СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ГЕПАТОЦИТОЛИЗА В УСЛОВИЯХ ЧАСТИЧНОЙ СОСУДИСТОЙ ИЗОЛЯЦИИ ПЕЧЕНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2018 года по МПК G09B23/28 A61K31/185 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для снижения гепатоцитолиза в условиях временного выключения печени из кровообращения.

Заболевания печени являются одними из самых распространенных в мире, зачастую требующими хирургической коррекции [Вишневский В.А. Операции на печени / В.А. Вишневский, В.А. Кубышкин, А.В. Чжао, Р.З. Икрамов. - М., 2003. - 155 с.], методы которой, так или иначе, приводят к региональной ишемии с последующей реперфузионной травмой органа. Одной из ключевых мишеней при этом является митохондрия, дисфункция которой наблюдается как при редуцировании кровотока, так и при его восстановлении. В условиях гипоксии ферментные системы клеточного дыхания являются потенциальной точкой коррекции. В связи с этим представляет интерес использование митохондриального цитопротектора дихлорацетата натрия, стимулирующего активность пируватдегидрогеназного комплекса [Knoechel T.R., Tucker A.D., Robinson С.М., Phillips С., Taylor W., Bungay P.J., Kasten S.A., Roche Т.Е., Brown D.G. Regulatory roles of the N-terminal domain based on crystal structures of human pyruvate dehydrogenase kinase 2 containing physiological and synthetic ligands // Biochemistry. - 2006. - Vol. 45. - P. 402-415].

Известен способ коррекции ишемического поражения печени в условиях ее обескровливания, суть которого заключается во внутривенном медленном введении экспериментальному животному (собаке) 5 мг 1% раствора серотонина адипината на 20 мл физиологического раствора до и после пережатия печеночно-двенадцатиперстной связки на 30 минут [Горпинич А.Б., Симоненков А.П., Копаев О.В., Горелик С.Г., Новомлинец В.В., Лунева Н.В., Должиков А.А., Привалова И.Л. Способ коррекции ишемического поражения печени в условиях ее обескровливания // Патент на изобретение №2134576 от 11.03.998]. Серотонина адипинат - гемостатическое средство, влияющее на эндогенную вазомоторику. Указанный способ предусматривает оценку степени гепатоцеллюлярного повреждения на основании морфологических изменений в печени.

Известно, что в условиях ишемии-реперфузии печени в нарушениях микроциркуляции большую роль играют тромбоциты. В терминальных артериолах и постсинусоидальных венулах наблюдается роллинг и адгезия тромбоцитов, связанная с увеличением тромбиновой активности и выходом тромбоцитов из системной циркуляции [Khandoga A., Biberthaler P., Messmer K. et al. // Microvasc. Res. - 2003. - Vol. 65. - №2. - P. 71-77].

Таким образом, недостатком способа является то, что в условиях венозного полнокровия в системе воротной вены и нарушений системной гемодинамики, вызванных временной окклюзией печеночно-двенадцатиперстной связки, использование серотонина адипината, стимулирующего агрегацию и адгезию тромбоцитов [Регистр лекарственных средств России РЛС 2008. - М., «РЛС-2008», 2007. - С. 800-801], может способствовать образованию тромбоцитарных тромбов.

Наиболее близким аналогом является способ коррекции ишемических нарушений, возникших в результате реперфузионной травмы печени, путем введения внутрибрюшинно препарата L-норвалина за 30 минут до начала ишемии в дозе 10 мг/кг с последующим повторным введением такой же дозировки препарата сразу же по окончании ишемии печени в сочетании с дистантным ишемическим прекондиционированием [Лопатин Д.В., Покровский М.В., Локтионов А.Л., Конопля А.И., Денисюк Т.А., Цепелева С.А. Способ коррекции ишемических нарушений, возникших в результате реперфузионной травмы печени // Патент на изобретение №2479872 от 11.01.2012]. Данный способ позволяет достичь снижения гепатоцитолиза, однако не лишен ряда недостатков:

1. Использование дистантного ишемического прекондиционирования, эффект которого реализуется посредством эндогенных систем стресс-протекции за счет собственных гуморальных, нейрогенных и внутриклеточных адаптационных механизмов организма [Лихванцев В.В., Мороз В.В., Гребенчиков О.А., Гороховатский Ю.И., Заржецкий Ю.В., Тимошин С.С., Левиков Д.И., Шайбакова В.Л. Ишемическое и фармакологическое прекондиционирование // Общая реаниматология. - 2012. - Т. VIII. - №1. - С. 61-66], что снижает достоверность получаемых результатов. Также применение этого метода несет потенциальную опасность ишемических эпизодов для патологически измененных тканей [Sommer С. Ischemic preconditioning: postischemic structural changes in the brain // J. Neuropathol. Exp. Neurol. - 2008. - Vol. 67. - P. 85-92]. Кроме того, самостоятельное введение L-норвалина в аналогичной дозировке - 10 мг/кг - не приводило к выраженной коррекции гепатоцеллюлярного повреждения [Лопатин Д.В., Алехин С.А., Покровский М.В., Назаренко П.М., Трошин В.П., Колмыков Д.И., Иванова Л.В., Шапошников А.А., Жилякова Е.Т., Луценко В.Д., Сперанский С.Л., Куликовский В.Ф., Олейник Н.В., Сухотерин И.В. Коррекция ишемических и реперфузионных повреждений печени при хирургических вмешательствах с использованием метода дистантного прекондиционирования и фармакологической защиты L-норвалином // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - №4 (133). - С. 171-175].

2. Технологическая сложность, обусловленная дополнительным применением метода дистантного ишемического прекондиционирования и необходимостью повторного введения препарата.

3. Получение результата через 24 часа после проведения эксперимента, что в данной ситуации в большей степени отражает активацию собственных адаптационных резервов организма, чем действие самого препарата, таким образом также снижая достоверность получаемых результатов.

Задачи изобретения: сокращение времени эксперимента за счет исключения применения дистантного ишемического прекондиционирования, снижение трудоемкости, повышение достоверности.

Техническим результатом изобретения является способ снижения гепатоцитолиза в условиях частичной сосудистой изоляции печени в эксперименте, включающий использование ингибитора киназы пируватдегидрогеназы - дихлорацетата натрия - в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного, разведенного в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия.

Фармакологическое действие дихлорацетата натрия обусловлено тем, что он в присутствии АДФ вызывает изменения в активном центре второй изоформы киназы пируватдегидрогеназы, что приводит к ее неконкурентному ингибированию и последующей активации мультиферментного пируватдегидрогеназного комплекса (МПДК) [Stacpoole P.W., Kurtz T.L., Han Z., Langaee Т. Role of dichloroacetate in the treatment of genetic mitochondrial diseases // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2008. - Vol. 60. - №13-14. - P. 1478-1487]. Прямое увеличение активности МПДК и частичное торможение окисления длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях в результате увеличения концентрации малонил-КоА, которое сопровождается усилением окисления пирувата, оказывает цитопротективный эффект при ишемии различных органов и тканей. Дихлорацетат натрия восстанавливает функциональную связь между гликолизом и окислительным декарбоксилированием пирувата в митохондриях, нейтрализует закисление цитоплазмы, оптимизирует расход кислорода в условиях ишемии, что важно, поскольку окисление глюкозы в митохондриях требует на 10-12% меньше кислорода, чем окисление жирных кислот при синтезе такого же количества АТФ. При этом полностью образование лактата не подавляется, что необходимо для регенерации окисленных коферментов и протекания анаэробного гликолиза. Однако содержание восстановленных коферментов существенно возрастает, что поддерживает функционирование антиоксидантной системы в условиях интенсификации образования свободных радикалов в момент реперфузии и обеспечивает быстрое восстановление энергетического метаболизма [Мануйлов A.M., Попов К.А., Цымбалюк И.Ю., Литвинова М.Г., Хубиева Ф.У. Биологическая активность дихлорацетата натрия: концепции и механизмы (обзор литературы) // Кубанский научный медицинский вестник. - 2016. - №6 (161). - С. 157-165].

Способ позволяет достичь снижения гепатоцитолиза за счет активации ферментных систем аэробного дыхания в клетке; обеспечивает уменьшение трудоемкости и сокращение времени эксперимента за счет исключения применения дистантного ишемического прекондиционирования; способствует повышению достоверности получаемых данных за счет минимизации возможности влияния на получаемый результат собственных систем стресс-протекции организма.

Сущностью способа является то, что снижение гепатоцитолиза вызывают путем интраперитонеального введения животному дихлорацетата натрия, разведенного в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного.

Исследование выполнено на 60 крысах-самцах, разделенных на три группы:

1) интактные (n=20) - псевдооперированные крысы;

2) ишемически-реперфузионное повреждение (n=20) - выполнялась лапаротомия, выделение и пережатие печеночно-двенадцатиперстной связки на 15 минут;

3) цитопротекция дихлорацетатом натрия (n=20) - выполнялась лапаротомия, введение интраперитонеально дихлорацетата натрия по предложенному способу, выделение и пережатие печеночно-двенадцатиперстной связки на 15 минут.

Способ осуществляют следующим образом.

Эксперименты проводят на крысах массой 200-230 г. Все манипуляции выполняют под общим обезболиванием Золетилом в дозе 15 мг на 1 кг внутримышечно. Производят лапаротомию и интраперитонеально вводят дихлорацетат натрия в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного, разведенный в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, затем сосудистый зажим типа "Бульдог" накладывают на печеночно-двенадцатиперстную связку на 15 минут. После окончания моделирования частичной сосудистой изоляции печени через 15 минут реперфузии производят забор крови животных из каудальной полой вены для последующего определения в плазме уровней аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Исследования выполняют на спектрофотометре "UNICO-2800" (США) с использованием коммерческих наборов реактивов фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Санкт-Петербург, Россия). Количественный анализ показателей АЛТ, ACT и ЛДГ производят кинетическим фотометрическим методом при длине волны 340 нм, температуре инкубации 25°C и длине оптического пути 10 мм. Для определения активностей АЛТ и ACT в пробирку вносят 500 мкл рабочего реагента и 50 мкл образца, ЛДГ - 500 мкл рабочего реагента и 10 мкл образца соответственно. Пробы тщательно перемешивают, инкубируют 60 секунд, измеряют оптическую плотность и повторяют измерение 3 раза: через 1, 2 и 3 минуты. Расчеты производят следующим образом. Вычисляют среднее изменение оптической плотности за 1 минуту (ΔЕ/мин), далее определяют активность АЛТ, ACT и ЛДГ в плазме крови (А) в Ед./л по формуле: A=ΔE/мин×F, где F - фактор для расчета, значение которого при длине волны 340 нм составляет для АЛТ и ACT - 1746, а для ЛДГ - 8095 соответственно.

При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. При сравнении используют метод сравнения гипотез по критерию Манна-Уитни. Различия считают достоверными при p<0,05.

Степень развития гепатоцитолиза оценивают по разности активностей АЛТ, ACT и ЛДГ плазмы крови животных. Активность АЛТ у животных, перенесших ишемически-реперфузионное повреждение печени, превышала показатели интактной группы в 4,6 раз. Активность ACT у животных, перенесших ишемически-реперфузионное повреждение печени, превышала показатели интактной группы в 2,8 раза. Активность ЛДГ у животных, перенесших ишемически-реперфузионное повреждение печени, превышала показатели интактной группы в 13,2 раза.

В группе, животным которой вводили дихлорацетат натрия в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного, отмечалось достоверное снижение показателей, характеризующих гепатоцитолиз. Так, активность АЛТ уменьшилась в 2,03 раза в сравнении с группой с ишемически-реперфузионным повреждением, ACT - в 1,65 раза и ЛДГ - в 3,18 раз соответственно (см. таблицу).

Примечание: ¹ - p<0,05 - в сравнении с интактными, ² - p<0,05 - в сравнении с ишемически-реперфузионным повреждением.

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать снижение гепатоцитолиза в условиях частичной сосудистой изоляции печени при интраперитонеальном введении дихлорацетата натрия в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного.

Примеры конкретного выполнения

Пример №1. Крыса 24. Операция 05.09.2016 г.

В операционной учебно-производственного отдела (вивария) ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России под общим обезболиванием Золетилом (15 мг на 1 кг внутримышечно) выполнена лапаротомия, выделение и пережатие сосудистым зажимом типа «Бульдог» печеночно-двенадцатиперстной связки на 15 минут. После 15-минутного периода реперфузии произведен забор крови из каудальной полой вены для определения активностей в плазме АЛТ, ACT, ЛДГ. Животное выведено из эксперимента.

Результаты биохимических исследований: АЛТ - 106,36 Ед./л, ACT - 132,21 Ед./л, ЛДГ - 1902,45 Ед./л. Полученные результаты указывают на достоверное повреждение клеток печени, сопровождающееся гепатоцитолизом.

Пример №2. Крыса 38. Операция 14.09.2016 г.

В операционной учебно-производственного отдела (вивария) ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России под общим обезболиванием Золетилом в дозировке 15 мг на 1 кг внутримышечно выполнена лапаротомия, выделена и пережата сосудистым зажимом типа «Бульдог» на 15 минут печеночно-двенадцатиперстная связка. По окончании 15-минутного периода реперфузии произведен забор крови из каудальной полой вены для определения активностей в плазме АЛТ, ACT и ЛДГ. Животное выведено из эксперимента.

Результаты биохимических исследований: АЛТ - 108,23 Ед./л, ACT - 130,47 Ед./л, ЛДГ - 1952,64 Ед./л. Полученные результаты указывают на достоверное повреждение клеток печени, сопровождающееся гепатоцитолизом.

Пример №3. Крыса 43. Операция 23.09.2016 г.

В операционной учебно-производственного отдела (вивария) ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России под общим обезболиванием Золетилом (15 мг на 1 кг внутримышечно) выполнена лапаротомия, интраперитонеально введен дихлорацетат натрия в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного, разведенный в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, выделена и пережата сосудистым зажимом типа «Бульдог» печеночно-двенадцатиперстная связка на 15 минут. После 15-минутного периода реперфузии произведен забор крови из каудальной полой вены для определения в плазме активностей АЛТ, ACT, ЛДГ. Животное выведено из эксперимента.

Результаты биохимических исследований: АЛТ - 52,23 Ед./л, ACT - 81,07 Ед./л, ЛДГ - 605,78 Ед./л. Полученные результаты указывают на достоверное уменьшение повреждения клеток печени на фоне введения дихлорацетата натрия, сопровождающееся снижением гепатоцитолиза.

Пример №4. Крыса 56. Операция 20.10.2016 г.

В операционной учебно-производственного отдела (вивария) ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России под общим обезболиванием Золетилом (15 мг на 1 кг внутримышечно) выполнена лапаротомия, интраперитонеально введен дихлорацетат натрия в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного, разведенный в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, выделена и пережата сосудистым зажимом типа «Бульдог» печеночно-двенадцатиперстная связка на 15 минут. По окончании 15-минутного периода реперфузии произведен забор крови из каудальной полой вены для определения в плазме активностей АЛТ, ACT и ЛДГ. Животное выведено из эксперимента.

Результаты биохимических исследований: АЛТ - 53,84 Ед./л, ACT - 79,23 Ед./л, ЛДГ - 614,25 Ед./л. Полученные результаты указывают на достоверное уменьшение повреждения клеток печени на фоне введения дихлорацетата натрия, сопровождающееся снижением гепатоцитолиза.

Предлагаемый способ позволяет:

- снизить гепатоцитолиз в условиях частичной сосудистой изоляции печени;

- уменьшить трудоемкость и время проведения исследования путем сокращения экспериментальных этапов (за счет отсутствия дополнительного применения метода дистантного ишемического прекондиционирования).

Таким образом, способ является менее трудоемким и позволяет достичь снижения гепатоцитолиза за счет активации дихлорацетатом натрия ферментных систем аэробного дыхания в клетке.

Работа выполнена при поддержке государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (от 28.01.2015 г., ч. 1, раздел 1) «Осуществление прикладных научных исследований, в том числе проведение доклинических исследований лекарственных средств и клинических исследований лекарственных препаратов».

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для снижения гепатоцитолиза в условиях временного выключения печени из кровообращения. Для этого моделируют на крысе ишемически-реперфузионное повреждение печени путем пережатия печеночно-двенадцатиперстной связки на 15 минут. При этом с целью снижения гепатоцитолиза после лапаротомии проводят интраперитонеальное введение дихлорацетата натрия, разведенного в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного. Способ позволяет достичь снижения гепатоцитолиза за счет активации ферментных систем аэробного дыхания в клетке, способствует повышению достоверности получаемых данных за счет минимизации возможности влияния на результат собственных систем стресс-протекции организма. 1 табл., 4 пр.

Способ снижения гепатоцитолиза в условиях частичной сосудистой изоляции печени в эксперименте, включающий моделирование на крысах ишемически-реперфузионного повреждения печени путем пережатия печеночно-двенадцатиперстной связки на 15 минут и введение препарата, отличающийся тем, что снижение гепатоцитолиза вызывают путем интраперитонеального введения животному после лапаротомии дихлорацетата натрия, разведенного в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела животного.