Способ нейропротекции головного мозга при моделировании фотоиндуцированного ишемического инсульта Российский патент 2024 года по МПК A61M16/12 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано при определении клинической эффективности и безопасности применения инертного газа криптона в качестве нейропротектора при фокальной ишемии головного мозга (ГМ).

Уровень техники.

К настоящему времени известно несколько примеров использования газовых смесей, содержащих криптон в режиме ингаляционного воздействия на организм с различными целями.

В частности известно использование криптона в терапии соматоформных психических расстройств, включающее вдыхание ингаляционной смеси криптона и кислорода в соотношении от 50/50 до 80/20 об. % через открытый или закрытый дыхательный контур с помощью ингаляционного устройства, контролируемого газоанализатором (RU 2769783). Однако данный способ воздействия не позволяет сделать выводы о степени влияния ингаляционного воздействия криптона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом.

Известен также способ лечения боли при реабилитации онкологических больных после выполнения хирургических вмешательств на позвоночнике, включающий вдыхание смеси криптона и кислорода в соотношении 70/30 об. %. В течение 5-7 мин за один сеанс (RU 2713455). Техническим результатом известного способа является снижение болевого синдрома с минимальными побочными эффектами за счет снижения дозы опиоидных анальгетиков. Данный способ воздействия, также как предыдущий, не позволяет сделать выводы о степени влияния ингаляционного воздействия криптона на состояние ГМ, пораженного ишемическим инсультом.

Известно также применение газообразной композиции, содержащей криптон, в качестве вдыхаемого лекарственного средства для предотвращения или лечения нейроинтоксикации у людей, в которой газообразный криптон является активным началом, а объемная доля криптона составляет от 15 до 80% (WO 2012025677). Как указано в описании известного способа, технический результат его использования заключается в лечении нейроинтоксации, являющейся результатом или последствием черепно-мозговой травмы, нарушения мозгового кровообращения ЦНС, церебральной ишемии, приема вещества, вызывающего зависимость, болезни Альцгеймера, а также болезни Паркинсона, хореи Гентингтона, бокового амиотрофического склероза, острого диссеминированного энцефаломиелита, поздней дискинезии, оливопонтоцеребеллярной атрофии, шизофрении или эпилепсии. Причем газообразный криптон предлагается использовать в очень широком диапазоне дозировок от 15 до 80%. В этой связи описанный способ воздействия, не позволяет сделать выводы о точной концентрации и продолжительности ингаляционного воздействия криптона с целью нивелирования повреждения ГМ при ишемическом инсульте.

Способов нейропротекции головного мозга при моделировании фотоиндуцированного ишемического инсульта в доступной авторам информационной базе данных обнаружить не удалось.

Раскрытие сущности изобретения.

В настоящее время отмечается повышение внимания клинической медицины к результатам воздействия инертных газов на организм человека благодаря неспособности инертных газов вступать в химические соединения с другими элементами периодической таблицы Д.И. Менделеева, а также их способности оказывать биологические воздействия на живой организм, поступая и покидая организм в неизменном виде. Криптон - один из представителей инертных газов, не обладающий ни запахом, ни цветом, ни радиоактивными свойствами, плотнее воздуха в несколько раз. Его биологические свойства пока слабо изучены.

Целью настоящего исследования являлась оценка влияния 2-часовой ингаляции криптон-кислородной смесью (Kr 70%/О₂ 30%) после моделирования фотоиндуцированного ишемического инсульта (ФИИ) на выраженность неврологического дефицита и степень повреждения ГМ у крыс по сравнению с контрольной группой, в которой была проведена 2-часовая ингаляция газовой смесью азот/кислород (N₂ 70%/О₂ 30%)

На модели ФИИ, в основе которой лежит фокальное повреждение эндотелиальной выстилки сосудов коры ГМ крысы, была обнаружена более быстрая адаптация и организация данной области под воздействием 2-часовой ингаляции криптон-кислородной смесью, о чем свидетельствуют как результаты гистологического и иммуногистохимического исследований, так и клинические данные - Тест ПКО.

Данные неврологического осмотра по результатам теста ПКО.

На третьи сутки наблюдения после моделирования ФИИ значимой разницы суммы баллов теста ПКО в группах Криптон и Азот не выявлено (р=0,4020). На 7-е сутки наблюдения отмечается значимая разница в группе Криптона (р=0,0245), что может свидетельствовать о более быстрой реабилитации животных группы Криптон.

Данные морфологических исследований, таких как МРТ ГМ, гистологическое и иммуногистохимическое исследование ГМ, не оставляют сомнений в том, что в группе Криптон наблюдается значимое ускорение процессов репарации и организации очага ишемии и зоны пенумбры. В частности, по результатам данных МРТ исследования площадь очага повреждения ГМ была значимо меньше в группе Криптон в сравнении с группой Азот и в среднем составила 17,56 [14,18; 20,38] мм² и 22,19 [17,98; 24,42] мм² соответственно (р=0,0435).

Об активации процессов регенерации в группе Криптон свидетельствует более быстрый, по сравнению с группой Азот, регенеративный процесс, формирование рубца (разрастание соединительной ткани), сосудообразование в зоне некроза. В группе Азот отмечается тенденция к отграничению очага ишемии с формированием клеточного вала на периферии и некротического очага в центре, что говорит о начале формирования кистозно-глиозного образования на месте инфаркта мозга. Установлено, что реабилитационный потенциал на порядок выше в группе Криптон.

В гистологических препаратах ГМ животных группы Криптон, отмечалось полнокровие мягких оболочек мозга. Утолщения оболочек мозга не обнаружено. Отмечалось полнокровие новообразованных сосудов в зоне повреждения. Участок повреждения был представлен некротическим детритом с диффузным разрастанием соединительной ткани в виде ячеистой структуры, в которой располагались микроглиоциты. Новообразованные сосуды обнаружены как по периферии, так и в центре зоны повреждения. По периферии участка повреждения ткань ГМ разрежена вследствие отека, в части препаратов отмечались кистоподобные образования без эпителиальной выстилки. В зоне пенумбры были выявлены нейроны с признаками повреждения (темные нейроны, смещение ядра, смещение ядрышка, гиперхромные ядра, гипохромные ядра, набухшие ядра).

В группе Азот мягкие оболочки присутствовали на большинстве препаратов. Мягкие оболочки частично отслоены, утолщены на всех препаратах. Сосуды полнокровны, встречались гиалинизированные. Участок повреждения в коре, центральная часть которого, в группе Азот представлена гомогенно окрашенным участком некротического детрита, окруженным валом из глиальных клеток, макрофагов с зернистой цитоплазмой, пенистых клеток на разных стадиях апоптоза. Наблюдались полнокровные капилляры в зоне клеточного вала. На всех препаратах из группы Азот на периферии участка повреждения были выявлены пенистые клетки, глиальные клетки и новообразованные сосуды. В зоне пенумбры были отмечены нейроны с признаками повреждения (темные нейроны, смещение ядра, смещение ядрышка, гиперхромные ядра, гипохромные ядра, набухшие ядра)

Наблюдаемое диффузное разрастание соединительной ткани, равномерное распределение микроглиоцитов в зоне повреждения, присутствие сосудов как в центре, так и по периферии участка повреждения, свидетельствует о более выраженной регенерации на препаратах группы Криптон, по сравнению с препаратами группы Азот, на которых не наблюдалось роста соединительной ткани, микроглиоциты образовывали вал по периферии участка некротического детрита, так же в этой зоне наблюдались пенистые клетки на разных стадиях альтерации.

В результате иммуногистохимического исследования установлено, что иммугистохимическая окраска NeuN, которая выявляет ядерный белок, свойственный только нейронам, в гистологических препаратах обеих групп выявила нейроны, на участке некроза коры ГМ. В центре зоны повреждения так же выявлены NeuN позитивные клетки. В зоне организации нейроны не обнаружены. Вне пределов повреждения ядра и цитоплазма нейронов, окрашены интенсивно.

Иммуногистохимическое выявление маркера микроглии в Iba в группе Азот выявило небольшое число клеток микроглии, локализующихся в зоне некроза. В зоне организации некроза так же обнаружены малочисленные клетки микроглии. В группе Криптон, выявлено большое количество диффузно распространенных iba- позитивных клеток, как в зоне некроза, так и в зоне организации некроза.

Иммуногистохимическое выявление GFAP, являющегося маркером астроцитов, показало, что GFAP - позитивные клетки располагаются с внешней стороны зоны организации некроза на границе с тканью ГМ в обеих группах.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что 2-часовая ингаляция криптон-кислородной смесью Kr 70%/О₂ 30% оказывает нейропротективный эффект при ФИИ, что выражается в положительной динамике неврологического статуса (тест ПКО «Постановка конечности на опору») на 7-е сутки наблюдения, уменьшении очага ишемии по данным МРТ-исследования, а также более выраженных процессах репарации и регенерации по данным гистологического и иммуногистохимических исследований.

Осуществление изобретения.

Эксперименты были проведены на крысах-самцах линии Wistar весом 250-300 г (n=20). Накануне эксперимента животные не получали корм 8 часов, но имели свободный доступ к воде. Протокол исследования был утвержденным Локальным этическим комитетом ФНКЦ РР 3/22/3 от 14 декабря 2022 г. Эксперименты проводили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях.

Животные были случайным образом разделены на 2 группы в зависимости от объема проводимых вмешательств:

- контрольная группа с ФИИ + ингаляция N₂ 70%/О₂ 30% (группа Азот), n=10;

- опытная группа с ФИИ + ингаляция Кг 70%/О₂ 30% (группа Криптон), n=10.

Моделирование ФИИ.

После внутрибрюшинного введения 6% хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг было выполнено моделирование ФИИ в соответствии с известной методикой [Silachev D.N., Uchevatkin A.A., Pirogov Y.A., Zorov D.B., Isaev N.K. Comparative evaluation of two methods for studies of experimental focal ischemia: magnetic resonance tomography and triphenyltetrazoleum detection of brain injuries. Bull Exp Biol Med. 2009; 147 (2): 269-72. doi: 10.1007/s10517-009-0489-z. PMID: 19513437]. ФИИ моделировали в сенсомоторной коре ГМ крыс с помощью фотохимически индуцированного тромбоза сосудов коры ГМ. Введение светочувствительного красителя rose Bengal (3%, 40 мг/кг внутривенно; Sigma-Aldrich, St. Луис, Миссури, США) осуществляли в яремную вену. После этого, голова крысы была зафиксирована в стереотаксической рамке (стереотаксические координаты Bregma: 0,5 мм дистально и 2,5 мм латерально), череп был обнажен через разрез по средней линии, очищен от надкостницы. Далее, полушарие мозга в области сенсомоторной коры облучали зеленым светом при λ=550 нм в течение 15 минут. После наложения швов на кожу, крыс помещали в клетку под инфракрасную нагревательную лампу до их выхода из наркоза. Температура тела во время всего эксперимента поддерживалась на уровне 37±0,5°С. Термометрию выполняли путем установки ректального датчика температуры тела, а терморегуляция осуществлялась в автоматическом режиме путем соединения модуля обогрева с термореле и установкой пограничных значений.

Воздействие криптоном.

После пробуждения животных помещали в прозрачную пластиковую камеру объемом 36 литров, в которую постоянно подавалась свежая газовая смесь (N₂ 70%/О₂ 30% - группа Азот; Kr 70%/О₂ 30% - группа Криптон) с потоком 0,5 л/мин на одно животное. Одномоментно в камере находились не более 5 животных одной группы, что позволяло избежать гипоксии и гиперкапнии.

Продолжительность экспозиции в камере составила 2 часа. Во время всего эксперимента осуществлялся непрерывный контроль уровня О₂ и СО₂ в камере с животными с использованием блока контроля атмосферы закрытых помещений (ЗАО «ИНСОВТ» СПБ, Россия). После окончания периода экспозиции проводили оценку общего состояния животного (уровень бодрствования, подвижность) и обезболивание (парацетамол 50 мг/кг п/к). Затем животных перемещали в клетку с предоставлением свободного доступа к воде и пище.

На 3-й день (Д3), через 7 дней (Д7) и 14 дней (Д14) после инсульта были проведены следующие оценочные исследования состояния опытных животных.

Оценку неврологического статуса животных проводили с помощью теста ПКО. Использовали протокол, основанный на методике, описанной Де Риком и соавт.(1989) [De Ryck М., Van Reempts J., Borgers M., Wauquier A., Janssen P.A. Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats. Stroke. 1989; 20 (10):1383-90. doi: 10.1161/01.str.20.10.1383. PMID: 2799870] и модифицированный Ю. Еолкконеном и соавт.(2000) [Jolkkonen J., Puurunen K., Rantakomi S., Harkonen A., Haapalinna A., Sivenius J. Behavioral effects of the alpha(2)-adrenoceptor antagonist, atipamezole, after focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol. 2000; 400 (2-3): 211-9. doi: 10.1016/s0014-2999(00)00409-x. PMID: 10988336]. Крыс приучали к рукам в течение недели до тестирования. Тест состоял из семи испытаний, оценивающих сенсомоторную интеграцию передних и задних конечностей в ответ на тактильную, проприоцептивную и зрительную стимуляцию. Каждый тест оценивали следующим образом: крыса выполняла испытание нормально - 2 балла; крыса выполняла испытание с промедлением >2 с и/или не полностью - 1 балл; крыса не выполнила испытание - 0 баллов.

На Фиг. 1 представлена динамика изменения результатов ПКО в обеих группах в виде суммы баллов за тест.

МРТ-исследование.

На 14-е сутки после инсульта было проведено МРТ-исследование животных на томографе с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м (BioSpec 70/30, Bruker, Германия). Анестезию выполняли изофлураном (1,5-2%), после чего крысу помещали в устройство позиционирования с системой стереотаксиса и терморегуляции [Silachev D.N., Uchevatkin А.А., Pirogov Y.A., Zorov D.B., Isaev N.K. Comparative evaluation of two methods for studies of experimental focal ischemia: magnetic resonance tomography and triphenyltetrazoleum detection of brain injuries. Bull Exp Biol Med. 2009; 147 (2): 269-72. doi: 10.1007/s10517-009-0489-z. PMID: 195134370 шибка! Источник ссылки не найден.].

Использовали стандартный протокол исследования мозга крысы, который включает в себя получение Т2-взвешенных изображений. Для передачи радиочастотного (РЧ) сигнала использовали линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции РЧ-сигнала - поверхностную приемную катушку для мозга крысы. Использовали следующие импульсные последовательности (ИП): RARE - ИП на основе спинового эха с параметрами: TR = 6000 мс, ТЕ = 63,9 мс, толщина среза 0,8 мм с шагом 0,8 мм, размер матрицы 256 × 384, разрешение 0,164 × 0,164 мм/пиксел. Общая продолжительность сканирования одного животного составляла около 25 мин. Степень повреждения ГМ оценивали с помощью графического анализа МРТ изображений с подсчетом объема поврежденного участка ГМ. Для этого на серии МРТ изображений выделяли слайд с наибольшей площадью поражения ГМ. С помощью программы ImageJ (National Institutes of Health image software, Bethesda, MD, США) рассчитывали площадь повреждения в мм². Далее аналогичным образом рассчитывали площадь повреждения ГМ еще на четырех слайдах (два краниальнее и два каудальнее). Объем повреждения ГМ рассчитывали по следующей формуле: V = ΣSn × d, где d - толщина одного среза (0,8 мм), ΣSn - сумма площадей повреждения на пяти слайдах (мм²). Летальность в группах животных оценивали через 24 часа, на 7-е и 14-е сутки после инсульта.

На фиг.2 представлен объем зоны повреждения на 14-е сутки наблюдения по результатам МРТ-исследования животных.

Гистологическое исследование.

Гистологическое исследование (определение объема очага повреждения) у крыс осуществляли на 14-е сутки после ЧМТ сразу после эвтаназии (декапитация под анестезией хлоралгидратом 6%). Кусочки мозга были зафиксированы в 4% буферном формалине в течение 24 часов. Далее исследования были проведены по стандартной парафиновой проводке. Полученные фронтальные срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, окраской по Нисслю. Морфометрию проводили после получения цифровых снимков на микроскопе «Nikon Eclipse Ni-U» (Япония) объективы: 4х, 10х, 20х 40х. камера DS-RI2. Морфометрию проводили в программе NIS-Elements BR «Nikon» (Япония). Были оценены морфологические изменения в зоне инфаркта, и пенумбры, а также площадь участка повреждения.

Иммуногистохимическое исследование

В качестве исследуемой группы были отобраны парафиновые блоки умерших крыс с диагнозом нетравматическое субарахноидальное кровоизлияние геморрагического инсульта в количестве 56 случаев, контрольная группа составлена из 7 случаев умерших с диагнозом «острая коронарная смерть». Критерии исключения были: травма, злокачественные заболевания. Материал предоставлен Московским бюро судебно-медицинской экспертизы. В дальнейшем, блоки были нарезаны на микротоме «микротомнейм» срезами по 5 мкм и окрашены. Использовались окраски гематоксилин и эозин, и окраска по Нисслю. Для иммуногистохимического исследования были применены окраски на выявления Iba и NeuN антигенов. Срезы были депарафинизированы в ксилоле, и дегидрированы в этиловом спирте. Высокотемпературная демаскировка проводилась в цитратном буфере рН 6 (Target Retrieval Solution, DAKO, Glostrup, Denmark). Срезы были охлаждены и промыты трижды в дистиллированной воде и трижды промыты в фосфатном буфере (PBS) с эскпозицией по 5 минут.(PBS ШС Wash Buffer + Tween, Cell Marque, Rocklin, CA, USA). Для подавления эндогенной пероксидазы срезы были выдержаны в 3% перекиси водорода в течение 10 минут. Для предотвращения неспецифического связывания первичных или вторичных антител с белками тканей, использовали (Protein Block Serum-free, Abeam, Cambridge, UK) с экспозицией 15 минут. Срезы были инкубированы при 37°С в течение 1 часа с первичными антителами (ab5076, 1:500, ab68428 1:500 и ab177487 1:200 разведение в Antibody Diluent ab64211, Abeam, Cambridge, UK). Далее срезы были отмыты в PBS дважды по 5 минут.Интенсивность реакции определяли, используя набор для детектирования (ab64264, Abeam, Cambridge, UK). После промывания срезов в PBS, они были контрастированы гематоксилином. После промывания в проточной воде срезы дегидратировали и заключали под покровное стекло. Анализ производили на микроскопе Nikon Eclipse Ni-e с помощью программного обеспечения NIS-Elements и ImageJ.

Статистический анализ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ STATISTICA 10.0 (StatSoft. Inc., США) и GraphPad Prizm. Нормальность распределения признака в выборках оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. Все данные представлены как медиана (интерквартильный интервал). Статистические различия в данных, имеющих хотя бы в одной из групп распределение, отличное от нормального, анализировали с использованием U-теста Манна-Уитни с применением поправки Бонферрони для сопоставления трех и более групп, а также критерий Краскела-Уоллиса или U-теста Манна-Уитни для анализа не более 2-х групп. Критерием статистической значимости был уровень Р<0,05.

Таким образом, достоверно установлено, что инертный газ криптон обладает биологической активностью в отношении фокального ишемического повреждения ГМ.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к неврологии. Крысам с фотоиндуцированным ишемическим инсультом осуществляют 2-часовую ингаляцию криптон-кислородной смесью Kr 70%/О₂ 30% с потоком 0,5 л/мин на одно животное. Способ позволяет определить клиническую эффективность и безопасность применения инертного газа криптона в качестве нейропротектора при фокальной ишемии головного мозга. 2 ил., 1 пр.

Способ нейропротекции головного мозга in vivo, заключающийся в том, что крысам с фотоиндуцированным ишемическим инсультом осуществляют 2-часовую ингаляцию криптон-кислородной смесью Kr 70%/О₂ 30% с потоком 0,5 л/мин на одно животное.