие высокой концентрации факторов роста количество бактерий в нем резко увеличивается во время замораживания и размораживания, причем это занимает достаточно долгое время из-за высокой плотности молозива в первые несколько часов.
Молозиво затем разбавляют физраствором: данный раствор не только обеспечивает улучшенную фильтрацию без закупоривания пор фильтра, но прежде всего позволяет высвободить активные факторы, связанные с жирами и казеином. Разбавленное таким методом молозиво подвергается тангенциальному микрофильтрованию (керамические мембраны с пороговым значением / размером пор от 2 до 6 мкм, температура 5/20°C, трансмембранное давление от 0.2 до 2 бар), которое можно повторить, для получения опалесцирующего раствора без жировой матрицы, казеина и молочных белков. Все данные вещества содержат более 90% аллергического содержания молозива и коровьего молока. Затем данный раствор пропускают через мембраны или альтернативно через молекулярное сито с пороговым значением при 300,000 дальтон (Да) для последующей очистки активных факторов, все весом менее 200,000 дальтон.
Раствор затем диализуют при помощи ультрафильтрации (пороговое значение 1000/2000 дальтон) при высоком давлении и затем немедленно высушивают заморозкой. В результате получают стерильный, без консервантов, безаллергенный порошок (казеин и лактоальбумин вызывают более 95% случаев аллергии на коровье молоко) с очень высокой растворимостью, с максимально высокой возможной концентрацией активных факторов и отличается очень низким содержанием бактерий (<40 CFU).
Продукты, полученные из сыворотки, плаценты или молозива, могут применять в отдельности или в комбинации. Продукты в любом случае будут соответствовать качественным параметрам, перечисленным в таблицах 1-7.
Комбинацию согласно заявленному изобретению преимущественно применяют, перорально или локально, в лечении заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей, в качестве замещения терапии стволовыми клетками. В частности, сочетание согласно заявленному изобретению, содержащее те же компоненты, что и супернатант культур стволовых клеток, успешно применяют для перорального лечения:
- аутоиммунных заболеваний, особенн, диабета I типа, множественного склероза, артрита, аутоиммунного гепатита, язвенного колита;
- невропатических болей;
- желудочно-кишечных заболеваний, например, некротического острого энтероколита, болезни Крона, гастроэзофагального рефлюкса, энтероколита, вызванного СПИДом, синдрома раздраженной толстой кишки, инфекционного колита, спастического колита, колита, вызванного приемом антибиотиков, хиатальной грыжи, синдрома короткого пищевода и т.п.;
- остеопороза;
Комбинация согласно заявленному изобретению также применима для местного лечения различных форм алопеции; язв роговицы; ран, ожогов, язв кожи; язв слизистой рта.
Для перорального лечения комбинацию согласно заявленному изобретению могут приготовить в форме композиции с соответствующими носителями и эксципиентами в приемлемой дозировке, например, в виде капсул, таблеток, порошков, гранул, суспензий, функциональный питательных продуктов и подобных форм, используемых в нутрицевтике.
Дневная дозировка комбинации (сочетания) зависит от вида и тяжести заболевания, а также состояния пациента, возраста и пола. Обычно составляет от 10 до 30 г ежедневно, в один или более приемов, как правило, в три или четыре приема.
Для местного лечения приемлемые формы введения включают кремы, мази, гели, порошки, лосьоны, средства для полоскания рта, пластыри, содержащие, как правило, от 10 до 20% по весу сочетание согласно заявленному изобретению. Сочетание согласно заявленному изобретению, полученное из молозива, сыворотки или плаценты, при необходимости, могут покрывать оболочкой для специфического применения, например, в формах с контролируемым высвобождением, предпочтительно в микросферах.
Композиции могут содержать прочие ингредиенты для специфического применения.
Например, для лечения ран и язв могут добавлять оксид цинка и экстракт Arnica montana.
Далее по тексту, заявленное изобретение описано детально в экспериментальной части, представляющей примеры применения.
Пример 1 - Аутоиммунные заболевания
Влияние превентивного перорального введения PMF Ab исследовали на различных моделях аутоиммунных заболеваний, например экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE), диабет I типа, язвенный колит, вызванный TNBS, гепатит, вызванный ConA, и артрит, вызванный адъювантом и коллагеном.
Пример 1a - Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE)
EAE вызвали в женских особях мышей SJL 6-7 недель отроду, как описано в J.St. Louis et al. Мышей иммунизировали с применением 75 мкг протеолипидного белка PLP (139-151) (Genemed synthesis, San Francisco CA), эмульгированного в CFA, содержащем 0.6 мг/мл Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difeo, Detroit, MI, USA) для получения эмульсии 1:1. Каждой мыши ввели 200 мкл эмульсии внутрикожно в четыре места, проксимальных к аксиллярным и ингвинальным лимфоузлам. Токсин пертуссин (Calbiochem, Nottingham, UK) использовали как ко-адъювант, растворенный в воде в концентрации 2 мкг/мл, и ввели в объеме 100 мкл в день 0 и день 2 после иммунизации. Клиническую оценку провели в соответствии со следующей шкалой: 0 = нет признаков заболевания, 1 = опавший хвост, 2 = умеренный парапарез, 3 = тяжелый парапарез, 4 = агония, 5 = гибель.
Две группы по 6-10 мышей получили перорально P.M.F. Ab в дозировке 0.1 г I особь в основе (вода) начиная с дня 0.
PMF Ab растворили в воде в концентрации 0.1 мг/мл и ввели окончательный объем 0.25 мл.
Результаты
Воздействие P.M.F. Ab на развитие EAE, вызванного протеолигшдным белком PLP (Proteolipid Protein) и токсином пертуссином.
Через 42 дня лечения P.M.F. Ab (25 мкг) заболевание развилось только у 2 из 6 мышей (33.3%) в сравнении с 9 из 10 мышей в группе мышей, которым вводили основу (90%). Дополнительно, мыши, которым вводили P.M.F Ab, показали более легкое течение заболевания с более низким средним кумулятивным показателем и более короткой продолжительностью заболевания, чем у мышей, которым давали воду (Таблица 8).
Пример 1б - Диабет I типа
Диабет миеллитного типа 1 (DM тип 1) представляет собой мультифакторный синдром, вызванный неспособностью вырабатывать эндогенный инсулин как результат иммунного ответа аутореактивных Т-лимфоцитов и макрофагов в отношении панкреатитных бета клеток Лангенганса.
40 мг/кг стрептозотоцина (STZ) ввели 1 pаз в течение 5 последующих дней мужским особям мышей C57B16J 7-8 недель отроду.
Двум группам мышей из 7-8 особей вводили перорально со дня 0 по день 21 шесть раз в неделю P.M.F. Ab в дозировке 0.2 г/особь или с основой. P.M.F. Ab растворили в воде в концентрации 0.4 мг/мл и вводили в конечном объеме 0.5 мл.
Мышей обследовали раз в неделю измерением уровня гликемии. Диабет диагностировали при уровне гликемии, превышающем 11,8 ммоль/л.
Результаты
Как и ожидалось, у мышей в контрольной группе, которым вводили основу, развилась гипергликемия через 2 недели после последней инъекции STZ, при 100% проявлении диагноза в течение 3 недель.
В сравнении профилактическое лечение P.M.F. Ab полностью защитило мышей от гипергликемии, вызванной STZ.
Лечение P.M.F. Ab в течение 21 дня в дозировке 0.2 г/особь протекало без осложнений.
Пример 1в - Язвенный колит, вызванный тринитробензолом сульфатом TNBS
Для изучения возможного воздействия P.M.F. Ab на данную специфическую в отношении определенного органа аутоиммуннную патологию использовали экспериментальную модель IBD, вызванную TNBS.
В модели единственное введение TNBS вызвало появление, в течение 4 дней, заболевания в клиническими иммуногистологическими проявлениями, весьма похожими на симптомы воспаленного кишечника человека, например, при болезни Крона и язвенном колите.
Колит вызвали у 20 мужских особей Balb/C мышей, весом 20-25 г, одиночным введением в желчные пути в день 0 раствора 4 мг тринитробензола сульфата (TNBS) в 0.1 мл 50% этанола.
10 мышам ввели перорально PMF Ab в дозировке 0.2 г/мышь и 10 мышам (контрольная группа) ввели соответствующую основу (воду), ежедневно в течение 4 последовательных дней, начиная с индукции (дни 0, 1, 2 и 3).
Мышей усыпили на 4 день и исследовали повреждения слизистой (ADM) на отрезке дистального сегмента кишки длиной 7 см. Оценку уровня макроскопического повреждения (SDM) провели согласно следующим критериям: 0 = повреждения отсутствуют; 1 = локальная гиперемия и/или отечность; 2 = продольная язва < чем половина ширины кишки; 3 = продольная язва > чем половина ширины кишки; 4 = поперечная язва < 1 см; 5 = поперечная язва от 1 до 2 см; 6 = поперечная язва > 2 cм.
Результаты
Как и ожидалось, в контрольной группе наблюдали серьезную потерю массы тела со дня 0 и до дня усыпления (-18%), повышение массы кишки (0.47±0.16 г) и маркированные повреждения слизистой толстой кишки (среднее ADM=68±57 mm2, Table 9).
Лечение PMF Ab в дозировке 0.1 г/особь показало значительное снижение зоны некроза и положительную динамику уменьшения массы кишки.
Пример 1 г - Аутоиммунный гепатит
Использовали экспериментальную модель гепатита у мышей NMRI, вызванного ConA.
В данной модели одиночная инъекция Con А достаточна для развития иммунно-опосредованного повреждения печени, которое исследовали измерением уровня глутамат-пируват трансаминазы (ОРТ) в плазме.
20 мужским особям мышей-альбиносов NMRI, 6-7 недель отроду, привили внутривенно 20 мг/кг ConA (Sigma Chemical, St. Louis, МО) в стерильном PBS.
10 мышам ввели перорально PMF Ab в дозировке 0.2 г/мышь и 10 мышам (контрольная группа) ввели соответствующую основу (воду), 24 часа и 1 час до введения ConA.
Животных усыпили после введения ConA и измерили уровень глутамат-пируват трансаминазы в плазме.
Результаты
При вскрытии обнаружили признаки острого поражения печени у всех мышей контрольной группы, привитых ConA и получавших воду. Эти мыши, фактически, имели маркированное повышение в ОРТ плазмы, достигая средних значений 1556±869 U/I (Таблица 10). Лечение PMF Ab в дозировке 0.2 г/особь значительно уменьшило уровень ОРТ в плазме (р.О 1 Student t-test).
Пример 1д - Артрит, вызванный коллагеном типа II у мышей DB/1j (CIA)
Заболевание можно вызвать у мышей и крыс путем внутрикожной инъекции коллагена типа II, гомологенно или гетерогенно эмильгированного в полном адъюванте Фрейнда.
Воздействие PMF Ab исследовали путем тестирования PMF Ab в дозировке 0.2 г/особь. Мышей обследовали через день для оценки важных клинических показателей.
Использовали 40 мужских особей DBA/j 1 мышей, 8-9 недель отроду. Заболевание вызвали путем внутрикожной прививки эмульсии 100 мкг бычьего коллагена II типа в 100 мкл, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (CFA) (Sigma, Milano, Italia). Мышам ввели второй бустер на 21-й день после иммунизации путем внутривенной прививки 100 мкг коллагена II типа в полном объеме 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда.
Четыре группы по 10 мышей каждая получили перорально ежедневно PMF Ab (0.2 г/особь), в соответствующей основе (стерильный PBS) и дексаметазоне (0.3 мг/кг), начиная со дня индукции до 30-го дня после индукции. Добавили еще одну группу из 10 здоровых мышей (Sham). Клинический индекс артрита оценили шкалированием каждой лапки мышей (толщина, набухание/отек, распространение заболевания на одни, два или более суставов).
Результаты
У мышей контрольной группы развились ассоциированные с артритом клинические признаки в течение 29 дней после индукции, с постепенным увеличением как в клинической картине заболевания, так и толщине лапок, достигая максимума на 40-й день. Между контрольной группой и группой, получавшей лечение, не было разницы в массе тела особей.
PMF Ab в дозировке 0.2 г/особь значительно уменьшили клинические показатели заболевания (p<0.05 в сравнении с основой по t-test) с 30 по 33 день после индукции, с положительной динамикой начиная с 34 дня и до конца исследований.
Аналогичные результаты получили у мышей Lewis, на модели артрита, вызванного адъювантом.
Пример 2 - Невропатические боли
Пример 2а - Animal Испытания на животных
Использовали модель хронической компрессии (CCI, Bennett and Xie, 1988), поскольку она позволяет получить ярко выраженные валлеровскую дегенерацию и воспаление. Дополнительно, поскольку некоторые волокна сопротивляются повреждению, остается возможность проведения бихевиоральных тестов для оценки болевых симптомов.
Невропатию вызвали у мужских особей мышей C57BL/6J, 9 недель отроду, массой 20-25 г. Под барбитуратной анестезией, при помощи препаровальной лупы, в центре правых лапок обнажили седалищный нерв и вокруг, до трифуркации выполнили три свободные лигатуры, не препятствуя эпиневральному кровообращению.
Мыши с ложным управлением (открытый нерв без лигатуры) служили в качестве контроля.
Измеряли термическую аллодинию согласно методу Харгрейва, модифицированному для крыс, с использованием инструментального плантарного теста. Вкратце, мышей поместили в небольшие клетки из плексигласа и направили радиальный источник тепла постоянной интенсивности на центральную часть задней лапки. Измеряли время (секунды) от активации источника до убирания лапки.
PMF Ab вводили перорально в дозировке 0.4 г/мышь каждый день, начиная со дня травмы, в течение трех недель.
Результаты
Результаты приведены в табл. 11.
Лечение PMF Ab привело к повышению порогов анальгезии, которые были значительно выше, чем у животных с невропатией, которым давали раствор, сразу начиная с 21-го дня до достижения ими уровня состояния нормальных животных на 28-й день лечения.
Пример 2б - Клинические испытания с участием человека
Шесть пациентов, четверо мужчин и две женщины, с болевым синдромом после герпеса продолжительностью от двух до трех лет, получали каждый день в течение 30 дней PMF Ab перорально (10 г/день).
Болевой синдром оценили субъективно, с использованием ВАШ, VAS (визуальная аналоговая шкала) и объективно, применяя тест гиперальгезии, стимуляция с нитями фон Фрея областей, пораженных заболеванием и окружающих участков.
Исследование проводилось в «открытом» порядке, с оценкой выраженности болей и гиперальгезии с исходного уровня (начало лечения).
Пациентам, которым вводили PMF Ab, испытали улучшение субъективного восприятия боли, с вариацией ВАШ через 15 дней лечения с 6.0 до 2.0. Последнее значение сохранилось до окончания лечения (30 дней). Стимуляция с нитями фон Фрея (последовательность давления от 0.05 до 140 г) привело к появлению значительных различных кривых ВАШ/прилагаемое усилие, что указывает на прогрессивное улучшение гиперальгезии с 20-го дня лечения до окончания.
Пример 3 - Лечение анорексии
Двадцати пациентам женского пола, возраст от 16 до 30 лет, страдающим от нервной анорексии, с потерей веса от 15 до 30% от нормального уровня для возраста и телосложения, ежедневно давали по 40 г PMF Ab перорально. Интересно отметить, что все пациенты, несмотря на серьезные нарушения питания, согласились принимать препарат только при условии гарантии, что сам препарат повышает только мышечную массу, но не жировую массу тела, с положительным влиянием на сердечно-сосудистые, дыхательные и неврологические показатели.
Через три месяца адъювантной терапии 50% вернули более чем 30% массы тела, со значительным улучшением физического и ментального самочувствия. Показатели химического состава крови нормализовались.
Примечательно, что 25% данных пациентов даже возобновили нормальный режим питания с restitutio ad integrum массы тела. Остальные 25% не показали изменений.
Пример 4 - Остеопороз
Воздействие Р.M.F. Ab оценили in vitro и in vivo путем анализа пролиферации и дифференцировки остеогенных мезенхимальных стволовых клеток, предшественников костей, и остеобластов.
Пример 4а - in vitro тесты Пролиферация
Исследовали влияние P.M.F. Ab на клеточную пролиферацию с использованием остеобластов человека (Saos-2 and MG-63) и мезенхимальных стволовых клеток человека, в качестве модели прекурсора остеобластов (стволовые клетки из жировых тканей человека, hASC).
Изолировали ASC (Zuk PA et al. Tissue Eng, 2001, 7:.211-28) забором от 6 добровольцев-доноров и поместили в контрольную среду (DMEM с добавлением пирувата натрия, 10% FCS, 100 U/ml пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицина В). Остеобласты Saos-2 (АТСС номер: НТВ-85) и MG-63 (АТСС номер: CRL-1427) закупили в компании АТСС. Saos-2 и MG-63 содержали соответственно в McCoy' SA (Gibco, Life Technologies) с 15% FBS и в DMEM с 10% FCS.
Клетки засеяли в 96-луночные планшеты и подвергли тесту МТТ на 1, 3, 5 и 7 дни, содержали во влажной атмосфере с 5% C02 при 37°C. PMF показали потенциальный дозозависимый пролиферативный эффект на все исследуемые линии, максимально выраженный в концентрации 5 мг/мл.
Пример 4б - in vivo тесты на женских особях крыс после овариэктомии
Влияние PMF Ab на костную массу исследовали на животной модели остеопении (хирургическая овариэктомия) у взрослой крысы, сравнимой с постменопаузным остеопорозом у человека.
Крыс породы Sprague-Dawley, 5 месяцев отроду, подвергли хирургической двусторонней овариэктомии. Воздействие PMF Ab на костную массу исследовали путем измерения двухмерной и объемной плотности костного минерала бедренной кости (BMD) (дистальный метафиз и медиальный диафиз) путем компьютеризированной модели плотности костного минерала (DXA) костной томографии (pQCT). Оценили мРНК для интерлейкина-8, лиганд рецептора-активатора ядерного фактора кВ и остеопротегин пептида как биохимические маркеры ремоделирования кости. Крысам в течение 60 дней с момента овариэктомии давали перорально PMF Ab (2-4-8 г/кг) в течение 5 дней в неделю. Биохимические параметры BMD и ремоделирования кости оценили до (ТО), во время (Т30) и после окончания лечения (Т60).
Лечение индуцировало дозозависимое восстановление после остеопении и нормализацию соотвествующих биохимических параметров.
Пример 5 - Лечение острого некротического колита (NEC)
Использовали модель NEC на свиньях, с идентичными человеку макроскопическими и микроскопическими патологическими эффектами.
1. Сравнение особей, получавших молоко с композицией + PMF Ab, и особей, получавших только молоко
У особей, получавших молоко плюс 20 г/плошку PMF Ab, наблюдался регулярный рост в сравнении с контрольной группой, питавшейся молоком свиноматки. Свиньи, которых кормили с рождения только молоком, после первого дня регулярного роста, показали со второго дня прострацию, локомоторную атаксию, остановку добровольного кормления, регургитацию и диарею. После быстрой потери массы тела в течение последующих 24-48 часов животные умирали. Гистопатологическое исследование различных участков толстого кишечника при вскрытии подтвердило диагноз острого некротического энтероколита, подтвержденный электронной микроскопией (фиг. 1а и 1б).
2. Сравнение групп, получавших повышенные дозы PMF Ab
Особи, получавшие молоко + 20 г/день PMF Ab: постоянный рост, полностью сравнимый с ростом особей контрольной группы, питавшихся от свиноматки.
Особи, получавшие молоко + 1 г/день PMF Ab: все особи быстро худеют, и в течение последующих 24-48 часов вся группа умирает.
Группа особей, получавших молоко + 5 г/день PMF Ab: наблюдается состояние реальной кахексии и смерть всей группы в течение нескольких дней. Гистопатологическое исследование различных участков толстого кишечника особей данной группы, получавших 1 г/день и 5 г/день PMF Ab, при вскрытии подтвердило диагноз острого летального некротического энтероколита.
Группа особей, получавших молоко + 10 г/день PMF Ab: диарея проявляется у всех особей. На 13-й-14-й день патологические показатели резко ухудшаются и животные умирают от острого некротического колита.
Группа особей, получавших молоко + 15 г/день PMF Ab: постоянный рост, без проявления патологических признаков, но развитие группы несколько отстает от группы особей, получавших молоко + 20 г/день PMF Ab.
Группа особей, получавших молоко + 20 г/день PMF Ab (до 15-го дня): постоянный рост, полностью сравнимый с контрольной группой, питавшейся от свиноматки.
3. Сравнение особей, получавших молоко + PMF Ab, и особей, получавших только PMF Ab + сахарный раствор ad libitum
Поросята получали в неограниченном количестве сахарный раствор + 20 г/день PMF Ab, без добавления молока, не показали признаков заболевания, но постоянно теряли вес, что является признаком недостаточного поступления питательных веществ с сахарным раствором вместо молока. Эти особи также в конце умирали, но при гистопатологическом исследовании толстая кишка нормальная, без признаков острого некротического энтероколита.
Пример 6 - Местное лечение кожных язв
Десяти пациентам (6 мужчинам и 4 женщинам) с диабетическими язвами ног, плохо поддающимися лечению вследствие системности основного заболевания, наносили дважды в день локально 5% водный раствор PMF Ab. Полное восстановление происходило через 4-6 недель у семи пациентов с диабетическими язвами от 2.5 до 24.5 см; в трех случаях первоначальная язва уменьшилась на 60-85%.
Пример 7 - Лечение язв ротовой полости
Эффективность PMF Ab, как в свободной композиции, так и в форме включений в микросферы, исследовали в клинических испытаниях у 50 пациентов (мужчины в возрасте от 18 до 43 лет, средний возраст 28.73), без патологических состояний, кроме хронического ротового стоматита (No. 25), состоявших в группе I данного исследования (местное применение 5% водного раствора PMF Ab, 3 раза в день) и в контрольной группе II (ополаскивания с бензидамином гидрохлоридом 3 раза в день в течение 2 минут).
Оценили размер язв, видеонаблюдение (с ВАШ шкалой) и степень удовлетворения от лечения. Местное применение PMF Ab привело к полному исчезновению язв у 8 пациентов в течение 2-4 дней, 4-7 дней у 10 пациентов, в течение 7-10 дней у оставшихся 7 пациентов группы I. В контрольной группе II полное излечение афтозных язв произошло у 3 пациентов в течение 2-4 дней, 4-7 дней у 9 пациентов, в течение 7-10 дней у оставшихся 10 пациентов, и 3 пациента не излечились. Средний размер язв в двух группах был значительно меньше, начиная с четвертого дня в группе (I) в сравнении с контрольной группой (II).
Пример 8 - Лечение язв роговицы у собак
Испытание провели на 5 собаках с фотофобией, эпифорой, блефароспазмом. У собак были язвы роговицы вследствие общих травм (повреждения инородными телами, кошачьи царапины и пр.).
Вводили глазные капли, содержащие 5% PMF Ab, дважды в день, инсталляцией в коньюнктиву в течение 8-10 дней.
Результаты
При обследовании у пяти собак обнаружили две поверхностные язвы, одна хроническая незаживающая язва и две глубокие язвы.
Заживление повреждения роговицы произошло у всех собак (под заживлением понимают полное заживление язвы и отрицательный тест с использованием флуоресцеина, а также исчезновение симптомов клинического обследования (фотофобия, эпифора, блефароспазм). Во всех случаях удалось сохранить зрение животным и отсутствовало, не наблюдали постоянного рубцового бельма, невзирая на тот факт, что не использовали другое лечение (например, местное введение кортикостероидов).
Средний срок излечения составил 6 дней. Необходимо отметить, что, дополнительно к заживлению язвы, возможно, благодаря эффекту, аналогичному применению лимбических стволовых клеток, PMF Ab также выполнял функцию антибактериального агента, предотвращая развитие вторичных инфекций, и противовоспалительного агента, приводя к полному заживлению раны без остаточных шрамов.
Пример 9 - Лечение алопеции
Алопецию можно эффективно предотвратить и лечить с применением PMF Ab, предпочтительно нанесением в последовательном порядке первой композиции местного применения, которая воздействует на волосяные луковицы в катаген-фазе, и второй композиции местного применения, которая стимулирует повторный рост волос.
Первая композиция для местного применения содержит в качестве активных ингредиентов масляную смолу стручкового перца, витамин PP и кофеин, дополнительно к традиционным эксципиентам. Вторая композиция для нанесения на кожу головы через 15-30 минут после первой композиции содержит PMF Ab частично в свободной форме и частично инкапсулированной в микросферы, а также другие ингредиенты, выбранные из серицина, экстракта Aloe vera, кофеина, мелатонина и пантенола. Примеры приемлемых композиций приведены далее по тексту:
1 предварительное лечение
Масляная смола стручкового перца 0.05%
Витамин PP 0.20%
Кофеин 0.01%
Эксципиенты - сколько потребуется
2 лечение
P.M.F. Ab 10.00%
P.M.F. Ab в микроинкапсулированной форме 2.5%
Серицин 1.00%
Алоэ 1.00%
Пантенол 0.20%
Мелатонин 0.005%
Кофеин 0.01%
эксципиенты - сколько потребуется
Композиции клинически испытаны на 30 пациентах с возвратной потерей волос (телоген), в особенности весной и осенью. Потерю волос предотвратили у 88% пациентов-мужчин и 75% пациентов-женщин.
Из 20 пациентов, прошедших химиотерапию (женщины с раком груди), только 12% пациентов потеряли волосы, у 20% волосы истончились, но не выпали, во всех случаях - без побочных эффектов.
Композиции также протестировали на 10 пациентах с острым выпадением волос, 10 пациентах с хроническим выпадением волос, 5 пациентах с гнездной алопецией, 40 пациентах с андрогенной алопецией и 7 пациентах с рубцовой алопецией.
В случаях острого выпадения волос ответ на лечение у пациентов, 8 женщин и 2 мужчин, был различен.
Через два месяца нанесения препарата, раз в день, наблюдали резкое снижение выпадения волос у 8 пациентов (7 женщин - 1 мужчины) с умеренным восстановлением только в одном случае (мужчина) на третий месяц терапии, в то время как в других двух случаях (соответственно, у мужчины и женщины) ситуация оставалась неизменной.
При хроническом выпадении волос, из 10 пациентов, принявших лечение (9 женщин и 1 мужчина), у 8 пациентов наблюдали снижение через два месяца терапии. У двух пациентов отсутствовал ответ на терапию.
У пациентов с гнездной алопецией все пролеченные случаи (5 пациентов, 3 женщины и 2 мужчин) показали очень незначительный или вовсе нулевой ответ через два месяца терапии.
40 пациентов (30 мужчин и 10 женщин) с андрогенной алопецией получили лечение. Через два месяца терапии, наблюдали снижение потери волос и улучшение внешнего вида волос, с количественными показателями увеличения диаметра стержня, увеличением объема и блеска волос в 30 пролеченных случаях.
В других 10 случаях клиническая картина осталась без изменений.
В 7 случаях рубцовой алопеции (4 женщины и 3 мужчин), в которых также наблюдали воспалительную реакцию кожи с сильным зудом, наблюдали удивительный ответ через один месяц терапии - снижение либо даже исчезновение зуда, исчезновение раздраженности кожи form и стабилизацию алопеции.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к комбинации и фармацевтической композиции для лечения заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей. Комбинация цитокинов, факторов роста, хемотаксических факторов, факторов стволовых клеток, белкового комплемента, иммуноглобулинов и антибактериальных/антивирусных факторов, взятых в определенном соотношении и с определенным составом компонентов, для лечения заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей. Вышеописанные комбинация и фармацевтическая композиция позволяют эффективно восстанавливать и регенерировать ткани. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 11 табл., 9 пр.
1. Комбинация цитокинов, факторов роста, хемотаксических факторов, факторов стволовых клеток, белков комплемента, иммуноглобулинов и антибактериальных/антивирусных факторов для лечения заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей, характеризующаяся следующим содержанием компонентов:
Цитокины (пкг/мг)
Факторы роста (пкг/мг)
Факторы стволовых клеток (пкг/мг)
Хемотаксические факторы (пкг/мг)
Антибактериальные/антивирусные факторы (мкг/мг)
Белки комплемента (пкг/мг)
Иммуноглобулины (мг/мг)
2. Комбинация по п. 1, получаемая путем экстрагирования молозива.
3. Комбинация по п. 1, получаемая путем экстрагирования плаценты.
4. Комбинация по п. 1, получаемая путем экстрагирования сыворотки, собранной за 5-15 дней до родов.
5. Комбинация по пп. 1-4 для применения в лечении заболеваний, требующих восстановления тканей и регенерации и для замещения терапии/трансплантологии с применением стволовых клеток.
6. Комбинация по пп. 1-5, которую применяют для лечения заболеваний, являющихся аутоиммунными заболеваниями, невропатическими болями, остеопорозом, раневыми поражениями, ожогами, кожными язвами, повреждениями ротовой полости, различными формами алопеции, некротическим острым колитом, болезнью Крона, гастроэзофагальным рефлюксом, энтероколитом, вызванным СПИДом, синдромом раздраженной толстой кишки, инфекционным колитом, спастическим колитом, колитом, вызванным приемом антибиотиков, хиатальной грыжей, синдромом короткого пищевода.
7. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, требующих восстановления и регенерации тканей, содержащая комбинацию по пп. 1-5 в качестве активного ингредиента в смеси с приемлемыми носителями и/или эксципиентами.
8. Фармацевтическая композиция по п. 7 для перорального введения.
9. Фармацевтическая композиция по п. 7 для местного введения.
| Молозиво TSN | |||
| Способ использования делительного аппарата ровничных (чесальных) машин, предназначенных для мериносовой шерсти, с целью переработки на них грубых шерстей | 1921 |
|
SU18A1 |
| WO 2006029518 А1, 23.03.2006 | |||
| WO 2008003688 A1, 10.01.2008 | |||
| WO 1995000155 A1, 05.01.1995. | |||
