Средство, увеличивающее устойчивость сердца к реперфузионному повреждению Российский патент 2018 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P9/00 

Изобретение относится к разделу экспериментальной медицины и может быть использовано для создания нового эффективного средства, увеличивающего устойчивость сердца к реперфузионным повреждениям.

Реперфузионное повреждение является патофизиологической основой такого социально значимого заболевания, как острый инфаркт миокарда (ОИМ), поскольку подобные повреждения возникают при реканализации инфаркт-связанной коронарной артерии. Некоторые пациенты с ОИМ погибают, несмотря на успешное восстановление коронарного кровотока, в результате реперфузионного повреждения сердца [Марков В.А. и др., 2011]. Кроме того, этот тип повреждения миокарда возникает во время кардиохирургических вмешательств с использованием искусственного кровообращения [Марков В.А. и др., 2011]. Применяемые в настоящее время в клинической практике фармакологические агенты не способны существенно повлиять на реперфузионные повреждения сердца.

По этой причине создание лекарственных средств, способных предупреждать реперфузионные повреждения сердца, является актуальной задачей фармакологии и кардиологии.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, увеличивающих устойчивость сердца к реперфузионным повреждениям.

Использованное вещество гексапептид «Дельтолей» было синтезировано в компании ЗАО «Синтез пептидов», Москва (Россия).

Химическая формула этого соединения:

Tyr-dAla-Phe-Gly-Phe-Leu-NH2

Синтез проводили в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Tribute-UV фирмы ProteinTechnologies, Inc. (США) в соответствии с программой для однократной конденсации Fmoc-аминокислот.

В работе использовали производные L-аминокислот: Fmoc-Tyr(But)-OH, Fmoc-Phe-ОН, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-dAla-OH,Fmoc-Leu-OH, а также реагенты и растворители (4-пиперидин (4-MePip), 1.8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ен (DBU), N-метилморфолин (NMM), трифторуксусная кислота (TFA), N,N,N,N-тетра метил-O-(бензотриазол-1-ил)урония тетрафторборат (TBTU) фирмы Fluka (Швейцария). Реакции конденсации проводили при помощи N,N,N',N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил)урониятетрафторбората (TBTU) в диметилформамиде (DMF) с использованием четырехкратных избытков производных аминокислоты N-метилморфолина (NMM) в качестве основания. Для деблокирования α-аминогрупп использовали раствор 10% 4-метилпиперидина (4-MePip)и 2% диазобициклоундецена(DBU) в DMF.

Синтез проводили с С-конца, исходя из 0.52 г (0.375 ммоль)амидной смолы ringamid-AMPS-resin фирмы SENNChemicals со степенью замещения 0.72 ммоль/г.

По окончании синтеза пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3×30 мл), дихлорметаном (5×30 мл), сушили на воздухе. Получали 0.81 г Fmoc-пептидил-полимера.

Для отщепления пептида от полимера использовали смесь реагентов: 10.0 мл трифторуксусной кислоты (TFA) + 0.5 мл деионизированной воды + 0.5 мл триизобутилсилана. Время отщепления 1 час. Сырой продукт высаживали диэтиловым эфиром, отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром. Получено 0.25 г технического продукта с содержанием основного вещества 58% по результатам аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Очистку проводили методом препаративной обращенно-фазной ВЭЖХ, используя колонку Kromasil 100-10-С18 (50×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов применяли буфер А - 0.1% TFA, буфер Б - 70% ацетонитрила в буфере А. Элюцию проводили от 100% буфера А градиентом буфера Б (от 0 до 10% за 5 мин и от 10% до 60% за 100 мин) со скоростью потока 1 мл в мин. Пептид детектировали при длине волны 220 нм. Получено 120 мг готового вещества с содержанием основного продукта 99.35%. Выход 45.3% в расчете на стартовую аминокислоту.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе Gilson (Франция), на колонке Kromasil 100 С18, 5 мкм (4.6×250 мм) (Швеция), подвижная фаза: буфер А - 0.05М KH2PO4, рН 3.0, буфер Б - 70% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин. Детекция - при 220 нм.

Структура полученного пептида доказана спектрами 1Н-ЯМР и данными масс-спектрометрии. Спектры 1Н-ЯМР получены на спектрометре WM-500 (Bruker) (ФРГ) в DMSO-d6 при 300 К, концентрация пептида составляла 2-3 мг/мл. Масс-спектры регистрировали на приборе UltrafexTOF/TOF (BrukerDaltonics, ФРГ) с время пролетной базой методом MALDI.

ИССЛЕДОВАНИЕ ИНФАРКТ-ЛИМИТИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ

Исследование инфаркт-лимитирующего действия пептида было проведено на модели реперфузионного повреждения миокарда крысы.

Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г. Животных наркотизировали внутрибрюшинным введением α-хлоралозы (60 мг/кг, внутрибрюшинно, Sigma) и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких "SAR-830 Series" (CWE Inc. США). Коронароокклюзию и реперфузию осуществляли по методу J.E. Schultz и соавт. [Schultz J.E. et al., 1997]. Регистрация частоты сердечных сокращений (ЧСС) и артериального давления (АД) осуществлялась с помощью датчика давления SS13L (BiopacSystemInc., Goleta, Калифорния, США), сопряженного с аппаратом для электрофизиологических исследований МР35 (Biopac System Inc., Goleta, США). Данный прибор также использовался для регистрации ЭКГ. После 45 минут ишемии узел лигатуры развязывали и восстановление кровотока подтверждали появлением эпикардиальной гиперемии. Продолжительность реперфузии составляла 2 часа. Выявление зоны некроза и области риска проводили по методу J. Neckar и соавт. [Neckar J. et al., 2003]. После реперфузии сердце удаляли из грудной клетки и промывали ретроградно через аорту физиологическим раствором. Для определения зоны риска (ЗР) лигатуру вновь затягивали и миокард окрашивали струйно через аорту 5% перманганатом калия. Зоной риска принято называть миокард, подвергнутый ишемии-реперфузии. После промывки физиологическим раствором делали срезы сердца толщиной в 1 мм перпендикулярно к продольной оси с помощью слайсера HSRA001-1 (Zivic Instruments, Pittsburgh, США). Визуализацию зоны некроза от зоны риска осуществляли путем окрашивания 1%-ным раствором 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида в течение 30 минут при 37°C. В основе метода лежит способность 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида приобретать стойкую окраску при переходе из окисленного состояния в восстановленное под действием дегидрогеназ. Поскольку в погибших кардиомиоцитах отсутствовали дегидрогеназы, некротизированный миокард не окрашивался. После окончания окраски срезы помещали в 10% раствор формальдегида на 1 сутки. Срезы сканировали с обеих сторон сканером HP Scan Jet G4050. Размер ЗР и зоны инфаркта (ЗИ) определяли компьютеризированным планиметрическим методом. Размер инфаркта определяли как соотношение ЗИ/ЗР в процентах от размера зоны риска.

Исследование кардиопротекторной активности «Дельтолей» проводилось по следующей схеме.

«Дельтолей» растворяли extempore в физиологическом растворе и вводили внутривенно в дозе 0,1 мг/кг после 40 минут ишемии за 5 минут до начала реперфузии (основная группа).

Контролем служила группа животных, которым по такой же схеме вводили физиологический раствор.

В качестве препарата сравнения был выбран препарат даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg). Известно, что даларгин, так же как и исследуемый препарат, представляет собой гексапептид, близкий по структуре к исследуемому веществу. Даларгин является фармакологическим препаратом и применяется в клинической практике как противоязвенное средство.

Группа сравнения включала 14 крыс, которым аналогично вводили даларгин в дозе 0,1 мг/кг.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Манна-Уитни.

После 45-минутной коронароокклюзии и последующей 2-часовой реперфузии размер инфаркта в контрольной группе животных оказался равным 46,6±5,1% от зоны риска (табл. 2).

В основной группе соотношение зоны инфаркта/зона риска составляло 30,9±4,9%, что на 33% меньше аналогичного показателя в группе контроля (р<0,05) (табл. 2).

В группе сравнения (введение даларгина за 5 минут до реперфузии) размер зоны некроза составил 44,2±5,7% от зоны риска и не отличался от значений контрольной группы (табл. 2).

Измерение ЧСС у крыс в экспериментальных группах не выявило статистически значимых изменений этого параметра на фоне введения «Дельтолей» или даларгина на протяжении всего эксперимента (Табл. 3).

Измерение АД у крыс в экспериментальных группах не выявило статистически значимых изменений этого параметра на фоне введения «дельтолея» или даларгина на протяжении всего эксперимента (данные не представлены в таблице).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что гексапептид «дельтолей» способствует ограничению размера зоны некроза при 45-минутной коронароокклюзии и 2-часовой реперфузии, то есть оказывает кардиопротекторный эффект, достоверно больший, чем препарат сравнения, и не влияет на ЧСС и АД при ишемии-реперфузии. Положительное действие «дельтолея», приводящее к уменьшению размера зоны реперфузионного некроза, было выявлено впервые. В патентной и научно-медицинской литературе не найдено сведений о том, что «дельтолей» увеличивает устойчивость сердца к реперфузионным повреждениям. Данное свойство «дельтолея» не вытекает из уровня техники в данной области и неочевидно для специалиста.

Применение предлагаемого изобретения позволит расширить арсенал средств, увеличивающих устойчивость сердца к реперфузионным повреждениям.

Изобретение может быть использовано в экспериментальных исследованиях для создания нового кардиопротекторного лекарственного препарата; для уменьшения повреждения миокарда при ишемии/реперфузии у пациентов с острым инфарктом миокарда, в ходе кардиохирургических вмешательств с использованием искусственного кровообращения и при трансплантации сердца.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

ЛИТЕРАТУРА

1. Марков В.А., Рябов В.В., Максимов И.В., Вышлов Е.В., Демьянов С.В., Сыркина А.Г., Белокопытова Н.В., Шурупов B.C., Оюнаров Э.О., Максимов А.И., Васильев А.Г. Вчера, сегодня, завтра в диагностике и лечении острого инфаркта миокарда. Сиб. мед. жур. (Томск) 2011; Т. 26, №2, Выпуск 1:8-14.

2. Schultz J.E.J., Yao Z., Cavero I., Gross G.J. Glibenclamide induced blockade of ischemic preconditioning is time dependent in intact rat heart. Am. J. Physiol. 1997; 272(6 Pt 2); H2607-H2615.

3. , , Herget J., , Cardioprotective effect of chronic hypoxia is blunted by concomitant hypercapnia. Physiol Res. 2003; 52(2): 171-5.

Изобретение относится к применению соединения с химической формулой Tyr-dAla-Phe-Gly-Phe-Leu-NH2 в качестве средства, увеличивающего устойчивость сердца к реперфузионному повреждению, например, для уменьшения повреждения миокарда при ишемии/реперфузии у пациентов с острым инфарктом миокарда, в ходе кардиохирургических вмешательств с использованием искусственного кровообращения и при трансплантации сердца. 3 табл., 1 пр.

Применение соединения с химической формулой Tyr-dAla-Phe-Gly-Phe-Leu-NH2 в качестве средства, увеличивающего устойчивость сердца к реперфузионному повреждению.