ТЕТРАДЕКАПЕПТИДЫ, УЛУЧШАЮЩИЕ ВОССТАНОВИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ИШЕМИИ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/10 A61P9/10 

Изобретение относится к биологически активным пептидам, способным влиять на метаболическое и функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, а также к лекарственным средствам на их основе. Предложены тетрадекапептиды (I)-(III) общей формулы H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-X-Gly-Pro-Y,

где

Заявляемые пептиды могут найти применение в качестве лекарственных средств для кардио- и нейропротекции при острых ишемических состояниях сердечно-сосудистой системы.

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает первое место в структуре смертности от заболеваний системы кровообращения (на втором месте сосудистые заболевания мозга) [1, 2]. Несмотря на прогресс в лечении данного ряда заболеваний, количество смертей от них в мире продолжает неуклонно расти.

Морфологической основой ИБС в 95-97% случаев является атеросклероз коронарных артерий, ведущий к их сужению и нарушению коронарного кровотока и адекватной перфузии миокарда. Окислительный стресс, возникающий при нарушении сердечного метаболизма, запускает каскад биохимических процессов в миокарде и сосудистом эндотелии, что приводит к разрушению и гибели кардиомиоцитов [3].

В настоящее время ведется активный поиск новых кардиопротекторных веществ и создание на их основе противоишемических препаратов. Эти препараты должны быть направлены на снижение степени повреждения сердца в период восстановления нормального кровотока (реперфузии) и восстановление энергетического обмена в миокарде. Использование в качестве таких препаратов регуляторных пептидов, связанных с G-белками, является весьма перспективным направлением в данной сфере. Было обнаружено, что C-концевые фрагменты пептида апелина способны защищать сердце от ишемического и реперфузионного стресса. Также были разработаны стабильные и устойчивые при хранении синтетические структурные аналоги природного апелина-12, способные защищать сердце при экспериментальном ишемическом и реперфузионном повреждении ex vivo и in vivo.

Следует отметить, что в последнее время высок интерес к изучению сочетанных сосудистых расстройств, в частности взаимосвязи ишемических состояний с риском возникновения инсульта и, наоборот, влияния мозговых нарушений на сердце. В частности, было показано, что метаболические инсульты приводят к начальной стадии глобальной ишемии при перфузии сердца у крыс. В этой связи, в качестве потенциальных лекарственных средств могут выступить нейропротективные пептиды, действующие и в сердечно-сосудистой системе.

Известен нейропептид галанин, состоящий из 29 аминокислотных остатков, который синтезируется в гипоталамусе, спинном мозге и кишечнике. Данные о действии галанина на сердечно-сосудистую систему ограничены. В сердце существуют все субтипы рецепторов галанина. Было показано, что выделяющийся из симпатических нейронов сердца галанин ингибирует холинергическую нейротрансмиссию и стимулирует регенерацию аксонов в сердце при ишемии.

За связывание с рецепторами отвечает N-концевой фрагмент галанина, первые 15 аминокислотных остатков которого консервативны у большинства видов млекопитающих.

N-концевой фрагмент галанина (2-11) широко экспрессируется в центральной нервной системе, регулируя огромное количество физиологических и патологических процессов, взаимодействуя с тремя G-протеин-связанными рецепторами - GalR1, GalR2 и GalR3, что делает их мишенями для создания таргетных пептидных лекарственных препаратов. Изучению галанина как нейропротективного средства посвящено огромное количество научной и патентной литературы, в частности была предложена фармацевтическая композиция для лечения мозговых нарушений, содержащая пептид галанин (2-11). Галанин (2-11) является одним из немногочисленных лигандов, обладающих высокой аффинностью к GalR2, гораздо меньшим сродством к GalR1, и практически не активирует GalR3. Можно предположить, что запуск галанином сигнального пути через рецептор GalR2 способен снижать гибель кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии сердца, так как было показано, что этот путь активирует ферменты, влияющие на сердечный метаболизм.

В предварительных опытах на перфузируемом сердце крысы было продемонстрировано существенное улучшение восстановления функции сердца после тотальной ишемии при реперфузии с галанином (2-11). Однако данный пептид оказался плохо растворим в воде, что затрудняет его исследование как потенциального терапевтического средства. Для преодоления проблемы растворимости синтезировали и исследовали более длинный N-концевой фрагмент галанина - галанин (2-15). Этот пептид обладает сродством к рецептору GalR2 и лучшей растворимостью в воде.

Известен близкий по химической структуре к заявляемым пептидам (I)-(III) фрагмент галанина (1-15), обладающий вазоактивным действием (Diaz-Cabiale Z., Parrado C., Vela C. et al Role of galanin and galanin (1-15) on central cardiovascular control. Neuropeptides. 2005; 39: 189-190).

Однако механизмы его действия и влияния на ишемизированный миокард остаются неизученными. Так как модифицированные пептиды галанина ранее не были изучены в экспериментальных исследованиях как потенциальные кардиопротекторы, в качестве наиболее близкого прототипа был использован фрагмент природного галанина (2-15) Н-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-OH (пептид IV).

Библиография патентов по аналогам N-концевого фрагмента галанина (2-15) не содержит сведений по предмету изобретения - разработке кардиопротекторных средств на основе пептидов химической структуры I-III. В доступной литературе также отсутствуют данные о влиянии прототипа IV - природного галанина (2-15) на повреждения функции сердца и мембран кардиомицитов, возникающие в результате ишемии и последующей реперфузии.

Задачей настоящего изобретения является синтез структурных аналогов галанина (2-15), обладающих способностью улучшать функцию сердечно-сосудистой системы при повреждениях, вызванных ишемией и реперфузией.

Технический результат изобретения заключается в улучшении функции сердечно-сосудистой системы при повреждениях, вызванных ишемией и реперфузией.

Технический результат достигается твердофазным синтезом (ТФС) тетрадекапептидов:

Для получения пептидных молекул с улучшенными свойствами были применены приемы структурной модификации, обеспечивающие повышенную устойчивость пептидов к действию протеолитических ферментов: амидирование C-концевой аминокислоты (пептид I), введение в пептидную цепь остатков неприродных аминокислот (бета-аланина в пептид II или норлейцина в пептид III). Кроме того, для повышения растворимости в водных средах в молекулу пептида III в качестве C-концевой аминокислоты был введен остаток аргинина. Следует отметить, что любой дизайн пептидных молекул является чисто теоретическим подходом. В ряду пептидных аналогов на основе одной аминокислотной последовательности не существует четкой взаимосвязи структура-активность, так как каждый модифицированный пептид является уникальным химическим соединением, его биологическая активность не является очевидной и требует экспериментального подтверждения.

Синтез тетрадекапептидов (I)-(IV) проводили с С-конца с применением Fmoc(9-флуоренилметоксикарбонил)-методологии. Протоколы синтезов приведены в примерах. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную (Bu^t) для гидроксильной функции серина, треонина и тирозина, тритильную (Trt) - группу для имидазольной функции гистидина и амидной функции аспарагина, трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - для индольного кольца триптофана, 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильную (Pbf) - для гуанидиновой функции аргинина.

Для деблокирования α-аминогрупп в процессе ТФС использовали раствор, содержащий 10% 4-метилпиперидина (4-MePip) и 2% 1,8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ена (DBU) в N,N'-диметилформамиде (DMF). В качестве конденсирующего агента использовали N,N,N',N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил)урония тетрафторборат (TBTU) и N-метилморфолин (NMM). Отщепление и деблокирование тетрадекапептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты (TFA) со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции, и очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до 97-98%-й чистоты.

Структуру пептидов подтверждали данными ¹H-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI).

Заявляемое техническое решение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Синтез тетрадекапептида H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-NH₂ (I)

В работе были использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem и Fluka (Швейцария), реагенты: DBU, 4-метилпиперидин, NMM, TBTU, TFA и триизобутилсилан (TIBS) и растворители: дихлометан (DCM), DMF, N-метилпирролидон (NMP) фирмы Fluka (Швейцария).

Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы Panreac (Испания). Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке Диасфер С18 (РФ) (4.0×250 мм, размер частиц сорбента - 5 мкм) на хроматографе фирмы Gilson (Франция). В качестве элюентов использовали: буфер А - 0.1% TFA, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, пептиды элюировали градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин со скоростью 1 мл/мин, детекцию пептидов осуществляли при длине волны 220 нм. Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Knauer (ФРГ) с использованием колонки Eurosphere ODS (20×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А - 0.1% TFA, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А. Элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б в буфере А от 100% буфера А со скоростью 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 220 нм. Фракции, соответствующие целевому веществу, объединяли, концентрировали в вакууме и лиофилизировали.

¹H-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в дейтерированном диметилсульфоксиде (DMSO-d₆) при 300 K, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл, химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на приборе Ultraflex MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics (ФРГ).

Пептид (I) был синтезирован автоматическим твердофазным методом на полимере Ринка, представляющем собой сополимер стирола и 1% дивинилбензола, с 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)-феноксиметильной якорной группировкой (Nova BioChem, Швейцария), предназначенном для получения амидов пептидов. Синтез проводили автоматическим методом с использованием Fmoc-производных аминокислот на пептидном синтезаторе Tribute-UV (Protein Technologies, Inc., США), исходя из 0.53 г (0.375 ммоль) амидного полимера Ринка, содержащего 0.71 ммоль/г аминогрупп. Использовался стандартный протокол автоматического синтезатора для однократной конденсации 4-кратного избытка Fmoc-аминокислоты (Fmoc-AA) по отношению к содержанию аминогрупп в полимере методом TBTU/NMM. Синтетический цикл приведен в таблице 1.

* Деблокирование α-аминогрупп происходит под контролем полноты отщепления Fmoc-защиты по данным УФ-мониторинга (при неполном отщеплении защиты за 1,5 мин реакцию автоматически повторяют необходимое количество раз, как правило, не больше 2-х повторов).

Вес пептидилполимера по окончании синтеза составил 1.32 г. Заключительное деблокирование проводили в одну стадию действием смеси 10 мл TFA, 0.5 мл деионизированной воды, 0.5 мл TIBS и 0.5 г дитиотреитола в течение 1.5 ч при интенсивном перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали, сырой пептид осаждали сухим холодным диэтиловым эфиром, отфильтровывали, промывали на фильтре DCM и диэтиловым эфиром. Выход «сырого» продукта ТФС составил 0.60 г, содержание целевого вещества по данным аналитической ВЭЖХ - 78%. Пептид (I) очищали (порциями по 0.2 г) с помощью препаративной ВЭЖХ в указанных выше условиях. Выход целевого пептида (I) составил 0. 16 г (28.4, % в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру), чистота - 95.8%. Данные масс-спектрометрии: m/z 1498.68 (вычислено 1498.64). ¹Н-ЯМР - спектрометрия показала корректный аминокислотный состав (данные не приводятся).

Характеристики заявляемых пептидов и прототипа приведены в таблице 2.

Пример 2. Синтез тетрадекапептида H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH (II) проводили на автоматическом твердофазном синтезаторе Tribute-UV согласно протоколу, представленному в табл. 1. При синтезе пептида (II) исходили из 0.53 г (0.375 ммоль) Fmoc-His(Trt)-полимера фирмы Nova Biochem, Швейцария со степенью замещения стартовой аминокислотой - 0.71 ммоль/г. В качестве полимерного носителя использовали полимер Ванга (сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой), предназначенный для получения пептидов с C-концевой карбоксильной группой. Для наращивания пептидной цепи использовали 1.5 ммоль каждой Fmoc-аминокислоты - 4-х кратный избыток по отношению к аминоацилполимеру. Отщепление защитных групп и очистку целевых продуктов проводили так же, как описано в примере 1. После очистки методом ВЭЖХ в описанных выше условиях было получено 0.18 г пептида (II) с чистотой 97.4%. Его характеристики приведены в таблице 2.

Пример 3. Синтез тетрадекапептида H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Nle-Gly-Pro-His-Arg-OH (III) проводили на автоматическом твердофазном синтезаторе Tribute-UV согласно протоколу, представленному в табл. 1. При синтезе пептида (III) исходили из 0.625 г (0.375 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-полимера Ванга фирмы Nova Biochem, Швейцария со степенью замещения стартовой аминокислотой 0.60 ммоль/г. Для наращивания пептидной цепи использовали 1.5 ммоль каждой Fmoc-аминокислоты - 4-х кратный избыток по отношению к аминоацилполимеру. Отщепление защитных групп и очистку целевых продуктов проводили так же, как описано в примере 1. После очистки с помощью ВЭЖХ в описанных выше условиях было получено 0.16 г пептида (III) с чистотой 95.2%. Его характеристики приведены в таблице 2.

Пример 4. Синтез тетрадекапептида - прототипа H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-OH (IV) (галанина 2-15). Твердофазный синтез пептида IV проводили, исходя из 0.59 г (0.375 ммоль) Fmoc-Ala-полимера Ванга фирмы Nova Biochem, Швейцария со степенью замещения 0.64 ммоль/г, на автоматическом твердофазном синтезаторе Tribute-UV согласно протоколу, представленному в табл. 1. Для наращивания пептидной цепи использовали 1.5 ммоль каждой Fmoc-аминокислоты - 4-х кратный избыток по отношению к аминоацилполимеру. По окончании ТФС пептидилполимер переносили на стеклянный фильтр и промывали DMF (3×10 мл), DCM (3×10 мл), сушили на воздухе. После сушки получено 1.3 г пептидилполимера. Заключительное деблокирование проводили в одну стадию действием смеси 10 мл TFA, 0.5 мл деионизированной воды, 0.5 мл TIBS и 0.5 г дитиотреитола в течение 1.5 ч при интенсивном перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали, сырой пептид осаждали сухим холодным диэтиловым эфиром, отфильтровывали, промывали на фильтре DCM и эфиром. Выход сырого продукта ТФС составил 0.71 г, содержание целевого продукта 69% по данным аналитической ВЭЖХ. Целевой галанин (2-15) выделяли с помощью препаративной ВЭЖХ в указанных выше условиях. Выход целевого пептида (IV) составил 0.26 г, 46.2% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру, чистота 96.6%. Данные масс-спектрометрии: m/z 1499.72 (вычислено 1499.67). ¹Н-ЯМР - спектрометрия показала корректный аминокислотный состав (данные не приводятся).

* Выход приведен в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру.

** Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке Диасфер 110- С-18 4,0×250 мм,

с сорбентом С18, размер частиц 5 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0.1% ТФУ, pH 3.0, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, пептиды элюировали градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин со скоростью 1 мл/мин. Детекцию осуществляли при длине волны при 220 нм.

Оценка кардиопротекторных свойств пептидов галанина

Для исследования кардиозащитных свойств пептидов использовали модель глобальной ишемии и реперфузии изолированного перфузируемого сердца крысы и модель региональной ишемии и реперфузии сердца у наркотизированных крыс in vivo. Обе модели обеспечивают анализ влияния пептидов на показатели функции сердца и коронарных сосудов, параметры гемодинамики, размеры инфаркта миокарда, метаболическое состояние сердца и повреждения мембран кардиомиоцитов при реперфузии в сравнении с исходным состоянием до ишемии. Опыты выполнены на сердце крыс-самцов линии Wistar (290-340 г). Все эксперименты проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья, США, №85-23).

Пример 5. Влияние пептидов галанина на восстановление функции сердца при реперфузии

Модель глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца крысы. У наркотизированных уретаном животных (1,25 мг на г массы тела, внутрибрюшинно) извлекали сердце и перфузировали ретроградно в течение 15-20 мин раствором Кребса-Хензелейта (РКХ) с 11 мМ глюкозой, насыщенным карбогеном (95% О₂ + 5% СО₂), pH 7,4±0,1 при 37°C, при постоянном перфузионном давлении 60 мм рт. ст. После этого сердца перфузировали антеградно по методу Нийли при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт. ст. и среднем перфузионном давлении в аорте 60 мм рт. ст. [14]. Давление в аорте и левом желудочке регистрировали при помощи тензометрических датчиков Р50, монитора SP1405 и регистратора SP2010 (Gould Statham, США). Показателем интенсивности сократительной функции (СФ) левого желудочка служило произведение частоты сокращений сердца (ЧСС) на развиваемое давление (разность между систолическим и минимальным диастолическим давлением). Насосную функцию левого желудочка оценивали по величине минутного объема (МО - сумме коронарного потока и аортального объема).

Протокол опытов. После 20-мин перфузии сердца по Нийли регистрировали показатели функции сердца и коронарных сосудов (исходное состояние). Далее в контрольных опытах осуществляли 5-мин инфузию РКХ с постоянной скоростью 4 мл/мин и подвергали сердца глобальной нормотермической (37°C) ишемии в течение 35 мин. За ишемией следовала 5-мин ретроградная инфузия РКХ со скоростью 4 мл/мин и реперфузия по Нийли в течение 25 мин.

Влияние прототипа - N-концевого фрагмента галанина 2-15 (пептид IV) и заявляемых пептидов (I-III) на восстановление коронарной, сократительной и насосной функции левого желудочка изучено после 35-мин глобальной ишемии и 30-мин реперфузии. Пептиды добавляли в РКХ (после предварительного растворения в ДМСО). Конечная концентрация ДМСО в РКХ составляла 0,12%. Оптимальная концентрация пептидов в РКХ составляла 210-220 мкМ. Она была определена в отдельных сериях опытов для каждого пептида в диапазоне концентраций от 25 до 350 мкМ. РКХ с пептидами вводили в аорту в течение 5 мин с постоянной скоростью 4 мл/мин после глобальной ишемии, далее перфузию проводили РКХ без пептидов. В контроле в аорту после ишемии вводили РКХ без пептидов.

Результаты опытов. В исходном состоянии величина коронарного потока составила 17±2 мл/мин, ЧСС - 301±1 уд./мин, интенсивность СФ - 30380±373 мм рт. ст./мин, МО - 43±1 мл. На Фиг. 1 сопоставлено влияние оптимальных концентраций пептидов I-IV на восстановление основных показателей функции сердца и коронарных сосудов к концу реперфузии после периода глобальной ишемии. В контроле наблюдали сниженное восстановление коронарного потока и ЧСС (до 76 и 78% от исходных значений, соотв.) и значительное уменьшение интенсивности СФ сердца и основного показателя насосной функции МО (до 47 и 31%, соответственно). Инфузия пептида IV после ишемии достоверно улучшала восстановление всех показателей, кроме коронарного потока. При сравнении действия заявляемых пептидов были выявлены следующие особенности. Каждый из них достоверно увеличивал восстановление показателей сократительной и насосной функции сердца, ЧСС и коронарного потока по сравнению с контролем. Преимущества заявляемых пептидов I и II по сравнению с прототипом проявлялись в достоверно лучшем восстановлении коронарного потока, интенсивности СФ и МО. В наибольшей степени защитные эффекты проявлялись при использовании пептида II. На Фиг. 1 показано влияние инфузии пептидов галанина I-IV после ишемии на восстановление показателей функции изолированного сердца крысы в конце реперфузии. Контроль - инфузия РКХ, концентрация пептидов I, II и IV в РКХ составляла 220 мкМ, концентрация пептида III - 210 мкМ. Представлены M±m, полученные в сериях из 8 опытов. Достоверно отличается (Р<0,05) от: * контроля, # IV (прототипа).

На основании анализа полученных результатов (Фиг. 1) можно заключить, что эффективность защиты функции сердца и сосудов от ишемического и реперфузионного повреждения под действием заявляемых пептидов увеличивается в ряду III<I<II.

Пример 6. Влияние пептидов галанина на ограничение размеров инфаркта миокарда у крыс

Модель региональной ишемии и реперфузии сердца у крыс in vivo. У наркотизированных 20% уретаном крыс (120 мг/кг, внутрибрюшинно) в условиях трахеотомии осуществляли искусственную вентиляцию легких комнатным воздухом с помощью аппарата KTR-5 (Hugo Sacks Electronik). Яремную вену катетеризировали для окрашивания интактной зоны сердца раствором Эванса в конце опыта. Сонную артерию катетеризировали для регистрации артериального давления. После присоединения артериального катетера к тензометрическому датчику регистрировали систолическое артериальное давление (САД) и ЧСС на полиграфе Biograph-4 (Санкт-Петербургский госуниверситет аэрокосмического приборостроения). Запись на компьютер выполнена с помощью аналого-цифрового преобразователя USB 6210 (National Instruments, США) и программы в системе LabView 7 (National Instruments, США).

Для создания региональной ишемии миокарда левый желудочек (ЛЖ) прошивали атравматической иглой 5-0 под левым ушком в направлении, перпендикулярном большой оси сердца. Затягивание лигатуры на передней нисходящей коронарной артерии (ПНА), находящейся в толще прошитого миокарда, прекращало кровоснабжение участка миокарда; ослабление лигатуры приводило к восстановлению коронарного потока. Показатели кислотно-основного баланса артериальной крови (pH, pO₂ и pCO₂) в течение всего опыта контролировали на кислотно-основном газоанализаторе ABL-30 (Radiometer) и поддерживали на физиологическом уровне. После окончания препарирования следовал 30-минутный период стабилизации гемодинамических показателей (исходное состояние). В контрольных опытах после этого выполняли окклюзию передней нисходящей артерии (ПНА) продолжительностью 40 мин, длительность последующего восстановления коронарного кровотока (реперфузии) составляла 60 мин. Перед началом реперфузии в контроле вводили внутривенно болюсом 0,5 мл физиологического раствора.

Протокол опытов. В экспериментальных сериях после периода региональной ишемии внутривенно болюсом вводили пептиды галанина - IV (прототип) и заявляемые пептиды I, II и III в дозах 0,5; 1,0; 2,0 или 3,0 мг/кг веса одновременно с началом реперфузии. В контроле вводили такой же объем (0,5 мл) физиологического раствора. В отдельных сериях опытов было изучено влияние растворителя пептидов галанина ДМСО (0,2%) на размеры ИМ. Для идентификации зоны риска (ЗР) и интактной области миокарда в конце опыта окклюдировали ПНА, в яремную вену вводили болюсом 2 мл 2% раствора Эванса. Затем выделяли сердце и отделяли ЛЖ, который замораживали при температуре -20°C для определения размеров ИМ. Из замороженной ткани ЛЖ готовили поперечные срезы толщиной около 1,0-1,5 мм, которые инкубировали 10 мин в 1% растворе 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4 при температуре 37°C). Полученные образцы сканировали на сканере Epson 2480, площади ИМ и ЗР на изображениях срезов определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу Imagecal. После этого срезы взвешивали для определения массы ЛЖ. В каждой группе рассчитывали отношения ЗР/масса ЛЖ и ИМ/ЗР в процентах. Этот показатель сравнивали со значениями, полученными в контрольных сериях и в опытах с ДМСО, при отсутствии достоверных различий отношений ЗР/масса ЛЖ между опытной и контрольной группами, т.е. в условиях одинакового ишемического повреждения миокарда.

Результаты опытов. В таблице 3 представлены величина зоны риска и размер инфаркта миокарда в контрольной группе и в опытных группах I-IV. Величина ЗР/ЛЖ, % в группах с введением пептидов I-IV (среднее значение 39,9±0,8%) не отличалась достоверно от значения в контроле (39,2±0,7%). Это указывало на стандартное моделирование ишемического и реперфузионного повреждения сердца во всех исследуемых группах. Внутривенное введение растворителя пептидов ДМСО (проведено 6 опытов с концентрацией 0,2 или 1,0%) не оказывало влияния на ЗР/ЛЖ, % и ИМ/ЗР, % по сравнению с этими величинами в контроле. Введение пептида IV достоверно снижало ИМ/ЗР,% на 22±4% по сравнению с контролем. Применение пептидов I-III также достоверно ограничивало размеры ИМ - под их влиянием размер ИМ уменьшался в среднем на 29±1% по сравнению с контролем. Кардиопротекторное действие заявляемых пептидов увеличивалось в ряду I<III<II. При использовании оптимальной дозы пептида II 2,0 мг/кг веса ИМ снижался достоверно в большей степени, чем под действием прототипа IV (на 33±3% по сравнению с контролем), что свидетельствует о его преимуществе.

Приведены M±m для серий из 10-12 опытов. Значения ЗР/ЛЖ, % и ИМ/ЗР, % указаны для оптимальных доз пептидов (1,0 мг/кг веса для I и III и 2,0 мг/кг веса для II и IV), введенных внутривенно в начале реперфузии. Достоверно отличается (Р<0,05) от: ^а контроля, ^б прототипа IV.

Пример 7. Влияние пептидов галанина на повреждения сарколеммы кардиомиоцитов

Оценка повреждения клеточных мембран. Использовали модель региональной ишемии и реперфузии сердца у крыс in vivo, как указано в Примере 6. В конце реперфузии в плазме крови крыс определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и МВ-фракции креатинфосфокиназы (КФК-МВ). Кровь собирали в гепаринизированные пробирки из венозного катетера в исходном состоянии перед окклюзией ПНА и после часа реперфузии. Плазму отделяли центрифугированием (2000 об/мин в течение 10 мин при температуре 10°C). Активность ферментов в свежевыделенной плазме определяли спектрофотометрически при λ=340 нм, используя наборы фирмы BioSystems и реактивы Sigma-Aldrich. Результаты опытов представлены в таблице 4.

Приведены M±m для серий из 8-10 опытов. Активность ферментов в контроле и в опытах с пептидами галанина I-IV определяли в конце реперфузии. Достоверно отличается (Р<0,05) от: ^а исходного состояния, ^б контроля.

Из данных, представленных в табл. 4 видно, что активность КФК-МВ и ЛДГ в плазме крыс, подвергнутых региональной ишемии миокарда и последующей реперфузии (контроль), в конце опыта возрастала в 8 и 20 раз, соответственно, по сравнению со значениями в исходном состоянии. Под действием пептида IV активность КФК-МВ и ЛДГ достоверно снижалась в среднем на 40% по сравнению с контролем, что указывало на меньшие повреждения мембран кардиомиоцитов. Внутривенное введение пептидов I, II или III перед началом реперфузии также уменьшало активность обоих ферментов по сравнению с контролем. Несмотря на более низкие абсолютные значения активности ЛДГ (для пептидов I и III) и КФК-МВ (для пептида II), достоверных различий между модифицированными пептидами I-III и прототипом IV не обнаружено.

Из примеров 6 и 7 следует, что модифицированные аналоги фрагмента природного галанина (2-15) - пептиды I, II и III - способны снижать размеры инфаркта миокарда при моделировании ишемического и реперфузионного повреждения сердца у крыс in vivo. Причем в случае пептида II ограничение ИМ происходит более эффективно, чем при использовании прототипа. Этот защитный эффект сочетается с уменьшением активности маркеров некроза - КФК-МВ и ЛДГ - в плазме крови, что свидетельствует о меньших повреждениях клеточных мембран после региональной ишемии и реперфузии сердца.

Таким образом, впервые получены экспериментальные подтверждения того, что модифицированные аналоги природного галанина (2-15) - пептиды I, II и III, являются кардиопротекторными соединениями, способными улучшать восстановление функции сердца и снижать необратимые повреждения кардиомиоцитов после ишемического и реперфузионного повреждения. Экспериментально подтверждены их преимущества при защите сердца от ишемии и реперфузии по сравнению с природным прототипом. Эти пептиды могут служить рациональной основой для создания новых лекарственных средств, использующихся при терапии ишемической болезни сердца.

Использованная литература

1. Сердечно-сосудистые заболевания. ВОЗ. Информационный бюллетень. Январь 2015 г.

2. Rosamond W. et al. Heart Disease and Stroke Statistics - 2008 Update. A Report From the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2008. 117: e25-e146.

3. Ройтберг Г.E., Струтынский А.В. Внутренние болезни. Сердечно-сосудистая система. 2005. М.: Бином-пресс.

4. Simpkin J.C., Yellon D.M., Lim S.Y., Wynne A.M., Smith C.C. Apelin-13 and apelin-36 exhibit direct cardioprotective activity against ischemia-reperfusion injury. Basic Res. Cardiol. 2007; 102: 518-528.

5. O.I. Pisarenko, L.I. Serebryakova, I.M. Studneva, Y.A. Pelogeykina, O.V. Tskitishvili, Z.D. Bespalova, M.V. Sidorova, A.A. Az’muko, D.N. Khatri, M.E. Palkeeva, A.S. Molokoedov. Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats. J. Pharmacology and Pharmacotherapeutics, 2013. 4(3): 198-203

6. Takayama E., Bessho M., Nishizawa К., Yamagishi Т., Yanagida S., Kusuhara M., Ohsuzu F. Relation of metabolic insults to transient contraction during early global ischemia in perfused rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2002. 34(10): A30.

7. Драпкина O.M., Ашихин Я.И., Ивашкин В.Т. Профилактика инфаркта миокарда и инсульта: единый подход. Эффективная фармакотерапия. Кардиология и ангиология. 2011. №5: 12-21.

8. Lang R., Gundlach A., Kofler В. The galanin peptide family: Receptor pharmacology, pleiotropic biological actions and implications in health and disease. Pharmacology & Therapeutics. 2007. 115: 177-207.

9. Webling K., Runesson J., Bartfai T. and Langel U. Galanin receptors and ligands. Front. Endocrinol. 2012. 7(3): 146.

10. Alston E.N., Parrish D.C., Hasan W. et al. Cardiac ischemia - reperfusion regulates sympathetic neuropeptide expression through gp130-dependent and independent mechanisms. Neuropeptides. 2011; 45(1): 33-42.

11. Diaz-Cabiale Z., Parrado C., Vela C. et al Role of galanin and galanin (1-15) on central cardiovascular control. Neuropeptides. 2005; 39: 189-190.

12. Lu X., L., Langel U., Bartfai T. Galanin (2-11) binds to GalR3 in transfected cell lines: Limitations for pharmacological definition of receptor subtypes. Neuropeptides. 2005; 39: 165-167.

13. Wynick D. Galanin receptor and brain injury. 2005. US Pat. No WO 2005080427 A1.

14. Шульженко В.С, Серебрякова Л.И., Студнева И.М., Пелогейкина Ю.А Веселова О.М., Молокоедов А.С., Овчинников М.В., Палькеева М.Е., Сидорова М.В., Писаренко О.И. Способность N-концевого фрагмента нейропептида галанина уменьшать ишемическое и реперфузионное повреждение сердца крысы. Кардиологический вестник, 2016, XI, №3, 12-21.

15. Synthetic peptides. A user’s guide. Second edition. Ed. by G.A. Grant. New York Oxford University Press. 2002.

16. Forgerau K., Hoffmann T. Peptide therapeutics: current status and future directions Drug Discovery Today. 2015; 20(1): 122-128.

Изобретение относится к медицине и касается тетрадекапептида общей формулы H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-X-Gly-Pro-Y, где X=Leu, Y=-βpAla-His-OH (II); X=Nle, Y=-His-Arg-OH (III). Изобретение обеспечивает улучшение восстановления функции сердца и снижение необратимых повреждений кардиомиоцитов после ишемического и реперфузионного повреждения. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 7 пр.

1.Тетрадекапептид общей формулы H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-X-Gly-Pro-Y, где

X=Leu, Y=-βpAla-His-OH (II)

X=Nle, Y=-His-Arg-OH (III).

2. Тетрадекапептид общей формулы по п. 1, который получают твердофазным методом с использованием Fmoc-аминокислот.