СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТА РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И МИКРОПЛАНШЕТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИЙ АГГЛЮТИНАЦИИ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/53 G01N21/75 B01D57/00 

Настоящее изобретение относится к способу определения результата реакции агглютинации и к микропланшету для определения продуктов реакций агглютинации.

Из уровня техники известно использование тестовых элементов, таких как гелевые карты или кассеты с шариками, при определении групп крови, определении антигенов или антител, или в других смежных иммуногематологических областях применения или использования. Указанные тестовые элементы обычно содержат планарную подложку, на которой размещено несколько визуально прозрачных и вертикально размещенных колонок или реакционных лунок. Каждая из реакционных лунок содержит некоторое количество инертного материала, такого как стеклянные шарики или гель, смешанного с суспензией, содержащей антиген или антитело, или связанного с ней. В ходе использования пробу от пациента размещают в реакционной лунке поверх инертного материала. Затем пробу инкубируют и центрифугируют с целью ускорения реакции агглютинации. Эритроциты агрегируют и фильтруются матрицей из инертного материала. Инертный материал выполняет функцию фильтрационного материала. Карты или кассеты обычно содержат ряд колонок или реакционных лунок, и выполнены из прозрачного материала. Вследствие выполнения гелем или матрицей из шариков функции фильтра, агрегированные клетки крови и неагрегированные клетки крови отделяются друг от друга и удерживаются в верхней части фильтрационного материала или проходят через фильтрационный материал и достигают донного участка соответствующей реакционной лунки. Ряд реакционных лунок, в которых агрегированные клетки крови отделены от неагрегированных клеток крови, может быть сканирован посредством камеры, причем обзор камеры направлен с боковой стороны ряда колонок или реакционных лунок. Соответственно, все реакционные лунки могут быть зарегистрированы одновременно на одном изображении.

В US 8076126 В2 раскрыты тестовые элементы с одной колонкой, подходящие для использования в установке для клинического тестирования. Каждый из тестовых элементов содержит одну реакционную лунку, содержащую инертный материал, а также суспензию, содержащую антиген или антитело, или связанный с носителем антиген или антитело, и обертку или пленку, закрывающую реакционную лунку. Пленка выполнена прокалываемой с целью обеспечения доступа к содержимому реакционной лунки. Обеспечен картридж, содержащий рамку, в которой размещено несколько тестовых элементов, причем тестовые элементы расположены в ряд.

В WO 95/31731 раскрыты способ и установка для обнаружения антигенов и антител группы крови. В данном случае для обнаружения указанных антигенов и антител использована иммунореактивная аффинная хроматография. Способ включает размещение исследуемых эритроцитов в реакционной пробирке, содержащей несколько частиц, содержащих иммуноглобулин-связывающие лиганды, такие как, например, белок А, белок G, и т.д. После завершения указанного этапа осуществляют этап центрифугирования и обнаружения, на котором содержимое пробирки анализируют с рассмотрением сбоку.

В работе Д. Харменинга и др. "Современная методика хранения и переливания крови", пятое издание, глава 15: "Альтернативные технологии и автоматизация стандартного тестирования запасов крови", 1 января 2005 г., СОВРЕМЕННАЯ МЕТОДИКА ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ, ПЯТОЕ ИЗДАНИЕ, F:A: DAVIS COMPANY, США, СТР. 293-302, ISBN: 0-8036-1248-6, представлен обзор технологий стандартного тестирования запасов крови и описаны требования и преимущества автоматизации известных способов. В US 2012/0288887 А1 раскрыт еще один способ определения изображения агглютинированных клеток крови с соответствующим устройством. В указанном способе используют микропланшет, содержащий множество реакционных лунок, расположенных в виде двухмерной матрицы. Реакционные лунки содержат нижнюю стенку, имеющую по существу коническую форму. Внутренняя поверхность нижней стенки выполнена в виде многоярусной части, содержащей несколько ступеней, выполненных в виде концентрических окружностей. Реакции агглютинации выполняют в реакционных лунках и, в зависимости от результата реакций агглютинации, большее или меньшее количество ступенчатых частей покрыты продуктами реакции. Диаметр продуктов реакции определяют оптическим методом, посредством камеры. На основании измеренного диаметра может быть автоматически определен результат реакции агглютинации. Способ включает этап центрифугирования и этап покачивания с целью ускорения реакции агглютинации и перемещения продуктов реакции книзу в коническую нижнюю стенку.

В работе Ашрафа Агайлана и др. "Высокочувствительный анализ агглютинации частиц с целью обнаружения р53-аутоантител у пациентов, страдающих от рака легких", РАК, том 110, №11, 1 января 2007 г., стр 2502-2506, ISSN: 0008-543Х, DOI: 10.1002/cncr.23057, раскрыт высокочувствительный и простой метод иммуноанализа агглютинации частиц с использованием суперпарамагнитных частиц для аутоантител к р53, белка р53 и комплексов белок р53-антитело в больших объемах проб сыворотки крови.

ЕР 0797097 А1 относится к способу обнаружения аналита в жидкой пробе посредством агглютинации, в котором жидкую пробу вводят во контакт с агглютинирующим реагентом, и в котором определяют реакцию между анализируемым веществом и агглютинирующим реагентом. Кроме того, раскрыты реакционные сосуды и реагенты для реализации указанного способа. Для разделения используют компактную матрицу с каналами, имеющими заданные диаметры.

ЕР 1450159 А2 относится к анализам агглютинации, и в частности, к установке для осуществления указанных тестов. В данном случае указанная установка содержит участок отделения для отделения агглютинатов. В указанном участке отделения не используют шарикоподобные частицы или гели, а используют элементы, прикрепленные к подложке (см. [0028]). Кроме того, в ЕР 1450159 А2 раскрыта автоматизированная система, выполненная с возможностью осуществления анализа агглютинации с повышенной скоростью и точностью.

WO 2009/120516 А1 относится к иммунодиагностическому тесту, содержащему опорный элемент, по меньшей мере одну колонку для анализа, содержащую исследуемый материал, и обертку, покрывающую верхнюю часть по меньшей мере одного тестового элемента. Пробирки, используемые в WO 2009/120516 А1, расположены в картах.

US 2004/002415 А1 относится к автоматической центрифужной системе для автоматического центрифугирования жидкостей, содержащих биологические материалы (см. реферат).

В ЕР 2124054 А1 раскрыта установка для иммунодиагностического исследования, содержащая по меньшей мере один элемент для получения изображения с целью обеспечения предварительной оценки агглютинации в ходе цикла центрифугирования (см. название).

Задачей настоящего изобретения является обеспечение способа определения результата реакции агглютинации, который может быть осуществлен автоматически, является надежным и обеспечивает высокую производительность.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение микропланшета, выполненного с возможностью реализации способа определения результата реакции агглютинации с высокой степенью надежности и высокой производительностью.

Задачи настоящего изобретения решены посредством способа и микропланшета, охарактеризованных в независимых пунктах формулы изобретения. Обладающие преимуществами примеры реализации настоящего изобретения охарактеризованы в соответствующих зависимых пунктах формулы изобретения.

Способ определения результата реакции агглютинации включает следующие этапы:

- этап реакции, на котором проба может реагировать с реагентом в лунке, причем использован микропланшет, содержащий множество лунок, расположенных в виде двухмерной матрицы,

- этап центрифугирования, на котором микропланшет поворачивают таким образом, что нижняя стенка лунки направлена кнаружи относительно оси поворота, причем на этапе центрифугирования агглютинированный материал пробы отделяется от неагглютинированного материала пробы посредством сепарирующего материала, такого как гель или матрица из шариков,

- этап получения изображения, на котором получают по меньшей мере одно изображение верхней стороны микропланшета и по меньшей мере одно изображение нижней стороны микропланшета,

- этап определения, на котором определяют положительный или отрицательный статус пробы в указанной лунке в отношении реакции агглютинации, причем сравнивают интенсивность цвета и/или уровень серого для указанной лунки на изображениях верхней стороны и нижней стороны микропланшета.

В настоящем способе определяют различие в интенсивности цвета и/или уровне серого для заданной лунки с верхней стороны и с нижней стороны лунки. Указанное различие может быть определено с высокой точностью. Помехи, такие как фоновое освещение, обычно оказывают одинаковое влияние на оба изображения верхней стороны и нижней стороны лунки, в результате чего указанные помехи исключают путем сравнения интенсивности цвета и/или уровня серого для верхней стороны и нижней стороны соответствующей реакционной лунки. Указанный подход позволяет обеспечить высокую надежность и устойчивость к ошибкам настоящего способа. Настоящий способ пригоден для промышленного применения с целью автоматического тестирования тысяч или миллионов проб без какого-либо вмешательства со стороны человека.

Кроме того, двухмерная матрица позволяет одновременно выполнять множество реакций агглютинации и определять результат нескольких реакций агглютинации. Благодаря определению лунок с нижней стороны и с верхней стороны, устранена необходимость в использовании лишь одномерного порядка расположения реакционных лунок, известного, например, из US 8076126 В2.

Предпочтительно, на этапе центрифугирования микропланшет поворачивают вокруг горизонтальной оси. Указанный подход способствует интеграции этапа центрифугирования в автоматическую систему. Центрифуги для проб имеющие горизонтальную ось поворота, описаны в WO 2013/117606 А1 и ЕР 13179437.2. ЕР 13179437. еще не опубликован. Документы WO 2013/117606 А1 и ЕР 13179437.2 включены в настоящую заявку путем ссылки.

Согласно предпочтительному примеру реализации, перед выполнением этапа центрифугирования может быть выполнен этап инкубации с целью ускорения реакции агглютинации.

Продукты реакции, а именно, агглютинированные части пробы, отделяют от исходных реагентов, а именно, неагглютинированных частей пробы, на этапе центрифугирования посредством сепарирующего материала, такого как гель или матрица из шариков. Матрица из шариков выполняет функцию фильтровального материала, удерживающего агглютинированные части пробы, в частности, агрегированные клетки крови, поверх матрицы из шариков, а неагглютинированные части пробы проходят через матрицу из шариков и собираются в нижней части соответствующей лунки. При использовании гелевой матрицы неагглютинированные части пробы разделяют от агглютинированных частей пробы за счет того, что неагглютинированные части пробы проходят через гелевую матрицу на этапе центрифугирования и перемещаются ко дну реакционной лунки, а более крупные агглютинированные части пробы удерживаются поверх гелевой матрицы или в гелевой матрице.

Реагент может быть введен поверх сепарирующего материала или сепарирующий материал может быть вмешан в суспензию, содержащую реагент. Реагент может содержать антитела и/или антигены, реагирующие с заданной пробой. При смешивании гелевой матрицы с реагентом реакция агглютинации протекает в гелевой матрице, и агглютинированные продукты удерживаются в гелевой матрице, в которой протекает реакция.

В случае, если для обеспечения видимости реакции антигена/антитела необходима подложка, она также может быть включена в гель. Подложка также может быть расположена лишь в нижней и верхней частях.

Микропланшет для определения продуктов реакций агглютинации содержит множество лунок, расположенных в виде двухмерной матрицы, причем по меньшей мере одна из указанных лунок содержит участок сепарации, содержащий сепарирующий материал, такой как гель или матрица из шариков, и причем участок сепарации содержит по меньшей мере одну коническую часть, сужающуюся книзу, для обеспечения концентрирования материала пробы, проходящего через сепарирующий материал.

Концентрирование материала пробы, проходящего через сепарирующий материал, позволяет усилить интенсивность цвета или уровень серого на изображении нижней стороны лунки вследствие того, что указанный материал пробы концентрируется в центре реакционной лунки. Указанный подход облегчает осуществление автоматического визуального анализа. Указанный подход также повышает надежность теста вследствие облегчения сравнения интенсивности цвета или уровня серого на верхней и нижней сторонах реакционной лунки.

Реакционные лунки предпочтительно содержат участок наполнения на верхнем конце лунок, причем площадь поперечного сечения участка наполнения превышает площадь поперечного сечения участка сепарации.

Предпочтительно, микропланшет содержит по меньшей мере 96 лунок. Указанный микропланшет может содержать по меньшей мере 300 (и в частности 384), или по меньшей мере 1000 (и в частности 1536) лунок. Внутренняя высота реакционных лунок предпочтительно находится в пределах от 5 мм до 25 мм, в частности, от 10 мм до 20 мм, или от 10 мм до 15 мм.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, установка для тестирования содержит центрифугу и камеру для регистрации верхней стороны реакционной лунки, а также другую камеру для регистрации изображения нижней стороны реакционной лунки. Указанная установка для тестирования содержит блок управления для реализации способа согласно вышеприведенному описанию.

Предпочтительно, установка для тестирования содержит механизм загрузки для горизонтальной загрузки микропланшета в центрифугу и для горизонтального выведения микропланшета из центрифуги. Вдоль пути загрузки микропланшетов могут быть выполнены линейные камеры с целью регистрации верхней поверхности и нижней поверхности микропланшета. Линейные камеры проходят в направлении, поперечном направлению перемещения микропланшетов.

Установка для тестирования предпочтительно содержит средства пипетирования для автоматического заполнения реакционных лунок сепарирующим материалом, таким как гель. Указанный подход позволяет использовать лишь требуемое количество реакционных лунок микропланшета. Другие реакционные лунки могут быть пустыми. Следовательно, использование микропланшета, содержащего множество реакционных лунок, позволяет обеспечить высокую производительность при низких затратах вследствие того, что лишь фактически используемые реакционные лунки загружены сепарирующим материалом и реагентами.

Настоящее изобретение более подробно раскрыто в нижеприведенном подробном описании со ссылкой на сопутствующие чертежи. На чертежах:

На фиг.1а показан вид сверху примера реализации микропланшета согласно настоящему изобретению,

На фиг. 1b и 1с показаны виды сбоку микропланшета по фиг. 1,

На фиг. 2 показан вид сбоку одной реакционной лунки микропланшета по фиг. 1а, причем внутренние края отмечены штриховыми линиями,

На фиг. 3 показан вид в перспективе одной реакционной лунки микропланшета по фиг. 1а,

На фиг. 4a-4f показана каждая из реакционных лунок, содержащих пробу, после проведения реакции агглютинации, причем для каждой из лунок приведено изображение верхней стороны (над лункой) и нижней стороны (под лункой) лунки,

На фиг. 5-8 показаны различные виды (без корпуса) установки для реализации способа определения результата реакции агглютинации, и

На фиг. 9 показан носитель микропланшета.

На фиг. от 1а-1с до 3 показан пример реализации микропланшета 1 согласно настоящему изобретению. Микропланшет содержит 384 реакционные лунки 2, расположенные в виде двухмерной матрицы (16×24 лунки).

Микропланшет 1 выполнен из прозрачного инертного пластикового материала, такого как поликарбонат.

Каждая из лунок 2 (фиг. 2, 3) выполнена идентичной. Каждая из реакционных лунок 2 содержит отверстие 3 на верхнем конце и нижнюю стенку 4 на нижнем конце. При надлежащем использовании микропланшет расположен таким образом, что отверстия обращены кверху, а нижние стенки обращены книзу. Соответственно, в нижеприведенном описании под термином "кверху" следует понимать направление к отверстию 3, а под термином "книзу" следует понимать направление к нижней стенке 4.

Реакционная лунка 2 на верхнем конце содержит участок 5 наполнения. Участок 5 наполнения имеет квадратное поперечное сечение. Естественно, могут быть выполнены и другие формы поперечного сечения, такие как круглая или прямоугольная формы. Однако квадратная форма является предпочтительной вследствие того, что указанная форма обеспечивает наибольшую возможную площадь поперечного сечения в конфигурации с заданной плотностью размещения реакционных лунок 2. Чем больше площадь поперечного сечения участка 5 наполнения, тем проще процедура заполнения реакционной лунки 2.

Под участком 5 наполнения выполнен переходный участок 6, связывающий участок 5 наполнения с участком 7 сепарации. Участок 7 сепарации имеет меньшую площадь поперечного сечения по сравнению с участком 5 наполнения, в результате чего переходный участок 6 сужается книзу для обеспечения перехода от большей площади поперечного сечения участка наполнения к меньшей площади поперечного сечения участка 7 сепарации.

Участок 7 сепарации содержит верхнюю часть 8 в виде полого цилиндра. В настоящем примере реализации верхняя часть 8 имеет квадратное поперечное сечение.

Нижняя часть 9 участка 7 сепарации выполнена в виде конической части, сужающейся книзу.

Нижний конец конической части 9 ведет в участок 10 для сбора. Участок 10 для сбора выполнен в виде полого цилиндра. Указанный полый цилиндр в настоящем примере реализации имеет круглое поперечное сечение.

Площадь поперечного сечения участка 10 для сбора значительно меньше площади поперечного сечения верхней части 8 участка 7 сепарации. Соответственно, в нижней части конической части 9 площадь поперечного сечения уменьшается от верхней части 8 участка 7 сепарации к участку 10 для сбора в пропорции по меньшей мере 2:1, предпочтительно по меньшей мере 3:1, и особо предпочтительно, по меньшей мере 4:1.

Большая часть участка сепарации заполнена сепарирующим материалом, таким как гель или матрица из шариков. Указанный сепарирующий материал используют для отделения агглютинированных частей пробы от неагглютинированных частей пробы. В случае, если агглютинированные и неагглютинированные части материала пробы размещены на верхней стороне сепарирующего материала и подвергнуты воздействию центробежной силы, направленной от верхнего конца к нижнему концу реакционной лунки 2, лишь неагглютинированные части пробы проходят через гель или фильтровальный материал, такой как матрица из шариков. Соответственно, обеспечена возможность отделения агглютинированных частей пробы от неагглютинированных частей пробы и возможность сбора неагглютинированных частей пробы на участке для сбора.

Вследствие уменьшения площади поперечного сечения от верхней части 8 участка 7 сепарации к участку 10 для сбора проходящая часть материала пробы сконцентрирована в центре реакционной лунки. Соответственно, проходящая часть материала пробы сконцентрирована в небольшом объеме участка 10 для сбора. В результате участок 10 для сбора содержит высокую концентрацию материала пробы, прошедшего сквозь сепарирующий материал. Указанная высокая концентрация материала пробы обладает преимуществами при обнаружении оптическим методом.

В настоящем примере реализации высота участка наполнения составляет 4,5 мм, высота переходного участка 6 составляет 3 мм, высота верхней части 8 участка 7 сепарации составляет 5 мм, высота конической части 9 участка 7 сепарации составляет 1 мм, а высота участка 10 для сбора составляет 1 мм.

Длина внешних краев участка 5 наполнения составляет 4,5 мм. Толщина стенки реакционной лунки составляет примерно 0,7 мм.

Длина внутренних горизонтальных краев верхней части 8 участка 7 сепарации составляет примерно 2 мм, в результате чего площадь поперечного сечения верхней части 8 участка 7 сепарации составляет примерно 4 мм². Диаметр поперечного сечения участка 10 для сбора не превышает 1 мм, в результате чего площадь поперечного сечения составляет менее 1 мм².

Общая внутренняя высота реакционной лунки 2, проходящая от внутренней стороны нижней стенки 4 до верхнего конца реакционной лунки 2, составляет 14,5 мм.

Вышеописанные конкретные значения приведены для конкретного примера реакционной лунки 2. Естественно, размеры могут быть изменены. В случае, если микропланшет 1 содержит меньшее количество реакционных лунок 2, площадь поперечного сечения каждой из реакционных лунок 2 может быть увеличена при использовании микропланшета идентичных размеров.

В зависимости от вида используемого сепарирующего материала, высота участка 7 сепарации может варьироваться. Большая часть участка 7 сепарации заполнена сепарирующим материалом. Также возможен вариант, в котором переходный участок 6 и даже нижняя часть участка 5 наполнения заполнены сепарирующим материалом.

Согласно фиг. 1b и 1с, каждая из стенок, задающих участок 5 наполнения, представляет собой часть двух реакционных лунок 2, расположенных с обеих сторон от указанных стенок.

Микропланшет 1 содержит рамку 11, окружающую матрицу реакционных лунок 2. Вертикальные боковые стенки 12 обеспечивают опору для рамки 11.

В настоящем примере реализации множество реакционных лунок 2 выполнены заодно в одном микропланшете 1. Указанный вариант предпочтителен, но также могут быть использованы отдельные реакционные лунки, которые могут быть размещены на подставке. Подставка содержит гнезда для удержания реакционных лунок, причем гнезда предпочтительно выполнены в виде двухмерной матрицы.

На фиг. 5 показана установка 13 для тестирования с целью определения результата реакции агглютинации.

Центрифуга 14 содержит переднюю платформу 15, участок 16 центрифуги и участок 17 привода (фиг. 6, 7, 8).

В виде сверху передняя платформа 15 имеет прямоугольную форму и размеры, незначительно превышающие размеры стандартного микропланшета. На всех боковых краях передней платформы 15, за исключением края, прилегающего к участку 16 центрифуги, выполнены бурты 18.

Участок 16 центрифуги содержит ротор 19. Ротор 19 установлен на горизонтальном валу 20 (фиг. 7). Ротор 19 содержит участок вместилища для размещения одного микропланшета 1. Участок вместилища выполнен в виде пластины-поддона 21. Пластина-поддон 21 задана прямоугольной стенкой 22 основания и двумя П-образными направляющими (U-rails) 23. П-образные направляющие 23 выполнены таким образом, что они расположены напротив друг друга и обращены друг к другу открытыми сторонами. В наиболее нижнем положении пластины-поддона, П-образные направляющие 23 расположены ниже стенки 22 основания. На фиг. 6 пластина-поддон 21 показана с частичным вырезом, в результате чего видны микропланшет 2 и носитель 26 микропланшета, размещенные в пластине-поддоне 21.

Расстояние от пластины-поддона 21 до оси 24 поворота предпочтительно превышает боковую ширину блока реакционных лунок, в частности, превышает боковую ширину блока реакционных лунок по меньшей мере в 1,5 раза или в 2 раза.

Противовес 40 прикреплен к фланцам 39 посредством ножек 41 и расположен диаметрально противоположно относительно участка вместилища или пластины-поддона 21. Вместо противовеса 40 может быть обеспечена другая пластина-поддон, выполненная с целью размещения на ней микропланшета или носителя микропланшета вместе с микропланшетом с целью обеспечения регулируемого противовеса для микропланшета, используемого в пластине-поддоне 21.

Отверстие 29 в передней боковой стенке 28 выполнено на уровне наиболее низкого положения пластины-поддона 21, представляющего собой положение загрузки ротора 19. Передняя платформа 15 размещена на уровне стенки 22 основания пластины-поддона 21 в положении загрузки, в результате чего микропланшет или микропланшет на носителе микропланшета может быть перемещен с передней платформы 15 на стенку 22 основания и обратно, причем отверстия реакционных лунок 2 микропланшета 1 обращены к валу 20, удерживающему ротор 19.

В настоящем примере реализации стенки 22 основания, П-образные направляющие 23 и участки между стенками 22 основания выполнены из одной алюминиевой детали.

Пластины-поддоны 21 выполнены открытыми на передней стороне ротора 19, в результате чего микропланшет может быть перемещен в пластину-поддон 21. На задней стороне ротора 19 обеспечен стопор 25. Предпочтительно, стопор 25 содержит магнитный элемент.

Участок между стенками 22 основания снабжен максимально возможным вырезом, и в стенках 22 основания выполнены отверстия с целью минимизирования момента инерции.

В настоящем примере реализации пластина-поддон 21 выполнена с возможностью размещения на ней микропланшета 1 вместе с носителем 26 микропланшета. Носитель 26 микропланшета представляет собой прямоугольную рамку, имеющую бурты 42 на боковых краях, причем внутренние поверхности буртов задают положение микропланшета на носителе 26 микропланшета с небольшим люфтом. Верхние поверхности буртов 42 наклонены кнутри, в результате чего микропланшет перемещается на участок, заданный буртами.

Носитель 26 микропластины на одном боковом крае содержит связующий элемент 43, выполненный из магнитного материала, в частности, из ферромагнитного материала. Указанный связующий элемент 27 может взаимодействовать с магнитным стопором 25 на роторе 19.

Отверстие 29 в передней боковой стенке 28 имеет форму прямоугольной щели. Обеспечена автоматическая дверца для закрытия отверстия 29. Отверстие 29 выполнено на уровне передней платформы 15. В положении загрузки ротор 19 расположен таким образом, что стенки 22 основания ориентированы горизонтально, а стенка основания пластины-поддона 21 расположена на уровне передней платформы 15, что позволяет обеспечить горизонтальное перемещение носителя 26 микропланшета и микропланшета 1 с передней платформы 15 на нижнюю пластину-поддон 21 и обратно.

На верхнем крае отверстия обеспечены сопла для пипетирования с целью размещения реагентов в реакционных лунках 2 микропланшета 1.

В зазоре между передней платформой 15 и ротором 19 расположена верхняя линейная камера 44, размещенная поверх пути перемещения микропланшета, причем обзор камеры направлен книзу, к верхней поверхности микропланшета 1. Нижняя линейная камера 45 расположена под путем перемещения микропланшета, причем обзор камеры направлен кверху, к нижней поверхности микропланшета 1 (фиг. 5). При перемещении микропланшета 1 через отверстие 29 целостные изображения верхней и нижней сторон микропланшета 1 могут быть зарегистрированы посредством линейных камер 44, 45.

Участок 17 привода содержит двигатель (не показан) для обеспечения поворота вала 20 и ротора 19. Двигатель связан с блоком управления с целью управления скоростью поворота. Указанная центрифуга предназначена для центрифугирования микропланшета 1. Вследствие большого расстояния между микропланшетом и валом 20 или осью 24 поворота, жидкость в различных реакционных лунках 2 подвергается почти идентичному центробежному ускорению. Соответственно, достигается идентичный центробежный эффект вне зависимости от расположения жидкости в центральных реакционных лунках или в боковых реакционных лунках.

С целью управления скоростью и ускорением ротора выполнен блок управления. Скорость ротора находится в пределах от 100 об/мин до 3000 об/мин. Ускорение и замедление ротора находится в пределах от 100 до 1200 об/мин в секунду. При запуске ротора он совершает такое ускорение, что после поворота на примерно 180°, должно быть обеспечено центробежное ускорение по меньшей мере в 1 g. Ускорение микропланшетов с глубокими реакционными лунками может быть максимально быстрым. Однако при ускорении микропланшетов с небольшими реакционными лунками может происходить загрязнение вследствие разбрызгивания жидкости из одной реакционной лунки в соседнюю реакционную лунку в результате ускорения. Риск указанного загрязнения вследствие разбрызгивания зависит от объема наполнения реакционных лунок, а также от формы реакционных лунок. Установлено, что при ускорении до 500-1200 об/мин в секунду не происходит загрязнения вследствие ускорения.

Участок 17 привода также содержит механизм 30 загрузки для загрузки и выгрузки центрифуги 14 с микропланшетом 1.

Механизм 30 загрузки содержит гибкую удлиненную балку 31 для продвижения и отведения микропланшета 1 или носителя 26 микропланшета вместе с микропланшетом 1 (фиг. 5). Гибкая удлиненная балка 31 выполнена из полосы металлического листа, незначительно изогнутой в направлении, поперечном ее длине. Соответственно, металлический лист обеспечивает некоторую жесткость при линейном размещении, но с другой стороны, может быть согнут вокруг оси, поперечной относительно длины балки. Подобные изогнутые полосы из металлического листа широко применяют в быту в качестве металлических измерительных лент.

В настоящем примере реализации один конец балки 31 вертикально прикреплен к внутренней стенке 32 участка 17 привода, причем балка отходит кзади от внутренней стенки 32. Балка 31 выполнена с П-образным изгибом (U-turn), в результате чего свободный конец 33 балки направлен кпереди, а балка проходит сквозь щель во внутренней стенке 32. Соответственно, балка содержит верхнюю ленту 34, прикрепленную к внутренней стенке 32, и нижнюю ленту 35, проходящую сквозь щель во внутренней стенке 32. Лента 35, проходящая сквозь внутреннюю стенку 32 и содержащая свободный конец 33, зажата между двумя колесами (не показаны), причем одно из двух колес приводится в действие шаговым двигателем 37. На чертежах показано лишь одно из двух колес. Свободный конец 33 балки 31 снабжен магнитным элементом 38. Балка 31 может быть приведена в действие посредством шагового двигателя 37, в результате чего свободный конец 33 с магнитным элементом 38 продвигают или проводят сквозь участок 16 центрифуги и сквозь отверстие 29 в передней боковой стенке 28. Соответственно, свободный конец 33 балки 31 в максимально выдвинутом положении достигает участка передней платформы 15. В максимально отведенном положении свободный конец 33 балки 31 расположен за ротором 19 и, в частности, вне участка 16 центрифуги, в результате чего обеспечен свободный поворот ротора 19.

Механизм 30 загрузки может быть связан с носителем 26 микропланшета, размещенным на передней платформе 15, путем выдвижения балки 31 до обеспечения связи магнитного элемента со связующим элементом 27 носителя 26 микропланшета. При отведении балки 31 носитель 26 микропланшета втягивают в одну из пластин-поддонов 21 ротора 19. После достижения упора носителя 26 микропланшета в стопор 25, связь между магнитным элементом 38 балки 31 и связующим элементом 27 носителя 26 микропланшета нарушается путем дальнейшего отведения балки, и одновременно образуется связь между связующим элементом 27 носителя 26 микропланшета и магнитным элементом стопора 25, в результате чего связующий элемент 27 неподвижно зафиксирован в роторе 19.

Указанный механизм 30 загрузки может обеспечить связь центрифуги 14 с любой транспортировочной системой для транспортировки микропланшетов в автоматическом рабочем механизме. Рабочий механизм должен лишь разместить микропланшет 1 на носителе 26 микропланшета, расположенном на передней платформе 15. Затем механизм 30 загрузки может загружать и выгружать ротор 19. Кроме того, центрифуга 14 может быть размещена без передней пластины таким образом, что она непосредственно прилегает к транспортировочному конвейеру, причем микропланшеты 1 могут быть удалены с транспортировочного конвейера посредством механизма 30 загрузки, и могут быть повторно размещены на транспортировочном конвейере. В настоящем примере реализации использован носитель 26 микропланшета, содержащий связующий элемент 27. Также возможен вариант, в котором микропланшеты 1 снабжены подобными связующими элементами 27, в результате чего исключена необходимость использования носителя микропланшета.

Дополнительное преимущество заключается в том, что механизм 30 загрузки размещают на задней стороне участка 16 центрифуги таким образом, что центрифуга 14 может быть связана с существующим лабораторным механизмом без необходимости использования каких-либо промежуточных устройств. Указанный подход способствует интеграции центрифуги в существующие лабораторные механизмы.

В нижеприведенном описании раскрыто использование вышеописанного микропланшета 1 в установке 13 для тестирования с целью определения результата одной или нескольких реакций агглютинации.

Предпочтительно, выполнение способа начинают с обеспечения пустого микропланшета 1. Реакционные лунки 2 заполняют гелем посредством устройства для пипетирования. Для каждой выполняемой реакции агглютинации гелем заполняют отдельную реакционную лунку 2. В случае, если число реакций агглютинации меньше количества реакционных лунок 2, выполненных на одном микропланшете, лишние реакционные лунки не заполняют гелем.

После заполнения каждой из реакционных лунок заданным объемом геля микропластину подвергают центрифугирования с целью продвижения геля в нижнюю часть реакционных лунок таким образом, что гель заполняет участок для сбора и большую часть участка 7 сепарации, и не содержит пузырьков воздуха.

Вследствие выполнения этапа центрифугирования, обеспечена возможность заполнения реакционных лунок гелем на месте даже при использовании реакционных лунок малого диаметра. Исключена необходимость использования реакционных лунок, предварительно загруженных сепарирующим материалом. Естественно, также могут быть использованы и предварительно загруженные реакционные лунки.

Реакционные лунки, содержащие сепарирующий материал, загружают суспензией, содержащей заданный реагент. Различные реакционные лунки могут быть загружены различными реагентами. Реагенты обычно содержат антиген, антитело или клетки крови известной группы крови.

Заданный объем анализируемой пробы размещают в реакционных лунках, содержащих сепарирующий материал и реагент. Предпочтительно, материал одной пробы распределяют по реакционным лункам, содержащим различные реагенты, а материал различных проб может быть распределен по различным группам реакционных лунок. Соответственно, обеспечена возможность одновременного тестирования нескольких различных проб, причем каждую из проб тестируют относительно нескольких различных реагентов.

Микропланшет, содержащий реакционные лунки, загруженные пробами, реагентами и сепарирующим материалом, инкубируют, т.е. подвергают воздействию заданной температуры в течение заданного промежутка времени. Указанный этап инкубации может быть осуществлен в отдельном инкубаторе. При необходимости центрифуга содержит средства нагревания, в результате чего микропланшет может быть инкубирован в центрифуге. Затем микропланшет подвергают центрифугированию, на котором неагглютинированные части пробы проходят через гель в направлении нижней стенки 4 реакционных лунок 2. Неагглютинированные части пробы собирают в участке 10 для сбора реакционных лунок 2. В случае, если результат реакции агглютинации положительный (произошла агглютинация), агглютинированный материал пробы остается на верхней стороне сепарирующего материала (фиг. 4а). При незначительной реакции агглютинации или замедленной реакции агглютинации агглютинированные агрегаты имеют небольшой размер, удерживаются внутри геля и не достигают нижней стенки 4 или участка 10 для сбора реакционных лунок 2. Агглютинированный материал геля удерживается в геле и распространяется по нему, как показано на фиг. 4b и 4с. Чем слабее реакция агглютинации, тем больше число неагглютинированных частей пробы, и тем большая число частей пробы достигает участка 10 для сбора, как показано на фиг. 4d-4f.

По завершении этапа центрифугирования микропланшет выводят из центрифуги, и посредством линейной камеры получают изображения реакционных лунок с верхней стороны и с нижней стороны.

На каждой из фиг. 4a-4f показано изображение верхней стороны над соответствующей реакционной лункой 2, и изображение нижней стороны под соответствующей реакционной лункой. Уровни серого на указанных двух изображениях автоматически сравнивают, после чего вычисляют разность уровней серого. Результаты разделены на пять категорий: 0, 1+, 2+, 3+ и 4+. Каждая ступень различия отнесена к определенной категории, причем при наличии исключительно агглютинированного материала пробы верхняя сторона реакционной лунки является темной, а нижняя сторона реакционной лунки является светлой, и результат относят к категории 4+, а при крайне слабой реакции агглютинации все или почти все части пробы достигают участка 10 для сбора, и в этом случае нижняя сторона реакционной лунки является темной, а верхняя сторона является светлой (фиг. 4, 4f), и результат относят к категории 0 (отсутствие реакции агглютинации).

В случае, если материал пробы содержит эритроциты, предпочтительно получают цветные изображения и сравнивают интенсивность красного цвета на изображениях верхней стороны и нижней стороны.

В настоящем примере реализации поперечное сечение отверстия 3 реакционной лунки 2 имеет квадратную форму, а поперечное сечение участка 10 для сбора имеет круглую форму. Соответственно, на изображениях, полученных с верхней стороны, показан квадрат, а на изображениях, полученных с нижней стороны, показан круг. По форме полученного рисунка (в виде кругов или квадратов) можно определить, с какой стороны реакционной лунки: верхней или нижней получено изображение. При ручной обработке изображений указанный прием позволяет отличить изображения нижней стороны от изображений верхней стороны, что позволяет избежать ошибки. Следовательно, формы поперечных сечений отверстия 3 и участка 10 для сбора реакционных лунок 2 предпочтительно выполнены различными.

Абсолютная интенсивность цвета или уровень серого зависят от ряда обстоятельств, таких как фоновое освещение, вид сепарирующего материала, объем материала пробы, размещенного в каждой из реакционных лунок, и т.д. При сравнении изображений верхней стороны и нижней стороны реакционных лунок указанное воздействие нейтрализовано вследствие того, что заключение о наличии или отсутствии реакции агглютинации основано исключительно на различии в интенсивности цвета и/или уровне серого на двух изображениях. Указанный подход позволяет обеспечить высокую надежность и устойчивость исследования к ошибкам. Кроме того, облегчена калибровка тестов с использованием различных сепарирующих материалов и различных реагентов, в результате чего процедура в целом является крайне универсальной. Настоящая система особенно подходит для исследования большого количества проб с обеспечением высокой производительности при низких затратах.

В вышеописанном примере реализации сравнивают интенсивность цвета и/или уровень серого двух изображений верхней стороны и нижней стороны реакционной лунки. Изображения могут быть дополнительно сравнены с заданными изображениями пробы.

Список условных обозначений

1. микропланшет

2. реакционная лунка

3. отверстие

4. нижняя стенка

5. участок наполнения

6. переходный участок

7. участок сепарации

8. верхняя часть

9. нижняя часть (коническая часть)

10. участок для сбора

11. рамка

12. боковая стенка

13. установка для тестирования

14. центрифуга

15. передняя платформа

16. участок центрифуги

17. участок привода

18. бурт

19. ротор

20. вал

21. пластина-поддон

22. стенка основания

23. П-образная направляющая

24. ось поворота

25. стопор

26. носитель микропланшета

27. связующий элемент

28. передняя боковая стенка

29. отверстие

30. механизм загрузки

31. гибкая удлиненная балка

32. внутренняя стенка

33. свободный конец

34. верхняя лента

35. нижняя лента

36.

37. шаговый двигатель

38. магнитный элемент

39. фланец

40. противовес

41. ножка

42. бурт

43. сопло для пипетирования

44. верхняя линейная камера

45. нижняя линейная камера

Группа изобретений относится к способу определения результата реакции агглютинации, а также к микропланшету и устройству, используемым при осуществлении указанного способа. Способ определения реакции агглютинации включает этап реакции пробы с реагентом в лунке микропланшета, этап центрифугирования микропланшета, причем на этапе центрифугирования агглютинированный материал пробы отделяют от неагглютинированного материала пробы посредством сепарирующего материала, этап получения по меньшей мере одного изображения верхней стороны микропланшета и по меньшей мере одного изображения нижней стороны микропланшета и этап определения, на котором определяют положительный или отрицательный статус пробы в отношении реакции агглютинации путем сравнения интенсивности цвета и/или уровня серого на изображениях верхней стороны и нижней стороны микропланшета. Также раскрыты микропланшет для определения продуктов реакций агглютинаций и тестирующая установка для определения реакции агглютинации. Группа изобретений обеспечивает высокую надежность и высокую производительность определения результатов реакции агглютинации. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил.

1. Способ определения результата реакции агглютинации, включающий

- этап реакции, на котором обеспечивают возможность реакции пробы с реагентом в лунке (2), при этом используют микропланшет (1), содержащий множество лунок (2), расположенных в виде двухмерной матрицы,

- этап центрифугирования, на котором микропланшет (1) поворачивают таким образом, что нижняя стенка (4) лунки (2) направлена кнаружи относительно оси (24) поворота, причем на этапе центрифугирования агглютинированный материал пробы отделяют от неагглютинированного материала пробы посредством сепарирующего материала, такого как гель или матрица из шариков,

- этап получения изображения, на котором получают по меньшей мере одно изображение верхней стороны микропланшета (1) и по меньшей мере одно изображение нижней стороны микропланшета (1),

- этап определения, на котором определяют положительный или отрицательный статус пробы в указанной лунке (2) в отношении реакции агглютинации, причем сравнивают интенсивность цвета и/или уровень серого для указанной лунки на изображениях верхней стороны и нижней стороны микропланшета, причем при наличии исключительно агглютинированного материала пробы верхняя сторона реакционной лунки является темной, а нижняя сторона реакционной лунки является светлой, а при крайне слабой реакции агглютинации все или почти все части пробы достигают участка для сбора, и нижняя сторона реакционной лунки является темной, а верхняя сторона является светлой.

2. Способ по п. 1,

в котором на этапе центрифугирования микропланшет (1) поворачивают вокруг горизонтальной оси.

3. Способ по п. 1,

также включающий этап инкубации перед этапом центрифугирования.

4. Способ по п. 2,

также включающий этап инкубации перед этапом центрифугирования.

5. Способ по п. 1,

в котором реагент содержится в суспензии, а сепарирующий материал перемешивают в указанной суспензии.

6. Способ по п. 4,

в котором реагент содержится в суспензии, а сепарирующий материал перемешивают в указанной суспензии.

7. Способ по п. 1,

в котором реагент размещают поверх сепарирующего материала.

8. Способ по п. 6,

в котором реагент размещают поверх сепарирующего материала.

9. Способ по п. 1,

в котором проба содержит пробу клеток крови.

10. Способ по п. 8,

в котором проба содержит пробу клеток крови.

11. Способ по п. 1,

в котором реагент содержит антитела и/или антигены.

12. Способ по п. 10,

в котором реагент содержит антитела и/или антигены.

13. Способ по п. 1,

в котором при осуществлении способа микропланшет изначально содержит пустые лунки, а перед выполнением этапа реакции по меньшей мере некоторые из лунок заполняют сепарационным материалом, реагентом и материалом пробы.

14. Способ по п. 12,

в котором при осуществлении способа микропланшет изначально содержит пустые лунки, а перед выполнением этапа реакции по меньшей мере некоторые из лунок заполняют сепарационным материалом, реагентом и материалом пробы.

15. Микропланшет для определения продуктов реакций агглютинации, содержащий множество лунок (2), расположенных в виде двухмерной матрицы,

при этом по меньшей мере одна из указанных лунок содержит участок (7) сепарации, содержащий сепарирующий материал, такой как гель или матрица из шариков,

причем участок (7) сепарации содержит нижнюю часть в виде конической части (9), сужающейся книзу, и ведущей в участок (10) для сбора материала пробы, проходящего через сепарирующий материал, на нижнем конце лунки, причем участок (10) для сбора предпочтительно имеет форму полого цилиндра, в результате чего материал пробы, проходящий через сепарирующий материал, сконцентрирован в центре соответствующей лунки (2).

16. Микропланшет по п. 15,

в котором участок (7) сепарации содержит полый цилиндр.

17. Микропланшет по п. 15,

в котором лунки (2) содержат участок (5) наполнения на верхнем конце лунок (2), причем площадь поперечного сечения участка (5) наполнения превышает площадь поперечного сечения участка (7) сепарации.

18. Микропланшет по п. 16,

в котором лунки (2) содержат участок (5) наполнения на верхнем конце лунок (2), причем площадь поперечного сечения участка (5) наполнения превышает площадь поперечного сечения участка (7) сепарации.

19. Микропланшет по п. 15,

в котором микропланшет (1) содержит по меньшей мере 96 лунок, и/или

в котором внутренняя высота реакционных лунок (2) составляет от 5 мм до 20 мм.

20. Микропланшет по п. 18,

в котором микропланшет (1) содержит по меньшей мере 96 лунок, и/или

в котором внутренняя высота реакционных лунок (2) составляет от 5 мм до 20 мм.

21. Тестирующая установка для определения результата реакции агглютинации, содержащая

центрифугу (14), камеру (44) для регистрации верхней стороны реакционной лунки (2), камеру (45) для регистрации нижней стороны реакционной лунки и блок управления для осуществления способа определения результата реакции агглютинации по любому из пп. 1-14, в котором использован микропланшет по любому из пп. 15-20.