Способ определения агглютинации энтеробактерий Советский патент 1988 года по МПК G01N33/53 

Од

N«

00 ОС

Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается вопросов серологического анализа и может быть использовано при диагностике инфек- адонных заболеваний и идентификации бактерий.

Цель изобретения - повышение точ- |Ности способа за счет повышения чувствительности определения о

Способ осуществляют следующим об- |разом.

I Суспензию энтеробактерий {концентрация от микробных тел/мл) смешивают .с разведенной агглютинирую щей сывороткой в объемных соотношени }ях 1:10, Целесообразно выбирать Ьбъемные соотнощения, не превышающие соответств енно 0,1 мл и 1,0 мл. При этом готовят две идентичные .пробы. Целее полученные пробы анализируют на содержание агглютинатов энтеробактерий проточньв фотоэлектрическим Методом путем их количественного подсчета с помощью соответствующего устройства. При этом первое измере- ие через 1-3 мин проводят сначала fc одной пробой, а второе измерение Мерез 20-40 мин от начала реакции с {другой пробой. Для анализа каждый |раз отбирают строго постоянный объем fipo6bi. Перед, измерением отобранный |объем разводят ампульным физиологи- :ческим раствором так, чтобы разведе- |ние вновь полученной пробы было в 110 раз больше исходной. После этого |прОБодят регистрацию количества агглютинатов в 1 мл новой пробы. При этом подсчитывают только те агглюти- наты, размеры которых достигли или превышают 5 мкм„Положительным результатом регистрации РА энтеробактерий считают вариант, при котором количество агглютинатов определенное при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом, более чем в 1,3 раза. Во всех других вариантах результат считают отрицательным.

В предлагаемом способе величина бактериальных агломератов, регистрируемых как агглютинаты энтеробактерий ограничена по размерам нижним пределом, равным 5 мкм. Опытным путем получено, что в процессе агглютинации на начальной стадии реакции преобладающим размером, образующихся в пробе агглютинатов, является величина 7/ 5 мкм, что обусловлено слипа

0

5

5

0

5

0

45

50

55

нием (.под действием сыворотки) 5-10 клеток энтеробактерий со средними размерами 1-1,5 мкм (верхний предел размеров регистрируемых агглютинатов не указьшается, так как при использовании для постановки РА сывороток с высокой агглютинирующей активностью, отдельные агглютинаты могут достигать величины, при которой становятся различимы даже невооруженным глазом). Вместе с тем, в анализируемой пробе, наряду с агглютинатами энтеробактерий, образующиеся в ходе РА, возможно наличие спонтанноагглютинировав- ших бактерий В неагглютинированных суспензиях энтеробактерий максимальные размеры спонтанных агломератов практически не превышают 5 мкм и их количество может колебаться на фоне общей бактериальной массы.

В силу указанных обстоятельств, с целью исключения артефактов при учете РА регистрируют только агглютинаты, размеры которых 5 мкм. При этом регистрация агглютинатов с размерами 5 мкм возможна, так как при повременном учете количество спонтанно агглютинировавших бактерий и других частиц (загрязнение) с этими размерами не будет существенно изменяться (экспериментально установлено, что максимальное изменение уровня спонтанной агглютинации в течение времени регистрации РА не превьшает 1,3 раза). При подсчете агглютинатов допустимые значения отношений количества агглютинатов при втором измерении N(t 2) к количеству агглютинатов при первом N(t|), при которых возможен положительный учет РА должны быть выше 1,3. При всех значениях ,)/N(t.,) 1,3 изменение количества агглютинатов в процессе РА становится сравнимо с колебаниями уровня спонтанной агглютинации. В этом случае достоверность результатов не гарантируется.

Регистрируют агглютинацию энтеробактерий при двух отсчетах времени. Целесообразно проводить первое измерение в интервале 1-3 мин от начала РА. Как известно, в течение первых трех минут протекает специфическая фаза реакции.- При этом на первой минуте агглютинации, как правило, не происходит - реакция характеризуется взаимодействием антител сыворотки с гомологичными антигенами знтеробактерий. Далее специфическая фаза сопровождается начальной агглютинацией бактерий. Через 3 мин специфическая фаза завершается - реакция характеризуется нарастанием количества агглютинатов в пробе. Второе измерение числа агглютинатов в пробе целесообразно ГФОБОДИТЬ через 20 - 40 мин от начала РА, Это обусловлено тем, что при использовании для постановки РА сывороток с низкими агглютинирующими свойствами (например, разведенной до титра) процесс нарастания количества агглютинатов в пробе значительно растянут во времени При этом за время 3 мин изменение (увеличение) числа агглютинатов в ходе РА может оказаться

1,3, что не позволяет отдифференцировать РА от колебаний уровня спонтанной агглютинации С другой стороны, возможны случаи, когда через 40 мин количество регистрируемых агпробы, для чего берут по 0,05 мл стан дартного сальмонеллезного бактериального диагностикума - 0(7) и добавляют по 0,5 мл агглютинирующей сыворотки к сальмонеллам группы С,, разведенной 1:1600 ампульным физиологическим растворомо Через 1 мин одну из проб разводят в 10 раз ампульным фи10 зиологическим раствором подсчитывают число агглютинатов в пробе проточным фотоэлектрическим методоМо

Через 20 мин тем же путем проводят подсчет числа агглютинатов в дру15 гой пробе. По отношению числа агглю- тинат Ьв при первом измерении к числу агглютинатов при втором измерении делают заключение о регистрации РА (положительная) .

20 Пркмер2о Регистрируют агглютинацию бактерий рода Salmonella Предварительно готовят две идентичные пробы, для чего берут по 0,05 мл стандартного сальмонеллезного диа гнос

глютинатов может существенно снизить- 25 тикума -0(7) и добавляют по 0,5 мл

агглютинирующей сыворотки к сальмося, во-первых, по причине их укруп-- нения с соответствующим уменьшением количества, во-вторых, в результате возможного эффекта обратимости РА,

неллам группы С,, разведенной 1:1600 ампульным физиологическим раствором„ Через 2 мин одну из проб разводят в

пробы, для чего берут по 0,05 мл стандартного сальмонеллезного бактериаль ного диагностикума - 0(7) и добавляют по 0,5 мл агглютинирующей сыворотки к сальмонеллам группы С,, разведенной 1:1600 ампульным физиологическим растворомо Через 1 мин одну из проб разводят в 10 раз ампульным фи0 зиологическим раствором подсчитывают число агглютинатов в пробе проточным фотоэлектрическим методоМо

Через 20 мин тем же путем проводят подсчет числа агглютинатов в дру5 гой пробе. По отношению числа агглю- тинат Ьв при первом измерении к числу агглютинатов при втором измерении делают заключение о регистрации РА (положительная) .

0 Пркмер2о Регистрируют агглютинацию бактерий рода Salmonella Предварительно готовят две идентичные пробы, для чего берут по 0,05 мл стандартного сальмонеллезного диа гноснеллам группы С,, разведенной 1:1600 ампульным физиологическим раствором„ Через 2 мин одну из проб разводят в

Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения - повьппе- ние точности и чувствительности. Суспензию энтероба |:терий смешивают с разведенной агглютинирующей сывороткой. Пробы анализируют на содержание агглютинатов энтеробактерий.Подсчитывают те агглютинаты, размеры которых 5 мкм или больше. Положительным результатом считают вариант, при котором количество агглютинатов при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом измерении более, чем в 1,3 раза. Способ обеспе- чивает возможность регистрации реакции агглютинации на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспензии энте- робактерий.

при котором из-за нарушения оптималь-30 Ю раз тем же физиологическим раство- ности соотношений исходных ингредиен- ром и проводят под-счет агглютинатов, тов РА, происходит перегруппировка

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогична примеру 1. Через 30 мин

агглютинатов, сопровождающаяся их частичным разрушением. В силу этих

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогична примеру 1. Через 30 мин

эффектов условие N(t )/N(t )1 ,3 мо- проводят подсчет агглютинатов во втожет быть нарушено

Приготовление двух идентичных проб для повременного учета РА необходимо в целях исключения нарушения процесса агглютинации -при отборе час- 40 ти пробы для измерения, так как при работе с одной пробой возможны нарушения соотношения ингредиентов РА„ При зтом искажается результат анализа.

Предварительное разведение исходной пробы перед измерением, обеспечивает разделение агглютинатов друг от друга и дает возможность учета каждорой пробе тем же путем По соотношению числа агглютинатов при первом и втором измерениях делают заключение о регистрации РА (положительная).

Использование предлагаемого способа регистрации агглютинации знтеро- бактерий обеспечивает (по сравнению с известным) возможность регистра- 45 ции РА на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспензии энтеробактерий. При этом обеспечивается возможность счета отдельных агглютинатов в пото-

го из них в отдельности, а также поз- 50 пробы, что позволяет увеличить воляет преостановить РА и зарегистри- чувствительность способа (в сравнес известным) на 4-5 порядков.

ровать мгновенную картину агглютинации в определенный момент времени.

Способ может быть реализован на серийно выпускаемом приборе класса ПКЖ..

П р и м е р 1 о Регистрируют агглютинацию бактерий рода Salmonella. Предварительно готовят две идентичные

55

НИИЭто дает возможность учитывать практически единичные агглютинаты, образующиеся в пробе в ходе РА, что в сочетании с повременным учетом их количества позволяет существенно повысить точность (достоверность) регистрируемых параметров.

Ю раз тем же физиологическим раство- ром и проводят под-счет агглютинатов,

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогична примеру 1. Через 30 мин

проводят подсчет агглютинатов во второй пробе тем же путем По соотношению числа агглютинатов при первом и втором измерениях делают заключение о регистрации РА (положительная).

Использование предлагаемого способа регистрации агглютинации знтеро- бактерий обеспечивает (по сравнению с известным) возможность регистра- ции РА на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспензии энтеробактерий. При этом обеспечивается возможность счета отдельных агглютинатов в пото-

с известным) на 4-5 порядков.

5

НИИЭто дает возможность учитывать практически единичные агглютинаты, образующиеся в пробе в ходе РА, что в сочетании с повременным учетом их количества позволяет существенно повысить точность (достоверность) регистрируемых параметров.

5 14064886

Предлагаемый способ, (в отличие отагглютинации прсредством измерения

известного) позволяет проводить экс-светорассеяния в пробе, о т л и пресс-оценку агглютинации энтеробак-чающийся тем, что, с целью

терий, так как обеспечивает воэмож-повышения чувствительности и точносность получения результатов РА в те-ти, регистрацию проводят проточным

чение 20-30 мин,фотоэлектрическим методом путем подсчета числа агглютинатов с раэмераФормула изобретенийми 5 мкм и вьппе дважды через 1-3 и

Способ определения агглютинации Q 20-40 мин от начала реакции и при

энтеробактерий путем обработки сус-увеличении числа более чем в 1,3 рапензии агглютинирующим реагентом сза определяют агглютинацию.энтеропоследующей регистрацией микробной бактерий.