ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ ГЛАЗА Российский патент 2018 года по МПК A61K38/39 A61P27/02 

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека и может быть использовано в медицине, фармацевтике, ветеринарии для регенерации роговицы глаза, но не ограничивается указанной областью. Более детально, заявленное техническое решение относится к пептидам, получаемым из коллагена, нативного коллагена, денатурированного коллагена, гидролизованного коллагена, желатина, используемым для лечения повреждений и дегенеративных заболеваний роговицы глаза.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлены биополимеры и их аналоги для лечения заболеваний и повреждений роговицы глаза, относящиеся, например, к классам полисахаридов, гликопротеинов, пептидов. Заявленное техническое решение относится к классу пептидов.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту РФ №2272635 - фармакологически активная субстанция для лечения заболеваний и повреждений роговицы глаза, включающая полисахариды. Сущностью являются сульфатированные гликозаминогликаны, отличающееся тем, что она (субстанция) содержит сухую смесь компонентов - натриевой соли кератансульфата и натриевой соли хондроитинсульфата, общее количество которых в смеси составляет не менее 98 мас. %, при следующем соотношении компонентов, мас. %: натриевая соль кератансульфата - 2-90, натриевая соль хондроитинсульфата - 8-96, физиологический раствор - остальное.

Существенный недостаток известной субстанции по патенту РФ №2272635 заключается в том, что она (субстанция) является, преимущественно, средством для снятия воспаления роговицы глаза за счет антиэкксудативного и дегидратирующего действия, то есть не обладает собственной регенеративной активностью по отношению к поврежденным тканям роговицы, таким образом, изобретение не предназначено для эффективного лечения повреждений роговицы глаза. Указанные недостатки существенно ограничивают область применения.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлены офтальмологическое лекарственное средство и способ его применения, по патенту РФ №2220687, сущностью технического решения являются офтальмологическое лекарственное средство и способ его применения, в отношении своего состава включающее гликопротеин и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что оно содержит в качестве гликопротеина сывороточный гликопротеин, выделенный из сыворотки крови млекопитающих изоэлектрическим фокусированием в градиенте рН с отбором необходимой фракции, растворимый в насыщенном растворе сульфата аммония, имеющий изоэлектрическую точку в диапазоне рН от 4,5 до 5,1 и кажущуюся молекулярную массу от 10 до 37 килодальтон и, возможно, хлористый кальций при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Сывороточный гликопротеин 1⋅10^-16 - 1⋅10^-9

Кальций хлористый 0-0,01

Носитель - остальное.

Средство по патенту РФ №2220687 применяют для лечения заболеваний и повреждений роговицы глаза путем инсталляции (закапывания) на роговицу глаза 2-7 кратно в сутки в течение 10-15 суток.

Существенными недостатками известного изобретения являются трудоемкость процесса выделения сывороточного гликопротеина методом изоэлектрического фокусирования, высокий риск передачи инфекции из крови млекопитающих, многократная (от 20 до 105 в течение полного курса лечения) инсталляция на роговицу глаза, свидетельствующая о кратковременности действия офтальмологического средства, его низкой регенеративной активности и, как следствие, необходимости длительного лечения. Кроме того, вышеуказанное средство обладает присущей сывороточным гликопротеинам низкой стабильностью при хранении. Указанные недостатки существенно ограничивают область применения.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен ряд относящихся к классу пептидов аналогов, используемых для регенерации роговицы глаза.

Наиболее активными среди средств пептидной природы для регенерации роговицы глаза являются факторы роста, приведенные далее.

Например, известен эпидермальный фактор роста (далее по тексту - ЭФР) по патенту на изобретение US 4959353 А «Ускорение заживления повреждений роговицы глаза с помощью эпидермального фактора роста человека, полученного с помощью технологии рекомбинантной ДНК». Сущностью технического решения является способ лечения повреждений роговицы глаза, включающий применение рекомбинантного эпидермального фактора роста (далее по тексту - ЭФР), где указанный ЭФР получают путем создания генетической конструкции, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной природному ЭФР.

Существенным недостатком изобретения является высокая трудоемкость и длительность процесса получения ЭФР, получаемого технологией рекомбинантных ДНК и используемого в составе средства для заживления роговицы глаза. Указанные недостатки существенно ограничивают область применения.

Известен тромбоцитарный фактор роста (далее по тексту - ТФР) по патенту на изобретение US 5955436 А «Использование фактора роста тромбоцитов для усиления заживления ран», сущностью является способ ускорения заживления роговицы глаза при локальном введении определенного количества ТФР в зону повреждения в дозе, эффективной для ускорения заживления раны.

Существенным недостатком изобретения является высокая трудоемкость и длительность процесса получения ТФР, производимого способами генной инженерии, и, как следствие, высокая себестоимость содержащего ТФР ранозаживляющего средства. Недостаток существенно ограничивает область применения.

Наиболее близким к заявленному техническому решению, выбранное заявителем в качестве прототипа, совпадающему с техническим решением по назначению, является композиция по патенту на изобретение US 5942487 А, сущностью являются композиция на основе фактора стволовых клеток (далее по тексту - ФСК) и способ стимулирования регенерации эпителия роговицы глаза, заключающийся в нанесении композиции на поверхность поврежденной роговицы в терапевтически эффективной дозе.

Таким образом, композиция по прототипу US 5942487 А содержит терапевтически эффективное количество ФСК и фармацевтически приемлемый носитель, содержит, по меньшей мере, один пептид из числа: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2), инсулин, интерферон, интерлейкин, фактор роста кератиноцитов (KGF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β). Способ применения изобретения по прототипу US 5942487 А заключается в нанесении вышеуказанной композиции на основе ФСК в терапевтически эффективной дозе и фармацевтически приемлемого носителя на поверхность роговицы для лечения повреждений роговицы глаза.

Существенным недостатком прототипа является необходимость применения в составе композиции на основе ФСК вышеуказанных природных факторов роста для достижения терапевтического эффекта - регенерации роговицы глаза.

Существенный недостаток природных факторов роста заключается в том, что в тканях и клетках высших организмов факторы роста содержатся в низкой концентрации, например, в бычьем гипофизе - 5 мг/кг [1], в сыворотке крови человека - 604-780 пг/мл [2]. Вследствие этого, процесс выделения природных факторов роста в промышленном производстве технологически и экономически не обоснован. Технологически возможно получение аналогов природных факторов роста - рекомбинантных факторов роста - генно-инженерными и биотехнологическими способами. Указанные способы включают использование генетических конструкций (ДНК-плазмид) и микроорганизмов-продуцентов [3].

Существенными недостатками рекомбинантных факторов роста являются:

1) высокая трудоемкость, большое число стадий и длительность технологического процесса, включающего, по меньшей мере, получение генетической конструкции, создание и культивирование генно-модифицированных микроорганизмов, многоэтапное выделение и очистку целевого продукта;

2) необходимость высокой степени очистки целевого продукта от компонентов бактериальных клеток;

3) высокий риск токсичности, иммуногенности, аллергенности целевого продукта, обусловленных остаточными примесями, например бактериальными токсинами;

4) низкий выход целевого продукта (факторов роста).

В целом, недостатками известного технического решения - по прототипу (US 5942487 А), является то, что для регенерации роговицы глаза требуются рекомбинантные факторы роста, характеризующиеся:

- необходимостью получения, культивирования и сохранения генно-модифицированных микроорганизмов;

- необходимостью многоэтапного, трудоемкого и длительного выделения факторов роста из микроорганизмов;

- низким содержанием факторов роста в микроорганизмах и, как следствие, низкой производительностью процесса выделения;

- необходимостью многоэтапной и трудоемкой очистки факторов роста от опасных компонентов микроорганизмов;

- необходимостью многократного применения по назначению (для регенерации эпителиальной ткани роговицы глаза).

Указанные недостатки существенно ограничивают область применения прототипа (US 5942487 А) в медицине, фармацевтике и ветеринарии.

Целью предлагаемого изобретения является разработка офтальмологического средства, характеризующегося сопоставимой с факторами роста регенеративной активностью и устраняющего недостатки прототипа US 5942487 А, предназначенного для регенерации роговицы глаза при повреждениях и дегенеративных заболеваниях.

Цели достигают применением офтальмологического средства, содержащего пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена. Офтальмологическое средство применяют в составе офтальмологической формы из числа: глазной раствор, глазные капли, глазная мазь.

В качестве источника полипептидных цепей коллагена используют нативный коллаген, денатурированный коллаген, гидролизованный коллаген, желатин. Т.е. заявленное офтальмологическое средство может быть получено из любых вышеуказанных видов коллагена. Вышеуказанные виды коллагена могут являться промышленным продуктом крупнотоннажной переработки тканей млекопитающих.

Заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, обладает существенными преимуществами по сравнению с прототипом, а именно:

- исключает необходимость использования генно-модифицированных микроорганизмов и, как следствие, не требует их (микроорганизмов) получения, культивирования и сохранения;

- исключает необходимость выполнения многоэтапного, трудоемкого и продолжительного процесса выделения факторов роста из микроорганизмов, который требует значительного расхода реагентов;

- исключает необходимость многоэтапной и трудоемкой очистки факторов роста от иммуногенных и токсичных компонентов микроорганизмов, например эндотоксинов;

- требует меньшей частоты применения, например - три раза в сутки в течение четырех суток (12 процедур) против не менее двадцати процедур (два раза в сутки в течение десяти суток) по прототипу при сопоставимой эффективности процесса регенерации тканей роговицы.

Преимущества заявленного технического решения по сравнению с прототипом существенно расширяют область его (предлагаемого изобретения) применения по назначению: в медицине, фармацевтике и ветеринарии.

Далее заявителем приведен пример технологии производства заявленного офтальмологического средства.

Используют в качестве источника полипептидных цепей коллагена желатин, например желатин производства Sigma-Aldrich (США). Проводят гидролитическое расщепление полипептидных цепей коллагена одним протеолитическим ферментом с образованием офтальмологического средства, содержащего пептиды с различной молекулярной массой (далее по тексту - ММ), идентифицируемой стандартными методами, например масс-спектрометрией (см. ПРИМЕР ПЕРВЫЙ). Более детально, заявленное офтальмологическое средство содержит пептиды с ММ в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон и не содержит исходные полипептиды коллагена, имеющие ММ массу более 100 кДа.

Проводят фракционирование и очистку офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена одним из известных способов, например диализом, хроматографией, ультрафильтрацией.

Таким образом, заявленное техническое решение не требует трудоемких, длительных и энергозатратных процессов, используемых по прототипу, таких как получение и культивирование микроорганизмов, лизиса клеток, выделения и очистки продукта (от нецелевых компонентов микроорганизмов).

Заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, обладает высокой регенеративной активностью, не уступающей регенеративной активности факторов роста по прототипу US 5942487 А, а именно обладает, по меньшей мере, высокой митогенной активностью, т.е. способностью усиливать пролиферацию (деление и рост) клеток млекопитающих и человека (см. ПРИМЕР ВТОРОЙ), а также усиливает функциональную активность клеток, например стимулирует биосинтез коллагена и других белков внеклеточного матрикса (см. ПРИМЕР ТРЕТИЙ).

Исследование свойств предлагаемого изобретения - офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена - выявило его способность усиливать регенерацию тканей роговицы глаза (соединительной ткани стромы и эпителиальной ткани), например - в модели химического (щелочного) ожога роговицы глаза крысы (см. ПРИМЕР ПЯТЫЙ и ПРИМЕР ШЕСТОЙ).

Далее заявителем описаны примеры применения заявленного технического решения по назначению и его (заявленного технического решения) преимущества.

Для проявления терапевтического эффекта офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена - достаточной является однократная в сутки в течение 7 суток инсталляция на роговицу глаза, тогда как при применении прототипа требуется многократная (4 раза в сутки) инсталляция в течение не менее 3 суток, а суммарное число инсталляций в течение терапевтического курса - не менее 12-ти (см. описание прототипа).

В совокупности, приведенная заявителем информация позволяет сделать вывод о том, что применение по назначению заявленного технического решения в качестве офтальмологического средства является более эффективным, по сравнению с аналогом, наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и результату, достигаемому при его использовании - прототипом по патенту на изобретение US 5942487 А.

Кроме изложенного выше, к характерным особенностям заявленного технического решения следует отнести способность офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена образовывать однородные стабильные растворы, вязкие гели и эмульсии, его совместимость с известными вспомогательными веществами и возможность изготовления на его основе различных препаративных форм, например глазных капель, гелей, мазей, не ограничиваясь ими.

Способность заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена усиливать процесс регенерации роговицы не ограничивается его применением в качестве терапевтического средства только при травматическом повреждении, например химическом ожоге (по ПРИМЕРАМ ПЯТОМУ и ШЕСТОМУ). Заявленное офтальмологическое средство применимо при иных патологиях, обусловленных, например недостаточной пролиферативной и/или синтетической активностью фибробластов и/или эпителиальных клеток.

Известны заболевания глаза, например кератоконус, проявляющиеся в дегенеративных изменениях структуры роговицы, например в истончении стромы и эпителия, изменении формы (сферичности) роговицы, приводящие к снижению остроты зрения [4]. В случае указанных дегенеративных изменений структуры роговицы офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена способен устранять дефекты роговицы за счет стимулирующей активности на пролиферацию и синтетическую активность клеток роговицы.

С учетом экспериментально выявленных свойств, пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена может быть применен в качестве заявленного офтальмологического средства при травматических повреждениях и дегенеративных заболеваниях роговицы глаза.

Заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, имеет следующие существенные преимущественные признаки перед прототипом:

- не требует получения генетических конструкций, получения, культивирования и сохранения генетически модифицированных микроорганизмов, и, как следствие, имеет пониженную трудоемкость и меньшую продолжительность процесса получения,

- не требует многоэтапного и трудоемкого процесса выделения целевого продукта;

- не содержит токсичных и иммуногенных примесей и, следовательно, не требует многоэтапной и трудоемкой очистки целевого продукта;

- требует меньшей кратности и длительности применения по назначению (для регенерации тканей роговицы).

Цели достигают применением офтальмологического средства для регенерации роговицы глаза, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена.

Офтальмологическое средство для регенерации роговицы глаза, включающее пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена.

Офтальмологическое средство по п. 1 в составе офтальмологической формы из числа: глазной раствор, глазные капли, глазная мазь.

Заявленное техническое решение поясняется следующими материалами – Фиг. 1-6. Комментарии к Фигурам - в тексте описания.

На Фиг. 1 показаны результаты масс-спектрометрического анализа заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, по горизонтальной оси показан параметр масса/заряд для входящих в состав заявленного офтальмологического средства пептидов, численно соответствующий значениям ММ пептидов, по вертикальной оси - интенсивность параметра отношения массы к заряду. Фиг. 1 демонстрирует наличие в офтальмологическом средстве, в сущности своей - пептидов с ММ в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена и отсутствие исходных полипептидов коллагена, имеющих ММ массу более 100 килодальтон.

На Фиг. 2 показано максимальное стимулирующее влияние заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена на пролиферацию мышиных фибробластов линии NIH 3Т3 в сравнении с факторами роста (в процентах относительно контроля), где 1 - заявленное офтальмологическое средство, 2 - FGF-2 (фактор роста фибробластов), 3 - EGF (эпидермальный фактор роста). Фиг. 2 демонстрирует, что заявленное офтальмологическое средство стимулирует пролиферацию фибробластов на 42,8%, что соизмеримо с действием вышеуказанных факторов роста, т.е. заявленное офтальмологическое средство обладает митогенной активностью, соизмеримой с активностью факторов роста.

На Фиг. 3 (4 фото) показаны светлопольные микрофотографии, окрашенных гистологическими красителями (пикриновой кислотой, анилиновым синим) NIH 3Т3 фибробластов, выращенных в питательной среде с добавлением заявленного офтальмологического средства (фото 2), или фактора роста фибробластов (FGF-2) (фото 3), или эпидермального фактора роста (EGF) (фото 4) по сравнению с необработанными (контрольными) фибробластами (фото 1) по истечении 48 часов культивирования. Фиг. 3 демонстрирует, что заявленное офтальмологическое средство стимулирует биосинтетическую активность фибробластов до уровня, сопоставимого с действием факторов роста.

На Фиг. 4 (2 фото) показаны светлопольные микрофотографии срезов роговицы глаза крысы, обработанной заявленным офтальмологическим средством и без обработки (инсталляции), через 7 суток после химического (щелочного) ожога. Окраска: железный гематоксилин, увеличение 400×. Фото 1 - контроль (ожог без последующей инсталляции), фото 2 - ожог и инсталляция заявленного офтальмологического средства. Фигурной скобкой выделена строма роговицы, стрелкой указана передняя пограничная (боуменова) мембрана. Фиг. 4 демонстрирует, что заявленное офтальмологическое средство приводит к восстановлению поврежденной структуры роговицы по сравнению с необработанной роговицей.

На Фиг. 5 показаны результаты измерения толщины регенерирующего эпителия (среднее значение) через 7 суток после химического (щелочного) ожога, где: 1 - контроль (ожог без инсталляции), 2 - ожог и инсталляция заявленного офтальмологического средства. Фиг. 5 демонстрирует, что заявленное офтальмологическое средство (2) приводит к увеличению толщины эпителия (на 23%) по сравнению с эпителием необработанной роговицы (1).

На Фиг. 6 показаны результаты подсчета числа слоев эпителиоцитов в составе регенерирующего эпителия (среднее значение) через 7 суток после химического ожога, где 1 - контроль (ожог без инсталляции), 2 - ожог и инсталляция заявленного офтальмологического средства. Фиг. 6 демонстрирует существенное увеличение числа слоев эпителиоцитов (от 1,65 слоев в контроле до 2,5 слоев после инсталляции заявленного офтальмологического средства), т.е. существенный прирост числа клеточных слоев (на 52%) по сравнению с эпителием необработанной роговицы (1).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР ПЕРВЫЙ, показывающий характеристики заявленного офтальмологического средства.

Заявителем в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ приведены источники полипептидных цепей коллагена и физико-химические характеристики заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена.

Используют коллаген, например бычий коллаген производства Sigma-Aldrich (США). Способ реализуют следующим образом: растворяют коллаген в подкисленном водном растворе, например 2,5% соляной кислоте, нейтрализуют раствор коллагена раствором гидроксида натрия (0,1 моль/л) и уравновешивают буферным раствором, например фосфатно-солевым буферным раствором (далее по тексту - ФСБ) с рН 7,4.

Используют желатин, например бычий желатин производства Sigma-Aldrich (США). Готовят водный раствор желатина, например в ФСБ с концентрацией желатина не более 20,0 мас. %

Проводят гидролитическое расщепление коллагена и/или желатина обработкой различными факторами, например ферментами, например трипсином из поджелудочной железы свиньи (РАА Laboratories) с концентрацией, например 0,5%, и температуре, например плюс 37°С. Останавливают гидролитическое расщепление, например путем добавления соляной кислоты (1,0 моль/л). Проводят очистку продуктов гидролитического расщепления одним из известных способов, например диализом - через избирательно проницаемую полимерную мембрану.

В результате реализации указанной выше последовательности действий получают заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды из полипептидных цепей коллагена, при этом способы очистки пептидов не ограничиваются указанным выше.

Определяют ММ пептидов в заявленном офтальмологическом средстве, например масс-спектрометрией матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации [5] с использованием масс-спектрометра MALDI-TOF/TOF ultrafleXtrme (Bruker Daltonik GmbH, Германия).

На Фиг. 1 показаны результаты масс-спектрометрического анализа заявленного офтальмологического средства, в сущности своей пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, по горизонтальной оси показан параметр масса/заряд для входящих в состав заявленного офтальмологического средства пептидов, численно соответствующий значениям ММ пептидов, по вертикальной оси - интенсивность параметра отношения массы к заряду. Как видно из Фиг. 1, заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды из полипептидных цепей коллагена, содержит пептиды с ММ в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон (см. стрелки на Фиг. 1) и не содержит исходные полипептиды коллагена с ММ более 100 килодальтон.

Приведенный пример демонстрирует, что заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, например бычьего коллагена, содержит смесь пептидов из коллагена с ММ в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон, т.е. вышеуказанные молекулярные массы пептидов меньше ММ полипептидов коллагена. Аналогичное заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена - получают при использовании источников, полипептидных цепей коллагена, например желатин, известный также как денатурированный (гидролизованный) коллаген [6], без ограничения им.

ПРИМЕР ВТОРОЙ, показывающий стимулирующее влияние заявленного офтальмологического средства на пролиферацию клеток (в сравнении с факторами роста).

Используют фибробласты линии NIH 3Т3 от компании АТСС (США). Культивируют фибробласты асептически в стандартных условиях: питательная среда α-МЕМ, 10% эмбриональная телячья сыворотка, атмосфера 5% CO₂, температура плюс 37°С [7]. Фибробласты рассеивают в 96-луночные планшеты в количестве 2000 клеток в каждой лунке и культивируют 24 часа. Полученное по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена добавляют к фибробластам до конечной концентрации не менее 1 нг/мл и культивируют клетки в течение 72 часов. Добавляют в лунки в качестве препарата сравнения основной фактор роста фибробластов человека (далее по тексту - FGF-2) и эпидермальный фактор роста (далее по тексту - EGF), например производства ООО «Компания «ПанЭко» (Россия). FGF-2 и EGF являются одними из наиболее биологически активных природных факторов роста [1, 2].

Далее оценивают число живых клеток в лунках - показатель пролиферативной (митотической) активности клеток - с помощью МТТ-теста [8] на микропланшетном анализаторе Infinite 200 PRO (Tecan, Швейцария) - по величине оптического сигнала продукта восстановления реагента МТТ (Promega, США). Уровень стимуляции пролиферативной активности клеток рассчитывают в процентах от контроля (необработанные клетки).

На Фиг. 2 показано максимальное стимулирующее влияние заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, на пролиферацию мышиных фибробластов линии NIH 3Т3 в сравнении с факторами роста (в процентах относительно контроля), где 1 - заявленное офтальмологическое средство, 2 - FGF-2, 3 - EGF.

Таким образом, экспериментально выявлено, что максимальная стимуляция пролиферативной активности клеток заявленным офтальмологическим средством, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена составляет 42,8% (Фиг. 2, см. 1), а максимальная стимуляция пролиферативной активности препаратами сравнения FGF-2 (Фиг. 2, см. 2) и EGF (Фиг. 2, см. 3) и составляет 53,5% и 29,8% соответственно. Таким образом, заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, проявляет стимулирующий эффект на пролиферативную активность фибробластов, соразмерный с действием природных факторов роста. Это показывает, что по своей митогенной активности заявленное офтальмологическое средство не уступает используемым в прототипе (US 5942487 А) факторам роста. При этом заявленное офтальмологическое средство характеризуется отсутствием имеющихся у прототипа недостатков, при этом устраняет недостатки, так как не требует применения генно-инженерных (рекомбинантных) микроорганизмов (см. ПРИМЕР ПЕРВЫЙ).

ПРИМЕР ТРЕТИЙ, показывающий стимулирующее влияние заявленного офтальмологического средства на синтетическую активность клеток (в сравнении с факторами роста).

Выявляют стимулирующее действие полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявленного офтальмологического средства на биосинтетическую активность клеток, например - фибробластов линии NIH 3Т3 от компании АТСС (США). Выполняют действия по ПРИМЕРУ ВТОРОМУ, но при этом культивируют фибробласты в 24-х луночных планшетах с добавлением заявленного офтальмологического средства, или основного фактора роста фибробластов человека (FGF-2), или эпидермального фактора роста (EGF) в течение 48 часов. Фиксируют клетки раствором 4% параформальдегида и окрашивают выявляющими коллаген гистохимическими красителями, например - последовательно пикриновой кислотой и анилиновым синим [9]. Проводят микроскопическое исследование окрашенных фибробластов, например на световом микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 400×.

На Фиг. 3 (4 фото) показаны светлопольные микрофотографии, окрашенных гистологическими красителями (пикриновой кислотой, анилиновым синим) NIH 3Т3 фибробластов, выращенных в питательной среде с добавлением заявленного офтальмологического средства (фото 2), или фактора роста фибробластов (FGF-2) (фото 3), или эпидермального фактора роста (EGF) (фото 4) по сравнению с необработанными (контрольными) фибробластами (фото 1) по истечении 48 часов культивирования. Из Фиг. 3, фото 2 (заявленное офтальмологическое средство) и фото 1 (контроль) видно, что заявленное офтальмологическое средство (фото 2) повышает интенсивность гистохимического окрашивания фибробластов по сравнению с контролем (фото 1), так как клетки на фото 2 более интенсивно окрашены по сравнению с клетками на фото 1. Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем эффекте заявленного офтальмологического средства на внутриклеточный синтез белков, например предшественников коллагена. При этом заявленное офтальмологическое средство (фото 2) проявляет сопоставимый стимулирующий эффект на биосинтетическую активность фибробластов с природными факторами роста - FGF-2 (фото 3) и EGF (фото 4). Таким образом, по своему стимулирующему эффекту на биосинтетическую активность клеток заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена не уступает используемым в прототипе (US 5942487 А) факторам роста. При этом заявленное офтальмологическое средство характеризуется отсутствием имеющихся у прототипа недостатков, при этом заявленное офтальмологическое средство устраняет их, так как не требует применения генно-инженерных (рекомбинантных) микроорганизмов (см. ПРИМЕР ПЕРВЫЙ).

ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ, показывающий предлагаемые терапевтические формы заявленного офтальмологического средства.

Готовят различные офтальмологические формы, содержащие полученное по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявленное офтальмологическое средство, в сущности своей - пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена. Готовят водный раствор заявленного офтальмологического средства путем его растворения в очищенной воде или физиологическом солевом растворе, например 0,9% растворе хлорида натрия. Вводят в состав раствора заявленного офтальмологического средства один из известных антимикробных агентов, обладающих бактерицидным, бактериостатическим и/или противогрибковым действием или комбинацию антимикробных агентов. В состав раствора заявленного офтальмологического средства вводят вспомогательные вещества из числа: консерванты; стабилизаторы; увлажняющие средства, например гликоли; кератопротекторы; любриканты, например полисахариды, производные полисахаридов, поливиниловый спирт; мукоадгезивные полимеры; желатин; амфифильные поверхностно-активные вещества; эмульгаторы; обезболивающие средства; биологически активные вещества, например аминокислоты, витамины. Стерилизуют раствор заявленного офтальмологического средства любым из известных способов [10]. Применяют стерильный раствор заявленного офтальмологического средства в виде глазных капель путем инсталляции на роговицу глаза.

Смешивают раствор заявленного офтальмологического средства с одним из известных гелеобразующих полимеров, например производным целлюлозы. Вводят в состав полученного геля вспомогательные вещества из числа: консерванты; стабилизаторы; увлажняющие средства, например гликоли; кератопротекторы, любриканты, например полисахариды, производные полисахаридов, поливиниловый спирт; мукоадгезивные полимеры; желатин; амфифильные поверхностно-активные вещества; эмульгаторы; обезболивающие средства; биологически активные вещества, например аминокислоты, витамины. Стерилизуют гель (мазь) заявленного офтальмологического средства известными способами. Применяют стерильный гель (мазь) заявленного офтальмологического средства в виде глазного геля (мази) путем инсталляции на роговицу глаза.

Приведенные выше офтальмологические формы заявленного офтальмологического средства: раствор, капли, гель (мазь) не ограничиваются изготовлением готовой формы на водорастворимой основе, но также могут быть изготовлены на липофильной основе, например в виде эмульсии, или в твердой форме, например в высушенном (сублимированном) виде.

ПРИМЕР ПЯТЫЙ, показывающий стимулирующее влияние заявленного офтальмологического средства на регенерацию соединительнотканной стромы роговицы глаза.

Выявляют стимулирующее действие заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена на регенерацию тканей роговицы глаза, например соединительнотканной стромы. Эксперимент проводят на лабораторных животных, например на 12 здоровых половозрелых белых крысах-самках Вистар массой 250±20 г, полученных из ООО «Питомник Российской академии медико-технических наук». Животных наркотизируют внутрибрюшинно раствором хлоралгидрата в дозе 340 мг/кг массы животного. Вызывают химический, например - щелочной, ожог роговицы глаза. Для этого на поверхность глаза накладывают двухслойный диск фильтровальной бумаги диаметром (далее по тексту - ∅) 5,0 мм, пропитанный 0,25 молярным раствором гидроксида натрия, и выдерживают в течение 30 сек. Удаляют диск, промывают глаз 0,9% раствором хлорида натрия.

На роговицу одного сожженного глаза инсталлируют 1 раз в сутки в течение 7 суток заявленное офтальмологическое средство, роговицу правого глаза используют в качестве контроля (без инсталляции).

Извлекают глазные яблоки, фиксируют в растворе 10% формалина (ООО Биовитрум, Россия) в ФСБ в течение 24 часов, вырезают роговицы и заключают в парафин по стандартной методике [9]. Получают парафиновые срезы, например на микротоме НМ 355S (Thermo Scientific, Германия) с микротомными лезвиями Feather S35 (Feather, Япония) и окрашивают по стандартной методике [9] гистологическими красителями, например железным гематоксилином (ООО БиоВитрум, Россия). Исследуют влияние заявленного офтальмологического средства на восстановление морфологического строения роговицы методом светлопольной микроскопии на микроскопе, например Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия). Количественный анализ проводят с использованием программного пакета Axio Vision для Observer Z1 версия 4.8.2 (Carl Zeiss, Германия). Для подсчета числа клеток в строме роговицы, измерения толщины эпителия и стромы роговицы используют микрофотографии гистологических срезов при увеличении 400×.

На Фиг. 4 (2 фото) показаны светлопольные микрофотографии срезов роговицы глаза крысы, обработанной заявленным офтальмологическим средством и без обработки (инсталляции), через 7 суток после химического (щелочного) ожога. Окраска: железный гематоксилин, увеличение 400×. Фото 1 - контроль (ожог без последующей инсталляции), фото 2 - ожог и инсталляция заявленного офтальмологического средства. Фигурной скобкой выделена строма роговицы, стрелкой указана передняя пограничная (боуменова) мембрана.

Как видно из Фиг. 4 (фото 2) заявляемое офтальмологическое средство приводит к формированию стромы (см. фигурную скобку), состоящей из параллельно расположенных пластинок коллагеновых фибрилл без пустот (щелей), в отличие от контроля (с пустотами) (Фиг. 4, фото 1, см. фигурную скобку). Наличие пустот между организованными в виде пластинок коллагеновыми волокнами является признаком дефектной роговицы - дефект проявляется в снижении остроты зрения, вплоть до полной потери зрения [4]. Формирование стромы с большим количеством коллагеновых пластинок и, следовательно, более плотной стромой является преимущественным признаком заявленного офтальмологического средства. Таким образом, результаты свидетельствуют о существенном стимулирующем действии заявленного офтальмологического средства на процесс регенерации поврежденной стромы роговицы.

ПРИМЕР ШЕСТОЙ, показывающий стимулирующее влияние заявленного офтальмологического средства на регенерацию эпителия роговицы глаза.

Выявляют стимулирующее действие заявленного офтальмологического средства на регенерацию тканей роговицы глаза, например эпителиальной ткани. Выполняют действия по ПРИМЕРУ ПЯТОМУ и после моделирования щелочного ожога исследуют эпителиальную ткань при действии заявленного офтальмологического средства.

На Фиг. 4 (фото 2) видно, что инсталляция заявленного офтальмологического средства приводит к формированию передней пограничной (боуменовой) мембраны (указана стрелкой) и пластов эпителиальных клеток, при этом эпителий более интенсивно (темно) окрашен, чем без обработки заявленным офтальмологическим средством (Фиг. 4, фото 1). Интенсивность окрашивания регенерирующей эпителиальной ткани роговицы гистологическими красителями является критерием пролиферативной активности клеток и интенсивности репаративных процессов.

На Фиг. 5 показаны результаты измерения толщины регенерирующего эпителия (среднее значение) через 7 суток после химического (щелочного) ожога, где 1 - контроль (ожог без последующей инсталляции), 2 - ожог и инсталляция заявленного офтальмологического средства. Из Фиг. 5 видно, что заявленное офтальмологическое средство (2) приводит к увеличению толщины эпителия (на 23%) по сравнению с эпителием необработанной роговицы (1).

На Фиг. 6 показаны результаты подсчета числа слоев эпителиоцитов в составе регенерирующего эпителия (среднее значение) через 7 суток после химического ожога, где 1 - контроль (ожог без инсталляции), 2 - ожог и инсталляция заявленного офтальмологического средства.

Как видно из Фиг. 6, заявленное офтальмологическое средство (1) приводит к увеличению числа клеточных слоев (от 1,65 слоев в контроле до 2,5 слоев после инсталляции заявленного офтальмологического средства), то есть наблюдается прирост числа клеточных слоев (на 52%) по сравнению с эпителием необработанной роговицы (1).

То есть из Фиг. 5 и Фиг. 6 видно, что увеличение толщины эпителия роговицы при применении заявленного офтальмологического средства происходит не за счет увеличения объема клеток, а вследствие интенсивной пролиферации клеток и увеличения числа клеточных слоев, что согласуется с наличием митогенной активности у заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена (ПРИМЕР ВТОРОЙ). Таким образом, результаты показывают существенное стимулирующее действие заявленного офтальмологического средства на процессы пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток, необходимые для регенерации роговицы.

Таким образом, ПРИМЕРЫ ПЯТЫЙ и ШЕСТОЙ подтверждают высокую регенеративную активность заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена в отношении тканей роговицы глаза, обусловленную его (заявленного офтальмологического средства) отличительными преимущественными признаками и позволяют применять заявленное офтальмологическое средство для регенерации тканей роговицы глаза.

Применение заявленного офтальмологического средства, в сущности своей пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена не ограничивается лечением химического (щелочного) ожога роговицы, но также может применяться при иных травмах роговицы глаза (термических ожогах, механических травмах, хирургических вмешательствах). Кроме того, благодаря установленной регенеративной активности (см. ПРИМЕРЫ ВТОРОЙ, ЧЕТВЕРТЫЙ, ПЯТЫЙ, ШЕСТОЙ) заявленное офтальмологическое средство может быть использовано для лечения заболеваний роговицы глаза, обусловленных недостаточной пролиферативной и/или синтетической активностью фибробластов стромы и клеток эпителия. Известен ряд заболеваний глаза, например кератоконус, сопровождающихся дегенеративными изменениями структуры роговицы, например истончением стромы и эпителия, изменением сферичности роговицы [4], и, как следствие, ухудшением зрения. Таким образом, заявленное офтальмологическое средство может быть применено и как офтальмологическое средство при дегенеративных заболеваниях роговицы глаза различной этиологии.

Приведенные примеры получения и применения предлагаемого изобретения показывают высокую эффективность заявленного офтальмологического средства, в сущности своей - пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена для регенерации роговицы. Таким образом, посредством получения и применения заявленного офтальмологического средства заявителем достигнута цель, устранены недостатки прототипа (US 5942487 А):

- разработано офтальмологическое средство, в сущности своей пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена, относящееся к классу пептидов и отличающееся значительно меньшими трудоемкостью, числом этапов и продолжительностью способа получения по сравнению с факторами роста по прототипу (ПРИМЕР ПЕРВЫЙ);

- более детально, заявленное техническое решение не требует получения и применения генетических конструкций, получения, культивирования и сохранения генно-модифицированных организмов (ПРИМЕР ПЕРВЫЙ);

- более детально, заявленное техническое решение характеризуется отсутствием нецелевых и токсичных компонентов микроорганизмов (ПРИМЕР ПЕРВЫЙ);

- вследствие вышеизложенного заявленное офтальмологическое средство не содержит опасных компонентов микроорганизмов, таких как токсины, вызывающих иммунные, аллергические и воспалительные реакции, следовательно, обладает безопасностью для организма;

- при наличии высокой, соизмеримой с прототипом (факторами роста), регенеративной активности пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена (ПРИМЕРЫ ВТОРОЙ, ТРЕТИЙ, ПЯТЫЙ, ШЕСТОЙ), заявленное офтальмологическое средство при этом требует меньшего числа инсталляций на роговицу глаза для проявления терапевтического эффекта (ПРИМЕРЫ ПЯТЫЙ, ШЕСТОЙ).

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемым к изобретениям, так как при анализе идентифицированных источников информации не выявлены иные офтальмологические средства для регенерации роговицы глаза с признаками, совпадающими с признаками, приведенными в формуле. Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», т.к. не является очевидным для специалистов в данной области техники, а полученные экспериментальные данные о применении пептидов с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена в качестве офтальмологического средства свидетельствуют о существенных отличительных признаках предлагаемого изобретения, преодолевающих вышеуказанные недостатки известных аналогов и прототипа (факторов роста), и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, поскольку его можно реализовать в промышленном производстве с использованием крупнотоннажного сырья - источников полипептидных цепей коллагена и в деятельности организаций здравоохранения, ветеринарии посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Gospodarowicz D. Purification of a fibroblast growth factor from bovine pituitary. The Journal of Biological Chemistry. 1975. 250: 2515-2520.

2. Joh Т., Itoh M., Katsumi K., Yokoyama Y., Takeuchi Т., Kato Т., Wada Y., Tanaka R.. Physiological concentrations of human epidermal growth factor in biological fluids: use of a sensitive enzyme immunoassay. Clinica Chimica Acta. 1986. 158(1): 81-90.

3. Demaina A.L., Vaishnavb P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances. 2009. 27(3): 297-306.

4. Romero-Jimenez M., Santodomingo-Ribido J., Wolffsohn J.S. Keratoconus: a review. Cont. Lens Anterior Eye. 2010. 33(4): 157-66.

5. Gundry R., White M., Murray C.I. Preparation of Proteins and Peptides for Mass Spectrometry Analysis in a Bottom-Up Proteomics Workflow. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2009. 34(5): 121-25.

6. Schrieber R., Gareis H. Gelatine Handbook: Theory and Industrial Practice, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany. 2007. doi: 10.1002/9783527610969. ch2.

7. Todaro G., Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J. Cell Biol. 1963. 17: 299-313.

8. Berridge M., Herst P., Tan A. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 2005. 11: 127-152.

9. Микроскопическая техника: Руководство / Под. ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.

10. Subhashini G., Meenakshi S. Systematic Review on Sterilization Methods of Implants and Medical Devices. International Journal of Chem. Tech. Research. 2015. 8(2): 897-911.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для регенерации роговицы глаза. Офтальмологическое средство для регенерации роговицы глаза включает пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена. Указанное средство используется в составе офтальмологической формы из числа: глазной раствор, глазные капли, глазная мазь. Использование изобретения позволяет повысить эффективность регенерации роговицы глаза при повреждениях и дегенеративных заболеваниях. 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

1. Офтальмологическое средство для регенерации роговицы глаза, включающее пептиды с молекулярной массой от 3600 до 10000 дальтон из полипептидных цепей коллагена.

2. Офтальмологическое средство по п. 1 в составе офтальмологической формы из числа: глазной раствор, глазные капли, глазная мазь.