Способ получения лимбальных стволовых клеток в коллагеновом гидрогеле Российский патент 2023 года по МПК A61F9/01 C12N5/797 

Изобретение относится к биотехнологии и офтальмологии, и может быть использовано для получения лимбальных стволовых клеток в коллагеновом гидрогеле.

Роговица является главным компонентом оптических сред глаза и обладает на 4/5 преломляющей силой глаза. Эпителий роговицы является многослойным неороговевающим и находится в постоянном обновлении в физиологическом состоянии и при ответе на повреждение, это обеспечивается как лимбальными стволовыми клетками (ЛСК) роговичной части лимба в нише Вогта, так и мезенхимальным стволовыми клетками лимба. При повреждении ЛСК, нарушении их микроокружения (лимбальной ниши) под воздействием химических, механических, аутоиммунных и др. факторов развивается лимбальная недостаточность (ЛН). Это сопровождается неоваскуляризацией и потерей прозрачности роговицы, нарушением ее эпителиального слоя, патологическим разрастанием конъюнктивы и, как следствие, снижением остроты зрения (Deng S.X., Borderie V., Chan С.С., et al. Global consensus on definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency // Cornea. 2019. Vol.38, N 3. P. 364-375. doi: 10.1097/ICO.0000000000001820, Deng S.X., Kruse F., Gomes J.A.P., et al. Global consensus on the management of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2020;39: 1291-1302, Ramachandran C., Basu S., Sangwan V.S., et al. Concise review: the coming of age of stem cell treatment for corneal surface damage // Stem Cells Transl Med. 2014. Vol.3, N 10. P. 1160-1168. doi: 10.5966/sctm.2014-0064). Лечение ЛН включает комплекс мероприятий, направленных на регенерацию эпителия и восстановление функции лимбальной ниши. На данный момент существуют как терапевтические, так и хирургические подходы для решения данной проблемы.

Консервативные методы подразумевают симптоматическое лечение с помощью различных препаратов (слезозаменители, противовоспалительные), лечебных контактных линз, а также дериватов аутокрови, которые содержат различные факторы роста, стимулирующие эпителизацию роговицы и активирующие провоспалительные цитокины. К недостаткам консервативного лечения следует отнести отсутствие таргетного воздействия на пораженную ткань и возможности обеспечить длительный терапевтический эффект. Кроме того, необходимость частых инсталляций приводит к снижению качества жизни пациента. В связи с этим современный акцент лечения ЛН смещается к хирургическим техникам, в том числе, включающим лимбальную трансплантацию и трансплантацию культивированных клеток.

Известен способ получения трансплантата для лечения лимбальной недостаточности (патент на изобретение RU 2720470 от 30.04.2020), включающий механическую очистку донорской склеры, двукратную последовательную обработку перекисью водорода, гидроксидом аммония, вымачивание, заморозку, нагревание, фрагментирование, культивирование на их концентрированной клеточной суспензии мультипатентных мезенхимальных стволовых клеток и прогениторных клеток для использования при лечении ЛН.

Недостатком данного способа является то, что данный трансплантат является децеллюлированным фрагментом донорской аллогенной склеры, а донорская ткань сохраняет в своем составе часть антигенов и может вызывать реакцию организма реципиента на трансплантат.

Известен способ получения лимбальных клеток для лечения лимбальной недостаточности с использованием тканеинженерной конструкции, состоящей из культивированных ЛСК, выращенных на фидерном слое из фибробластов, и децеллюлированной амниотической мембране (патент на изобретение CN 1635115 от 06.07.2005). Недостатком данного способа является относительная трудность при подготовке трансплантата. Кроме того, источниками для получения фибробластов и ЛСК являются фибробласты из стромы лимба новорожденных, свежий донорский глаз, контралатеральный здоровый глаз пациента или глаз родственников, при этом высок риск передачи инфекции при использовании амниотической мембраны.

Известен способ получения трансплантата для лечения ЛН (Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency. / J.J. Chae, W.M. Ambrose, F.A. Espinoza et al. // Acta Ophthalmologica. - 2015; 93(l):e57-e66). с использованием коллагена Vitrigel, который содержит низкую концентрацию коллагена - 0.5% - в качестве носителя для культивирования ЛСК при лечении предварительно созданной тотальной ЛН, вызванной химическим ожогом.

Недостатком данного способа является то, что вследствие низкой концентрация коллагена носитель обладает неудовлетворительными биомеханическими свойствами, что приводит к возникновению затруднений во время операции при выполнении хирургических манипуляций. В связи с этим для фиксации, использовали шовное подшивание к склере и дополнительный фибриновый клей, что является коммерческим малодоступным материалом и обладает невысокой адгезионно-когезионной прочностью и относительно низкими механическими свойствами.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ того же назначения с культивированием ЛСК на основе коллагенового носителя (Безушко А.В., Дубовиков А.С., Куликов А.Н., Чурашов С.В., Черныш В.Ф., Блинова М.И., Александрова О.И., Хорольская Ю.И., Гаврилюк И.О., Карпович В.В., Даниличев В.Ф. Применение коллагенового скаффолда и амниотической мембраны с культивируемыми стволовыми клетками лимба для устранения лимбальной недостаточности: экспериментальное исследование. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2019. - No 2. С. 54-57). Недостатком данного способа является использование желатина, изготовленного из коллагена I типа с низкой концентрацией (2 мг/мл), который быстро биодеградирует и не способен длительно поддерживать оптимальную среду для культивированных ЛСК. Кроме того, из-за высокого содержания воды данный носитель обладает более низкими биомеханическими свойствами.

Задачей изобретения является дальнейшая разработка способов получения ЛСК на основе коллагенового гидрогели.

Техническим результатом предлагаемого способа является получение культивированных клеток с максимально сохранными характеристиками и пролонгированной биодеградаций.

Технический результат достигается за счет получения лимбальных клеток двухэтапным ферментированием с диспазой и трипсином и культивированием на биополимерном носителе на основе коллагена I типа Viscoll РА 8. Из-за особенности строения лимба с погруженной вглубь лимбальной нишей во время забора биоптат лимбальной ткани выделяют с участком склеры, из стромы лимбальной ткани далее при культивировании выделяются мезенхимальные стволовые клетки лимба, которые регулируют функции ЛСК и будут поддерживать клеточный гомеостаз в лимбе после трансплантации при лечении лимбальной недостаточности.

Двойное ферментирование позволяет быстро получать большой объем клеточной массы: на первом этапе при помощи диспазы весь эпителий отделяется от стромы по линии базальной мембраны. При втором ферментировании с помощью трипсина происходит разделение ткани на отдельные клетки в суспензии.

Гидрогель с повышенной концентрацией нативного, химически не модифицированного коллагена Viscoll РА 8 (http://imtek.ru/catalog/products/cell-culture/viscoll/Viscoll_Kit_for_3D_bioprinting_and_cell_culture/) позволяет воспроизвести архитектуру, близкую к естественной нише лимбальных стволовых клеток. Клетки при этом находятся не на поверхности, а распределены в структуре гидрогеля.

Совокупность приемов позволяет получить ЛК с максимальным выходом, выживаемостью и сохранением свойств культивированных клеток. Предложенным способом были получены лимбальные клетки в составе гидрогеля на 5 кроликах-самцах породы «шиншилла» с исходной массой тела 2,5-3,0 кг.

Для оценки характеристик культивированных клеток, в том числе жизнеспособности, пролиферативной активности и фенотипа клеток, проводили окраску витальными красителями (Calcein AM и Heoest) и иммунофлюоресцентный анализ. На всех этапах культивирования оценивали морфологию клеток, для наблюдений использовали фазово-контрастную микроскопию.

На 1-й день клетки начали адгезировать ко дну чашки Петри. На 10 сутки культивирования образовывали неплотный монослой, а к 14 суткам - плотный субконфлуентный слой. На 14 сутки культивированные клетки были сняты с поверхности культурального флакона, и после подсчета было выявлено, что в культуре к этому моменту уже 0.5×10⁶ клеток на 1 мл.

По результатам витального окрашивания Calcein-AM было показано, что выживаемость клеток на мембране являлась высокой и составляла 92,0±2,6%. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что в культуре наблюдалась высокая концентрация пролиферирующих клеток, положительно окрашивающихся на белок Ki67. При оценке фенотипа полученных клеточных культур было выявлено, что большинство клеток окрашивалось на K3/12 или Vimentin. Около 20% клеток были положительными по маркеру Р63 и формировали характерные круглые колонии, что свидетельствовало о наличии в клетках, полученных из биоптата, популяции ЛСК. Иммунофлуоресцентный фенотип клеток также оставался сохранным при культивировании в составе гидрогелевой коллагеновой конструкции. Кроме того, была выявлена относительно высокая пролиферативность культивированных клеток. Полученные предложенным способом лимбалные клетки в составе коллагенового гидрогеля, можно использовать с целью лечения ЛН, а также в качестве источника ЛСК для восстановления любых дефектов эпителия роговицы путем трансплантации в зону повреждения.

Способ осуществляют следующим образом.

Биоптат лимбальной ткани выделяют с участком склеры, ферментируют с помощью 2% раствора диспазы при 37°С в течение 1 часа. Фрагментируют и ферментируют повторно с помощью 0,25% раствора трипсина в EDTA при 37°С в течение 20 мин. Полученную клеточную суспензию культивируют в условиях 5% СО₂ при 37°С в течение 14 суток. 1 мл суспензии, содержащей 0.5×10⁶ клеток, помещают в смесь, состоящую из 1 мл раствора коллагена Viscoll РА 8, 1 мл нейтрализующего буферного раствора, затем ресуспендируют. Образовавшийся гидрогель с клетками в его составе культивируют в условиях 5% СО₂ при 37°С в течение 7 суток.

Пример.

Кролику-самцу породы шиншилла №1, массой 3,5 кг, оперировали левый глаз. Выполнили субконъюнктивальную анестезию 2% лидокаином - 0.5 мл. Произвелили разрез вдоль лимба протяженностью 2 часа. Конъюнктиву и тенноновую оболочку отсепаровали, провели гемостаз. Фрагмент ткани размером 2×4 мм вырезали с помощью остроконечного офтальмологического лезвия, отступая 1 мм со стороны роговицы и конъюнктивы в глубину 200 мкм. Операцию заканчивали наложением двух узловых швов и инъекцией 0,3 мл 0,4% дексаметазона.

Удаленную ткань, как это принято, промыли раствором Хенкса, содержащим антибиотики (гентамицин 0,16 мг/мл и стрептомицин 1 мг/мл) и амфотерицин В (5 мг/мл). Затем биоптат поместили в 2% раствор диспазы в DMEM и ферментировали в течение 1 ч при 37°С. Затем осуществляли фрагментацию и промывали раствором EDTA с последующим вторичным ферментированием раствором 0,25% трипсина в EDTA в течение 20 мин. при 37°С. Трипсин инактивировали средой DMEM/F12, содержащей сыворотку (10% FBS-Fetal Bovine Serum (эмбриональная телячья сыворотка)), после чего пипетировали фрагменты лимба с последующим центрифугированием при 400 g (об./мин) в течение 6 мин. Супернатант сливали, остаток с нерастворившимися кусочками лимба и отдельными клеточными конгломератами ресуспендировали, как это принято, в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 нг/мл rEGF, 5 мл готового реагента Insulin-Transferrin-Selenium, 10000 U/mL пенициллина/стрептомицина. Клетки культивировали в условиях 5% CO2 при 37°С в течение 14 суток. Среду меняли каждые два дня. Клетки подсчитывали на автоматическом счетчике клеток ТС20. На 14 сутки культивированные клетки были сняты с поверхности культурального флакона. 1 мл раствор коллагена (Viscoll РА 8) тщательно перемешивали с 1 мл нейтрализующего буферного раствора (Tris 80 мМ, Н Fne 220 мкг/мл, DMEM) и в полученную смесь добавляли 1 мл суспензии клеток с концентрацией 0.5×10⁶ клеток на 1 мл, конечную смесь перемешивали до гомогенного состояния. Затем переливали по 2 мл на стерильную чашку Петри d=90 мм, дополнительно сдавливая стерильной чашкой Петри d=35 мм легкими движениями для выравнивания толщины диска гидрогеля. После формирования дисков из гидрогеля с ЛСК добавляли в чашки 10-15 мл питательной среды и дополнительно культивировали в течение 7 суток. Полученные ЛСК в составе гидрогеля исследовали для оценки их характеристик.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать ЛСК с сохранными свойствами, что создает предпосылки для их использования в лечении лимбальной недостаточности.

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии и офтальмологии, и может быть использовано для получения лимбальных стволовых клеток. Биоптат лимбальной ткани выделяют с участком склеры, ферментируют с помощью 2% раствора диспазы при 37°С в течение 1 часа. Фрагментируют и ферментируют повторно с помощью 0,25% раствора трипсина в EDTA при 37°С в течение 20 мин. Полученную клеточную суспензию культивируют в условиях 5% СО₂ при 37°С в течение 14 суток. 1 мл суспензии, содержащей 0.5×10⁶ клеток, помещают в смесь, состоящую из 1 мл раствора коллагена Viscoll РА 8, 1 мл нейтрализующего буферного раствора, затем ресуспендируют. Образовавшийся гидрогель с клетками в его составе культивируют в условиях 5% СО₂ при 37°С в течение 7 суток. Изобретение обеспечивает получение культивированных клеток с максимально сохранными характеристиками и пролонгированной биодеградацией, что создает предпосылки для их использования в лечении лимбальной недостаточности. 1 пр.

Способ получения лимбальных стволовых клеток, включающий получение биоптата лимбальной ткани, ферментирование, фрагментирование и культивирование, отличающийся тем, что биоптат лимбальной ткани выделяют с участком склеры, ферментируют с помощью 2% раствора диспазы при 37°С в течение 1 часа, после фрагментирования ферментируют повторно с помощью 0,25% раствора трипсина в EDTA при 37°С в течение 20 мин, полученную клеточную суспензию культивируют в условиях 5% СО₂ при 37°С в течение 14 суток, затем 1 мл суспензии, содержащей 0.5×10⁶ клеток, помещают в смесь, состоящую из 1 мл раствора коллагена Viscoll РА 8, 1 мл нейтрализующего буферного раствора, затем ресуспендируют и образовавшийся гидрогель с клетками в его составе дополнительно культивируют в условиях 5% СО₂ при 37°С в течение 7 суток.