СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭТАПОВ ОЧИСТКИ БЕЛКА, НАХОДЯЩИХСЯ НИЖЕ ПО ПОТОКУ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕМБРАННОЙ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2018 года по МПК C07K1/18 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к очистке белка. В частности, настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности находящихся ниже по потоку этапов очистки с целью удаления примесей посредством использования находящейся выше по потоку мембранной ионообменной хроматографии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Масштабная, экономичная очистка белков становится все более важной проблемой для биотехнологической промышленности. Как правило, белки получают путем культивирования клеток, с использованием либо эукариотических или прокариотических клеточных линий разработанных для получения интересующего белка путем введения рекомбинантной плазмиды, содержащей ген этого белка. Эти клетки должны подаваться со сложной средой роста, содержащей сахара, аминокислоты и факторы роста, обычно поставляемые из препаратов сыворотки животных. Разделение желаемого белка в смеси соединений, подаваемых к клеткам, и побочных продуктов самих клеток с чистотой, достаточной для использования в качестве терапевтических доз для человека, представляет собой сложную задачу.

Методики очистки белков от остатков клеток изначально зависят от механизма экспрессии данного белка. Некоторые белки могут быть секретированы непосредственно из клетки в окружающую питательную среду; другие созданы внутри клетки. Для последних белков, первый этап способа очистки содержит лизис клетки, что может осуществляться различными способами, в том числе механического разрезания, осмотического удара или ферментативных способов обработки. Такое разрушение высвобождает все содержимое ячейки в гомогенат, и, кроме того, производит субклеточные фрагменты, которые трудно удалить из-за их небольшого размера. Как правило, их удаляют дифференциальным центрифугированием или фильтрацией. Та же проблема возникает, хотя и в меньшем масштабе, с непосредственно секретируемыми белками за счет естественной смерти клеток и высвобождения внутриклеточных белков клетки-хозяина в ходе получения белка.

После того, как был получен представляющий интерес осветленный раствор, содержащий белок, без больших компонентов дебриса, его отделение от остальных других белков, продуцируемых клеткой, как правило, осуществляют с использованием комбинации различных способов хроматографии. Эти способы разделяют смеси белков и других примесей на основе их заряда, степени гидрофобности или размера. Для каждого из этих способов доступны несколько различных хроматографических смол, что позволяет осуществить правильную адаптацию схемы очистки вовлеченного, в частности, белка. Сущностью каждого из этих способов разделения является то, что белки подвергают либо движению с разной скоростью по длинной колонке, достигая физического разделения, которое увеличивается, когда они проходят далее вниз по колонке, или селективному присоединению к разделяющей среды, будучи затем дифференциально элюированными или перемещенными с помощью различных растворителей или заместителей. В некоторых случаях желаемый белок отделяют от примесей, причем примеси специфически прилипают к колонке, а представляющий интерес белок нет, то есть интересующий белок присутствует в "элюате". Публикации, касающиеся очистка белка, включают Fahrner и соавт., Biotechnol Genet Eng Rev. 2001; 18:301-27.

Типичный масштабный процесс очистки антител часто построен вокруг применения иммобилизованного протеина А в качестве основного этапа захвата и очистки, в сочетании с другими операциями в колонке. Протеин А представляет собой белок клеточной стенки Staphylococcus aureas со сродством к области Fc IgG. По этой причине он широко используется для очистки IgG. Операции с протеином А в колонке в целом предоставляют чистоту продукта более 98%, с большинством технологических примесей, вымываемых фракцией элюата. Тем не менее, существуют многочисленные недостатки использования хроматографии с протеином А. Во-первых, связывание обычно осуществляют при рН от нейтрального до слабощелочного и, как правило, элюирование обычно осуществляют при кислом значении рН. Одной из потенциальных проблем является то, что низкий рН может денатурировать или частично денатурировать IgG. Из-за этого и высокой чистоты продукта, необходимой для клинического применения, для разделения изомеров, связанных с продуктами, являются необходимыми дополнительные этапы концентрации, очистки и удаления оставшихся количеств белков/ДНК клетки-хозяина, культивирования клеток примесей, выщелоченного протеина А и вирусов. Усугубляется проблема тем, что многие из этих примесей могут помешать эффективности функциональных блоков технологического способа выделения очищенных антител ниже по потоку. Другой основной проблемой является цена - колонки с протеином А являются более дорогими, чем обычные ионообменные колонки. Наконец, существуют многочисленные сценарии, в которых хроматография с протеином А или не является подходящей, или стоимость является слишком высокой, например, с очисткой полипептидов, подобных антителам молекул, фрагментов антител и/или всех антител, выделенных из определенных клеточных систем.

Природа настоящего изобретения решает вышеобозначенные проблемы, и в вариантах его осуществления демонстрируют способ очистки, альтернативный доступным в настоящее время в данной области с использованием этапа очистки с протеином А антитела, фрагмента антитела и полипептида.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности последующих этапов хроматографии для очистки белков, которые содержат (а) пропускание композиции, содержащей представляющий интерес полипептид и различные загрязняющие вещества сквозь ионообменную мембрану, отличающуюся тем, что полипептид и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера, имеющего рН, достаточно отличающийся от pi полипептида для повышения заряда полипептида, и низкой ионной силы, эффективно предотвращающей экранирование зарядов буферными ионами, которое приводит к связыванию с мембраной молекул полипептида и по меньшей мере одного загрязняющего вещества, (b) улавливание фракции из ионообменной мембране, содержащей представляющий интерес полипептид; (с) дополнительный один или более этап(ы) очистки, которому подвергают композицию, содержащую полипептид, и (d) извлечение очищенного полипептида из элюата.

В одном альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения эффективности последующих этапов хроматографии для очистки белков, содержащих (а) пропускание композиции, содержащей представляющий интерес полипептид, и различных загрязняющих веществ через катионообменную мембрану, где этот полипептид и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера с рН от около 1 до около 5 единиц рН ниже pI полипептида и проводимости ≤ около 40 мСм/см, которая приводит к связыванию с мембраной полипептид и по меньшей мере одно загрязняющее вещество, и (b) выделение фракции на ионообменной мембране, содержащей представляющий интерес полипептид; (с) дополнительный один или более этап(ы) очистки, которому подвергают композицию, содержащую полипептид, и (d) извлечение очищенного полипептида из элюата.

В одном альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения эффективности последующих этапов хроматографии для очистки белков, содержащих (а) пропускание композиции, содержащей представляющий интерес полипептид, и различных загрязняющих веществ через анионообменную мембрану, где этот полипептид и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера с рН от около 1 до около 5 единиц рН выше pI полипептида и проводимости ≤ около 40 мСм/см, которая приводит к связыванию с мембраной полипептид и по меньшей мере одно загрязняющее веществе, и (b) выделение фракции на ионообменной мембране, содержащей представляющий интерес полипептид; (с) дополнительный один или более этап(ы) очистки, которому подвергают композицию, содержащую полипептид, и (d) выделение очищенного полипептида из элюата.

В одном аспекте загрязняющее вещество представляет собой белок яичника китайского хомячка (CHOP). В другом аспекте загрязняющее вещество представляет собой белок Е. coli (ЕСР). В другом аспекте загрязняющее вещество представляет собой гентамицин. В еще одном аспекте загрязняющее вещество представляет собой полиэтиленимин (PEI).

В отдельном аспекте полипептид содержит область СН2/СН3. В другом аспекте полипептид представляет собой антитело. В еще одном дополнительном аспекте антитело представляет собой моноклональное антитело.

В других аспектах способы дополнительно включают воздействие на композицию, содержащую полипептид, на дальнейшем одном или более этапе(ах) очистки до, во время или после стадии а на протяжении стадии b, описанной выше, стадия очистки в одном альтернативном варианте осуществления представляет собой Fc-связывающую аффинную хроматографию (напр., хроматографию с протеином А) и, в другом альтернативном варианте осуществления, ионообменную хроматографию, которая использует колонку или мембрану, действующую в режиме связывания/вымывания, промывания или перемещения. В еще одном аспекте ионообменную мембрану заменяют на монолит или объемный фильтр.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает получение фармацевтической композиции путем объединения очищенного полипептида с фармацевтически приемлемым носителем.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1. Схема очистки антител с использованием мембраны СЕХ для защиты колонки СЕХ с, или без, исходной колонки с протеином А.

Фигура 2. Схема очистки не-антител с использованием мембраны СЕХ для защиты колонки СЕХ в качестве начального этапа.

Фигура 3. Выход в случае анионообменной емкости mAb 1 при рН 5,5 и 6,4 мСм/см и при рН 8,0 и 5,0 мСм/см, Mustang™ S (малогабаритная, минутный объем 0,18 мл, 667 MV/час).

Фигура 4. Выход в случае анионообменной емкости mAb 2 при рН рН 8,0, Mustang™ Q (малогабаритная, минутный объем 0,35 мл, 600 MV/час).

Фигура 5. Клиренс CHOP в случае емкости с протеином A mAb 3 при рН 5,5, 3,2 мСм/см, Mustang™ S (малогабаритная, минутный объем 0,18 мл, 1333 MV/час).

Фигура 6. Клиренс примесей после перегрузки с мембранами СЕХ.

Фигура 7. Сила связывания Mustang S различных видов, которая определяется градиентом элюирования, и нормализация высокой концентрации видов в каждой фракции.

Фигура 8. Общую связанную массу различных видов на Mustang S рассчитывают с помощью суммирования всех масс фракций градиентного элюирования и при сравнении с разными плотностями нагрузки мембран и нормализацией к максимальной массе.

Фигура 9. Мембрану Mustang S загружают белком, промывают 20 мМ ацетатного буфера, пока УФ-поглощение не достигнет исходного уровня, а затем элюируют 20 мМ ацетат/гентамициновым буфером, чтобы продемонстрировать перемещение антитела относительно гентамицина.

Фигура 10. Схема, изображающая протокол для определения способности к динамическому связыванию (DBC) антител на колонке СЕХ (Fractogel SE Hicap) с, или без, использованием мембраны СЕХ на различных концентрациях гентамицина.

Фигура 11. Влияние концентрации гентамицина на DBC антитела Fractogel SE

Hicap.

Фигура 12. Сравнение DBC гентамицина на двух мембранах СЕХ (Mustang S и Natrix S).

Фигура 13. DBC антитела Fractogel SE Hicap с перегруженной Natrix S емкостью, которая демонстрирует 30% повышение DBC.

Фигура 14. Влияние % PEI, используемое в способе экстракции на SP Sepharose Fast Flow (SPSFF), на DBC белка демонстрирует повышение на от 36 до 51 г/л, при том, что используют меньше PEL

Фигура 15. Влияние % PEI, используемое в способе экстракции, на SPSFF, демонстрирует сниженный выход на этапе и повышенные примеси в емкости, при том, что используют больше PEI.

Фигура 16. DBC протеина на Natrix S, ЕСР и PEI демонстрируют прорыв PEI при 330 мг/мл мембраны, по сравнению с прорывом белка и ЕСР при 123 мг/мл мембраны.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения:

В данном документе численные диапазоны или количества, которым предшествует термином "около", полностью содержит точный диапазон или точное численное количество.

"Композиция", которая должна быть очищена по данному документу, содержит представляющий интерес полипептид и одно или более загрязняющее вещество. Композиция может быть "частично очищенный" (напр., такой, которая была подвергнута одному или нескольким этапам очистки, таким как хроматография с протеином А) или может быть получена непосредственно из клетки-хозяина или организма, продуцирующего полипептид (напр., композиция может содержать собранную культуральную жидкость).

Как используется в данном документе, "полипептид" в целом относится к пептидам и белкам, имеющим более чем около десяти аминокислот. Предпочтительно полипептид представляет собой белок млекопитающего, примеры которого содержат: ренин; гормон роста, в том числе гормона роста человека и бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратгормон; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор, и фактор фон Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или моча человека, или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа и -бета фактор некроза опухолей; энкефалиназа; RANTES (регулируют обычно по активации экспрессированных и секретированных Т-клеток); макрофагальный белок воспаления человека (MIP-1 -альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; антиген цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA), таких как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; протеин А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5, -6 (или NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервной ткани, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-1 (IGF-I мозга), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста (IGFBP); белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD 19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), напр., M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (ILS), напр., от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутазы; Т-клеточные рецепторы; белки поверхности мембраны; стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИДа; транспортные белки; "хоуминг"-рецептор; аддрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолеспецифический антиген, такой как рецептора HER2, HER3 или HER4; и фрагменты и/или варианты любого из вышеперечисленных полипептидов, а также антител, в том числе фрагменты антител, связывающихся с любым из вышеперечисленных полипептидов.

"Загрязняющее вещество" представляет собой материал, который отличается от желаемого полипептидного продукта. Загрязняющее вещество содержит, без ограничения ими, материалы клетки-хозяина, такие как белки яичника китайского хомячка (CHOP) или белки Е. coli (ЕСР); выщелоченный белок А; нуклеиновую кислоту; вариант, фрагмент, агрегат, изомер или производное желаемого полипептида; другой полипептид; эндотоксин; вирусное загрязняющее вещество; компоненты аминогликозидньгх антибиотиков (напр., гентамицин, стрептомицин, неомицин, канамицин); или ионный полимер, добавленный в процессе очистки (напр., полиэтиленимин (PEI), поливиниламин, полиаргинин, поливинилсульфоновая кислота, полиакриловая кислота) и т.д.

Используемый в данном документе термин "область C_H2/C_H3" относится к аминокислотным остаткам в области Fc молекулы иммуноглобулина. В предпочтительных вариантах область область C_H2/C_H3 содержит в себе неповрежденную область C_H2 после интактной области C_H3, и наиболее предпочтительно Fc-область иммуноглобулина. Примеры полипептидов, содержащих область C_H2/C_H3, содержат антитела, иммуноадгезины и слитые белки, содержащие представляющий интерес полипептид, слитый с, или сопряженный с, областью C_H2/C_H3.

В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения антитело, которое очищают по данному документу, представляет собой рекомбинантное антитело. "Рекомбинантное антитело" представляет собой таковое, полученное в клетке-хозяине, которая была трансформирована или, трансфицирована с, кодирующей антитело нуклеиновой кислотой, или получает антитело в результате гомологичной рекомбинации. "Трансформацию" и "трансфекцию" используют взаимозаменяемо для обозначения процесса введения нуклеиновой кислоты в клетку. После трансформации или трансфекции нуклеиновая кислота может интегрироваться в геном клетки-хозяина или может существовать как внехромосомный элемент."Клетка-хозяин" содержит в себе клетку в клеточной культуре in vitro, а также в клетке животного-хозяина. Например, способы рекомбинантного получения полипептидов, описанные в патенте США №5534615, специально содержатся в данном документе в виде ссылки.

Термин "антитело" используется в широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (в том числе непроцессированный моноклональные антитела), поликлональные антитела, мульти специфические антитела (напр., биспецифичные антитела) и фрагменты антител, пока они сохраняют, или изменены, чтобы содержать, область C_H2/C_H3 так, как они определены в данном документе.

Антитело по настоящему изобретению направлено против "антигена", представляющего интерес. Предпочтительно антиген представляет собой биологически важный полипептид и введение антитела млекопитающему, страдающему от заболевания или расстройства, которое может привести к терапевтическому действию для этого млекопитающего. Тем не менее, также рассматриваются антитела, направленные против не-полипептидных антигенов (таких, как ассоциированные с опухолью гликолипидные антигены, смотри патент США 5091178). Если антиген представляет собой полипептид, то он может быть трансмембранной молекулой (напр., рецептором) или лигандом, таким как фактор роста. Примерные антигены содержат полипептиды, описанные выше. Предпочтительные молекулярные мишени для антител, охватываемых настоящим изобретением, содержат CD полипептиды, такие как CD3, CD4, CD8, CD 19, CD20 и CD34; члены семейства рецепторов HER, такие как рецептор EGF (HER1), HER2, HER3 или рецептор HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, р150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрин av/b3, которые содержат их субъединицы А или В (напр., антитела анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD11b); факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (ОВ); рецептор mpI; CTLA-4; полипептид С и т.д. Растворимые антигены или их фрагменты, необязательно конъюгированные с другими молекулами, могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, в качестве иммуногена могут быть использованы их фрагменты (напр., внеклеточный домен рецептора). С другой стороны, в качестве иммуногена могут быть использованы клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу. Такие клетки могут быть получены из природного источника (напр., линии раковых клеток) или могут быть клетками, которые были трансформированы рекомбинантными способами для экспрессирования трансмембранной молекулы.

Примеры антител, которые должны быть очищены по данному документу, содержат, но без ограничения ими: антитела HER2, содержащие трастузумаб (в том числе HERCEPTIN®) (Carter и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США №5725856) и пертузумаб (OMNITARG™) (SEQ CHAPTER \h \r 1WO01/00245); антитела CD20 (см. ниже); антитела IL-8 (St John и соавт., Chest, 103:932 (1993), и международная заявка WO 95/23865); антитела рецептора VEGF или VEGF, в том числе гуманизированные антитело и/или антитело VEGF с созревшей аффинностью, такие как гуманизированное антитело VEGF huA4.6.1 бевацизумаба (AVASTIN®) и ранибизумаба (Lucentis®) (Ким и соавт., Growth Factors, 7:53-64 (1992), международные заявки WO 96/30046 и WO 98/45331, опубликованные 15 октября 1998); антитела PSCA (WO 01/40309); антитела CD11а, которые содержат эфализумаб (RAPTIVA®) (патент США №5622700, WO 98/23761, Steppe и соавт., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), и Hourmant и соавт, Transplantation 58:377-380 (1994)).; антитела, которые связывают IgE, в том числе омализумаб (XOLAIR®) (Presta и соавт., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), и международная заявка WO 95/19181; патент США №5714338, выданный 3 февраля 1998 или патент США №5091313, выданный 25 февраля 1992, WO 93/04173, опубликованный 4 марта 1993, или международная заявка PCT/US98/13410, поданная 30 июня 1998, патент США №5714338); антитела CD18 (патент США №5622700, выданный 22 апреля 1997, или как в WO 97/26912, опубликованной 31 июля 1997); антитела рецептора антитела Аро-2 (WO 98/51793, опубликованный 19 ноября 1998); антитела тканевого фактора (TF) (Европейский патент №0 420 937 В1, выданный 9 ноября 1994); α₄-α₇ интегриновые или антитела (WO 98/06248, опубликованный 19 февраля 1998); антитела EGFR (напр., химерное или гуманизированными антитела 225, цетуксимаб, ERBUTIX^®, как в WO 96/40210, опубликованном 19 Декабрь 1996); антитела CD3, такие как ОКТЗ (патент США №4515893, выданный 7 мая 1985); антитела CD25 или Тас, такие как CHI-621 (SIMULECT®) и ZENAPAX® (смотри патент США №5693762, выданный 2 декабря 1997); антитела CD4, такие как антитела сМ-7412 (Choy и соавт., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); антитела CD52, такие как САМРАТН-1Н (ILEX/Berlex) (Riechmann и соавт., Nature 332:323-337 (1988)); антитела рецепторов Fc, такие как антитела М22, направленные против Fc(RI, такие как в Graziano и соавт., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); антитела карциноэмбрионального антигена (СБА), такие как hMN-14 (Sharkey и соавт., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995)); антитела, направленные против эпителиальных клеток молочной железы, в том числе huBrE-3, hu-Mc 3 и CHL6 (Ceriani и соавт., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); и Richman и соавт., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); антитела, которые связываются с клетками карциномы толстой кишки, такие как С242 (Litton и соавт., EurJ. Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); антитела CD38, напр., AT 13/5 (Ellis и соавт., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); антитела CD33, такие как Ни Ml95 (Jurcic и соавт., Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s (1995)) и СМА-676 или CDP771; антитела ЕрСАМ, такие как 17-1A (PANOREX®); антитела GpIIb/IIIa, такие как абциксимаб или с7Е3 Fab (REOPRO®); антитела RSV, такие как MEDI-493 (SYNAGIS®); антитела CMV, такие как PROTOVIR®; антитела HIV, такие как PR0542; антитела к гепатиту, такие как антитело к Hep В OSTAVIR®; антитело СА 125 OvaRex; идиотипическое антитело ВЕС2 к антигену GD3; антитело αvβ3 (напр., VITAXIN®; Medimmune); антитело к почечно-клеточному раку человека, такое как ch-G250; ING-1; антитело к клеткам человека 17-1 An (3622W94); колоректальное опухолевое антитело к клеткам человека (А33); антитело к клеткам меланомы человека R24, направленное против ганглиозида GD3; плоскоклеточный рак к клеткам человека (SF-25); антитело лейкоцитарного антигена человека (HLA), такое как Smart ID 10 и анти-HLA натитело DR Oncolym (Lym-1); антитело CD37, такое как TRU 016 (Trubion); антитело IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); антитела против В-клетки (Impheron); В-клетка, специфическая к MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); антитело Lym-1, такое как Lym-1 Y-90 (USC) или анти-Lym-l Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); антитело BAFF (напр., WO 03/33658); антитело к рецептору BAFF (смотри, напр., WO 02/24909); BR3 антитело; антитело Blys, такое как белимумаб; LYMPHOSTAT -В™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); гомиликсима (Idee 152; Biogen Idee); антитело к рецептору IL-6, такое как атлизумаб (ACTEMRA™; Chugai/Roche); антитело IL-15, такое как HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); антитело к хемокиновому рецептору, такое как антитело CCR2 (напр., MLN1202; Millieneum); антикомплементное антитело, такое как антитело С5 (напр., экулизумаб, 5G1.1; Alexion); пероральный состав иммуноглобулина человека (напр., IgPO; Protein Therapeutics); антитело, IL-12, такое как АВТ-874 (CAT/Abbott); Teneliximab (BMS-224818; BMS); антитела CD40, которые содержат S2C6 и их гуманизированные варианты (WO 00/75348) и TNX 100 (Chiron/Tanox); антитела TNF-α, которые содержат сА2 или инфликсимаб (REMICADE®), CDP571, МАК-195, адалимумаб (HUMIRA™), фрагмент пегилированного антитела TNF-α, такого как CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), анти-TNF-α поликлональное антитело (напр., PassTNF; Verigen); антитела CD22, такие как LL2 или эпратузумаб (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), которые содержат эпратузумаб Y-90 и эпратзумаб 1-131, антитело CD22 от Abiogen (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), комботокс (UT Soutwestern), BL22 (NIH) и LympoScan Tc99 (Immunomedics).

Примеры антител CD20 содержат: "C2B8", который теперь называется "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (патент США №5736137); мышиное антитело 2 В8, помеченное иттрий-[90], обозначаемое "Y2B8" или "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®), коммерчески доступное от IDEC Pharmaceuticals, Inc. (патент США №5736137;. 2В8 хранят с АТСС под добавлении № НВ11388, 22 июня 1993); мышиный IgG2a "В1," также называемый "Tositumomab", необязательно помеченный ¹³¹I, для получения "131I-B1" или антитела "йод 1131 тозитумомаб" (Bexxar™), коммерчески доступного от Corixa (см. также патент США №5595721); мышиное моноклональное антитело "1F5" (Press и соавт., Blood 69(2):584-591 (1987)) и их варианты, которые содержат "измененный каркас" или гуманизированный 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; АТСС комплекс НВ-96450); мышиное антитело 2Н7 и химерное антитело 2Н7 (патент США №5677180); гуманизированное 2Н7 (WO 2004/056312, Lowman и соавт.,); 2F2 (HuMax-CD20), полностью человеческое высокоаффинное антитело, направленное на молекулу CD20 в клеточной мембране В-клеток (Genmab, Дания; смотри, например, Glennie и van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) и Cragg и соавт., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US 2004/0167319); человеческие моноклональные антитела, описанные в WO 2004/035607 и US 2004/0167319 (Teeling и соавт.,); антитела, имеющие сложные N-гликозид-связанные сахарные цепи, присоединенные к области Fc, описанные в US 2004/0093621 (Shitara и соавт.); моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, связанные с CD20 (WO 2005/000901, Tedder и соавт.,), такие как НВ20-3, НВ20-4, НВ20-25 и МВ20-11; молекулы, связывающие CD20, такие как серии антител АМЕ, напр., антитела АМЕ 33, как описано в WO 2004/103404 и US 2005/0025764 (Watkins и соавт., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, АМЕ); молекулы, связывающие CD20, такие как описаны в US 2005/0025764 (Watkins и соавт.); А20 антитело или его варианты, такое как химерное или гуманизированное антитело А20 (сА20, hA20, соответственно) или IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); антитела, связывающие CD20, в том числе бес-антигенные Leu-16, 1Н4 или 2 В8, необязательно сопряженные с IL-2, как в US 2005/0069545А1 и WO 2005/16969 (Carr и соавт.,); биспецифическое антитело, которое связывает CD22 и CD20, например, hLL2×hA20 (WO 2005/14618, Chang и соавт.,); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1В3, В-С1 или NU-B2, доступные от International Leukocyte Typing Workshop (Valentine и соавт., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma и соавт., Blood 92:184 (1998)); анти-СD20 конъюгат ауристатина Е (Seattle Genetics); анти-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); анти-CD20 терапия MAb (EpiCyte); анти-СD20 антитело TRU015 (Trubion).

Термин "моноклональное антитело", используемый в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, напр., индивидуальные антитела, содержащие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, направленными против одного иммунодоминантного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть изготовлены гибридомным способом, впервые описанным Kohler и соавт., Nature 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., напр., патент США №4816567). В дополнительном варианте, "моноклональные антитела" могут быть выделены из фаговых библиотек антител, полученных с использованием способов, описанных в McCafferty и соавт., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson и соавт., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks и соавт., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В последующих публикациях описано производство с высоким сродством (диапазон нМ) человеческого антитела по перестановки цепей (Marks и соавт., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и in vivo рекомбинации в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и соавт., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы являются приемлемой альтернативой традиционным гибридомным способам для выделения моноклональных антител. Кроме того, в настоящее время возможно получать трансгенных животных (напр., мыши), которые способны после иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека при отсутствии продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция тяжелой цепи антитела области присоединения (^JH) гена у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Передача ряда генов иммуноглобулина зародышевой линии человека зародышевой линии таких мутантных мышей приведет к производству человеческого антитела при антигенной стимуляции. Смотри, напр., Jakobovits и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits и соавт., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann и соавт., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Duchosal и соавт., Nature 355:258 (1992).

Моноклональные антитела в данном документе специально содержат "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из отдельных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США №4816567; и Morrison и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Термин "гипервариабельная область" при использовании в данном документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR" (напр., остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в тяжелой цепи вариабельного домена; Kabat и соавт., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (напр., остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в легкой цепи вариабельного домена и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в тяжелой цепи вариабельного домена; Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Каркас" или остатки "FR", как определено здесь, представляют собой остатки гипервариабельной области, отличные от остатков вариабельного домена.

"Гуманизированные" формы не принадлежащих к человеческому роду (напр., мышиные) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не принадлежащего к человеческому роду. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело реципиента), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области, не относящихся к человеку видов (антитело донора), таких как мышь, крыса, кролик или примат, имеющих желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки области каркаса Fv (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, не принадлежащими к человеческому роду. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в антителе реципиента или в антителе донора. Эти изменения сделаны для улучшения производительности антител в дальнейшем. В общем, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все, или по существу все, гипервариабельные петли соответствуют таковым из иммуноглобулина, не принадлежащего к человеческому роду, и всем, или по существу всем, областям FR из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также содержит, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, человеческого иммуноглобулина.

Выбор вариабельных доменов человека как легкого, так и тяжелого, которые используют для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. В соответствии со способом так называемого "максимального соответствия", осуществляют скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызуна по всей библиотеке известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая является наиболее близкой последовательности грызуна, в случае гуманизированного антитела затем, принимается как человеческий каркас (FR) (Sims и соавт., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia и соавт., J. Mol Biol, 196:901 (1987)).

Другой способ использует определенный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. И тот же каркас можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta и соавт., J. Immnol, 151:2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности по отношению к антигену и другим благоприятным биологическим свойствам. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются доступными и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных потенциальных последовательностей иммуноглобулина. Исследование этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании потенциальных последовательностей иммуноглобулина, напр., анализ остатков, которые влияют на способность потенциального иммуноглобулина связываться с его антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и объединены с реципиентом и вводимыми последовательностями таким образом, чтобы достигнуть требуемую характеристику антитела, такую как повышенная аффинность по отношению к антигену-мишени(ям). В общем, на связывание антигена остатки CDR влияют непосредственно и в наибольшей степени.

"Фрагменты антитела" содержат часть полноразмерного антитела, как правило, их область связывания антигена или вариабельную область. Примеры фрагментов антител содержат фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Для получения фрагментов антител были разработаны различные способы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (смотри, напр., Morimoto и соавт., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan и соавт., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут быть получены непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH могут быть выделены непосредственно из Е. coli и химически связаны с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter и соавт., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В другом варианте реализации настоящего изобретения F(ab')₂ формируется с помощью лейциновой застежки GCN4 для содействия сборке молекулы F(ab')₂. Согласно другому подходу, фрагменты F(ab')₂ могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Специалисту в данной области будут очевидны другие способы получения фрагментов антител.

В других вариантах реализации настоящего изобретения антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). Смотри WO 93/16185. "Одноцепочечные Fv" или фрагменты антител "sFv" составляют домены антитела V_H и V_L, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет sFv образовать желаемую структуру для связывания антигена. Для ознакомления с sFv смотри Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, фрагменты которых содержат вариабельный домен (V_H) тяжелой цепи, связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же полипептидной цепи (V_H-V_L). При использовании линкера, являющегося слишком коротким, чтобы позволить объединение двух доменов на той же цепи, домены вынуждены объединяться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Диатела более подробно описаны в, например, ЕР 404,097; WO 93/11161; и Hollinger и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

Выражение "линейные антитела", используемое в данной заявке, относится к антителам, описанным у Zapata и соавт., Polypeptide Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

"Мультиспецифические антитела" обладают специфичностью связывания с по меньшей мере двумя различными эпитопами, причем эпитопами, как правило, различных антигенов. В то время как такие молекулы обычно связывают только два антигена (напр., биспецифические антитела, BsAb), этим выражением охватываются антитела с дополнительными особенностями, такими как триспецифичные антитела, при использовании в данном документе. Примеры BsAb, содержат те, которые, с одной стороны, направлены против антигена опухолевых клеток, а с другой стороны, направлены против молекулы цитотоксического триггера, такой как анти-FcγRI/анти-CD15, анти- p185^HER2/FcγRIII (CD 16), анти-CD3/направленная против злокачественной В-клетка (1D10), анти-CD3/анти-p185^HER2, анти-CD3/анти-р97, анти-CD3/направленная против почечноклеточного рака, анти-CD3/анти-OVCAR-3, анти-CD3/L-D1 (направленная против антигена рака толстой кишки), анти-CD3/направленная против аналога меланоцитостимулирующего гормона, направленная против рецептора EGF/анти-CD3, анти-CD3/анти-САМА1, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/MoV18, направленная против нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM)/анти-CD3, направленная против фолат связывающего белка (FBP)/анти-CD3, направленная против пан-карциномного антигена (АМОС-31)/анти-CD3; BsAbs с одной стороны специфически связывается с опухолевым антигеном, а с другой стороны связывается с токсином, таким как антисапориновый/анти-Id-1, анти-CD22/антисапориновый, анти-CD7/антисапориновый, анти-CD38/антисапориновый, анти-СЕА/направленный против А цепи рицина, идиотип, направленный против интерферонаа(IFN-α)/гибридомы, анти-СЕА/направленный против алкалоида барвинка; BsAbs для преобразования активируемых ферментами пролекарств, таких как анти-CD30/направленная против щелочной фосфатазы (который катализирует превращение пролекарства фосфата митомицина в митомициновый спирт); BsAbs, который могут быть использован в качестве фибринолитического средства, такого как анти-фибрин/направленный против тканевого активатора плазминогена (tPA), антифибриновый/направленный против активатор плазминогена урокиназного типа (uPA); BsAbs для таргетирования иммунных комплексов на рецепторы клеточной поверхности, такие как направленные против липопротеина низкой плотности (LDL)/направленные против рецептора Fc (напр., FcγRI или FcγRIII); BsAbs для использования в терапии инфекционных заболеваний, таких как анти-CD3/направленный против вируса простого герпеса (HSV), направленный против рецептора Т-клеток: комплекс CD3/антипротивогриппозный, анти-FcγR/анти-HIV; BsAbs для обнаружения опухоли in vitro или in vivo, такой как анти-СЕА/анти-EOTUBE, анти-СЕА/анти-DPTA, анти-p185^HER2/антигаптеновый; BsAbs в качестве адъювантов вакцин; и BsAbs в качестве диагностических инструментов, таких как направленные против кроличего IgG/анти-ферритин, направленный против пероксидазы хрена (НКР)/антигормональный, направленный против соматостатина/направленный против вещества Р, анти-HRP/анти-FITC, анти-СЕА/антиβгалактозидазный. Примеры триспецифичных антител содержат анти-CD3/анти-CD4/анти-CD37, анти-CD3/анти-CD5/анти-CD37 и анти-CD3/анти-CD8/анти-CD37. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (напр., биспецифические антитела F(ab')₂).

Рассматривают антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt и соавт., J. Immunol. 147: 60 (1991).

"Изолированное антитело", в терминах настоящего изобретения, представляет собой антитело, которое не конъюгировано с цитотоксическим фрагментом или радиоактивной меткой.

"Интактное антитело" в данном документе представляет собой такое, которое содержит в себя две области, связывающие антиген, а также область Fc. Предпочтительно, чтобы интактное антитело имело функциональную область Fc.

"Лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, содержат такие, которые уже имеют заболевание, а также тех, у которых заболевание может быть предотвращено.

"Заболевание" означает любое состояние, должное получить пользу от лечения очищенным антителом, как описано в данном документе. Это содержит в себе как хронические и острые заболевания и расстройства, так и такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому заболеванию.

Фраза "ионообменная хроматография" относится к способу сепарации, в котором соединения разделяют на основе их суммарного заряда. Молекулы классифицируют как анионы (имеющие отрицательный заряд) или катионы (имеющие положительный заряд). Некоторые молекулы (напр., полипептиды) могут иметь как анионные, так и катионные группы.

Ионообменная смола или ионообменный полимер представляет собой нерастворимую матрицу (или опорную конструкцию), обычно в виде мелких (диаметр 1-2 мм) шариков, изготовленных из субстрата на основе органического полимера. Horie и соавт. Pure Appl. Chem. (2004) Vol. 76, No. 4, pp. 889-906. Материал имеет высокоразвитую структуру пор, на поверхности которых находятся сайты с легко захватываемыми и освобождаемыми ионами. Захват ионов происходит только при одновременном высвобождении других ионов; таким образом, этот процесс называется ионным обменом. Есть несколько различных типов ионообменной смолы, которые изготавливаются избирательного предпочтения одного или нескольких различных типов ионов.

Наиболее типичные ионообменные смолы основаны на сшитом полистироле. Требуемые активные группы могут быть введены после полимеризации или могут быть использованы замещенные мономеры. Например, сшивание часто достигается в процессе полимеризации путем добавления в стирол 0,5-25% дивинилбензола. Несшитые полимеры используют редко, потому что они менее стабильны. Сшивание уменьшает способность смолы к ионному обмену и продлевает время, необходимое для достижения ионообменных процессов. Размер частиц также влияет на параметры смолы; мелкие частицы имеют большую внешнюю поверхность, но вызывают большие потери напора в ходе процессов в колонках.

Есть четыре основных типа ионообменных смол, отличающихся их функциональными группами: сильно кислые (обычно с сульфокислыми группами, например, натрийсульфонат пенополистирола или поли-AMPS); сильно основные (четвертичные аминогруппы, например, триметиламмониевые группы, например поли-АРТАС); слабокислые (в основном, карбоксильные группы); слабоосновные (первичные, вторичные и/или третичные аминогруппы, например полиэтиленамин). Есть также специализированные типы: хелатобразующие смолы (иминодиуксусная кислота, тиомочевина и многие другие).

При ионообменной хроматографии мембрана связывает соединения с общим положительным или отрицательным зарядом. Связывающие участки расположены вдоль пор адсорбера. Соединение транспортируется к сайту связывания за счет конвекции. Положительно заряженная мембрана (анионообменная смола) связывает соединение с общим отрицательным зарядом. И наоборот, отрицательно заряженная мембрана (катионообменная смола) связывает соединение с общим положительным зарядом.

Ионообменные мембраны могут быть дополнительно классифицированы либо как сильные, либо как слабые. Сильные ионообменные мембраны заряжены (ионизированы) в широком диапазоне уровней рН. Слабые ионообменные мембраны ионизированы в узком диапазоне значений рН. Четыре наиболее распространенные ионообменные составы представляют собой:

В общем, ионообменные мембраны имеют размеры пор от 0,1 до 100 мкм. В качестве справки, Sartoblnd Q (Sartorius AG) представляет собой сильную анионообменную мембрану с номинальным размером пор от 3 до 5 мкм и коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки, a Mustang Q (Pall Corporation) представляет собой сильную анионообменную мембрану с номинальным размером пор 0,8 мкм и также коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки. В качестве еще одной справки, Sartobind S (Sartorius AG) представляет собой сильную катионообменную мембрану с номинальным размером пор 3-5 мкм и коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки, a Mustang S (Pall Corporation) представляет собой сильную катионообменную мембрану с номинальным размером пор 0,8 мкм и также коммерчески доступен в виде однослойной или многослойной пленки. В качестве еще одной справки, Natrix S (Natrix Separations, Inc) представляет собой сильную катионообменную мембрану, которая состоит из нетканого высоковолокнистого прочного полимерного субстрата, заключенного в макропористый гидрогель с большой площадью поверхности.

"Номинальное" отношение размера пор характеризует способность мембраны сохранить большинство частиц при размере пор 60 до 98% от номинального.

"рН" раствора определяет кислотность или щелочность по отношению к ионизации пробы воды. Значение рН воды является нейтральным, напр., 7. Большинство значений рН находятся в диапазоне от 0 до 14. Растворы с более высоким, чем в случае воды (рН менее 7), значением [Н+] являются кислыми; растворы с более низким, чем в случае воды (рН больше 7), значением [Н+] являются основными или щелочными. рН может быть измерено с помощью рН-метра. Устанавливаемое значение рН может быть отрегулировано с использованием кислоты или основания, таких как HCl или NaOH.

"pI" или "изоэлектрическая точка" молекулы, такой как полипептид, обозначает рН, при котором полипептид содержит равное количество положительных и отрицательных зарядов. Значение pI может быть рассчитано, исходя из суммарного заряда аминокислотных остатков полипептида, или может быть определено с помощью изоэлектрического фокусирования. Амфотерный характер полипептидов может быть изменен для того, чтобы получить как анионные, так и катионные группы. Значение рН полипептида может быть снижено до точки, в которой желаемый полипептид ведет себя как катион (имеющий положительный заряд). Кроме того, значение рН полипептида может быть увеличено до точки, в которой желаемый полипептид ведет себя как анион (имеющий отрицательный заряд).

Термин "проводимость" соответствует способности раствора проводить электрический ток между двумя электродами. Основной единицей проводимости является сименс (S), которая ранее называлась мо. Проводимость обычно выражается в единицах мСм/см. Поскольку проводимость электрического тока обеспечивается зарядом ионов в растворе, электропроводность раствора пропорциональна концентрации ионов в растворе. Оба эти параметра хорошо коррелируются с ионной силой. Ионная сила тесно связана с концентрацией электролитов и указывает, насколько эффективно заряд конкретного иона в электролите экранирован или стабилизирован другими ионами. Основное различие между ионной силой и концентрацией электролита заключается в том, что ионная сила является более высокой, если некоторые из ионов являются более высокозаряженными. Еще одно различие между ними состоит в том, что ионная сила отражает концентрацию свободных ионов, а не только то, сколько соли добавляют к раствору. Проводимость может быть измерена с помощью электрокондуктометра, например, различных моделей электрокондуктометров Orion. Проводимость раствора может быть изменена путем изменения концентрации ионов в ней. Например, концентрация буферного агента и/или концентрация соли (напр., хлорида натрия, ацетата натрия или хлорида калия) в растворе могут быть изменены для того, чтобы достичь желаемой проводимости. Предпочтительно для того, чтобы достичь желаемой проводимости изменяют концентрацию соли различных буферов.

В случае мембранной хроматографии, "скорость потока" обычно описывается как объемы мембраны в час (MV/ч).

В случае мембранной хроматографии, "плотность нагрузки" часто выражается в граммах состава, обрабатываемых на литр мембраны.

"Буфер" представляет собой раствор, которое препятствует изменению рН при действии на него кислотно-основных компонентов конъюгата. Различные буферы, которые могут быть использованы в зависимости, например, от желаемого рН буфера, описаны в Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

Под "очисткой" полипептида из композиции, содержащей полипептид и одно или более загрязняющее вещество, подразумевается увеличение степени чистоты полипептида в композиции путем удаления из композиции (полностью или частично) по меньшей мере одного загрязняющего вещества. "Этап очистки" может быть частью общего процесса очистки, что приводит к "гомогенной" композиции. Термин "гомогенная" в данном документе используют для обозначения композиции, которая в пересчете на общую массу композиции содержит по меньшей мере около 70% массы представляющего интерес антитела, предпочтительно по меньшей мере около 80% массы, более предпочтительно по меньшей мере около 90% массы, еще более предпочтительно по меньшей мере около 95% массы.

"Связывание" молекулы с ионообменной мембраной означает то, что молекула при соответствующих условиях (рН и/или проводимости) подвергается воздействию ионообменной мембраны таким образом, что молекула является обратимо иммобилизованной в, или на, ионообменной мембране в силу электростатических взаимодействий между молекулой и заряженной группой или заряженными группами ионообменной мембраны.

Под "промыванием" ионообменной мембраны подразумевают прохождение соответствующего буфера через, или сквозь, ионообменную мембрану.

"Элюирование" молекулы (напр., антитела или загрязняющего вещества) с ионообменной мембраной означает удаление молекулы оттуда.

В случае мембранной хроматографии "элюат" соответствует связыванию примесей с мембраной, в то время как соединение является неудерживаемым.

В случае мембранной хроматографии "конкурирующая адсорбция" означает более чем один компонент, связывающийся с мембраной при данном состоянии.

В случае мембранной хроматографии "хроматография с перегрузкой" относится к обеспечению конкурентной адсорбции к мембране и соединения, представляющего интерес, и примеси. Мембрану загружают сверх связывающей способности соединения. Воспользовавшись дифференциальной прочностью связывания соединения и примеси, при том, что примесь связывается намного сильнее, соединение вытесняется примесями, десорбируется из мембраны и поступает в элюат мембраны.

"Вытеснительная хроматография" относится к способу хроматографии, в котором образец помещают в колонку или мембрану, а затем вытесняют его с помощью растворенного вещества, которое адсорбируется сильнее, чем компоненты исходной смеси. В результате, компоненты растворяют в последовательных "прямоугольных" зонах высококонцентрированных чистых веществ, а не "пиках", разделенных растворителем. Tugcu (1994) Methods in Molecular Biology: Vol 421 Affinity Chromatography: Methods and Protocols pp 71-89. По сравнению с другими видами хроматографии, могут быть достигнуты более высокая концентрация продукта, более высокая чистота и увеличение пропускной способности. Вытеснительная хроматография является эффективным способом для очистки белков из сложных смесей при высоких загрузках колонок в различных применениях. Вытеснительная хроматография хорошо подходит для получения мг количества очищенных белков из сложных смесей с использованием стандартной хроматографической аналитической лабораторной колонки. Она помимо этого особенно хорошо подходит для обогащения сырье микрокомпонентами. Вытеснительную хроматографию возможно с легкостью осуществить с использованием различных систем смол, в том числе, ионобменной, HIC и RPLC. Freitag and Breier. (1995) J. Chromatogr. A 691, 101-112.

Фраза "смешанный режим" относится к сорбенту, который имеет возможность отделить соединений на основе двух различных механизмов, напр., разделения на основе различий в гидрофильности/гидрофобности между полипептидами, наложенных на разделение на основе суммарного заряда. Это часто осуществляется с помощью мультимодального лиганда, который может взаимодействовать с молекулой-мишенью несколькими различными способами, которые содержат ионное взаимодействие и связывание водорода или гидрофобное взаимодействие. Сорбенты, такие как GE Healthcare Capto™ ММС и Capto™ Adhere являются примерами хроматографических смол "смешанного типа".

"Объемный фильтр" представляет собой разновидность фильтра, который использует пористую фильтрующую среду, чтобы удерживать частицы во всей среде, а не только на поверхности среды. Эти фильтры обычно используют, если жидкость, которая подлежит фильтрации, содержит высокую нагрузку частиц, так как, по сравнению с другими типами фильтров, они могут удерживать большую массу частиц до того, как наступит засорение.

"Монолит" относят к хроматографической среде, которая состоит из пористой подложки, химически измененной для конкретного применения. Ионообменные монолиты, которые были разработаны в качестве альтернативы хроматографическим смолам, как правило, демонстрируют высокую проницаемость и небольшие расстояния диффузии, что выражается в лучшей массопередаче и более низком давлении, что позволяет использовать их при более высоких скоростях потока и/или более коротком времени пребывания.

Способы реализации настоящего изобретения

Настоящее изобретение по данному документу обеспечивает способы очистки полипептида из композиции (напр., водного раствора), содержащей полипептид и одно или более загрязняющее вещество. Композицию, как правило, получают в результате рекомбинантного получения полипептида, но, возможно, что в результате получения полипептида по пептидному синтезу, (или другим синтетическим способам) или полипептида, который может быть очищен из естественного источника полипептида. Предпочтительно полипептид представляет собой полипептид, который содержит область C_H2/C_H3. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения полипептид, который содержит область Сн2/Сн3 представляет собой антитело.

Рекомбинантное получение антител

В случае рекомбинантного получения полипептида, для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии в реплицируемый вектор выделяют и встраивают нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептидную последовательность. ДНК, кодирующую полипептид, легко выделяют и секвенируют, используя общепринятые способы (напр., с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Пригодными являются многие векторы. Компоненты вектора обычно содержат, но без ограничения ими, один или более из следующих компонентов: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или несколько маркерных генов, элемент-энхансер, промотор и последовательность завершения транскрипции (напр.,, как описано в патенте США 5534615, который специально содержится в данный документе в виде ссылки).

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах в данном документе представляют собой прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки. Подходящие прокариоты для этой цели содержат эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, напр., Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, напр., Salmonella typhimurium, Serratia, напр., Serratia marcescans, и Shigella, также как Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (напр., В. licheniformis 41P, описанные в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989), Pseudomonas, такие как Р. aeruginosa и Streptomyces. Одним предпочтительным носителем для клонирования Е. coli является Е. coli 294 (АТСС 31446), хотя другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31537) и Е. coli W3110 (АТСС 27325) также являются подходящими. Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.

Кроме прокариотов, подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев наиболее часто используют Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи. Тем не менее, некоторое количество или родов, видов и штаммов являются общедоступными и применимы в данном документе, например, Schizosaccharomyces pombe; носители Kluyveromyces, такие как, напр., K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (АТСС 24178), K. waltii (АТСС 56500), K. drosophilarum (АТСС 36906), K. rmotolerans и K. marxianus; yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastoris (ЕР 183070); Candida; Trichoderma reesia (ЕР 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и filamentous fungi, такие как, напр., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и носители Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного полипептида получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных содержат клетки растений и насекомых. Были определены многочисленные бакуловирусные штаммы, варианты и соответствующие пермиссивные инсектиционные клетки-хозяева таких носителей, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Разнообразие вирусных штаммов для трансфекции являются общедоступными, напр., вариант L-1 Autographa californica, штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы, в соответствии с настоящим изобретением, согласно данному документу могут быть использованы в качестве вируса, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Помимо этого в качестве носителей можно использовать культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, помидора и табака.

Тем не менее, больше интерес проявляют клетки позвоночных, а размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной методикой. Примеры полезных млекопитающих линий клеток-хозяев содержат, но не ограничиваются ими, клетки CV1 почек обезьяны, трансформированные с помощью SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); эмбриональные клетки почки человека (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham и соавт., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (СНО, Urlaub и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); фолликулярные клетки яичка мыши (ТМ4, Mar, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьян (CV1 АТСС CCL 70); клетки почек африканских зеленых мартышек (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки почек крысы линии Buffalo (BRL 3A, АТСС CRL 1442); альвеолярные клетки человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Маг и соавт., Annals NY. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и клетки гепатомы человека (Hep G2). Зачастую, клетки СНО являются предпочтительными для экспрессии антител и могут быть преимущественно использованы для получения антител, очищенных в соответствии с настоящим изобретением.

Клетки-хозяева трансформируют описанными выше экспрессирующими или клонирующими векторами для получения полипептида и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.

Клетки-хозяева, используемые для получения полипептида согласно настоящему изобретению, можно культивировать в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят такие коммерчески доступные среды, как Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma). Кроме того, любой из сред описана в Ham и соавт., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes и соавт., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патенты США №4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или в качестве культуральной среды для клеток-хозяев используют патент США Re. 30985. Любой из этих сред могут быть дополнены, при необходимости, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), аминогликозидными антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромольном диапазоне), глюкозой или эквивалентным источником энергии. В соответствующих концентрациях также могут содержаться любые другие необходимые добавки, которые известны специалистам в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН, и т.п., соответствуют тем, которые использовались по отношению к клетке-хозяину, ранее выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалисту в данной области.

При использовании рекомбинантных способов, полипептид может быть получен внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретируется в среду. Если полипептид получают внутриклеточно, в качестве первого этапа, удаляют нерастворимый дебрис, либо клеток-хозяев, либо лизированных клеток (напр., в результате гомогенизации), например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если полипептид секретируется в среду, супернатанты из таких систем экспрессии могут быть сконцентрированы с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, устройство ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon.

В одном из аспектов настоящего изобретения предполагают воздействие гентамицина на колонки СЕХ. Гентамицин и другие аминогликозидные антибиотики могут использовать в качестве бактерицидной добавки при применениях клеточной культуры для предотвращения появления неустойчивых примесей. При добавлении к культуре клеток она должна быть удалена как производственная примесь. Типичное удаление осуществляется с помощью этапа аффинной хроматографии, однако, в некоторых способах этап аффинности может не быть первым этапом очистки.

Как катионный аминогликозидный антибиотик, гентамицин является положительно заряженным на уровне нейтрального значения рН или ниже. Если колонка СЕХ является первым этапом хроматографии, то с целью связывания представляющего интерес полипептида при уровне нейтрального рН или ниже, гентамицин будет конкурировать при связывании сайтов на колонке. Предыдущие исследования показали, что гентамицин связывается с мембраной СЕХ или смолой сильнее, чем антитело, влияние на колонку СЕХ представляет собой очевидное уменьшение способности к связыванию антитела.

По еще одному аспекту настоящего изобретения предполагается воздействие полиэтиленимина (PEI) или других катионньгх полимеров на колонки СЕХ. PEI может быть использован в качестве флокулирующего средства перед сбором клеток в способах очистки полипептида E. coli. Если PEI добавляют после этапа гомогенизации клеток, он действует в качестве связующего вещества загрязнения и делает и центрифугирование, и фильтрацию, более устойчивыми способами. Проблемы в связи с тем, что содержится этот этап, являются следствием каких-либо дополнительных PEI, которые не используют для флокуляции примесей, потому что тогда они остаются в очистных емкостях, которые, в конечном итоге, вступают в контакт с колонками СЕХ.

Существует много различных форм PEI, изменяющиеся в диапазоне от линейных до разветвленных полимеров, и они могут содержать первичные, вторичные или третичные амины. Форма PEI является не настолько важной, как то, что она является положительно заряженной при большинстве условий обработки. Поэтому с колонкой СЕХ он будет связываться очень сильно. Кроме того, первым этапом хроматографии для большинства белков E. coli может быть колонка СЕХ, ввиду ее относительно высокой связывающей способности. Кроме того, из-за сильного связывания колонки СЕХ с PEI, иногда требуется использование более слабой колонки СЕХ, для того, чтобы элюировать PEI с колонки после каждого запуска.

Предыдущие исследования показали, что если для флокуляции используют различные уровни PEI, связывающая способность колонки СЕХ будет увеличиваться по мере использования более низких уровней PEL Также было отмечено, что выход на этапе хроматографии СЕХ будет увеличиваться при более низком уровне PEI при нагрузке.

Использование одинаково заряженных ионообменной мембраны перед ионообменной колонкой для уменьшения примесей может привести к увеличению связывающей способности, выхода, клиренса загрязнения, которые могут обеспечить большую эффективность способа и снижение эксплуатационных затрат.

Способ ионообменной мембранной хроматографии по настоящему изобретению

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения композиция, которую подвергают способу очистки по данному документу, представляет собой рекомбинантно полученный полипептид, предпочтительно интактное антитело, экспрессированное рекомбинантной культурой клеток-хозяев яичника китайского хомячка (СНО) или E. coli. Необязательно, перед мембранной ионообменной хроматографией композицию подвергают по меньшей мере одному этапу очистки. Композиция содержит представляющий интерес полипептид и одно или более загрязняющее вещество, такое как клетки яичника китайского хомячка (CHOP); белки E. coli (ЕСР); выщелоченный протеин А; нуклеиновая кислота; вариант, фрагмент, агрегат или производное желаемого антитела; другой полипептид; эндотоксин; вирусное загрязняющее вещество; аминогликозидные компоненты антибиотиков (напр., гентамицин); или ионный полимер, добавленный в процессе очистки (напр., полиэтиленимин (PEI), поливиниламин, полиаргинин, поливинилсульфоновая кислота, полиакриловая кислота) и т.д.

Примеры дополнительных методик очистки, которые могут выполнять до, во время или после способа мембранной ионообменной хроматографии, содержат фракционирование с помощью гидрофобной хроматографии (напр., на PHENYL-SEPHAROSE™), осаждение этанолом, термическое осаждение, осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ), изоэлектрофокусирование, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на HEPARIN SEPHAROSE™, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография, ионный обмен смешанного типа, хроматофокусирование, SDS-PAGE, осаждение сульфатом аммония, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ, хроматография на основе индукции заряд гидрофила, высокоэффективная ангенциальная поточная фильтрация (HPTFF) и аффинная хроматография (напр., с использованием протеина А, протеина G, антитела или определенного субстрата, лиганда или его антигена в качестве захватывающего реагента).

При использовании рекомбинантных способов, полипептид может быть получен внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретируется в среду. Если полипептид получают внутриклеточно, в качестве первого этапа, нерастворимый дебрис, либо клеток-хозяев, либо лизированных клеток, удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если полипептид секретируется в среду, рекомбинантные клетки-хозяева могут быть отделены от клеточной культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией.

В случае выделения антител, основная очистка происходит во время аффинной хроматографии протеина А, если его применяют в качестве первого этапа. Протеин А представляет собой бактериальный белок клеточной стенки, который специфически связывается с областью Fc антитела. Когда происходит иммобилизация в хроматографической среде, протеин А обеспечивает способ очистки рекомбинантных антител, поскольку он может избирательно связывать антитела в комплексные электролиты, позволяя примесям проходить сквозь.

Основная схема действий аффинной колонки с протеином А проста: связывает около нейтрального рН и вымывает в кислой среде. Белок, иммобилизованный на твердой фазе, используют для очищения полипептида, содержащего область C_H2/C_H3. Твердая фаза предпочтительно представляет собой колонку, которая содержит стекло, кремнезем, агарозу или полистиролдивинилбензольную поверхность для иммобилизации протеина А. Предпочтительно твердая фаза представляет собой стекляннуя колонку с контролируемым размером пор, колонку с кремневой кислотой или высокосшитую агарозную колонку. Колонка Mabselect SuRe™, коммерчески доступная от GE Healthcare, является примером высокосшитой агарозной колонки протеина А, эффективной при очистки антител. Иногда, колонку, в попытке предотвратить неспецифическое присоединение к колонке, покрывают реагентом, таким как глицерин. Колонка PROSEP А™, коммерчески доступная от Millipore Corporation, является примером стеклянной колонки с протеином А с контролируемым размером пор, покрытой глицерином. Твердую фазу в хроматографии с протеином А уравновешивают подходящим буфером.

Загрязненный препарат получают из рекомбинантных клеток-хозяев, загруженных на твердую фазу, уравновешенную с помощью загрузочного буфера, который может быть таким же, как уравновешивающий буфер. Также как загрязненный препарат проходит через твердую фазу, полипептид адсорбируется с иммобилизованным протеином А, а другие загрязняющие вещества (например, белки клеток яичника китайского хомячка, CHOP, при чем полипептид получают в клетке СНО, гентамицин и полиэтиленимин (PEI)) неспецифически связываются с твердой фазой.

Следующий этап выполняют последовательно, что влечет за собой удаление загрязняющих веществ, связанных с твердой фазой промывкой твердой фазы раствором, содержащим на промежуточном этапе промывки соль, аминокислоту и/или гидрофобный раствор электролита. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения соль в этом промывании представляет собой фосфат калия, аминокислота представляет собой аргинин, а гидрофобный электролит представляет собой ТЕМАС и/или ТЕАС. Хоть в промывании может принимать участие одно растворенное вещество, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения могут использовать два или более подобные растворенные вещества. Растворенное вещество(а) предпочтительно добавляют в рН буферный раствор, который имеет рН около нейтрального.

После промежуточного этапа промывания, соответствующего предыдущему пункту, из колонки извлекают представляющий интерес полипептид. Обычно это осуществляют с помощью подходящего элюирующего буфера. Полипептид могут, например, элюировать из колонки с использованием элюирующего буфера, имеющего низкий рН, напр., в диапазоне от около 2 до около 5 и предпочтительно в диапазоне от около 2,5 до около 3,5. Примеры элюирующих буферов для этой цели, содержат цитратные или ацетатные буферы.

Мембранную ионообменную хроматографию осуществляют таким образом, как заявлено в данном документе. Первым выбором, который должен быть сделан, является либо анионобменная, либо катионообменная мембрана, которую будут использовать. Хоть изоэлектрическая точка (pI) некоторых антител лежит в диапазоне от приблизительно 6,7 до 9,4, pI многих антител является высоким (часто >8, а иногда и >9). В общем, катионообменную мембрану могут использовать для антител с pI более около 8, и могут использовать анионообменную мембрану в случае антител с pI менее около 8.

Для работы мембранной катионообменной хроматографии в режиме перегрузки, рН материала нагрузки доводят до от около 1 до около 5 единиц рН ниже pI антитела, проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 40 мСм/см, в зависимости от рН и, затем закачивают антитела сквозь мембрану. В некоторых вариантах реализации значение рН материала нагрузки доводят на от около 1 до около 4 единиц рН, на от около 1 до около 3 единиц рН, на от около 1 до около 2 единиц рН или на около 1 единицу рН ниже pI антитела. В других вариантах реализации настоящего изобретения проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 20 мСм/см или ≤ около 10 мСм / см, в зависимости от рН. Поскольку рН нагрузки меньше pi антитела, антитело (которое стало положительно заряженным) НЕ будет возвращаться в первоначальное состояние. Скорее, антитело будет электростатически связанным с отрицательно заряженными функциональными группами катионообменной смолы. Это потому, что антитело (положительный) и мембрана (отрицательный) имеют противоположный заряд. Так как pI многих загрязняющих веществ, напр., белки клетки-хозяина, такие как CHOP или ЕСР, аминогликозидов, таких как гентамицин и ионные полимерные добавки, такие как полиэтиленимин (PEI), которые вымываются с антителом во время аффинной хроматографии с протеином А, лишь немного отличается от pI антитела, то pI могут отличаться только на от около 0,05 до около 0,2 единиц pI, такие загрязняющие вещества, как "основные" антитела, также связываются с мембраной. В схемах очистки, где не используется хроматография с протеином А, гентамицин, PEI, или другие примеси остаются в достаточно высокой концентрации, чтобы нарушить работу колонки IEX, если не используют мембрану. Без связи с теорией, представляется, что в случае мембранной катионообменной хроматографии, которая работает в режиме перегрузки, при условиях рН и проводимости, которые индуцируют заряд с минимальным ионным экранированием, происходит конкурентоспособная адсорбция и загрязняющие вещества преимущественно связываются с мембраной или иным образом эффективно "вытесняют" антитело из мембраны (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), позволяя антителу "вымываться" из матрицы или потока после связывания и восстанавливаться в элюате.

Для работы мембранной анионообменной хроматографии в режиме перегрузки, рН материала нагрузки доводят до от около 1 до около 5 единиц рН выше pI антитела, проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 40 мСм/см, в зависимости от рН и затем закачивают антитела сквозь мембрану. В некоторых вариантах реализации значение рН материала нагрузки доводят на от около 1 до около 4 единиц рН, от около 1 до около 3 единиц рН, от около 1 до около 2 единиц рН или на около 1 единицу рН выше pI антитела. В других вариантах реализации настоящего изобретения проводимость материала нагрузки доводят до ≤ около 20 мСм/см или ≤ около 10 мСм / см, в зависимости от рН. Поскольку рН нагрузки больше pI антитела, антитело (которое стало отрицательно заряженным) не будет возвращаться в первоначальное состояние. Скорее, антитело будет электростатически связанным с положительно заряженными функциональными группами катионообменной смолы. Это потому, что антитело (отрицательный) и мембрана (положительный) имеют противоположный заряд. Так как pI многих загрязняющих веществ, напр., белков клетки-хозяина, таких как CHOP, которые вымываются с антителом во время аффинной хроматографии с протеином А, лишь немного отличается от pI антитела, то pI могут отличаться только на от около 0,05 до около 0,2 единиц pi, такие загрязняющие вещества, как "кислые" антитела, также связываются с мембраной. Без связи с теорией, представляется, что в случае мембранной анионообменной хроматографии, которая работает в режиме перегрузки, при условиях рН и проводимости, которые индуцируют заряд с минимальным ионным экранированием, происходит конкурентоспособная адсорбция и загрязняющие вещества преимущественно связываются с мембраной или иным образом эффективно "вытесняет" антитело из мембраны (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), позволяя антителу "вымываться" из матрицы или потока после связывания и восстанавливаться в элюате.

В одном примере мембранную хроматографию осуществляют как на стандартной хроматографической системе, так и в оригинальной хроматографической системе, такой как АКТА™ Explorer (GE Healthcare), снабженной манометрами, датчиками и насосами с контроллерами насосов. В этом примере мембранное устройство устанавливают ниже по потоку относительно манометра. В указанном примере детекторы рН и проводимости устанавливают ниже по потоку от мембранного устройства. В продолжение этого примера, систему тщательно промывают водой, а затем уравновешивают буфером перед установкой мембраны. В дальнейшем в этом примере, систему с мембраной промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока рН раствора и проводимость на выходе не соответствуют спецификации уравновешивающего буфера (около пяти объемов мембраны) и не наблюдается стабильный исходный уровень. Продолжая далее в этом примере, исходный материал загружают с помощью насоса на 333-2667 MV/час, рН 5,5 (для очистки гипотетического "основного" антитела) или рН 8,0 (для очистки гипотетического "кислого" антитела) и проводимость приблизительно 4 мСм/см. Продолжая еще дальше в этом примере, записывают изменения в процессе эксплуатации операционного обратного фильтрационного давления, рН и проводимости. Наконец, в этом примере полипептид в мембранном элюате собирают сразу же после того, как след ультрафиолетового (УФ) поглощения при 280 нм составляет 0,2 единицы оптической плотности выше исходного уровня. После загрузки исходного материала, мембрану промывают соответствующим промывочным буфером, и сбор в емкость останавливают после того, как УФ след при 280 нм не превышает 0,2 единицы оптической плотности, а в образцах из емкости во фракции элюата мембраны анализируют концентрацию полипептида, уровень димеров/агрегации, белки клетки-хозяина, ДНК и выщелоченный протеин А. Этап восстановления, как правило, рассчитывают с использованием загруженного полипептида и полипептида в элюате мембраны. Обычно используют только одноразовую мембрану. Что касается химико-аналитических анализов, содержание полипептида (концентрация полипептид) может быть определено по поглощению при 280 нм с использованием спектрофотометра Beckman. Агрегация полипептида может быть определена с помощью гель-хроматографии. Уровни белка клетки-хозяина, напр., CHOP или ЕСР, могут быть проанализированы с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). ДНК клетки-хозяина может быть количественно определено с помощью использования TaqMan PCR (полимеразной цепной реакции). Выщелоченный белок может быть получен с использованием иммунохимического способа на основе ELISA, рекомендованного поставщиком смолы с протеином А. Гентамицин возможно анализировать с помощью ELISA и полиэтиленимина (PEL), их уровни оценивают количественно с помощью хроматографии с помощью Q Sepharose Fast Flow или ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Следующие буферы гипотетически разработаны и испытаны для использования с мембраной S: (1) 89 мМ уксусная кислота, 127 мМ трис-основание, 21 мМ лимонная кислота, рН 5,5, 6,0 мСм/см, (2) 28 мМ MES, 95 мМ NaCl, рН 6,0, 11 мСм/см, (3) 200 мМ NaOAc, рН 5,5, 12 мСм/см, (4) 100 мМ NaOAc, рН 5,5, 6,4 мСм/см, (5) 96 мМ уксусная кислота, 65 мМ TRIS, рН 5,0, 3,6 мСм/см, (6) 25 мМ MOPS, рН 7,1, 0,8 мСм/см, (7) 50 мМ HEPES, 90 мМ NaCl, рН 7,0, 10 мСм/см, (8) 0,5х фосфатно-солевой буфер (PBS), 4,5 мМ уксусная кислота, рН 5,0, 8,0 мСм/см, 25 мМ NaOAc, рН 5,0, 6,0 мСм/см.

Следующие буферы гипотетически разработаны и испытаны для использования с мембраной Q: (1) 50 TRIS, 15 мМ NaCl, рН 8,0, 4,3 мСм/см, (2) 25 мМ TRIS, рН 8,0, 1,3 мСм/см, (3) 60 мМ TRIS, 118 мМ NaCl, рН 8,0, 15,7 мСм/см, (4) 50 мМ TRIS, 50 мМ NaOAc, рН 8,0, 7,0 мСм/см, (5) 25 мМ HEPES, 85 мМ NaOAc, рН 7,0, 6,5 мСм/см, и (6) 91 мМ уксусная кислота, 130 мМ TRIS, рН 8,0, 5,0 мСм/см, (7) 75 мМ глицин, 9 мМ фосфорная кислота, 115 мМ Трис, рН 8,9, 0,8 мСм/см (8) 25 мМ TRIS, 5 мМ NaCl, рН 8,9, 1,0 мСм/см. (9) 25 мМ TRIS, 10 мМ NaCl, рН 9,0, 1,5 мСм/см, (10) 1х фосфатно-солевой буфер (PBS), рН 7,3, 15,2 мСм/см.

Кроме того, любая буферная система может увеличивать или уменьшать рН при добавлении уксусной кислоты, лимонной кислоты, HEPES, соляной кислоты, фосфорной кислоты, гидроксида натрия, TRIS или других подобных кислотных и основных буферов, для того, чтобы достичь подходящее значение рН. Любая буферная система также может увеличивать или уменьшать проводимость с использованием очищенной воды, воды для инъекций (WFI), ацетата натрия, хлорида натрия, фосфата калия или другого подобного буфера с низким и высоким содержанием соли, для того, чтобы достичь подходящую проводимость.

Развитие конкурентного этапа адсорбции мембранной хроматографии содержит пропускание материал нагрузки сквозь мембрану при различных уровнях рН и проводимости. Сохранение полипептида, либо представляющего интерес полипептида или примеси, может быть повышена, если молекула имеет большое электростатическое взаимодействие. Электростатические взаимодействия могут быть повышены при работе в условиях, если полипептиды являются высокозаряженными, напр., если используют буфер с рН, который достаточно отличается от pI полипептида, повышение заряда полипептида и низкую ионную силу для того, чтобы предотвратить экранирование зарядов буферными ионами. В отличие от этого, электростатические взаимодействия могут быть уменьшены при работе в условиях, если полипептиды являются слабозаряженными, напр., если используют буфер с рН, который достаточно близок к pI полипептида, уменьшения заряда полипептида и высокой ионную силу для того, чтобы обеспечить экранирование зарядов буферными ионами. В результате, полипептиды, которые имеют различные физико-химические свойства, могут быть разделены с помощью адсорбции на мембране за счет оптимизации буферного раствора. Некоторые молекулы могут удерживаться на данной мембране, в то время как остальные проходят сквозь, что основано на соответствующем выборе рН и ионной силы буфера.

Получение полипептида, осуществленное в соответствии со способом мембранной ионообменной хроматографии по данному документу, при необходимости подвергают дополнительным этапам очистки. Иллюстративные дополнительные этапы очистки были рассмотрены выше.

Как показано на Фигуре 1, отдельный пример успешной схемы очистки антитела представляет собой способ восстановления, который влечет за собой этап начального захвата аффинной хроматографии с протеином А, после чего используют катионообменную колонку в режиме связывания и элюции с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.

Как показано на Фигуре1, отдельный пример усовершенствованной схемы очистки антитела представляет собой способ восстановления, который влечет за собой этап начального захвата аффинной хроматографии с протеином А, с последующей работой катионообменной мембраны в режиме перегрузки, защищающем катионообменную колонку в режиме связывания и элюции, с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.

Как показано на Фигуре 1, еще один пример усовершенствованной схемы очистки представляет собой способ восстановления, который влечет за собой предварительную работу катионообменной мембраны в режиме перегрузки, защищающем катионообменную колонку в режиме связывания и элюции, с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.

Как показано на Фигуре 2, еще один пример эффективной схемы очистки в случае не антитела представляет собой способ восстановления, который влечет за собой этап начального захвата катионобменной хроматографии, с последующим этапом или этапами финишной обработки.

Как показано на Фигуре 2, еще один пример усовершенствованной схемы очистки представляет собой способ восстановления, который влечет за собой предварительную работу катионообменной мембраны в режиме перегрузки, защищающем катионообменную колонку в режиме связывания и элюции, с последующим конечным этапом или этапами финишной обработки.

В отличие от применений, в которых в первую очередь применяют мембраны IEX, в качестве единственного этапа очистка или этапа финишной обработки, мембраны по настоящему способу очистки в настоящее время используют для защиты одноименно заряженной ионообменной мембраны (напр., катионообменную мембрану размещают непосредственно перед катионообменной смолой). Это является выгодным, потому что мембраны являются более селективными по отношению к примесям, чем полипептиды/антитела, таким образом они снижают количество, или устраняют, примесей, которые идут на колонку. Примеси могут также смещать полипептид/антитело так, что он, в конечном счете, совершает свой путь на колонку. С вышеупомянутой колонкой мембраны могут использовать либо постоянно, либо с перерывами.

Использование мембран перед одинаково заряженной ионообменной колонкой в настоящем способе очистки может быть выгодно, при условии, что примеси в нагрузке снижают производительность катионообменной колонки. При удалении этих примесей с мембраной, она может позволить катионообменной колонки быть загруженной до более высокой связывающей способности, что приводит к уменьшению размера колонки или, в перспективе, к уменьшению количества циклов. Кроме того, с помощью удаления этих примесей с мембраной, это может позволить катионообменной колонке иметь увеличение выхода этапа, или иметь более длительный срок службы смолы, прежде чем утилизировать, или привести к снижению уровней загрязнения в катионообменной емкости, или уменьшить количество этапов финишной обработки ниже по потоку. Он также может позволить катионообменной колонке заменить аффинную колонку с протеином А, которая может быть выгодной, если является необходимым более дешевая альтернатива аффинной смоле с протеином А, или если представляющий интерес полипептид не будет связываться с аффинной смолой с протеином А. Использование катионообменной мембраны и катионообменной колонки в непрерывном режиме может быть выгодно ввиду уменьшения общего времени обработки, буферов или оборудования, такого как емкости или хроматографические системы.

Необязательно, полипептид по желанию конъюгирован с одной или более гетерологичной молекулой. Гетерологичная молекула может быть, например, такой, которая увеличивает время полураспада полипептида в сыворотке (напр., полиэтиленгликоль, PEG), или она может быть меткой (напр., ферментом, флуоресцентной меткой и/или радионуклидом) или цитотоксической молекулой (напр., токсином, химиотерапевтическим лекарственным средством или радиоактивным изотопом и т.д.).

Терапевтический состав, содержащий полипептид, необязательно конъюгированный с гетерологичной молекулой, может быть получен путем смешивания полипептида, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизирующими средствами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных композиций или водных растворов, "фармацевтически приемлемый" носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях являются нетоксичными для реципиентов и содержат буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, которые содержат аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярный (менее чем около 10 остатков) полипептид; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, которые содержат глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (напр., Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Активные ингредиенты могут также заключать в микрокапсулы, получаемые, например, способами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозная или желатиновая микрокапсула и микрокапсула на основе поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Состав, который будет использоваться для введения in vivo, должен быть стерильным. Это легко достигается путем фильтрации сквозь стерильные фильтрационные мембраны.

Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением содержат полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие полипептид, где матрицы находятся в виде формованных изделий, напр., пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением содержат сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γэтил-L-глутамат, недеградируемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Полипептид очищают, как описано в данном документе, или композицию, которая содержит полипептид и фармацевтически приемлемый носитель, затем используют для различных диагностических, терапевтических или других целей, известных для таких полипептидов и композиций. Например, полипептид может быть использован для лечения заболевания млекопитающего путем введения млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида.

Следующий пример(ы) предложены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Раскрытия всех цитирований в описании специально содержатся в данном документе в виде ссылок.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Внедрение

Это исследование фокусируется на очистки моноклональных антител с использованием ионообменных мембран в режиме конкурентной адсорбции для повышения эффективности колонок ниже по потоку. Поскольку мембраны, работающие в режиме конкурентной адсорбции, связывают многие примеси сильнее, чем моноклональные антитела или другие полипептиды, представляющие интерес, мембрана эффективно удаляет примеси, которые могут оказывать вредное воздействие на одинаково заряженную колонку ниже по потоку.

Этот подход является нелогичным для многих способов очистки, которые пытаются избавляться от избыточных этапов катионобменной или анионобменной очистки. В этом применении избыточная мембрана перед колонкой ниже по потоку может повысить производительность колонки так, что способ станет в общем более эффективным.

Для анализа, основанного на их молекулярном разнообразии, отбирают одну рекомбинантную ДНК, которая производит МКА, одну рекомбинантную ДНК, которая производит неполное антитело, и одну рекомбинантную ДНК, которая производит полипептид. mAb получают в клеточных культурах СНО и различают по степеням очистки, начиная с отсутствия хроматографической очистки, до трех хроматографических этапов на колонке (с протеином А, анионообменный и катионообменный). Неполное антитело получают в клеточных культурах E. coli и очищают на этапе хроматографии с протеином А. Полипептид получают в клеточных культурах E. coli и без предварительной хроматографической очистки. Потоки исходных материалов выбирают на основе остаточных уровней примесей, которые могут отрицательно влиять на хроматографическую колонку.

Это исследование изучает способность примесей, таких как гентамицин и полиэтиленимином (PEI), негативно влиять на ионообменные колонки и способность ионообменных мембран, таких как Mustang™ S и Natrix S, для того чтобы очистить эти примеси, что приведет к повышению производительности колонки.

Материалы и способы

Поток исходных материалов

Потоки исходных материалов берут из промышленных, опытных или малогабаритных партий клеточных культур (Genentech Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния), первоначально созданных для коммерческих или исследовательских целей. Потоки исходных материалов имеют различные степени очистки, то есть клетки разделяют и очищенную жидкость очищают или не очищают на по меньшей мере одном этапе хроматографии на колонке. Каждый поток исходных материалов содержит требуемый терапевтический полипептид и определяемый количественно уровень примесей. Состав каждого исходного потока изменяют в зависимости от конкретного способа и уровня очистки полипептида. Таблица 1 демонстрирует характеристики потока исходных материалов каждого из антител, полипептидов, или одновалентных антител, используемых в настоящем исследовании.

Определение количества полипептида

Концентрацию полипептида определяют с использованием трех способов. Если уровни примесей являются слишком низкими, чтобы иметь заметное влияние на УФ-поглощение, используют УФ-спектрофотометрическое сканирование при 280 и 320 нм. Если уровень примесей или цвет имеют заметное влияние на УФ-поглощение, для количественного определения концентраций антител или полипептидов используют, соответственно, аналитическую аффинную колонку или ионообменную колонку.

В случае образцов, испытанных с помощью УФ-спектрофотометрического сканирования, образцы, содержащие полипептид, разбавляют соответствующим неинтерферирующим разбавляющим веществом в диапазоне от 0,1 до 1,0 ЕОП. Пробоподготовку и спецификацию показаний сканирования проводят дважды и фиксируют среднее значение. Коэффициент поглощения протестированных полипептидов составляет от 1,45 до 1,70 (мг/мл)^-1см^-1. Для расчета концентрации mAb с использованием уравнения, известного как закон Бэра-Ламберта используют оптическую плотность при 280 и 320 нм, коэффициент разбавления, длину пути (1 см) и коэффициент ослабления абсорбции.

Для образцов, испытанных на аналитических аффинных колонках, образцы, содержащие антитело, в случае необходимости разбавляют соответствующим неинтерферирующим разбавителем в диапазоне от 0,025 до 4,0 мг/мл. С другой стороны, объем инъекции может быть в два раза больше или в два раза меньше наиболее низких или наиболее высоких образцов концентраций, соответственно. Подготовка образцов и исследование HPLC выполняют дважды и записывают среднее значение. Так же, как в случае HPLC анализа генерического антитела, результаты концентрации образца для специфических антител корректируют с помощью соответствующего коэффициент ослабления абсорбции против коэффициента ослабления абсорбции соответствующих материалов антитела.

В случае образцов, испытанных на аналитической ионообменной колонке, образцы, содержащие полипептид, в случае необходимости разводят соответствующим неинтерферирующим разбавителем в интервале от 0,1 до 0,8 мг/мл. Подготовка образцов и исследование HPLC выполняют дважды и записывают среднее значение. Результаты концентрации образца определяют интегрированием площади под пиком инъекции и коррелированием со стандартной кривой с использованием справочного материала.

Определение количества белков клетки-хозяина СНО (CHOP)

Для количественной оценки уровней CHOP используют твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Аффинно очищенные анти-СНОР антитела козы иммобилизируют в лунках микротитрационного планшета. Растворы образцов, содержащих СНО, стандарты и контроли, инкубируют в лунках, с последующей инкубацией с анти-СНОР антителами козы, конъюгированными с пероксидазой из хрена. Ферментативную активность пероксидазы из хрена определяют с помощью дигидрохлорида о-фенилендиамина. CHOP определяют количественно путем считывания оптической плотности при 492 нм в спектрофотометре для прочтения микротитрационных планшетов. Для создания стандартной кривой и автоматического расчета концентрации образца используют компьютерную программу построения кривой. Диапазон результатов количественного анализа в случае ELISA обычно составляет от 5 нг/мл до 320 нг/мл. Для каждого образца анализируют 2-4 разведения и усредняют значения. Количества CHOP делят на концентрацию белка, и результаты представляют в миллионных долях (нг СНОР/мг белка).

Определение количества белков Е. Coli (ЕСР)

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для количественной оценки уровней ЕСР используют таким же образом, как и для количественного определения CHOP.

Определение количества гентамицина

Для количественной оценки уровней гентамицина используют твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Поликлональные антитела козы к гентамицину-BSA иммобилизуют в лунках микротитрационного планшета. При связывании с антителом, гентамицин конкурирует с биотин-гентамицином. Количество связанного биотин-гентамицина измеряют пероксидазой хрена-стрептавидином, ферментативная активность которой обнаружена по отношению к тетраметилбензидину (ТМВ). Образцы разводят в разбавляющем веществе для анализа ELISA в соответствии с приемлемым разбавлением образца, установленном при определении образца. Гентамицин определяют количественно путем считывания оптической плотности при 450 нм в спектрофотометре для прочтения микротитрационных планшетов. Для создания стандартной кривой и автоматического рассчета концентрации образца используют компьютерную программу построения кривой с минимум 4 параметрами. Как правило, диапазон результатов в случае стандартной кривой в анализе гентамицина составляет от 0,58 нг/мл до 90 нг/мл. Для каждого образца анализируют 2-4 разведения и усредняют значения. Количества гентамицина разделяют на концентрацию белка и результаты представляют в единицах частей на миллион (нг гентамицина/мг белка).

Определение количества полиэтиленимина

Все данные записаны на спектрометре Bruker 600 MHz, снабженном криозондом TCI, оборудованным градиентом в 5 мм, и автоматическим пробоотборником. Данные получают с помощью последовательности импульсов спинового эха, предназначенной для сведения к минимуму резонансных сигналов от белка в растворе. Возбуждение, определяющее последовательность импульсов, в сочетании с последовательностью импульсов предварительного насыщения получают для того, чтобы минимизировать резонансный сигнал воды в растворе. До измерений по способу ЯМР, ко всем образцам добавляют D₂O до конечной концентрации 10% (630 мл пробы +70 мл D₂O).

Количественный анализ NMR представляет собой общий аналитический способ и может быть применен к исключительно большому числу органических молекул. Как правило, каждая молекула имеет уникальный набор сигналов NMR с характерными резонансными частотами, относительными пиковыми интенсивностями, ширинами линий и взаимосвязанными паттернами. Единственным критерием пригодности анализа NMR для определения концентрации небольших молекул, содержащих протон, состоит в том, что сигнал NMR анализируемого вещества и компонентов буфера не перекрываются. Анализ NMR является точным и обладает высокой точностью в широком диапазоне концентраций анализируемого вещества (например, от 1 мкг/мл до 154500 мкг/мл в случае пропиленгликоля).

Хроматографические мембраны

Испытываемыми мембранами являются Mustang™ S (Pall Corporation, East Hills, Нью Йорк) и Natrix S (Natrix Separations, Burlington, Канада). Mustang™ S и Natrix S представляют собой сильные катионообменные мембраны, которые эффективно связывают положительно заряженные белки и вирусные частицы. Mustang™ S изготовлена из полиэфирсульфона (PES) с 0,8 мкм порами и модифицирована образованием сульфоновой кислоты. Мембрана Natrix S состоит из полимерного гидрогеля, образованного внутри гибкой пористой матрицы носителя. Матрица носителя обеспечивает механическую прочность, тогда как свойства гидрогеля определяют химический состав для разделения продукта. Для увеличения связывающей способности производитель может объединить несколько слоев мембраны в каждом устройстве. Общее количество слоев и толщина варьируются в зависимости от производителя и размера устройства, которое изготавливают.Объем мембраны (MV) представляет собой физический объем мембраны (твердых и пустых) и измеряется в единицах мл. В данном исследовании используют множество мембранных устройств, представляющих различные масштабы. В Таблице 2 приведены соответствующие спецификации для каждой испытанной мембраны.

Хроматографические смолы

Испытываемые смолы представляют собой Fractogel SE Hicap (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, Нью джерси) и SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, Нью джерси). Смолы Fractogel SE Hicap и SP Sepharose Fast Flow являются сильными катионообменныеми смолами. Смола Fractogel SE Hicap состоит из сшитых полиметакрилатных частиц диаметром 40-90 мкм с размером пор около 800 А. Функциональный лиганд ковалентно связан частицой длинной линейной полимерной цепью. Смола SP Sepharose Fast Flow изготовлена из высокосшитую агарозных частиц диаметром 45-165 мкм с эксклюзионным пределом ~4000000 Да. Sepharose Fast Flow представляет собой сшитое производное Sepharose с сульфопропильным лигандом в качестве функциональной группы. Способ сшивания является собственностью производителя.

Системы очистки мембраны и смолы

Малогабаритные тесты проводят с АКТА Explorer™ 100 (GE Healthcare, Fairfield, Коннектикут), которая представляет собой систему очистки программируемого способа, которая содержит интегрированный насос-дозатор, датчик давления и встраиваемые рН-, проводимости и УФ-датчики. Система Explorer была запрограммирована и контролируется с помощью программного обеспечения UNICORN™ v5.10, работающего на компьютере (GE Healthcare, Fairfield, Коннектикут). Малогабаритные тесты выполняют также с помощью неавтоматизированной системы, которая содержит шланговый насос с цифровым режимом экономии Masterflex® L/S® (Cole Parmer, Vernon Hills, Иллинойс), встраиваемый датчик давления DTX™ Plus TNF-R (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Нью-Джерси), и весы AND EK-1200i (A&D Company, Ltd., Tokyo, Япония). Весы используют для физического мониторинга скорости потока насоса путем измерения накопления массы. Массу преобразуют в объем при условии, что плотность потока исходных материалов составляет 1,0 г/мл. Давление со стороны встраиваемых преобразователей и массы на весах непрерывно контролируют с помощью системы сбора данных сети NetDAQ™ 2640А/41А (Fluke, Everett, Вашингтон), который связан с компьютером под управлением Trendlink™ в версии 3.1.1 (Canary Labs Inc., Martinsburg, Пенсильвания) и программного обеспечения RsCom в версии 2.40 (A&D Company, Ltd., Tokyo, Япония) для давления и сбора массы соответственно.

Способ сбора образцов, проходящих сквозь мембрану

Проточные образцы собирают тремя различными способами. Случайные образцы и фракции являются наиболее распространенными. Случайный образец представляет собой небольшую мгновенную аликвоту потока, взятую при конкретной пропускной способности. Фракции крупнее проточных образцов, и определяются с помощью диапазонов пропускной способности. Проточную пробу также собирают в виде одной большой емкости. Анализ емкости является эффективным, но случайные образцы и фракции, как правило, являются более полезными для мониторинга уровней mAb и примесей, потому что последовательные пробы могут быть объединены для демонстрации трендов.

Способы способностей к динамическому связыванию (DBC)

Способности к динамическому связыванию (DBC) мембран и смол определяют путем загрузки потока исходных материалов в среду при обычной скорости технологического процесса. Это предпочтительнее, чем позволить среде впитаться в поток исходных материалов нагрузки, что обычно делают для определения статической связывающей способности. В случае данного применения DBC является более подходящим показателем производительности сред. DBC определяют, учитывая случайные проточные образцы или фракции во время фазы нагрузки. Использование конкретной пропускной способности в случае случайных образцов или объема всех фракций и концентрации полипептида или примеси для всех случайных образцов или фракций позволяет создать диаграмму DBC. Кроме того, если известны концентрации полипептида или примесей в материале нагрузки, график может быть получен для сравнения концентрации фильтрата (С) с концентрацией нагрузки (С₀). В этом случае значение С/С₀ равное 0 указывает на то, что концентрация фильтрата значительно ниже, чем концентрация нагрузки, а значение С/С₀ равное 1 указывает на то, что концентрация фильтрата совпадает с концентрацией нагрузки.

Экспериментальная часть

Сырье удаляют из холодильного оборудования (2-8°С или ≤70°С) и оставляют для уравновешивания до комнатной температуры. Затем необязательно, регулируют рН и/или проводимость при условиях, приведенных в Таблице 1, с использованием соответствующего средства для титрования (напр., 1,5 М Трис-основания или 1 М лимонной кислоты) или разбавителя (очищенная вода или 5 М хлорид натрия). После чего фильтруют в автономном режиме с использованием AcroPak™ 20 (Pall Corporation, East Hills, Нью-Йорк), AcroPak™ 1000 (Pall Corporation, East Hills, Нью Йорк) или 1000 мл вакуум-фильтра (Thermo Fisher Scientific, Rochester, Нью Йорк), чтобы удалить любые осадки, которые могли образоваться во время холодного хранения или регулирования температуры.

Система очистки получают с помощью промывания нагрузки и проточной линии с использованием очищенной воды или соответствующего буфера. Мембрану помещают в линию ниже по потоку от насоса подачи и датчика давления, а затем его промывают 50-500 MV очищенной воды или уравновешивающего буфера. После промывки, сырьевой поток наносят на мембрану и нагружают различные количества при постоянной скорости потока 333-2667 MV/час. Во время фазы нагрузки по мере необходимости из потока отбирают образцы. Затем, необязательно, мембрану очищают буфером для того, чтобы собрать остаточный продукт. Для поддержания удержания примесей на мембране очищающий (другими словами промывочный буфер) буфер по сравнению с сырьем в целом имеет аналогичное значение рН и имеет равную или меньшую проводимость.

Полученные случайные образцы мембраны, фракций или емкостей затем проанализируют для определения концентраций полипептида и/или примесей.

В некоторых случаях полученные мембранные емкости затем наносят на смолу. Хроматографию смолы выполняют только с использованием Äkta Explorer, чтобы УФ, рН и проводимость изменялась в режиме реального времени и накопление материала могло бы быть облегчено с помощью встраиваемого УФ-датчика. Во время фазы нагрузки по мере необходимости из потока отбирают образцы.

В некоторых случаях мембрану элюируют. Элюирование мембраны выполняют только с использованием Äkta Explorer, чтобы накопление материала могло быть облегчено с помощью встраиваемого УФ-датчика. Мембрану элюируют с использованием сильно минерализованный буфер (20 мМ ацетата натрия и 350 мМ хлорида натрия, рН 5,5). Кроме того, в некоторых случаях мембрану элюируют с градиентом двух буферов, (20 мМ ацетат натрия, 0 мМ хлорида натрия, рН 5,5 и 20 мМ ацетат натрия, 2000 мМ хлорида натрий, рН 5,5) от 0 до 100% за 20 мл.

В некоторых случаях смолу элюируют.Элюирование смолы выполняют только с использованием Äkta Explorer, чтобы накопление материала могло бы быть облегчено с помощью встраиваемого УФ-датчика. Смолы элюируют с использованием сильно минерализованного буферного градиента (от 50 до 500 мМ ацетата натрия, рН 5,5) или сильно минерализованного этап (50 мМ HEPES, 200 мМ хлорида натрия, 0,05% тринитротолуола, 1 мМ DTT, рН 7,5) при постоянной скорости потока 200 см/ч и собирают от 0,5-1,0 OD или 1,25-1,25 OD в случае Fractogel SE Hicap и SP Sepharose Fast Flow соответственно.

Результаты

Выход малогабаритной катионобменной мембраны

Анионообменная емкость MAb 1 при рН 8,0 и 5,0 мСм/см и анионообменная емкость mAb 1, которую доводили до рН 5,5 и 6,4 мСм/см с использованием 1М лимонной кислоты, обрабатывают мембраной Mustang™ S при 667 MV/час. Мембрана Mustang™ S использует 0,18 мл устройство Acrodisc®. Потоки исходных материалов mAb 1 при рН 5,5 и рН 8,0 оба ниже pi антитела, и, следовательно, являются положительно заряженными. Сырье и проточные случайные образцы анализируют на концентрацию антител. Хоть исходные образцы демонстрируют некоторое количество антител, связывающихся с мембраной, на Фигуре 3 продемонстрирован выход, который является аналогичным при обоих условиях рН, быстро возрастает при плотности нагрузки 1000 г/л, и ≥96% достижимо после плотности нагрузки приблизительно 5000 г/л.

Выход малогабаритной анионобменной мембраны

С целью сравнения для испытаний выбирают mAb 2 с использованием анионообменной мембраны выше изоэлектрической точки 7,7. Белки являются склонными к дезамидированию и агрегации при высокой рН, поэтому подобные тесты на mAb 1 не проводят.Катионообменную емкость при рН 5,5 и 9 мСм/см доводят до рН 8,0 с помощью 1,5 М трис-основания. Исходное сырье затем разделяют на три отдельные емкости и корректируют проводимость с использованием очищенной воды. Первая емкость имеет 10 мСм/см, вторую и третью емкость доводят до 7 мСм/см и 4 мСм/см, соответственно. Все три емкости поддерживают при рН 8,0. Каждый поток исходных материалов затем обрабатывают малогабаритной 0,35 мл Mustang™ Q при постоянной скорости потока 600 MV/час.mAb 3 при рН 8,0 на 0,3 единицы рН выше pI и поэтому антитела являются отрицательно заряженными. Нагрузку и проточные емкости анализируют на концентрацию антител. Фигура 4 иллюстрирует то, что выход является аналогичным при всех трех условиях рН, первоначально быстро растет при плотностью нагрузки 200 г/л, и составляет ≥96% при плотности нагрузки приблизительно 1000 г/л.

Клиренс загрязнения малогабаритной катионобменной мембраны

Для оценки клиренса загрязнения катионобменной мембраны, емкость mAb 3 с протеином А при рН 5,5 и 3,2 мСм/см обрабатывают сквозь более малогабаритную мембрану 0,18 мл Mustang™ S при постоянной скорости потока 1333 MV/час. Нагрузка mAb 3 составляет на 3,4 единицы ниже рассчитанной pI и поэтому антитела являются положительно заряженными. Нагрузка, проточные фракции и элюирующие образцы анализируют и результаты в случае CHOP проиллюстрированы на Фигуре 5. Данные показывают, что Mustang™ S изначально снижает CHOP от 438 до 109 частей на миллион. CHOP увеличивается до 318 частей на миллион, когда плотность нагрузки приближается к 55300 г/л. Мембрану элюируют с использованием раствора, имеющего высокое содержание солей. Ионы соли используют для защиты зарядов, тем самым разрушая электростатические взаимодействия, и это является причиной того, что белки десорбируются с поверхности мембраны и свободно перемещаются в подвижной фазе. Анализ емкости для элюирования демонстрирует обогащение примесями, подтверждающее то, что CHOP связывается с мембраной за счет электростатических сил.

Для дальнейшей оценки производительности адсорбера, анионообменную емкость mAb 3, при рН 5,5 и 6,0 мСм/см, обрабатывают мелкомасштабной мембраной 0,18 мл Mustang™ S при постоянной скорости потока 667 МВ/ч. рН mAb 3 составляет на 3,4 единицы ниже pi и поэтому антитело является положительно заряженным. Сырье и проточные случайные образцы анализируют на концентрации mAb, CHOP и гентамицина. Для сравнения концентраций сырья и случайного образца, получают диаграмму С/С₀ (случайный образец/нагрузка) как функцию плотности нагрузки мембраны. Как проиллюстрировано на Фигуре 6, величины С/С₀ mAb находятся вблизи 1,0 при плотностях нагрузки от 2 до 16 кг/л, предполагая, что концентрации случайного образца почти идентичны концентрации нагрузки, и, в очередной раз, выход будет очень высоким. С другой стороны, величины С/Со в случае CHOP и гентамицина являются низкими, на уровне ≤0,2 при плотности нагрузки от 2 до 16 кг/л, предполагая, что концентрации случайного образца значительно ниже, чем концентрация нагрузки, а Mustang™ S удаляет основную массу этих примесей, несмотря на перегруженность mAb.

Селективность связывания малогабаритной катионобменной мембраны

Чтобы оценить, насколько катионообменные мембраны являются селективными для связывания определенных примесей по сравнению с МКА, была разработана и выполнена серия экспериментов с использованием емкости mAb 3 с протеином А. Эту емкость выбирают из-за ее более высокого уровня примесей, в том числе высокомолекулярных частиц (HMWS), димера, низкомолекулярных соединений (LMWS), гентамицина и CHOP. Емкость с протеином А доводят до рН 5,5 и 4,4 мСм/см. Перед нагрузкой, каждую мембрану Mustang™ S уравновешивают 20 мМ ацетата натрия, рН 5,5 и 1,3 мСм/см буфера. Проводят четыре эксперимента, при каждой нагрузке мембраны 0,18 мл Mustang™ S с 1333 MV/ч до плотностей нагрузки 1000, 5000, 10000 или 15000 г/л. После загрузки, мембраны промывают 20 мМ ацетата натрия, рН 5,5 и 1,3 мСм/см буфера. После промывания для элюирования мембраны используют градиентное элюирование с использованием промывочного буфера и 20 мМ ацетата натрия, 2 М хлорида натрия, рН 5,1 и ~500 мСм/см. Градиент формируют за 20 мл, а для проведения анализа элюирующие фракции берут каждые 2 мл. Для четырех экспериментов, элюирующие фракции анализируют на все примеси и концентрации mAb. В любом данном эксперимента с плотностью нагрузки можно сравнивать фракции для того, чтобы определить, когда загрязнение или mAb элюируют из мембраны с позднее элюирующими видами, связанными более плотно, чем рано элюирующие виды. На Фигуре 7 проиллюстрирована доля нормированных концентраций различных видов, проанализированных через 10 фракций элюции для эксперимента с плотностью нагрузки 5000. Положение каждого пика предполагает, что мономер mAb связывается с мембраной наиболее слабо, так как быстро элюируется. В порядке возрастания связывания силы, за мономером следуют HMWS, димер, CHOP, LMWS и гентамицин. Хотя многие виды элюируются в градиенте на аналогичной позиции, эта диаграмма ясно показывает, что гентамицин связывается гораздо сильнее, чем конкурирующие виды.

Кроме того, для каждой плотности нагрузки рассчитывают общую массу каждой примеси или mAb, связанного с колонкой, и сравнивают между различными экспериментами с плотностью нагрузки. На рисунке 8 проиллюстрирована доля нормализованной массы каждого вида в зависимости от увеличения плотности нагрузки мембраны. Направление линий указывает, увеличивается или уменьшается масса вида. Мономер mAb, который, как было показано ранее, связывается наиболее слабо, имеет снижение уровня массы при увеличении плотности нагрузки. И наоборот, димер, HMWS, CHOP, гентамицин, и LMWS по увеличению массы при увеличении плотности нагрузки. Это подтверждает предыдущие результаты относительно прочности связывания и предполагает, что количество мономера mAb уменьшается, тогда как другие виды непрерывно связываются с мембраной.

Перемещение малогабаритной катионобменной мембраны

Чтобы определить, моет ли мономер mAb элюировать сильносвязывающие виды, такие как гентамицин, в качестве гипотезы для объяснения результатов селективности связывания, был проведен эксперимент с использованием емкости mAb 3 с протеином А. Емкость с протеином А доводят до рН 5,5 и 4,2 мСм/см. Эксперимент проводят с помощью уравновешивания мембраны 0,18 мл Mustang™ S с 20 мМ ацетата натрия, рН 5,4. Емкости mAb 1 с протеином А нагружают до тех пор, пока тренд УФ ясно не покажет прорыв mAb. Затем мембрану промывают уравновешивающим буфером перед тем, как для элюирования мембраны используют элюирующий буфер, состоящий из уравновешивающего буфера и 2 г/л гентамицина. Следует отметить, что уравновешивающий буфер и элюирующий буфера имеют одинаковый рН и проводимость, для того, чтобы предотвратить любые влияния на связывание mAb с мембраной. На Фигуре 9 проиллюстрирована хроматограмма, в том числе тренды УФ, рН и проводимости, во время этапов нагрузки, промывания и элюирования. Хроматограмма демонстрирует, что этапа промывания было достаточно для возвращения тренда УФ к базовому уровню, после инициирования этапа элюирования. Это также показывает, что в течение фазы элюирования, большой УФ пик наблюдается без каких-либо существенных изменений в трендах рН или проводимости. Это показывает, что гентамицин может эффективно смещать связанный мономер mAb с катионообменной мембраны.

Сравнение связывания гентамицина с СЕХ мембранами

Для определения связывающей способности гентамицина с СЕХ мембранами проводят эксперименты исследования мембраны 0,18 мл Mustang™ S и 0,23 мл Natrix S. Буфер PBS при рН 7,2 доводят 2,0 М уксусной кислоты и PW до конечного рН 5,00 и проводимости 8,10 мСм/см. Доведенный буфер затем метят емкостью UF/DF mAb 3 и гентамицином до конечных концентраций приблизительно 1,0 мг/мл и 40000 нг/мл. Полученный меченый раствор используют в качестве потока исходных материалов для нагрузки.

Для выполнения экспериментов, обе мембраны промывают очищенной водой, уравновешивают доведенным буфером, нагружают меченым раствором и промывают доведенным буфером. Во время этапа нагрузки, в случае Mustang™ S при 20, 40, 60, и 80 мл собирают 4 мл проточные случайные образцы. В случае Natrix S, 4 мл проточного случайного образца собирают при 10 мл, а затем каждые 60 мл, для получения в общей сложности 19 образцов. Все образцы затем анализируют на концентрации mAb и гентамицина и сравнивают с концентрациями нагрузки для создания диаграммы С/С₀ по сравнению с плотностью нагрузки мембраны, как показано на Фигуре 10.

Хотя это и не отображено на рисунке, концентрация mAb достигает значения С/С₀ 1,0, предполагая, что этап будет иметь высокий выход антител в элюате. Значения С/С₀ для гентамицина, наоборот, достигают 1,0 гораздо позже, предполагая, что обе мембраны связывают значительные уровни. Mustang™ S имеет способность связывать гентамицин между 4,4 и 8,9 г/л_м в то время как Natrix S имеет более высокую способность связывать гентамицин и продемонстрировал более медленный прорыв. При 50 г/л, величина С/С₀ составляет 0,3 и кривая прорыва является в какой-то степени линейной примерно до 125 г/л_м и величиной С/С₀ около 0,8. После 125 г/л _м кривая прорыва выравнивается, предполагая, что мембрана может все еще связывать гентамицин, одновременно с чем, возможно, вытесняя небольшие уровни mAb.

Эти результаты показывают, что различные мембраны СЕХ имеют разные способности связывать гентамицин и кривые прорыва. Natrix S, с ее более высокой связывающей способности и постепенным прорывом, делает ее более эффективной мембраной для удаления гентамицина. Кроме того, от связывания более высоких уровней гентамицина можно было бы ожидать, что смещается большее количество mAb, что приводит к более высокому выходу.

СЕХ смолы и влияния сильно связывающих аминогликозидных антибиотиков

Чтобы определить, что вызывает более сильное связывание примесей, таких как гентамицин, на упакованную колонку смолы СЕХ, разрабатывают серию экспериментов, чтобы проверить и модельные потоки исходных материалов и фактические потоки исходных материалов с или без мембраны СЕХ, защищающей колонку. Фигура 11 иллюстрирует различные эксперименты, концентрации антител и примесей, а также этапы, необходимые для выполнения этих экспериментов.

Во-первых, с помощью модельного потока исходных материалов PBS, помеченного с помощью емкости UF/DF mAb 3 и изменения уровней гентамицина, смолы Fractogel SE Hicap испытывают на способности связывать антитела путем создания кривых прорыва. PBS сначала доводят 1,0 М уксусной кислотой до рН 5,0, затем помощью очищенной воды доводят до проводимости 8,0 мСм/см. Емкость UF/DF метят в доведенный буфер до концентрации mAb примерно 1,6 мг/мл.

Для каждого выполненного хроматографического эксперимента, Fractogel SE Hicap сначала уравновешивают 25 мМ ацетата натрия при рН 5 перед нагрузкой желаемым потоком исходных материалов. После загрузки колонку промывают 50 мМ ацетата натрия при рН 5,5, промывают 25 мМ HEPES при рН 7,7, промывают 50 мМ ацетата натрия при рН 5,5, элюируют с использованием 350 мМ ацетата натрия при рН 5,5, восстанавливают с использованием 1 М NaCl и 0,5 н NaOH, а затем хранят в 0,1 н NaOH до следующего использования колонки.

Первый эксперимент проводят без помеченного гентамицина и демонстрируют DBC антитела 108 г/л. Далее, указанное изменение и добавление метки выполняют с помощью добавления гентамицина до конечной концентрации 24100 мг/мл. Этот эксперимент показал уменьшенную DBC антитела 89 г/л. Это условие повторяют с концентрацией гентамицина 30500, и рассчитывают DBC антитела 88 г/л. Эти данные показывают, что с использованием модельной системы PBS, очищенного антитела, а также различных уровней гентамицина, присутствие антител уменьшает DBC гентамицина на смоле Fractogel SE Hicap с 108 мг/мл до примерно 88 г/л.

Далее, выполняют два эксперимента с использованием собранной клеточной культуральной жидкости (HCCF), содержащий приблизительно 0,9 мг/мл mAb 3, от 24100 до 30000 нг/мл гентамицина и 408000 нг/мл CHOP. Использование HCCF на уровнях гентамицина согласуется с модельным потоком исходных материалов, DBC антител 68 и 71 г/л. Возможным объяснением разницы между модельным DBC потока исходных материалов 88 и 89 г/л и DBC 68 и 71 г/л, с использованием HCCF, является наличие высоких уровней CHOP в потоке исходных материалов.

Фигура 12 иллюстрирует кривые прорыва всех антител из указанных выше экспериментов, а также уровни загрязнения в потоке исходных материалов, и округленное DBC. Опыты также осуществляют в случайном порядке, чтобы избежать возможное ухудшение колонки или остатка гентамицина от опыта к опыту. Порядок экспериментов приведен в Таблице с прилагаемой Фигурой 12. Между порядком экспериментов и DBC антитела нет никакой корреляции, поэтому маловероятно, что колонка деградирует или что остаток гентамицина влияет на последующие опыты.

Наконец, зная, что наличие гентамицин в потоке исходных материалов демонстрирует значительное снижение в колонке DBCS и что мембраны СЕХ способны связывать гентамицин без привязки значительных уровней антител, для проверки, может ли мембрана СЕХ защитить и повысить производительность на смоле СЕХ, проводят два эксперимента. Поскольку Natrix S демонстрирует улучшенную способность связывания гентамицина на Mustang™ S, ее используют для защиты Fractogel SE Hicap. Размораживают 2 л HCCF, рН доводят до 5 с 2 М уксусной кислоты, доводят до 8 мСм/см с очищенной водой и стерильно фильтруют вне линии, чтобы удалить любые эффекты промерзания и оттаивания потока исходных материалов. Из этого доведенного и фильтрованного потока исходных материалов, нагрузку разделяют с тем, что одну часть загружают в колонку, в то время как другую часть пропускают сквозь 0,75 мл Natrix S, а затем нагружают в Fractogel SE Hicap. Для обоих этапов нагрузки колонки, отбирают 15 мл фракции, по около 60 образцов каждой. Доведенный HCCF, элюат Natrix и фракции Fractogel SE Hicap проанализируют на концентрации антител и гентамицина. Полученный HCCF, антитело потока исходных материалов элюата Natrix и концентрации загрязнения, а также полученные кривые прорыва Fractogel SE Hicap проиллюстрированы на Фигуре 13. Полученные данные демонстрируют, что Natrix продуктивно сокращает уровни гентамицина в доводенном HCCF от 24100 нг/мл до 870 нг/мл. Уровни CHOP несколько снижаются с 408000 нг/мл до 328000 нг/мл. Концентрация антител несколько ниже 0,83 мг/мл по сравнению с доведенной концентрацией HCCF 0,88 мг/мл, представляющей выход около 94%. Наконец, полученные кривые прорыва колонки СЕХ имеют DBC антитела 72 г/л, с использованием доведенной HCCF и DBC антитела 94 г/л с помощью элюата Natrix. Это представляет собой увеличение DBC приблизительно на 30% с помощью пропускания перед загрузкой на колонку СЕХ гентамицина, содержащего поток исходных материалов, через мембрану СЕХ.

Прорыв мембраны СЕХ, ЕСР и PEI

Чтобы проверить, может ли наблюдаться аналогичная производительность при использовании мембраны СЕХ с другими примесями, такими как ЕСР или PEI, проводят эксперимент с использованием емкости моновалентного антитела 1 с протеином А и 0,23 мл мембраной Natrix S. Емкость с протеином А предварительно доводят до рН 6,7 с помощью 1,5 М трис-основания, и разбавляют до проводимости 2,5 мСм/см с помощью очищенной воды. Нагрузка, которая характеризуется концентрацией антитела 4,7 г/л, 130 мкг/мл PEI и 8870 нг/мл ЕСР, загружают в уравновешенную Natrix S и отбирают 10 образцов фракций элюата по 2 мл и, после этого, 12 образцов фракции по 5 мл. Фракции элюата затем анализируют на концентрациию антител, PEI и ЕСР, которые затем используют для генерирования С/С₀ в зависимости от плотности нагрузки антител мембран. Фигура 14 иллюстрирует то, что прорыв и антитела и ЕСР сквозь мембрану СЕХ при приблизительно 123 мг/мл. Так как количественный уровень PEI составляет 30 мкг/мл, первые несколько образцов находятся на этом уровне или ниже этого уровня, а Фигура 14 иллюстрирует значение С/С₀ 0,23, так как неизвестно, какая существует концентрация PEI в тех образцах. Игнорируя уровни PEI 0,23, PEI демонстрирует прорыв при 330 мг/мл значительно позже, чем в случае антитела и ЕСР. Эти результаты показывают, что мембраны СЕХ также являются эффективными в удалении ионных полимеров без отрицательного влияния на выход антител.

Смолы СЕХ и влияния сильно связывающих ионных полимеров

Чтобы определить, какой эффект сильно связывающаяся примесь, такая как PEI, может иметь на наполненную колонку смолы СЕХ, выполняют серию экспериментов по оценку уровней PEI, используемых во время экстракция полипептида 1 и их влияние на колонку с SP Sepharose Fast Flow. Поскольку поток исходных материалов в случае данного продукта больше загрязнен, не удалось оценить количественно уровни PEI, которые идут на колонку, отмечают вместо уровней PEI, используемых при экстракции.

В этих экспериментах, извлеченный продукт обуславливают различные уровни PEI в пределах от 0,75 до 1,05%, разбавленный очищенной водой и центрифугированный для получения 4 образцов фильтрата. Каждый образец центрата, примерно при рН 7,0 и 8,0 мСм/см затем наносят на колонку SP Sepharose Fast Flow с образцами элюата, собирают и анализируют на концентрацию полипептида. Полученные данные используют для получения диаграммы С/С₀ как функции плотности нагрузки полипептида в смолу. На Фигуре 15 проиллюстрированы кривые прорыва и соответствующий DBC колонки для каждого испытания центрата. Как показано в таблице, одновременно с тем как растет % PEI в течение процесса экстракции, уменьшается DBC колонки.

Кроме того, на второй серии экспериментов с использованием полипептида 1, в колонку SP Sepharose Fast Flow загружают фильтраты с различными % PEI, с тем, что колонку последовательно промывают и элюируют для каждого эксперимента. Полученные емкости каждого эксперимента затем анализируют на концентрацию полипептида, ЕСР и размер продукта с помощью эксклюзионной хроматографии. Фигура 16 иллюстрирует что емкости генерируют с использованием повышения уровня % PEI в то время как экстракция приводит к уменьшении выхода этапа и емкость увеличивает уровни загрязнения, такого как ЕСР, агрегатов продуктов или димеров.

Хотя эксперименты с использованием мембраны СЕХ до этой колонке СЕХ не проводили, зная, что PEI может быть связано с Natrix S из предыдущих экспериментов и, наблюдая сниженную производительность колонки СЕХ как функцию % PEI, можно выдвинуть гипотезу, что использование мембраны СЕХ в этом потоке исходных материалов позволяет улучшить не только способность к связыванию колонки, но и полученную емкость.

Заключение

Ионообменные мембраны показали свою эффективность при удалении примесей при таком состоянии рН и проводимости, которое вызывает связывание белка. Действуя посредством хроматографии с перегрузкой и содействуя конкурентной адсорбции между примесями и представляющим интерес белком, показанные выходы составляют ≥96% после достижения плотностей нагрузки 1000-5000 г/л _м. Показано, что катионообменные мембраны в проточных фракциях на мембране связывают и значительно сокращают такие примеси, как CHOP и гентамицин, со значениями С/С₀<0,2 при плотности нагрузки 16000 г/л_м. Также показано, что катионообменные мембраны обладают селективностью по отношению к связывания некоторых примесей в отличие от антител с использованием менее очищенных потоков исходных материалов, содержащих высокомолекулярные частицы, димер, низкомолекулярные частицы, гентамицин и CHOP. В этих исследованиях было показано, что данные примеси связываются с различной силой, повышение плотности нагрузки мембраны демонстрирует продолжающееся связывание примесей, в то время как связь антитела с мембраной уменьшается, и низкомолекулярные высокозаряженные частицы, такие как гентамицин, связываются гораздо сильнее, чем конкурирующие виды. Кроме того, конкурентная адсорбция и вытеснительная хроматография подтверждают то, что наблюдается при элюировании антитела из катионообменной мембраны с использованием буфера, содержащего гентамицин. Было показано, что две катионообменные мембраны, Mustang™ S и Natrix S, имеют возможности для динамического связывания 4,4-8,9 г/л _м и 50 г/л_м гентамицина, соответственно. Также было показано, что кривая прорыва в случае Natrix S более пологая, чем в случае Mustang™ S. Natrix S создана для более высоких способностей к связывания, чем традиционные мембран, и это свойство, вместе с постепенным прорывом, делает ее хорошо подходящей для очистки от примесей.

Было показано, что катионообменные смолы обладают различными способностями к динамическому связыванию в присутствии гентамицина, с уменьшением DBC в качестве концентрации гентамицина при увеличении потока исходных материалов. DBC колонки Fractogel SE Hicap снижается от 108 до 88 г/л при использовании модельного потока исходных материалов, содержащего от 0 до 30 500 нг/мг гентамицина. С использованием репрезентативного потока исходных материалов, Fractogel SE Hicap показал DBC 68-71 г/л. Применимость катионообменной мембраны проверяют, когда она в состоянии снизить концентрации гентамицина в данном потоке сырья от 24100 нг/мг до 870 нг/мг гентамицина с выходом 94%. Поток исходных материалов со сниженной концентрацией гентамицина позволяет Fractogel SE Hicap иметь DBC 94 г/л по сравнению с 72 г/л, при прямом сравнении. Так же, как гентамицин, катионообменные мембраны были показаны для связывания высоко заряженных ионных полимеров, таких как PEI, в присутствии моновалентного антитела и ЕСР. Наконец, было показано, что катионообменные смолы негативно влияют на изменение концентраций PEI в потоке исходных материалов, что приводит к снижению способности динамического связывания и увеличенным примесям в емкости при увеличенных концентрациях PEI. Было показано, что колонка SP Sepharose Fast Flow уменьшается от 51 г/л до 36 г/л, тогда как PEI выше по потоку возрастает от 0,75% до 1,05%. В отдельном исследовании, выход этапа снижается с 96% до 70%, ЕСР увеличивается с 155 нг/мг до 904 нг/мг, содержание агрегатов увеличивается с 2,5% до 17,3%, содержание димера увеличивается с 3,7% до 5,9%, а концентрация PEI выше по потоку увеличивается с 0,6% до 1,1%. Использование катионообменной мембраны перед колонкой SP Sepharose Fast Flow не было проверено, нопоскольку известно, что колонка подвержена отрицательному влиянию PEI и мембрана является эффективной в связывании PEI, правильно подобранная мембрана должна уменьшить % PEI, что ведет к тому, что колонка служит причиной более высоких способностей к связывания и выхода, а также снижения концентраций примесей в емкости.

Постоянно появляются более совершенные технологии очистки. По мере разработки ионообменных смол с более высокой связывающей способностью, их использование в качестве аффинной смолы с протеином А является, по-видимому, подходящим, ввиду снижения эксплуатационных расходов. Тем не менее при воздействии на поток исходных материалов с повышенными уровнями загрязнения или примесей, таких как гентамицин или PEI, обычно не наблюдающихся в использовании ниже по потоку, их истинная эффективность может быть снижена. Использование ионообменной мембраны перед такой ионообменной смолой может защитить колонку за счет уменьшения примесей, которые нагружают на колонку. Это может привести к ряду улучшений в случае колонки, например, более высоким способностям динамического связывания, увеличенным выходам этапа или сниженным концентрациям загрязнения в емкости. С помощью выбора соответствующей мембраны с достаточными способностью к связыванию загрязнения, объемом и проницаемостью, два этапа могут функционировать непрерывно, дополнительно сокращается время работы и, в конечном счете, затраты на способ очистки.

Вышеизложенную спецификацию считают достаточной для того, чтобы позволить специалисту в данной области осуществить настоящее изобретение. Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме зарегистрированной концепции, так как зарегистрированный вариант реализации настоящего изобретения предполагается в качестве отдельной иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения, и любые концепции, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Депонирование материала в данном документе не является признанием того, что приведенное в данном документе описание является недостаточным для того, чтобы содержаться в практике любого аспекта изобретения, в том числе, в его оптимальный режим, и это не должны быть истолковано как ограничивающее объем формулы изобретения до конкретных иллюстраций, которые он представляет. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным здесь будут очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания, и попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к способу усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающему: а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер сквозь ионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, которые состоят из буфера, имеющего рН, достаточно отличающийся от pI антитела с целью повышения заряда антитела, и низкой ионной силы, эффективной для предотвращения экранирования зарядов буферных ионов, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один загрязняющий ионный полимер; b) перегрузку ионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один указанный загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате; c) улавливание элюата из ионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело; d) этап ионообменной хроматографии, которая имеет аналогичный предыдущей мембране заряд, которому подвергают элюат мембраны, содержащий представляющее интерес антитело, и e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа ионообменной хроматографии. Способ позволяет улучшить очистку белков и удалять примеси ионного полимера, например, такого как полиэтиленимин. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающий:

а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер сквозь ионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, которые состоят из буфера, имеющего рН, достаточно отличающийся от pI антитела с целью повышения заряда антитела, и низкой ионной силы, эффективной для предотвращения экранирования зарядов буферных ионов, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один загрязняющий ионный полимер;

b) перегрузку ионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один указанный загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате;

c) улавливание элюата из ионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело;

d) этап ионообменной хроматографии, которая имеет аналогичный предыдущей мембране заряд, которому подвергают элюат мембраны, содержащий представляющее интерес антитело, и

e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа ионообменной хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионообменная мембрана имеет размер пор от 0,1 до 100 нм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионообменную мембрану заменяют на монолит или объемный фильтр.

4. Способ усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающий:

а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер, сквозь катионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера, имеющего рН на от около 1 до около 5 единиц ниже pI антитела, и проводимости < около 40 мСм/см, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один указанный загрязняющий ионный полимер;

b) перегрузку катионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате;

c) улавливание элюата катионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело;

d) этап очистки с помощью катионообменной хроматографии, которому подвергают элюат мембраны, содержащий интересующее антитело, и

e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа катионообменной хроматографии.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 4 единиц рН ниже pI антитела.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что pH на от около 1 до около 3 единиц рН ниже pI антитела.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что pH на от около 1 до около 2 единиц рН ниже pI антитела.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что pH на около 1 единицу рН ниже pI антитела.

9. Способ по п.4, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 20 мСм/см.

10. Способ по п.4, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 10 мСм/см.

11. Способ по п.4, отличающийся тем, что катионобменная мембрана представляет собой катионобменный монолит или объемный фильтр.

12. Способ усиления эффективности этапов хроматографии для очистки антител ниже по потоку, включающий:

а) пропускание композиции, содержащей представляющее интерес антитело и загрязняющий ионный полимер, сквозь анионообменную мембрану, отличающееся тем, что антитело и мембрана имеют противоположный заряд, при рабочих условиях, состоящих из буфера, имеющего рН на от около 1 до около 5 единиц выше pI антитела, и проводимости < около 40 мСм/см, которые приводят к тому, что мембрана связывает антитело и по крайней мере один указанный загрязняющий ионный полимер;

b) перегрузку анионообменной мембраны до плотности нагрузки 1000-5000 г/л таким образом, что по меньшей мере один загрязняющий ионный полимер остается связанным с мембраной, тогда как представляющее интерес антитело находится, главным образом, в элюате;

c) улавливание элюата анионообменной мембраны, который содержит представляющее интерес антитело;

d) этап очистки с помощью анионообменной хроматографии, которому подвергают элюат мембраны, содержащий интересующее антитело, и

e) извлечение очищенного антитела из элюата этапа анионообменной хроматографии.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 4 единиц рН выше pI антитела.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 3 единиц рН выше pI антитела.

15. Способ по п.12, отличающийся тем, что рН на от около 1 до около 2 единиц рН выше pI антитела.

16. Способ по п.12, отличающийся тем, что pH на около 1 единицу рН выше pI антитела.

17. Способ по п.12, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 20 мСм/см.

18. Способ по п.12, отличающийся тем, что проводимость составляет < около 10 мСм/см.

19. Способ по п.12, отличающийся тем, что анионообменную мембрану заменяют анионообменным монолитом или объемным фильтром.

20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что мембрана представляет собой адсорбер смешанного типа.

21. Способ по пп.1-20, отличающийся тем, что ионный полимер представляет собой полиэтиленимин (PEI).

22. Способ по пп.1-21, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

23. Способ по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что дополнительный этап(ы) очистки содержит ионообменную хроматографию.

24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что дополнительный этап(ы) очистки непрерывно осуществляют во время этапов от a до e, а указанным этапом очистки является ионообменная хроматография.

25. Способ по любому из пп.23 или 24, отличающийся тем, что ионообменная хроматография содержит катионообменную колонку.

26. Способ по любому из пп.23 или 24, отличающийся тем, что ионообменная хроматография содержит анионообменную колонку.

27. Способ по любому из пп.1-26, который дополнительно включает получение фармацевтической композиции путем объединения очищенного антитела с фармацевтически приемлемым носителем.