Композиция для изготовления биодеградируемых скаффолдов и способ ее получения Российский патент 2019 года по МПК C12M3/00 A61F2/02 

Группа изобретений относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии, а более конкретно к области разработки новых способов получения биодеградируемых скаффолдов и их использования в регенеративной медицине для восстановления поврежденных органов и тканей.

Одной из актуальных проблем современной трансплантологии является нехватка донорских органов для пересадки. Решением этой проблемы может стать создание искусственных органов и тканей, представляющих собой конструкции, содержащие матриксный и клеточный компоненты. Выбор материала, который будет использоваться как каркас будущего искусственного органа, является первостепенной задачей. Этот материал должен максимально точно имитировать свойства нативного межклеточного матрикса и выполнять его функции: определять физические свойства тканей, обеспечивать адгезию, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток. В настоящее время в качестве таких материалов рассматривают как синтетические материалы, так и материалы природного происхождения.

Одним из универсальных материалов, используемых в качестве каркасного компонента, является фиброин шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori. Фиброин обладает свойствами, которые позволяют формировать из него различные изделия: покрытия, пленки, трубки, пористые матриксы, микро- и наночастицы, гели, а также широко использовать его в тканевой инженерии как самостоятельный материал, так и в составе композитов. К таким свойствам можно отнести его механические показатели, позволяющие осуществлять хирургические манипуляции, а также возможность контроля скорости биодеградации за счет регулирования конформационного состояния белка [Сафонова Л.А. Боброва М.М., Агапова О.И., Котлярова М.С., Архипова А.Ю., Мойсенович М.М., Агапов И.И. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка // Современные технологии в медицине. - 2015. - Том 7. - №3. - С. 6-13.]. Однако, изделия из чистого фиброина шелка обладают низкими адгезионными свойствами для клеток млекопитающих.

Известен способ получения биодеградируемых скаффолдов из фиброина шелка, включающий внесение в состав скаффолда, по меньшей мере, одного биодеградируемого полимера, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего [US 7842780]. Известный способ предполагает включение в рабочий раствор фиброина шелка для получения скаффолдов биодеградируемого полимера.

Однако при использовании в регенеративной медицине биодеградируемые скаффолды, полученные по указанному выше способу, не позволяют воссоздать нативные условия - трехмерное микроокружение и комплекс молекулярно-биологических сигналов для клеток млекопитающих.

Техническая проблема заключается в создании композиции для получения биодеградируемых скаффолдов, позволяющей изготовить скаффолды, обеспечивающие одновременно нативные условия существования для клеток млекопитающего и обладающие механическими свойствами, позволяющими формировать из него изделия различных размеров и формы.

Технический результат предлагаемой группы изобретений заключается в одновременном достижении комплекса характеристик у биодеградируемых скаффолдов, включая оптимизацию культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток при сохранении механической прочности и эластичности путем сочетанного введения в рабочий раствор (композицию) для получения скаффолдов водного раствора фиброина шелка и микрочастиц межклеточного матрикса при определенном соотношении компонентов.

Нами было установлено, что при соединении в рабочем растворе указанных компонентов они сохраняют свои свойства. Причем эти свойства сохраняются и в биодеградируемых скаффолдах, полученных из такого рабочего раствора.

Сущность предлагаемой группы изобретений состоит в следующем.

Композиция для изготовления биодеградируемых скаффолдов, включающая водный раствор фиброина шелка дополнительно содержит частицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм, по меньшей мере, одной ткани млекопитающего при следующем соотношении компонентов, масс. %:

водный раствор фиброин шелка 10-95 частицы межклеточного матрикса 90-5.

В частном случае она дополнительно содержит, по меньшей мере, один биодеградируемый полимер, способствующий адгезии и пролиферации клеток млекопитающего. Дополнительное использование биодеградируемого полимера позволит еще больше повысить биосовместимость изделия.

В качестве биодеградируемых полимеров, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего может быть использован коллаген и/или желатин, и/или фибронектин.

В качестве ткани млекопитающего она может содержать одну из следующих тканей: ткань сердца, ткань легкого, ткань мозга, ткань печени, ткань почки, ткань поперечнополосатой мышцы, ткань кожи, что расширяет возможности способа при применении в регенеративной медицине.

Способ получения указанной выше композиции характеризуется тем, что суспензию частиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм, по меньшей мере, одной ткани млекопитающего, смешивают с водным раствором фиброина шелка, обеспечивая соотношение компонентов, масс. %:

водный раствор фиброин шелка 10-95 частицы межклеточного матрикса 90-5.

В частном случае межклеточный матрикс ткани измельчают до размера частиц меньше 0,5 мм в гомогенизаторе или при помощи ступки и пестика. Получение частиц указанного размера позволяет получить на поверхности скаффолда трехмерную топографию, благоприятную для клеток.

Перед измельчением межклеточный матрикс может быть заморожен в жидком азоте. Такая криоконсервация позволяет сохранить свойства межклеточного матрикса нативными.

Для изготовления частиц межклеточного матрикса ткани может быть произведена децеллюляризация ткани млекопитающего раствором, содержащим, по меньшей мере, один детергент и один агент, удаляющий нуклеиновые кислоты, с последующей отмывкой межклеточного матрикса ткани путем инкубации в буферном растворе с рН 7,4 в течение 1-36 ч. Такая обработка ткани обеспечивает мягкое удаление клеточного материала, эффективное удаление генетического материала и сохранность свойств межклеточного матрикса ткани.

Для изготовления частиц межклеточного матрикса ткани может быть произведена децеллюляризация ткани раствором, содержащим, по меньшей мере, один детергент, после которой производят отмывку межклеточного матрикса ткани путем инкубации в буферном растворе с рН 7,4 в течение 1-36 ч. Такая обработка ткани обеспечивает мягкое удаление клеточного материала и сохранность свойств межклеточного матрикса ткани.

В частном случае децеллюляризацию ткани производят путем ее инкубации в течение 1-10 суток в буферном растворе с рН 7,4, содержащем в качестве детергентов тритон Х-100 с концентрацией 0,01-10% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,001-5%. При этом инкубация может быть проведена в буферном растворе, дополнительно содержащем раствор трипсина с концентрацией 0,01-0,5%. Такая обработка ткани обеспечивает мягкое и быстрое удаление клеточного материала и сохранность свойств межклеточного матрикса ткани для тканей с плотной структурой, например поперечнополосатой мышцы или почки.

В частном случае перед децеллюляризацией измельчают ткань до фрагментов размером 0,5-20 мм, а перед измельчением ткани может быть проведена ее перфузию через доступные сосуды буферным раствором с рН 7,4 со скоростью 50-300 мл/ч. Перфузия доступных сосудов обеспечит более эффективную децеллюляризацию высоковаскуляризированных органов и тканей.

Изобретения поясняются следующими фигурами

На фиг. 1 представлено изображение биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка.

На фиг. 2 представлено изображение биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка с внесенными в состав скаффолда микрочастицами децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени.

Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии, увеличение ×200.

Способ получения композиция для изготовления биодеградируемых скаффолдов осуществляется следующим образом.

На первом этапе для изготовления микрочастиц межклеточного матрикса ткани, например человека или крысы, производят ее децеллюляризацию раствором, содержащим, по меньшей мере, один детергент. При этом децеллюляризацию ткани производят путем инкубации ткани в течение 1-10 суток в изотоническом буферном растворе рН 7,4, содержащим в качестве детергентов тритон Х-100 с концентрацией 0,01-10% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,001-5%. Для этого ткань помещают в пробирку с растворами детергентов указанной концентрации и инкубируют в течение указанного времени.

В одном из вариантов для изготовления микрочастиц межклеточного матрикса ткани производят децеллюляризацию ткани путем ее инкубации в течение 1-10 суток в изотоническом буферном растворе рН 7,4, содержащим в качестве детергентов тритон Х-100 с концентрацией 0,01-10% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,001-5%; и в растворе трипсина с концентрацией 0,01-0,5%. Для этого ткань помещают в пробирку с растворами детергентов и затем в раствор трипсина указанной концентрации и инкубируют в течение указанного времени.

Кроме этого, существует вариант, в котором для изготовления микрочастиц межклеточного матрикса ткани производят ее децеллюляризацию раствором, содержащим, по меньшей мере, один детергент и агент, удаляющий нуклеиновые кислоты. При этом децеллюляризацию ткани производят путем ее инкубации в течение 1-10 суток в изотоническом буферном растворе рН 7,4, содержащим в качестве детергентов тритон Х-100 с концентрацией 0,01-10% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,001-5%, а в качестве агента, удаляющего нуклеиновые кислоты, например, ДНКазу с концентрацией 10 ед/мл. Для этого ткань помещают в пробирку с растворами детергентов и агент, удаляющий нуклеиновые кислоты, указанной концентрации и инкубируют в течение указанного времени.

В одном из вариантов перед децеллюляризацией ткани производится измельчение ткани до фрагментов размером 0,5-20 мм. Для этого ткань помещают в чашку Петри и измельчается до указанного размера, например, с помощью хирургических ножниц.

Кроме этого существует вариант, в котором перед измельчением ткани до фрагментов размером 0,5-20 мм производят перфузию ткани через доступные сосуды буферным раствором со скоростью 50-300 мл/ч. Для этого доступный сосуд ткани канюлируют и производят перфузия ткани доступным способом с указанной скоростью.

В одном из вариантов после децеллюляризации ткани производят отмывку межклеточного матрикса ткани путем инкубации в изотоническом буферном растворе рН 7,4 в течение 1-36 ч. Для этого децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани помещают в пробирку с изотоническим буферным раствором рН 7,4 и инкубируют в течение указанного времени.

После отмывки межклеточного матрикса ткани производят измельчение децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм, по меньшей мере, одним из следующих способов. Измельчение децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм производят при помощи ступки и пестика. Для этого децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани помещают в ступку и измельчают до указанного размера.

В одном из вариантов перед измельчением децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм при помощи ступки и пестика производят заморозку децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани в жидком азоте. Для этого децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани помещают в жидкий азот до полного замерзания.

Кроме этого существует вариант, в котором после отмывки межклеточного матрикса ткани производят измельчение децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм в гомогенизаторе. Для этого децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани помещают в гомогенизатор и измельчают при 25000 об/мин в течение 3 минут.

В одном из вариантов после измельчения децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм, по меньшей мере, одним из способов, производят выделение фракции микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани требуемого размера. Один из способов выделения фракции микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани размером 1 мкм и меньше является центрифугирования не менее двух раз по 10 минут при 1350 g, отбора супернатанта и повторного центрифугирования не менее 6 раз по 10 минут при 12100 g. Для этого децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани помещают в пробирку и производят центрифугирование не менее двух раз в течение указанного времени и указанными параметрами, отбора супернатанта и повторного центрифугирования не менее 6 раз в течение указанного времени и указанными параметрами.

Для доказательства возможности реализации заявленных назначений и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример.

Ткань печени человека была децеллюляризована раствором натрий-фосфатного буфера рН 7,4, содержащим в качестве детергентов тритон Х-100 с концентрацией 3% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,1%; и раствором трипсина с концентрацией 0,025% в течение 10 дней. Предварительно ткань печени была измельчена ножницами до размера 0,5-3 мм. Децеллюляризованный межклеточный матрикс ткани печени человека был отмыт раствором натрий-фосфатного буфера рН 7,4 в течение 24 часов. После чего была произведена заморозка децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени человека в жидком азоте, а затем было произведено измельчение децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани до размера частиц меньше 0,5 мм при помощи ступки и пестика. Далее было произведено выделение фракции микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани печени человека размером 1 мкм и меньше путем центрифугирования по 10 минут при 1350 g два раза, отбора супернатанта и повторного центрифугирования по 10 минут при 12100g 8 раз. Затем был изготовлен биодеградируемый скаффолд методом полива [Сафонова Л.А., Боброва М.М., Агапова О.И, Архипова А.Ю., Гончаренко А.В., Агапов И.И. Пленки на основе фиброина шелка для заживления полнослойной раны кожи у крыс // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2016. - Том 18. - №3. - С. 80-83.] на поверхности полированного тефлона из заявленной композиции, включающей раствор фиброина шелка и суспензию микрочастиц децеллюляризованного межклеточного матрикса ткани, доля последних по массе составляет 30% от общей массы смеси (фиг. 2).

Для сравнения на фиг. 1 приведено изображение биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка.

При сравнении микрофотографий модифицированного (предлагаемого нами) и немодифицированного биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка можно увидеть, что предлагаемый способ обработки приводит к изменению поверхности биодеградируемого скаффолда из фиброина шелка, что обеспечивает нативное микроокружение для клеток млекопитающих как за счет биохимического состава микрочастиц, так и за счет увеличения шероховатости поверхности.

Был проведен сравнительный анализ адгезии клеток культуры гепатокарциномы человека Hep G2 на модифицированном (предлагаемом нами) и немодифицированном биодеградируемом скаффолде из фиброина шелка. Было выявлено, что уровень адгезии клеток на модифицированном скаффолде на 30% выше, чем на немодифицированном скаффолде из фиброина шелка. Механические свойства скаффолда, созданного из предлагаемой композиции, соответствуют таковым у скаффолда из фиброина щелка.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к композиции для изготовления биодеградируемых скаффолдов, и способу ее получения. Способ включает смешение суспензии микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм одной ткани млекопитающего с водным раствором фиброина шелка при соотношении компонентов: водный раствор фиброина шелка 10-95 мас.% и микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм 90-5 мас.%. Изобретение позволяет повысить уровень адгезии клеток на скаффолде. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Композиция для изготовления биодеградируемых скаффолдов, включающая водный раствор фиброина шелка, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм по меньшей мере одной ткани млекопитающего при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водный раствор фиброина шелка 10-95 микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм 90-5

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит по меньшей мере один биодеградируемый полимер, способствующий адгезии и пролиферации клеток млекопитающего.

3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве биодеградируемых полимеров, способствующих адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, используют коллаген, и/или желатин, и/или фибронектин.

4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве ткани млекопитающего она содержит одну из следующих тканей: ткань сердца, ткань легкого, ткань мозга, ткань печени, ткань почки, ткань поперечнополосатой мышцы, ткань кожи.

5. Способ получения композиции по п. 1, характеризующийся тем, что суспензию микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм по меньшей мере одной ткани млекопитающего смешивают с водным раствором фиброина шелка, обеспечивая соотношение компонентов, мас.%:

водный раствор фиброина шелка 10-95 микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм 90-5

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что межклеточный матрикс ткани измельчают до размера частиц меньше 0,5 мм в гомогенизаторе или при помощи ступки и пестика.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что перед измельчением межклеточный матрикс замораживают в жидком азоте.

8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что для изготовления частиц межклеточного матрикса ткани производят децеллюляризацию ткани млекопитающего раствором, содержащим по меньшей мере один детергент и один агент, удаляющий нуклеиновые кислоты, с последующей отмывкой межклеточного матрикса ткани путем инкубации в буферном растворе с рН 7,4 в течение 1-36 ч.

9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что для изготовления частиц межклеточного матрикса ткани производят децеллюляризацию ткани раствором, содержащим по меньшей мере один детергент, после которой производят отмывку межклеточного матрикса ткани путем инкубации в буферном растворе с рН 7,4 в течение 1-36 ч.

10. Способ по любому из пп. 8, 9, отличающийся тем, что децеллюляризацию ткани производят путем ее инкубации в течение 1-10 суток в буферном растворе с рН 7,4, содержащем в качестве детергентов тритон Х-100 с концентрацией 0,01-10% и додецилсульфат натрия с концентрацией 0,001-5%.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что инкубацию проводят в буферном растворе, дополнительно содержащем раствор трипсина с концентрацией 0,01-0,5%.

12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что перед децеллюляризацией измельчают ткань до фрагментов размером 0,5-20 мм.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что перед измельчением ткани производят ее перфузию через доступные сосуды буферным раствором с рН 7,4 со скоростью 50-300 мл/ч.