Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения Российский патент 2018 года по МПК A61K38/00 A61P17/00 

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека и может быть использовано в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии для регенерации тканей организма.

Известны природные пептиды и их синтетические аналоги, стимулирующие процессы регенерации тканей кожи при травматических повреждениях и дегенеративных заболеваниях.

Известны синтетические линейные и циклические пептиды - фрагменты эпидермального фактора роста человека, обладающие ранозаживляющей и противоопухолевой активностями [1]. Существенными недостатками [1] являются трудоемкость этапов химического синтеза и очистки пептидов, токсичность применяемых для синтеза реактивов и растворителей, что ограничивает область применения аналога [1].

Известны природные пептиды - факторы роста эндотелия сосудов, например, изоформа С, стимулирующая деление клеток, образование кровеносных сосудов и, как следствие, усиливающая регенерацию тканей [2]. Существенным недостатком [2] является трудоемкость процесса получения пептидов, требующего генетическую модификацию клеток-продуцентов, многоэтапное выделение и очистку целевых пептидов [2], что требует привлечения высококвалифицированных специалистов и специализированного оборудования.

Недостатки существенно ограничивают области применения [1] и [2].

Наиболее близким к заявляемому изобретению, прототипом, является препарат пептидов, получаемых в результате ферментативного расщепления коллагена и/или желатина смесью не менее двух протеолитических ферментов (эндопептидаз). Препарат по прототипу [3] состоит из разных фракций пептидов из коллагена в диапазоне молекулярных масс (далее по тексту - ММ) от 600 до 3500 дальтон (далее по тексту - Да) со средней ММ в диапазоне от 1700 до 2300 Да. Отношение значений максимальной и минимальной молекулярных масс пептидов по прототипу [3] составляет (3500:600=5,8 раза), что характеризует препарат по прототипу [3] как полифракционный. Полифракционный состав пептидов по прототипу [3], значительно различающихся по ММ и, следовательно, по структуре и регенеративной активности пептидных молекул является существенным недостатком [3]. Полифракционный состав и, следовательно, пониженная гомогенность препарата по прототипу [3] приводит к его недостаточной регенеративной активности для целевого применения. Повышению регенеративной активности способствует высокая гомогенность по молекулярной массе пептидов в препарате, используемом, например - в медицине для регенерации тканей кожи.

Существенным недостатком прототипа [3] является необходимость применения не менее двух типов эндопептидаз для получения препарата пептидов. Применение нескольких (не менее двух) типов эндопептидаз для получения препарата пептидов усложняет его реализацию в промышленном масштабе и ограничивает область применения прототипа [3].

Препарат по прототипу [3] вводят в организм человека для улучшения состояния кожных покровов перорально. Не показана полезность [3] при иных способах применения, например - при наружном. Не выявлен механизм действия и не оценена безопасность (токсичность) препарата по прототипу [3], что ограничивает его применение в качестве лекарственного средства, например - при регенерации тканей кожи. В совокупности, недостатки прототипа [3] существенно ограничивают области его применения.

Для расширенного применения пептидного препарата из коллагена в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии существенными факторами являются:

- оптимальный для проявления регенеративной активности препарата диапазон ММ пептидов и, следовательно, их (пептидов) структур;

- монофракционность (близкие значения ММ) состава препарата;

- возможность получения препарата путем упрощенного однофакторного гидролитического расщепления коллагена;

- выявленные механизм действия и безопасность (токсичность) препарата пептидов.

Целью предполагаемого изобретения является создание биоактивного пептидного препарата с отличным от прототипа и более оптимальным для ускоренной регенерации тканей кожи диапазоном молекулярных масс (ММ) пептидов из коллагена, упрощение производства и расширение области применения препарата.

Цели достигают созданием пептидного препарата из коллагена для регенерации тканей кожи, состоящего из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Способ получения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат получают путем гидролитического расщепления коллагена с образованием фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Способ применения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат применяют для регенерации тканей кожи животных и человека.

Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируют примеры.

ПРИМЕР ПЕРВЫЙ, показывающий способ получения пептидного препарата из бычьего коллагена

Изобретение реализуют с использованием в качестве субстрата (полипептида) для гидролитического расщепления, например - бычьего денатурированного коллагена (желатина), например - производства компании Gelita (Германия). Проводят анализ молекулярных масс (структуры) желатина стандартным методом электрофореза в полиакриламидном геле [4]. По результатам анализа желатина подтверждают наличие в нем типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции, соответствующей одиночным (отдельным) полипептидным цепям коллагена (Фиг. 1). На Фиг. 1 показана электрофореграмма стандартов молекулярных масс белков в диапазоне ММ от 10 до 250 килодальтон (ряд 1, Фиг. 1) и основных фракций коллагена - альфа-, бета- и гамма-фракции (ряд 2, Фиг. 1). При наличии типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции, процесс получения пептидного препарата продолжают.

Бычий денатурированный коллаген растворяют при нагревании, например - при плюс 60°C, в буферном растворе, например - в фосфатно-солевом буферном растворе (далее по тексту - ФСБ) при рН в диапазоне значений рН от 6,0 до 8,0 с концентрацией (коллагена) не более 30,0% для обеспечения оптимальной вязкости раствора. Проводят гидролитическое однофакторное расщепление коллагена в приготовленном растворе одним из известных способов, например, реакцией с одной из эндопептидаз, например - с трипсином из поджелудочной железы млекопитающих в концентрации не более 3,0%. Расщепление коллагена проводят при контролируемой температуре, например - при плюс 37°C. По завершению гидролитического расщепления эндопептидазу инактивируют, например - добавлением раствора 1 М соляной кислоты. Проводят очистку продуктов гидролитического расщепления одним из известных способов (методов), например:

1) диализа, например - через полупроницаемую полимерную мембрану; или

2) гель-проникающей хроматографии, например - с использованием сорбента марки Сефадекс на хроматографе BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories, США); или

3) микрофильтрации, например - на установке тангенциальной поточной фильтрации Cogent М1 TFF System (Merck Millipore, США).

Способы (методы) очистки продуктов гидролитического расщепления не ограничиваются вышеперечисленными.

В результате получают фракцию пептидов из коллагена с молекулярной массой преимущественно (не менее 95%) в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон (Да), изначально - в виде прозрачного водного раствора, без запаха. Полученная фракция пептидов представляет собой заявляемый пептидный препарат из коллагена (далее по тексту - препарат), где не менее 95% молекул обладают молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 Да. На Фиг. 2 показана электрофореграмма стандартов молекулярных масс белков в диапазоне ММ от 10 до 250 килодальтон (ряд 1, Фиг. 2) и заявляемого пептидного препарата (ряд 2, Фиг. 2). Пептидный препарат на электрофореграмме (ряд 2, Фиг. 2) образует единственную полосу, соответствующую отдельной фракции пептидов. На Фиг. 3 показан масс-спектр пептидного препарата, полученный методом матрично-ашвированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ-массспектрометрия) на спектрометре MALDI-TOF/TOF ultrafleXtrme (Bruker Daltonik GmbH, Германия). На Фиг. 3 по горизонтальной оси показан параметр масса/заряд (m/z) для пептидных молекул (заявляемого препарата), численно соответствующий значениям их (пептидных молекул) ММ, по вертикальной оси - интенсивность параметра m/z. Результаты (Фиг. 2 и Фиг. 3) доказывают, что полученный по заявляемому изобретению пептидный препарат состоит из одной гомогенной фракции пептидов - продуктов гидролитического расщепления коллагена - с ММ преимущественно в диапазоне от 3600 до 10000 Да. При значениях массы молекул пептидов вне пределов указанного диапазона (при ММ менее 3600 и при ММ более 10000 Да) препарат проявляет существенно меньшую активность, чем препарат с молекулами пептидов в пределах указанного диапазона масс (от 3600 до 10000 Да).

Вышеуказанные молекулярные массы пептидов в заявляемом препарате существенно отличаются от молекулярных масс пептидов по прототипу [3], следовательно - пептиды в заявляемом препарате отличаются от прототипа [3] по числу входящих в их состав аминокислот, по своей структуре и, следовательно - по химическим и биологическим свойствам.

В отличие от прототипа [3] заявляемый пептидный препарат состоит из одной гомогенной (однородной) фракции пептидов с существенно меньшим отношением значений максимальной и минимальной масс пептидов (10000:3600=2,8 раза), чем у прототипа (3500:600=5,8 раза) [3], что характеризует заявляемый препарат как монофракционный по составу пептидов.

В отличие от прототипа [3] пептидный препарат по заявляемому изобретению получают однофакторным (одностадийным) гидролитическим расщеплением коллагена, что существенно упрощает процесс производства (препарата) и реализацию заявляемого способа в промышленном масштабе.

Полученный по заявляемому способу пептидный препарат стерилизуют, например - путем фильтрации через полимерные стерилизационные фильтры с размером пор не более 400 нм. Для длительного (не менее 6 месяцев) сохранения структуры и регенеративной активности (препарата) заявляемый препарат замораживают и хранят при температуре, например - при минус 24°C. Для более длительного (не менее 24 месяцев) сохранения структуры и регенеративной активности (препарата) заявляемый препарат высушивают с использованием одного из известных способов, например - путем лиофилизации на установке Free Zone Plus (Labconco, США), и хранят при температуре, например - плюс 4…8°C. Заявляемый препарат упаковывают и хранят в стерильных емкостях. Заявляемый препарат применяют по целевому назначению. Заявляемый препарат вводят в состав лекарственных форм. Заявляемый препарат вводят в состав лечебно-косметических форм.

Заявляемый способ получения пептидного препарата из коллагена не ограничивается использованием бычьего денатурированного коллагена в качестве исходного субстрата для гидролитического расщепления. Способ реализуют с применением любых иных субстратов (полипептидов), содержащих типичные для коллагена полипептидные цепи (Фиг. 1) и их фрагменты.

В совокупности, вышеуказанные преимущества заявляемого пептидного препарата, по сравнению с прототипом [3], существенно упрощают и расширяют возможности промышленного производства заявляемого препарата, расширяют области его (заявляемого препарата) применения, например - в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии для регенерации тканей кожи.

ПРИМЕР ВТОРОЙ, показывающий способ получения пептидного препарата из свиного коллагена

Изобретение реализуют с использованием в качестве субстрата для гидролитического расщепления иного полипептида, например - свиного нативного коллагена производства компании Sigma-Aldrich (США). Подтверждают аналогичным описанному в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем наличие в свином коллагене типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции (Фиг. 1). При наличии типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции, процесс получения пептидного препарата продолжают.

Пептидный препарат из свиного коллагена получают аналогичным описанному в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем. Пептидный препарат из свиного коллагена характеризуют аналогичными, описанными в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ, методами электрофореза в полиакриламидном геле и МАЛДИ-масс-спектроскопии. Результаты показывают, что полученный по заявляемому способу пептидный препарат из свиного коллагена состоит из одной гомогенной фракции пептидов - продуктов гидролитического расщепления коллагена - с ММ в диапазоне от 3600 до 10000 Да.

Таким образом, получаемый описанным в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем пептидный препарат из бычьего коллагена характеризуется одинаковым диапазоном ММ с пептидным препаратом, получаемым аналогичным путем из свиного коллагена. Следовательно, препараты гомологичны по структуре, химическим и биологическим свойствам. Результаты доказывают возможность получения заявляемого пептидного препарата из нативного и денатурированного коллагенов различных видов теплокровных животных.

ПРИМЕР ТРЕТИЙ, показывающий стимулирующее действие пептидного препарата на митотическую активность фибробластов

Используют фибробласты мыши линии NIH ЗТЗ, полученные от компании АТСС (США). Фибробласты культивируют в стандартных стерильных условиях: питательная среда а-МЕМ, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 5% CO₂, температура плюс 37°С [5]. Фибробласты рассеивают в 96-ти луночные планшеты в количестве 2000 клеток в каждую лунку и культивируют 24 часа. Полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемый пептидный препарат добавляют к фибробластам в лунки до конечной концентрации (препарата) не менее 0,1 нг/мл и культивируют клетки в течение 72 часов. Для оценки механизма действия заявляемого препарата в качестве препарата сравнения в лунки добавляют рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека, например - производства ООО Компании "ПанЭко" (Россия). Выбор природного фактора роста фибробластов в качестве препарата сравнения обусловлен его максимально возможным сродством с клеточными рецепторами, следовательно максимально достижимой стимуляции митотической активности фибробластов [6].

Оценивают число живых клеток в лунках - показатель пролиферативной (митотической) активности (клеток) - с помощью МТТ-теста [7] на микропланшетном анализаторе Infinite 200 PRO (Тесап, Швейцария) По величине оптического сигнала продукта восстановления реагента МТТ (Promega, США). Уровень стимуляции пролиферативной активности клеток рассчитывают в процентах от контроля (клетки, выращенные без добавления пептидного препарата или препарата сравнения).

На Фиг. 4.1 показано влияние заявляемого пептидного препарата в различных концентрациях (С) на пролиферативную активность мышиных фибробластов линии ЗТЗ по истечении 72 часов культивирования. На Фиг. 4.2 показано влияние фактора роста фибробластов на пролиферативную активность мышиных фибробластов линии ЗТЗ по истечении 72 часов культивирования. На Фиг. 4 по горизонтальной оси показан логарифм концентрации заявляемого препарата и препарата сравнения (log С), по вертикальной оси уровень стимуляции пролиферативной активности клеток в процентах (%) от контроля.

Результаты показывают, что максимальная стимуляция пролиферативной активности под действием полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемого пептидного препарата составляет 19% (Фиг. 4.2). Максимальная стимуляция пролиферативной активности препаратом сравнения (фактором роста фибробластов) составляет 21% (Фиг. 4.1). Различия в стимулирующем эффекте заявляемого пептидного препарата и препарата сравнения находятся в пределах ошибки опыта, поэтому - эффекты сопоставимы. Как видно из Фиг. 4.1 и Фиг. 4.2, заявляемый пептидный препарат и природный фактор роста фибробластов проявляют сходный дозозависимый стимулирующий эффект на пролиферативную активность фибробластов (Фиг. 4). Таким образом, заявляемый пептидный препарат приводит к максимально достижимой митотической активности фибробластов, что свидетельствует о сродстве пептидов в препарате к клеточным рецепторам природного фактора роста. Это раскрывает отсутствующий в описании прототипа [3] механизм действия заявляемого пептидного препарата, что является его (пептидного препарата) существенным преимуществом для применения в медицине и фармацевтике.

ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ, показывающий стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата на синтетическую активность фибробластов

Выявляют стимулирующее действие полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемого пептидного препарата на синтетическую активность (способность синтезировать биомолекулы) клеток, например мышиных фибробластов линии NIH ЗТЗ, полученных от компании АТСС (США). Выполняют действия по ПРИМЕРУ ТРЕТЬЕМУ, но культивируют фибробласты в 24-х луночных планшетах в течение 48 часов, фиксируют клетки раствором 4% параформальдегида и окрашивают выявляющими коллаген гистохимическими красителями, например - анилиновым синим/пикриновой кислотой [8]. Для оценки механизма действия заявляемого препарата в качестве препарата сравнения в контрольные лунки добавляют рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека, например - производства ООО Компании "ПанЭко" (Россия). Проводят микроскопирование окрашенных фибробластов, например - на световом микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 400^х.

На Фиг. 5.1 показаны световые микрофотографии фибробластов, выращенных в питательной среде с добавлением заявляемого препарата, по истечении 48 часов культивирования. На Фиг. 5.2 показаны микрофотографии фибробластов, выращенных в питательной среде с добавлением фактора роста фибробластов, по истечении 48 часов культивирования. На Фиг. 5.3 показаны микрофотографии фибробластов, выращенных в питательной среде без добавления заявляемого препарата/препарата сравнения, по истечении 48 часов культивирования (контроль).

На Фиг. 5.1 видно, что пептидный препарат повышает интенсивность гистохимического окрашивания фибробластов, что свидетельствует о сопоставимом с действием фактора роста фибробластов повышении внутриклеточного синтеза белков, например - предшественников коллагена (Фиг. 5.2). Таким образом, заявляемый пептидный препарат приводит к максимально достижимой синтетической активности фибробластов, что свидетельствует о сродстве пептидов в заявляемом препарате к клеточным рецепторам природного фактора роста. Повышение синтеза клетками белков, например - коллагена, является существенным преимуществом препаратов для регенерации соединительной ткани (дермы) кожи [9].

ПРИМЕРЫ ТРЕТИЙ и ЧЕТВЕРТЫЙ показывают, что полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемый пептидный препарат до максимально достижимого уровня повышает активность фибробластов: стимулирует их (фибробластов) пролиферативную и синтетическую активности, сопоставимые (в пределах ошибки опыта) с действием природного фактора роста фибробластов. Это свидетельствует о сродстве пептидов в составе заявляемого препарата к клеточным рецепторам фактора роста, что раскрывает, в отличие от прототипа [3], механизм действия заявляемого препарата и существенно расширяет области его (заявляемого препарата) применения.

ПРИМЕР ПЯТЫЙ, иллюстрирующий готовые формы пептидного препарата

5.1. Получают сыпучие твердые (порошковые) формы пептидного препарата по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ с разной степенью дисперсности, например - путем сублимационного, распылительного или конвективного высушивания без ограничения ими. На Фиг. 6.1 показан заявляемый пептидный препарат в форме порошка, полученный путем сублимационного высушивания. Порошковая форма заявляемого препарата по потребности содержит вспомогательные вещества, например - антимикробные средства, обезболивающие средства, микроэлементы, неорганические или органические сорбенты, без ограничения ими, или их (вспомогательных веществ) композиции. Порошковую форму заявляемого препарата упаковывают, например - в пакеты-саше, без ограничения ими, и используют в качестве присыпки для регенерации раневых дефектов кожи.

5.2. Приготавливают жидкие формы заявляемого пептидного препарата растворением получаемых по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидов в водном солевом растворе в диапазоне концентраций препарата, например - от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл. Жидкая форма заявляемого препарата (Фиг. 6.2) по потребности содержит вспомогательные вещества, например - антимикробные средства, обезболивающие средства, микроэлементы, спирт(ы), пропиленгликоль, глицерин, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сывороточный альбумин, без ограничения ими, или их (вспомогательных веществ) композиции. Для сохранения структуры и регенеративной активности пептидного препарата его жидкую форму дополнительно подвергают сублимационному высушиванию с последующим перерастворением в стерильном физиологическом растворе, например - 0,9% водном растворе хлорида натрия. Жидкую форму заявляемого препарата используют для регенерации кожи, например - в виде смачивающего раствора или виде аэрозоля (Фиг. 6.2).

5.3. Приготавливают мягкие формы, например - гели/мази для наружного применения с полученным по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидным препаратом путем смешивания препарата с образующими гель/мазь: синтетическим полимером, например - полимером акриловой/метакриловой кислоты, полиэтиленоксидом, поливиниловым спиртом, или с образующим гель природным полимером, например - полисахаридом, коллагеном, желатином, или путем смешивания препарата с липофильным компонентом, например углеводородами, липидами, силиконом, без ограничения вышеуказанными веществами. Мягкая форма заявляемого препарата (Фиг. 6.3) по потребности содержит вспомогательные вещества, например антимикробные средства, обезболивающие средства, микроэлементы, спирт(ы), увлажняющие вещества (пропиленгликоль, глицерин, полипропиленгликоль), сывороточный альбумин, ароматизаторы, красители, без ограничения ими. Мягкую форму заявляемого препарата используют, например - упакованную в тубу или шприц (Фиг. 6.3), для регенерации кожи (см. ПРИМЕРЫ ШЕСТОЙ, СЕДЬМОЙ).

Аналогичным путем приготавливают лечебно-косметические формы с полученным по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидным препаратом, например - твердые, жидкие, гелевые/мазевые формы, производные формы, например - стик, пластырь, губная помада, без ограничения ими.

ПРИМЕР ШЕСТОЙ, показывающий стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию эпителия кожи

Используют лабораторных животных, например - 12 крыс-самцов линии Вистар массой 300±25 г (ООО «Питомник» Российской Академии медико-технических наук, РФ). Исследуют влияние заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию эпителиальной ткани кожи, например на модели эксцизионной раны кожи. Проводят предоперационную наркотизацию животных изофлураном (4%, 2 мин, 1 л/мин) с помощью системы ингаляционной наркотизации (Abbott Laboratories, США). Вырезают на спине животного участок кожи диаметром (далее по тексту - ) 12 мм. Ограничивают края раны силиконовой шиной (внутренний 0=12 мм, внешний 0=25 мм, толщина=0,5 мм) и фиксируют (шины) скобами с помощью степлера для кожи Appose™ ULC 35W (Covidien, США) для предотвращения затягивания раны за счет закрывания краев [10]. Готовят гель для наружного применения (см. ПРИМЕР ПЯТЫЙ), содержащий полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидный препарат с конечной концентрацией пептидов (0,1% по массе), гелеобразователь - карбоксиметилцеллюлозу фармацевтического класса (2% по массе), антимикробный компонент (композиция пенициллина и стрептомицина). Животным опытной группы наносят на поверхность раны содержащий пептидный препарат гель объемом 200 мкл. Животным контрольной группы наносят равный объем (200 мкл) геля, содержащего карбоксиметилцеллюлозу (2% по массе) и антимикробный компонент (композиция пенициллина и стрептомицина). Проводят прижизненную перфузию (500 мл, 4% формалин в 1* ФСБ) и осуществляют забор тканевых образцов путем иссечения скальпелем участка раны в зоне травмы с захватом окружающей ткани (3 мм от края раны). Тканевые образцы фиксируют в растворе 4% формалина. Из образцов по стандартной методике [11] готовят криосрезы толщиной 7 мкм, окрашивают гематоксилин-эозином (ООО Biovitrum, РФ) и проводят гистологический анализ морфологического строения регенерировавшего эпидермиса кожи на микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).

На Фиг. 7 приведены окрашенные гематоксилин-эозином микрофотографии срезов кожи в зоне эпителизации (центр раны), демонстрирующие стимулирующее действие заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию эпителиальной ткани кожи. На Фиг. 7 видно, что в зоне раны, обработанной содержащим заявляемый препарат гелем, по истечении 7-ми суток формируются слои эпителиальных клеток разной толщины (указаны стрелками). В аналогичных условиях в обработанной гелем без пептидного препарата (контроль) зоне раны слои эпителиальных клеток не выявляются; выявляется только раневое отделяемое. Это подтверждает стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата на процесс восстановления эпителиальной ткани. Стимуляция формирования эпителия после травмы кожи является, по сравнению с прототипом [3], существенным преимуществом заявляемого препарата, так как дополнительно способствует восстановлению нижележащей соединительнотканной дермы кожи (см. ПРИМЕР СЕДЬМОЙ).

ПРИМЕР СЕДЬМОЙ, показывающий стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию соединительной ткани (дермы) кожи

Используют лабораторных животных, например - 12 крыс-самцов линии Вистар массой 300±25 г (ООО «Питомник» Российской Академии медико-технических наук, РФ). Выполняют действия по ПРИМЕРУ ШЕСТОМУ, но исследуют регенерацию соединительной ткани (дермы) кожи при действии заявляемого пептидного препарата в форме геля для наружного применения. Готовят по стандартной методике [11] криосрезы толщиной 7 мкм. Интенсивность синтетической активности фибробластов в регенерирующей дерме выявляют путем окрашивания коллагеновых волокон по Ван-Гизону [11]. Проводят гистологический анализ морфологического строения регенерировавшей дермы кожи на микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).

На Фиг. 7 приведены микрофотографии окрашенных гематоксилин-эозином срезов кожи в центре раны, демонстрирующие стимулирующее действие заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию соединительной ткани (дермы) кожи. На Фиг. 7 видно, что в зоне раны, обработанной содержащим пептидный препарат гелем, по истечении 7-ми суток формируется плотная сетчатая структура, состоящая из компонентов межклеточного матрикса. В аналогичных условиях в зоне раны, обработанной гелем без пептидного препарата (контроль), формируется менее плотная структура, содержащая меньшее количество межклеточного матрикса. Это свидетельствует о более быстром, по сравнению с контролем (гель без пептидного препарата), протекании процесса восстановления соединительной ткани кожи.

На Фиг. 8 приведены микрофотографии окрашенных по методу Ван-Гизона срезов кожи в зоне раны, демонстрирующие стимулирующее действие заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию соединительнотканных волокон (дермы) кожи. Видно, что применение геля с заявляемым пептидным препаратом, в отличие от контроля (гель без пептидного препарата), способствует более интенсивному формированию в образующейся дерме кожи коллагеновых волокон, окрашенных в красный цвет. Образование коллагеновых волокон свидетельствует о более выраженной синтетической активности фибробластов, выделяющих молекулы внеклеточного матрикса [6]. Вышеописанные результаты доказывают стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата на процессы заживления раны и восстановления тканей кожи.

Таким образом, ПРИМЕРЫ СЕДЬМОЙ И ВОСЬМОЙ доказывают, что полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемый пептидный препарат в форме геля для наружного применения стимулирует процессы регенерации эпителиальной и соединительной тканей кожи. В прототипе [3] показан оздоравливающий эффект на кожные покровы только при ограниченном, пероральном, использовании препарата [3] и не продемонстрирована его (прототипа) эффективность при наружном применении для лечения травмы кожи. Заявляемый же препарат применим при различных способах введения, например - наружном, пероральном, что является существенным преимуществом заявляемого препарата для восстановления кожи. Ускорение процессов регенерации и восстановления тканей кожи заявляемым пептидным препаратом является его существенным преимуществом перед прототипом [3], что позволяет рекомендовать заявляемый пептидный препарат к применению для регенерации и улучшения состояния тканей кожи.

ПРИМЕР ВОСЬМОЙ, показывающий отсутствие пероральной токсичности заявляемого пептидного препарата

Выявляют отсутствие острой, при однократном пероральном (внутрижелудочном) введении, токсичности заявляемого препарата на лабораторных теплокровных животных, например - здоровых половозрелых белых крысах линии Вистар: самках массой 210±20 г и самцах массой 300±25 г, полученных, например - из сертифицированного питомника лабораторных животных ООО «Питомник Российской академии медико-технических наук».

Выполняют токсикологические исследования в соответствии с российскими и европейскими правилами этичного и гуманного обращения с лабораторными животными [12, 13]. Содержат животных в соответствии с санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию лабораторных животных [14]. Кормят животных сертифицированным брикетированным кормом в соответствии с действующими нормами [14, 15]. Перед проведением исследований животных в течение 14 суток выдерживают в условиях вивария - для акклиматизации и карантина. Содержат животных в одиночных клетках при температуре +20°C и относительной влажности воздуха 60%.

Распределяют животных в опытные (5 самцов и 5 самок) и контрольные (5 самцов и 5 самок) группы. В ночь перед опытом животных оставляют без пищи в свободном доступе к воде. Принимают дозу в 2000 мг на кг массы животного в качестве максимальной для перорального введения в соответствии с ограниченным пероральным тестом для малотоксичных веществ [15, 16]. Готовят в соответствии с массой животных навески заявляемого пептидного препарата, полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ, растворяют навеску в 2 мл стерильного физиологического раствора (0,9% водный раствор хлорида натрия); полученные растворы вводят опытным животным канюлей. Контрольным животным аналогично вводят по 2 мл стерильного физиологического раствора (0,9% водный раствор хлорида натрия). Наблюдение за животными осуществляют в течение 15 суток.

Оценивают общее состояние животных в контрольных и опытных группах, например - двигательную активность, объем потребления корма и воды, состояние слизистых оболочек, шерстного и кожного покрова. Производят взвешивание животных перед началом и после введения пептидного препарата и ежедневно в восстановительный период (в течение стандартных 14-ти суток). Масса тела животных в опытных и контрольных группах достоверно не различается; потребление воды, пищи и двигательная активность экспериментальных животных соответствует физиологической норме согласно [17].

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии признаков острой токсичности заявляемого препарата. Летальная доза LD₅₀ заявляемого препарата при внутрижелудочном введении превышает максимально испытанную и допустимую для однократного внутрижелудочного введения животным [16] дозу (2000 мг на один кг массы животного). Заявляемый препарат при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 2000 мг на один кг массы животного не оказывает токсического действия и по показателям общего состояния животных является безопасным для теплокровных животных и человека.

ПРИМЕР ВОСЬМОЙ свидетельствует об отсутствии острой токсичности заявляемого пептидного препарата и возможности его (препарата) перорального применения, наряду с его (препаратом) наружным применением (см. ПРИМЕРЫ ШЕСТОЙ, СЕДЬМОЙ), что в отличие от прототипа [3] существенно расширяет области его (заявляемого препарата) применения в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии.

Приведенные примеры применения предполагаемого изобретения показывают его полезность, выражающуюся в применении пептидного препарата из коллагена для регенерации тканей кожи и лечения раневых дефектов. Более высокая, по сравнению с прототипом [3], и сопоставимая с действием природного фактора(ов) роста эффективность полученного в соответствии с предполагаемым изобретением пептидного препарата для регенерации тканей кожи является одним из существенных преимуществ предполагаемого изобретения.

Заявляемое техническое решение является неочевидным, соответствует предъявляемым к изобретениям критериям новизны, так как при анализе идентифицированных источников информации не выявлены иные препараты пептидов с признаками, совпадающими с отличительными преимущественными признаками предполагаемого изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, поскольку его можно реализовать в промышленном производстве (используются продукты крупнотоннажной переработки коллагенсодержащего сырья) и в деятельности организаций здравоохранения посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.

Заявленное техническое решение поясняется следующими материалами. Комментарии к Фигурам - в тексте описания.

На Фиг. 1 показана электрофореграмма коллагена в полиакриламидном геле.

На Фиг. 2 показана электрофореграмма пептидного препарата в полиакриламидном геле.

На Фиг. 3 показан МАЛДИ-масс-спектр пептидного препарата.

На Фиг. 4 показано влияние пептидного препарата и фактора роста фибробластов на пролиферативную активность фибробластов.

На Фиг. 5 показано влияние пептидного препарата и фактора роста фибробластов на синтетическую активность фибробластов.

На Фиг. 6 приведены готовые формы пептидного препарата для наружного применения.

На Фиг. 7 и 8 приведены результаты гистологического исследования влияния пептидного препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию тканей кожи in vivo.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. United States Patent US 5183805 A. Bioactive EGF peptides for promotion of tissue regeneration and cancer therapy [Текст] | Board Of Regents, The University Of Texas System, J.S. Lee, M. Blick. - Опубл. 02.02.1993.

2. United States Patent WO 1998033917 A1. Vascular endothelial growth factor с (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof [Текст] | K. Alitalo, V. Joukov, Ludwig Inst. Cancer Res., Univ. Helsinki Licensing. - Опубл. 06.08.1998.

3. United States Patent US 20130252899 A1 Collagen hydrolysate for use to improve the health of human skin, hair and/or nails [Текст] / S. Hausmanns, M. Giesen-Wiese, S. Oesser, Gelita AG, Eberbach (DE). - Опубл, 26.09.2013.

4. Техническое руководство Bio-Rad Laboratories, Inc. "2A guide to polyacrylamide gel electrophoresis and detection", (www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf).

5. L. Rittie, G.J. Fisher Isolation and culture of skin fibroblasts || Methods Mol. Med. 2005, Vol. 117, P. 83-98.

6. Bikfalvi, S. Klein, G. Pintucci, D.B. Rifkin. Biological roles of fibroblast growth factor-2 || Endocrine Reviews, 1997, 18(1), p. 26-45.

7. Техническое руководство Promega "CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay".

8. Микроскопическая техника: Руководство | Под. ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. 544 с. (-С. 424).

9. Т. Wong; J.A. McGrath; Н. Navsaria. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration // The British Journal of Dermatology, 2007; 156(6): 1149-1155.

10. Galliano, R.D. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing / R.D. Galliano, J. Michaels, M. Dobryansky, J.P. Levine, G.C. Gurtner || Wound repair and regeneration. 2004, V. 12 (4), P. 485-492.

11. Э. Пирс Гистология. - M.: Иностранная литература, 1962, 964 с.

12. Приказ Минвуза СССР №742 от 13.11.1984. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

13. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Text with EEA relevance, http://eur-lex.europa.eu/legalcontent/EN/TXT/?uri=celex:32010L0063.

14. Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г., №708н «Об утверждении правил лабораторной практики», http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html.

15. Миронов, А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / А.Н. Миронов, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильева, О.Л. Верстакова, М.В. Журавлева, В.К. Лепахин, Н.В. Коробов, В.А. Меркулов, С.Н. Орехов, И.В. Сакаева, Д.Б. Утешев, А.Н. Яворский. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

16. OECD. Guidelines for the testing of chemicals. Acute Oral Toxicity - Up-and-Down-Procedure (UDP). 2008. - 27 p.

17. Трахтенберг, И.М. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (Современные представления и методические подходы, основные параметры и константы) / И.М. Трахтенберг, Р.Е. Сова, В.О Шефтель и др. - М.: Медицина, 1978. - 176 с.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для создания препарата для регенерации тканей организма. Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи состоит из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Способ получения препарата заключается в гидролитическом расщеплении коллагена с образованием фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Полученный препарат применяют для регенерации тканей кожи животных и человека. Использование изобретений позволяет ускорить регенерацию тканей кожи за счет более оптимального диапазона молекулярных масс фракции активных пептидов, снизить токсичность препарата. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 8 пр.

1. Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, состоящий из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон.

2. Способ получения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат получают путем гидролитического расщепления коллагена с образованием фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон.

3. Способ применения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат применяют для регенерации тканей кожи животных и человека.