Штамм Rhodococcus qingshengii VER34 биодеструктор органических загрязняющих соединений, содержащих в своей структуре лактонное кольцо Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и представляет собой бактериальный штамм, способный выделять гидролитические ферменты класса лактоназ, разлагающие органические соединения, в структуру которых входит лактонное кольцо. К таковым относятся антибиотики группы макролидов, N-ацилгомосеринлактоны, бутиролактон и другие. Ежегодно данные вещества, обладающие высокой биологической активностью, в значительных количествах попадают в окружающую среду, приводя к устойчивым нарушениям в равновесии естественных экосистем. В первую очередь опасность представляет попадание в среду антибактериальных препаратов и некоторых продуктов их деградации. Это приводит к массированному появлению антибиотикоустойчивых потенциально патогенных бактериальных штаммов [4].

Основными источниками попадания опасных веществ в природную среду являются сточные воды объектов животноводства и поселений. Исследования последних десятилетий показали, что существующие методы очистки сточных вод ультрафиолетовыми лучами и хлорированием не снижает активность этих соединений, а потенциально вызывает их модификацию с образованием более активных продуктов - хлорпроизводных [1-3].

Среди микроорганизмов, участвующих в процессах самоочищения природных экосистем, важная экологическая роль в биологической детоксикации и деконтаминации почв и воды принадлежит актинобактериям рода Rhodococcus - устойчивым обитателям загрязненных почв, водоемов, активных илов, сточных вод, обладающим высокой активностью оксидоредуктаз, богатыми адаптивными возможностями в отношении различных токсических соединений, а также высоким потенциалом для биоремедиации загрязненных объектов [6]. Актуальность использования метаболического потенциала родококков для биодеградации подтверждается многочисленными научными исследованиями [5,7].

Известен способ очистки сточных вод от стойких и токсичных галогеносодержащих ароматических соединений, в частности хлор и бромбензолов, 1,3- и 1,4-дихлорбензолов, 2-,3- и 4-хлорфенолов, 2,4-дихлорфенола, 4-бром и 4-фторфенолов с использованием штамма Rhodococcus sp. ВКПМs-1192 [8]. Недостатком описанного способа является высокая оптимальная температура эксплуатации бактериального штамма (28-30°C), существенно ограничивающая географию его применения.

Известен способ деградации фармполлютанта диклофенака натрия штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 346, когда в результате биоконверсии фармполлютанта данным штаммом происходит разрыв C-N связи и раскрытие хинонового цикла [9]. Недостатком описанного способа является жесткие требования к условиям культивирования и составу среды.

Известен способ биодеструкции несимметричного диметилгидразина экобиопрепаратом «Центрум-MMS», представляющим собой ассоциацию микроорганизмов Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1769 [10]. Изобретение позволяет снизить количество несимметричного диметилгидразина в водных растворах более чем в 50 раз. Однако препарат имеет узкоспециализированное назначение, нет данных о его эффективности в отношении фармполлютантов, следовательно, прямым аналогом он не является

Задачей изобретения является выделение штамма, обладающего способностью деградировать широкий класс органических соединений, в том числе опасных фармполлютантов, имеющих в своей структуре лактонное кольцо.

Штамм Rhodococcus qingshengii VER34 был выделен из ризосферы растения Dactylorhiza incarnata (L.) Soo (Orchidaceae Juss.) в Ярославской области.

Штамм идентифицирован до вида и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика (ВКПМ), регистрационный номер АС-2178.

Культурально-морфологические свойства штамма Rhodococcus qingshengii VER34.

Грамположительные неподвижные клетки. От кокков до коротких овальных палочек, размер клеток 0,6х1-1,5 мкм. Спор не образуют. Штамм не требователен к факторам роста, хорошо растет на стандартных питательных средах: агаризованном бульоне LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl), хуже на мясопептоном агаре (МПА), минимальной среде с глюкозой М9 (Na₂HPO₄ - 6, KH₂PO₄ - 3, NH₄Cl - 1, NaCl - 0.5, 1М MgSO₄ - 2, 1M CaCl₂ - 1, глюкоза - 2). Морфология колоний на питательных средах (на 3 сутки роста при 28°C): на среде LB колонии круглые с фестончатыми краями, зернистые, слабовыпуклые, непрозрачные, бежевые, диаметр 2,5-3,5 мм, пигмент не выражен. Максимальная температура роста на питательных средах равна 37°C, минимальная температура 4°C, температурный оптимум роста 24-30°C. Хорошо растет при pH 7,0-8,0.

Штамм хранят на чашках с агаризованной средой LB при 4-8°C. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не менее 1 года под вазелиновым маслом в полужидкой агаризованной LB среде следующего состава (г/л): (бактотриптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, хлористый натрий - 10, агар - 7,5, pH 7,2).

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Определение лактоназной активности штамма Rhodococcus qingshengii VER34.

Метод определения лактоназной активности с использованием биосенсора Chromobacterium violaceum CV 26. Исследуемую культуру выращивали на среде LB с добавлением 50 мкМ C 6-АГЛ в течение ночи. Полученные суспензии центрифугировали (13 тыс. об/мин, 1 мин), отбирали 100 мкл супернатанта и смешивали его с равным объемом ночной культуры тестерного штамма C. violaceum CV 026 в лунках иммунологического планшета. Смесь инкубировали при 30°С в течении 48 часов. C. violaceum CV 026 продуцирует фиолетовый пигмент виолацеин в ответ на присутствие в среде АГЛ. Отсутствие окрашивания биосенсора C. violaceum CV 026 в фиолетовый цвет свидетельствовало о деградации АГЛ исследуемым штаммом. Спустя 24 часа инкубации в контрольном образце развивалась фиолетовая окраска, опосредованная пигментом виолациеном, что свидетельствовало о наличии в среде лактонов. В исследуемом образце окраска не развивалась, что указывает на наличие лактоназных свойств у исследуемого штамма.

Пример 2. Количественная оценка лактоназных свойств штамма Rhodococcus qingshengii VER34.

Для количественной оценки лактоназной активности штамма Rhodococcus qingshengii VER34 использовался спектрофотометрический метод определения лактонов с некоторыми модификациями. Исследуемые культуры выращивались на среде LB с добавлением 50 мкМ C6-АГЛ в течение ночи в шейкере-инкубаторе при температуре 28°С и при постоянном перемешивании (150 об/мин). Полученную суспензию центрифугировали (13 тыс. об/мин, 1 мин), 60 мкл супернатанта вносили в лунки иммунологического планшета. В качестве положительного контроля использовали среда LB c добавлением 50 мкМ С6-АГЛ, а отрицательного - LB без АГЛ. К супернатанту добавляли 72 мкл смеси, состоящей из 3,5М гидроксида натрия и 2М гидроксиламина, смешанных в равных объемах. Далее к ним вносили смесь из равных объемов 10% FeCl₃ в 4М HCl и 96% этанола. Определение оптической плотности образцов проводили при помощи планшетного фотометра iMark (BioRad) при длине волны 490 нм.

Установлено, что концентрация лактонов в культуральной среде снизилась на 63% по сравнению с контрольным образцом, что свидетельствует об эффективности использования штамма Rhodococcus qingshengii VER34 для биодеструкции лактонов.

Источники:

1. Agunbiade F. O., Moodley B. Occurrence and distribution pattern of acidic pharmaceuticals in surface water, wastewater, and sediment of the Msunduzi River, Kwazulu‐Natal, South Africa //Environmental Toxicology and Chemistry. - 2016. - Т. 35. - №. 1. - С. 36-46.

2. aus der Beek T. et al. Pharmaceuticals in the environment-Global occurrences and perspectives //Environmental toxicology and chemistry. - 2016. - Т. 35. - №. 4. - С. 823-835.

3. Baquero F., Martínez J. L., Cantón R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments //Current opinion in biotechnology. - 2008. - Т. 19. - №. 3. - С. 260-265.

4. Flaherty C. M., Dodson S. I. Effects of pharmaceuticals on Daphnia survival, growth, and reproduction //Chemosphere. - 2005. - Т. 61. - №. 2. - С. 200-207.

5. Habib S, Ahmad SA, Wan Johari WL, Abd Shukor MY, Alias SA, Smykla J, Saruni NH, Abdul Razak NS, Yasid NA. Production of Lipopeptide Biosurfactant by a Hydrocarbon-Degrading Antarctic Rhodococcus. Int J Mol Sci. 2020 Aug 26;21(17):6138. doi: 10.3390/ijms21176138. PMID: 32858859; PMCID: PMC7504157.

6. Kim CH, Lee DW, Heo YM, Lee H, Yoo Y, Kim GH, Kim JJ. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environ Res. 2019 Aug;91(8):739-747. doi: 10.1002/wer.1103. Epub 2019 Apr 18. PMID: 30874337.

7. Zhao HM, Hu RW, Chen XX, Chen XB, Lü H, Li YW, Li H, Mo CH, Cai QY, Wong MH. Biodegradation pathway of di-(2-ethylhexyl) phthalate by a novel Rhodococcus pyridinivorans XB and its bioaugmentation for remediation of DEHP contaminated soil. Sci Total Environ. 2018 Nov 1; 640-641:1121-1131. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.05.334. Epub 2018 Jun 7. PMID: 30021277.

8. Патент RU 2 041 943 C1, МПК C12N 1/20; C02F 3/34; C02F 101/36; C12N 1/12. Strain of bacteria Rhodococcus sp. being destructor of phenol, benzene and their halogen-substituted analogs. / Заявка 92014789/13; Заявл.: 1992.12.28; Опубл.: 1995.08.20.

9. Патент № 2 707 536 C1 Российская Федерация, МПК C12N 1/20; C02F 3/34; C12R 1/01. Strain of Rhodococcus ruber iegm 346 - diclofenac sodium biodestructor. / Заявка 2018132086; Заявл.: 2018.09.06; Опубл.: 2019.11.27.

10. Патент № 2 650 864 C1 Российская Федерация, МПК C12N 1/20; C02F 3/34; B09C 1/10. BIOLOGICAL destructor of non-symmetric dimethylhydrazine. / Заявка 2017133569; Заявл.: 2018.04.17; Опубл.: 2017.09.26.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Rhodococcus qingshengii VER34. Штамм Rhodococcus qingshengii VER34 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика, коллекционный номер ВКПМ Ас-2178. Штамм может быть использован для эффективного разрушения соединений, имеющих в своей структуре лактонное кольцо. 2 пр.

Штамм Rhodococcus qingshengii VER34, депонированный во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2178, для биодеструкции соединений, содержащих в структуре лактонное кольцо, за счет способности продуцировать гидролитические ферменты класса лактоназ.