СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ СКАФФОЛДОВ НА ОСНОВЕ ТКАНЕЙ ИЗ НАТУРАЛЬНОГО ШЕЛКА Российский патент 2018 года по МПК C12M3/00 

Изобретение относится к области регенеративной медицины, а более конкретно к области разработки новых способов получения биодеградируемых материалов и их дальнейшего использования в регенеративной медицине для восстановления органов и тканей.

Известен способ получения биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка, включающий нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего [US 8633027 В2].

Недостаток этого способа заключается в отсутствии возможности регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к снижению универсальности предлагаемого решения и ограничению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

Техническая проблема заключается в отсутствии у изделий регулируемой скорости биодеградации.

Технический результат изобретения заключается в том, что появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка, включающем нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, ткань из натурального шелка предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором хлорида кальция.

Существует вариант, в котором молярное соотношение компонентов хлорида кальция, этилового спирта и воды составляет 1:2:8, а обработку ткани из натурального шелка осуществляют при 20-80°C в течение 10-120 мин.

Существует вариант, в котором перед обработкой ткани из натурального шелка раствором хлорида кальция производят ее отмывание раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 мин при температуре 60-100°C, а затем производят ее отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 ч.

Существует вариант, в котором производят нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем пропитывания ткани из натурального шелка раствором этого вещества.

Существует вариант, в котором в качестве вещества способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего используют раствор желатина с концентрацией 1-100 мг/мл, а пропитку им осуществляют при температуре 4-60°C в течение 0,5-12 ч.

Существует вариант, в котором перед пропитыванием ткани из натурального шелка производят ее отмывание от раствора хлорида кальция путем инкубации ткани из натурального шелка в дистиллированной воде в течение 12-48 ч со сменой дистиллированной воды не менее трех раз.

Существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором глутарового альдегида с концентрацией 0,1-3% в течение 1-12 ч при температуре 4-40°C.

Существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 5-40 мМ в течение 1-12 ч.

Существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором, содержащим 5-40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 5-30 мМ N-гидроксисукцинимида, в течение 1-12 ч.

Существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее ультрафиолетовым излучением длиной волны 205-315 нм и мощностью 30 Вт в течение 0,5-2 ч.

Существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее гамма-излучением 10-30 кГр в течение 0,5-8 ч.

Существует вариант, в котором ткань из натурального шелка высушивают перед каждым последующим этапом обработки.

На фиг. 1 представлено изображение ткани из натурального шелка до обработки (фиг. 1А) и после обработки (фиг. 1Б) раствором хлорида кальция. Изображение получено методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение х200.

Способ получения биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка реализуется следующим образом.

На первом этапе ткань из натурального шелка предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором хлорида кальция. При этом молярное соотношение компонентов хлорида кальция, этилового спирта и воды составляет 1:2:8, а обработку ткани из натурального шелка осуществляют при 20-80°C в течение 10-120 мин. Для этого ткань из натурального шелка помещают в пробирку с водно-спиртовым раствором хлорида кальция с молярным соотношением компонентов хлорида кальция, этилового спирта и воды 1:2:8. Указанный температурный режим поддерживают с помощью термостата в течение указанного времени. Варьирование времени обработки в указанном диапазоне позволяет регулировать скорость биодеградации скаффолда: при увеличении времени обработки скорость биодеградации скаффолда также повышается.

В одном из вариантов перед обработкой ткани из натурального шелка раствором хлорида кальция производят ее отмывание раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 мин при температуре 60-100°C, а затем производят ее отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 ч. Для этого ткань из натурального шелка помещают в пробирку с дистиллированной водой. Указанный температурный режим поддерживают с помощью термостата в течение указанного времени.

В одном из вариантов после обработки ткани из натурального шелка раствором хлорида кальция или после отмывания ткани из натурального шелка раствором бикарбоната натрия производят нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем пропитывания ткани из натурального шелка раствором этого вещества. В качестве этого вещества используют раствор желатина с концентрацией 1-100 мг/мл, а пропитку им осуществляют при температуре 4-60°C в течение 0,5-12 ч. Пропитку осуществляют следующим образом. Ткань из натурального шелка помещают в чашку Петри с раствором желатина указанной концентрации и инкубируют в течение указанного времени.

В одном из вариантов перед пропитыванием ткани из натурального шелка производят ее отмывание от раствора хлорида кальция путем инкубации ткани из натурального шелка в дистиллированной воде в течение 12-48 ч со сменой дистиллированной воды не менее трех раз. Для этого ткань из натурального шелка помещают в пробирку с дистиллированной водой. Указанный температурный режим поддерживают с помощью термостата в течение указанного времени, производя смену дистиллированной воды не реже чем через каждые 12 ч.

В одном из вариантов после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором глутарового альдегида с концентрацией 0,1-3% в течение 1-12 ч при температуре 4-40°C. Это осуществляется следующим образом. Ткань из натурального шелка помещают в раствор глутарового альдегида с заданной концентрацией и инкубируют в термостате, поддерживая указанный температурный режим в течение требуемого времени.

Кроме этого существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 5-40 мМ в течение 1-12 ч. Это осуществляется следующим образом. Ткань из натурального шелка помещают в раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с заданной концентрацией и инкубируют в темноте в течение требуемого времени.

Возможен также вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором, содержащим 5-40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 5-30 мМ N-гидроксисукцинимида, в течение 1-12 ч. Это осуществляется следующим образом. Ткань из натурального шелка помещают в раствор, содержащий 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид и N-гидроксисукцинимид, в заданном соотношении и инкубируют в темноте в течение требуемого времени.

В одном из вариантов после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее ультрафиолетовым излучением длиной волны 205-315 нм и мощностью 30 Вт в течение 0,5-2 ч. Для этого ткань из натурального шелка помещают в чашку Петри и подвергают воздействию ультрафиолетового излучения с заданными параметрами в течение указанного времени. В качестве источника ультрафиолетового излучения можно использовать ультрафиолетовую лампу [1]. Варьирование времени воздействия в указанном диапазоне позволяет регулировать скорость биодеградации скаффолда: при увеличении времени воздействия скорость биодеградации скаффолда также повышается.

Кроме этого, существует вариант, в котором после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее гамма-излучением 10-30 кГр в течение 0,5-8 ч. Для этого ткань из натурального шелка помещают в чашку Петри и подвергают воздействию рентгеновского излучения с заданными параметрами в течение указанного времени [2]. Варьирование времени воздействия в указанном диапазоне позволяет регулировать скорость биодеградации скаффолда: при увеличении времени воздействия скорость биодеградации скаффолда также повышается.

Существует также вариант, в котором ткань из натурального шелка высушивают перед каждым последующим этапом обработки. Это можно выполнять путем помещения ткани на поверхность полированного тефлона с последующим инкубированием на открытом воздухе или в сушильном шкафу.

В качестве примера реализации способа представлено изображение ткани из натурального шелка (фиг. 1Б), полученное методом сканирующей электронной микроскопии. Ткань из натурального шелка была отмыта раствором 2,5 мг/мл бикарбоната натрия в течение 30 мин при температуре 100°C, затем дистиллированной водой в течение 12 ч. После чего была произведена обработка ткани из натурального шелка водно-спиртовым раствором хлорида кальция с молярным соотношением компонентов хлорида кальция, этилового спирта и воды 1:2:8 при температуре 37°C в течение 45 мин, а затем отмывание дистиллированной водой в течение 24 ч. Для сравнения на фиг. 1А приведено изображение необработанной ткани из натурального шелка, полученное аналогичным методом. При сравнении микрофотографий нативной ткани и ткани после обработки можно увидеть, что предлагаемый способ обработки приводит к удалению наружного слоя волокон ткани из натурального шелка, повышению структурированности волокон и степени развитости их поверхности.

То, что в способе получения биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка, включающем нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, ткань из натурального шелка предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором хлорида кальция, приводит к тому, что происходит частичное растворение волокон натурального шелка в составе ткани из натурального шелка, благодаря чему появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда за счет варьирования времени обработки, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что молярное соотношение компонентов хлорида кальция, этилового спирта и воды составляет 1:2:8, а обработку ткани из натурального шелка осуществляют при 20-80°C в течение 10-120 мин, приводит к тому, что появляется возможность регулировать скорость деградации ткани из натурального шелка за счет частичного растворения волокон натурального шелка в составе ткани без существенного изменения ее механических свойств, благодаря чему повышается универсальность предлагаемого решения, и расширяются функциональные возможности способа при использовании в медицине.

То, что перед обработкой ткани из натурального шелка раствором хлорида кальция производят ее отмывание раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 мин при температуре 60-100°C, а затем производят ее отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 ч, приводит к тому, что происходит очистка натурального шелка от примесных компонентов, например белка серицина. Благодаря такой обработке появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что производят нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем пропитывания ткани из натурального шелка раствором этого вещества, приводит к тому, что увеличивается адгезия и пролиферативная активность клеток млекопитающего на ткани из натурального шелка, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что в качестве вещества способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего используют раствор желатина с концентрацией 1-100 мг/мл, а пропитку им осуществляют при температуре 4-60°C в течение 0,5-12 ч, приводит к тому, что что увеличивается адгезия и пролиферативная активность клеток млекопитающего на ткани из натурального шелка, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что перед пропитыванием ткани из натурального шелка производят ее отмывание от раствора хлорида кальция путем инкубации ткани из натурального шелка в дистиллированной воде в течение 12-48 ч со сменой дистиллированной воды не менее трех раз, приводит к тому, что происходит удаление остаточного хлорида кальция и облегчается дальнейшее пропитывание растворами веществ, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего. Благодаря такой обработке появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором глутарового альдегида с концентрацией 0,1-3% в течение 1-12 ч при температуре 4-40°C, приводит к тому, что происходит ковалентное связывание веществ, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, и ткани из натурального шелка. Благодаря такой модификации появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 5-40 мМ в течение 1-12 ч, приводит к тому, что происходит ковалентное связывание веществ, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, и ткани из натурального шелка. Благодаря такой модификации появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором, содержащим 5-40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 5-30 мМ N-гидроксисукцинимида, в течение 1-12 ч, приводит к тому, что происходит ковалентное связывание веществ, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, и ткани из натурального шелка. Благодаря такой модификации появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее ультрафиолетовым излучением длиной волны 205-315 нм и мощностью 30 Вт в течение 0,5-2 ч, приводит к тому, что происходит ковалентное связывание веществ, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, и ткани из натурального шелка. Благодаря такой модификации появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда за счет варьирования времени воздействия, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее гамма-излучением 10-30 кГр в течение 0,5-8 ч, приводит к тому, что происходит ковалентное связывание веществ, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, и ткани из натурального шелка. Благодаря такой модификации появляется возможность регулировать скорость биодеградации скаффолда за счет варьирования времени воздействия, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

То, что ткань из натурального шелка высушивают перед каждым последующим этапом обработки, приводит к тому, что облегчается стерилизация и хранение полученных изделий, что приводит к повышению универсальности предлагаемого решения и расширению функциональных возможностей способа при использовании в медицине.

Источники информации

1. Miyamoto К., Sasaki М., Minamisawa Y., Kurahashi Y., Kano Н., Ishikawa S., 2004. Evaluation of in vivo biocompatibility and biodegradation of photocrosslinked hyaluronate hydrogels (HADgels) // Journal of Biomedical Materials Research. V. 70(4). P. 550-559.

2. В.И. Севастьянов, Н.В. Перова. «Биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ - инъекционный биодеградируемый имплантат для заместительной и регенеративной медицины», Практическая медицина, 2014, том 8, №84, с. 110-116.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к получению биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка. Способ включает обработку ткани из натурального шелка водно-спиртовым раствором хлорида кальция при молярном соотношении хлорида кальция, этилового спирта и воды 1:2:8 соответственно, при 20-80°С в течение 10-120 минут, нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способного к адгезии и пролиферации клеток млекопитающего. Изобретение позволяет получить скаффолд с ускоренной биодеградацией. 10 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка, включающий нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, отличающийся тем, что ткань из натурального шелка предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором хлорида кальция, при этом молярное соотношение хлорида кальция, этилового спирта и воды составляет 1:2:8, а обработку ткани осуществляют при 20-80°С в течение 10-120 мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед обработкой ткани из натурального шелка раствором хлорида кальция производят ее отмывание раствором бикарбоната натрия с концентрацией 1-3 мг/мл в течение 30-60 минут при температуре 60-100°С, а затем производят ее отмывание дистиллированной водой в течение 12-60 ч.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что производят нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем пропитывания ткани из натурального шелка раствором этого вещества.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, используют раствор желатина с концентрацией 1-100 мг/мл, а пропитку им осуществляют при температуре 4-60°С в течение 0,5-12 ч.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что перед пропитыванием ткани из натурального шелка производят ее отмывание от раствора хлорида кальция путем инкубации ткани из натурального шелка в дистиллированной воде в течение 12-48 ч со сменой дистиллированной воды не менее трех раз.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором глутарового альдегида с концентрацией 0,1-3% в течение 1-12 ч при температуре 4-40°С.

7. Способ по п. 3, отличающийся тем, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 5-40 мМ в течение 1-12 ч.

8. Способ по п. 3, отличающийся тем, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, производят обработку ткани из натурального шелка раствором, содержащим 5-40 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 5-30 мМ N-гидроксисукцинимида, в течение 1-12 ч.

9. Способ по п. 3, отличающийся тем, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее ультрафиолетовым излучением длиной волны 205-315 нм и мощностью 30 Вт в течение 0,5-2 ч.

10. Способ по п. 3, отличающийся тем, что после пропитывания ткани из натурального шелка раствором по меньшей мере одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, воздействуют на нее гамма-излучением 10-30 кГр в течение 0,5-8 ч.

11. Способ по любому из п. 1-10, отличающийся тем, что ткань из натурального шелка высушивают перед каждым последующим этапом обработки.