МИКРОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ НА ОСНОВЕ ПРОВОДЯЩЕЙ ПОЛИ(3-АМИНОФЕНИЛБОРНОЙ КИСЛОТЫ) Российский патент 2018 года по МПК C12M1/34 C12Q1/06 G01N27/04 C12R1/645 C12R1/82 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области аналитической химии для задач микробиологии, а именно электрохимическим микросенсорам, предназначенным для детектирования плесневых грибов с использованием модифицированных встречно-штыревых микроэлектродов.

Уровень техники

Микроорганизмы, такие как бактерии и плесневые грибы, являются неотъемлемой частью повседневной жизни человека как в жилых, так и в производственных помещениях. На протяжении жизни человек непрерывно вдыхает микроорганизмы в составе воздушного аэрозоля. При этом индивидуальная чувствительность может заметно различаться, и у лиц с предрасположенностью к атопии (гиперчувствительности к аллергенам) содержание спор микроорганизмов на 5-8 порядков меньше критического для здоровых людей может вызывать различные осложнения [World Health Organization. Indoor air quality: biological contaminants. // Report on WHO meeting, 1988, №31, P. 1-54]: бронхиальную астму, аллергический риносинусит, сенную лихорадку и пр. Более того, вышесказанное верно и в случае микроорганизмов, не признанных патогенными, как, например, Penicillium chrysogenum.

Традиционный метод детектирования плесневых грибов заключается в культивировании образца при помощи специальной питательной среды в каком-либо контейнере (например, чашке Петри) и последующем анализе выросшей культуры - обычно это визуальный подсчет числа и выявление характерных морфологических особенностей для идентификации и оценки степени микробного заражения. Такой метод применяется, например, при контроле качества производимой продукции и сырья на производственных, медицинских и пищевых учреждениях. Однако существенными недостатками применения этого метода являются необходимость 2-7 дней для культивирования и привлечение квалифицированного персонала.

По сравнению с другими методами - иммуноферментными, проточно-цитометрическими, масс-спектрометрическими, биолюминесцентными, а также основанными на ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции - электрохимические методы обладают перспективным сочетанием высокой чувствительности, экспрессности и, кроме того, простоты исполнения и низкой себестоимости [Sergeyeva et al., Sensors and Actuators В 34:283-288 (1996); Ghindilis et al., Biosensors and Bioelectronics 13:113-131 (1998); Bashir and Gomez, Biomedical Microdevices 3:201-209 (2001)]. Наиболее эффективные электрохимические системы основаны на принципе электрохимического импеданса [Yang et al. (2004) Anal. Chem.76, 1107-1113; Huang et al. (2010) Biosensors and bioelectronics 25:1204-11].

Один из методов анализа основан на измерении электрохимического импеданса раствора, содержащего микроорганизмы. Так, например, изменение проводимости раствора является следствием выделения живыми клетками метаболитов, являющихся электролитами, в ходе процессов жизнедеятельности. Для точного измерения импеданса системы авторы патента [Sensorelement und Verfahren zum Versorgen und Erfassen von biologischem Material mit , DE 102011082451 A1] используют взаимопроникающие электроды. Для детектирования спорообразующих организмов указанный в патенте метод неприменим из-за значительно сниженной метаболической активности спор.

Одним из популярных направлений методов детектирования микроорганизмов являются электрохимические биосенсоры. К примеру, в патенте [Impedimetric biosensor and its use for rapid detection of bacterial pathogens in solution, US 20050059105 A1] авторы используют взаимопроникающие микроэлектроды, модифицированные антителами для измерения импеданса суспензии клеток Escherichia coli в жидкости. Однако использование биологических объектов (антитела, аптамеры, лектины и др.) в качестве распознающих элементов создает существенные ограничения для практического применения из-за низкой операционной стабильности, невозможности повторного использования, сложности и высокой себестоимости производства. Избежать указанных ограничений позволяют синтетические рецепторы, сочетающие в себе высокую селективность и чувствительность биологических объектов и в то же время обладающие высокой стабильностью и возможностью повторного применения. Для использования в качестве синтетических рецепторов, дающих электрохимический отклик, как нельзя лучше подходят проводящие полимеры, содержащие функциональные группы для связывания с определяемыми объектами.

В патенте [Sensors comprising a semi-conductive polymer, WO 2002033732 A2] авторы используют проводимость полимера, наносимого на взаимопроникающие электроды, в качестве сигнала для детектирования патогенных вирусов и бактерий. Однако система относится к типу биосенсорных, поскольку в качестве рецепторов используются биологические объекты: антитела, белки, ферменты, нуклеиновые кислоты и пр. Таким образом, вышеперечисленные ограничения по-прежнему присутствуют.

Фенилборные кислоты, способные селективно и обратимо связываться моно-, олиго- и полисахаридами, оксикислотами с образованием устойчивых циклических боронатных эфиров, будучи включенными в структуру проводящих полимеров, например, полианилина, являются высокоэффективными синтетическим сенсорными материалами для электрохимического детектирования сахаров и оксикислот [Springsteen G., Wang В., Tetrahedron V. 58, 26, 2002, pp. 5291-5300(10)]. Поскольку клеточная стенка большинства микроорганизмов состоит в основном из олиго- и полисахаридов, их производных и оксикислот, концепция связывания борной кислоты с диольными группами указанных соединений является перспективной основой для способа детектирования микроорганизмов. Помимо преимуществ, перечисленных выше для электрохимических методов, такой способ не требует предварительной пробоподготовки образца, как в случае большинства методов для детектирования микроорганизмов, а кроме того, является безреагентным - в процессе связывания борной кислоты с диольной группой не требуются дополнительные реагенты. В патентах [US 6797152 В2, US 8454819 В2] используют полианилинборные кислоты, синтезированные как химическим, так и электрохимическим путем, для использования в качестве сенсорного покрытия. Несмотря на указанное среди возможных аналитических откликов изменение импеданса системы, нет подтверждения того, что полученный полимер является проводящим, что является необходимым условием для его использования в качестве основы для импедиметрического сенсора.

Встречно-штыревые электроды демонстрируют высокую чувствительность в применении к детектированию микроорганизмов, в связи с чем их целесообразно использовать в качестве основы для создания сенсоров [М. Varshney, Y.B. Li. Biosensors & Bioelectronics, 24 (2009), pp. 2951-2960]. В работе, выбранной в качестве прототипа, [Impedance based devices and methods for use in assays, US 7470533 B2] представлен способ детектирования клеток или молекул на основе изменения импеданса взаимопроникающих структур различной геометрии. В качестве чувствительного слоя, согласно изобретению, используют самособирающиеся монослои, внеклеточные компоненты, белки, заряженные группы и полимерные материалы. Использование биораспознающих элементов, таких как белки и компоненты внеклеточного матрикса, обуславливает недостатки системы, указанные выше для биосенсоров. Другие группы материалов - самособирающиеся монослои, заряженные группы и полимеры - не обеспечивают точность и достоверность анализа, поскольку не содержат группы, специфически связывающихся с компонентами клеточных стенок и внешних мембран. Такие типы систем также будут давать отклик, например, на фрагменты пыли, не содержащие микроорганизмы. Более того, деградация, например, полимера или самособирающихся монослоев также вызывает изменение импеданса системы, но при этом не является полезным сигналом и не обусловлено присутствием микроорганизмов. Также для полимеров не указано, обладают ли они проводимостью в нейтральной среде, что необходимо для использования изменения импеданса в качестве аналитического сигнала.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящей группы изобретений является создание микросенсора для достоверного определения концентрации клеток плесневых грибов в водных и воздушных средах и способ определения концентрации плесневых грибов с высокой точностью.

Поставленная задача решается микросенсором для определения концентрации клеток плесневых грибов в водных и воздушных средах, включающим размещенную на диэлектрической подложке систему из по меньшей мере двух встречно-штыревых микроэлектродов, область встречно-штыревой части которых модифицирована поли(3-аминофенилборной кислотой), полученной в состоянии проводящего полимера и характеризующейся уменьшением сопротивления при взаимодействии полимера с микроорганизмами по сравнению с эталонным значением.

Предпочтительно использовать встречно-штыревые электроды, расположенные на расстоянии от 1 до 20 микрометров друг от друга.

Поставленная задача также решается способом получения микросенсора, заключающимся в синтезе полимера путем электрополимеризации мономера 3-аминофенилборной кислоты на встречно-штыревых микроэлектродах в кислом растворе в присутствии фторид-ионов с постоянным увеличением скорости окисления мономера при фиксированном потенциале.

Поставленная задача также решается способом определения концентрации плесневых грибов в водных и воздушных средах с использованием вышеуказанного микросенсора путем помещения его в исследуемую водную среду или поток воздушной среды, регистрации спектров электрохимического импеданса с определением из спектров сопротивления полимера и определения количественного содержания плесневых грибов по градуировочной зависимости, предварительно полученной для плесневых грибов.

Предпочтительно для получения градуировочной зависимости микросенсор помещают в исследуемую водную среду или поток воздушной среды регистрируют спектры электрохимического импеданса с определением из спектров эталонного сопротивления - сопротивления полимера до введения пробы с плесневыми грибами - и сопротивления при введении проб с известным различным содержанием плесневых грибов, строят убывающую градуировочную зависимость относительного сопротивления, полученного путем деления сопротивления в присутствии различных проб.

Техническим результатом группы изобретений является то, что микросенсор на основе полимерного материала позволяет с высокой точностью (с вероятностью 95% возможно определять плесневые грибы в диапазоне содержаний от 120 до 2600 КОЕ/мл) и достоверностью определять присутствие микроорганизмов как в водной, так и в воздушной среде. Регистрируемый методом спектроскопии электрохимического импеданса эффект уменьшения сопротивления полимера в составе микросенсора обусловлен исключительно специфическими взаимодействиями полимера с микроорганизмами. При проведении определения заявляемым способом исключено влияние побочных процессов и конкурирующих реакций, которые всегда приводят к обратному эффекту увеличения сопротивления полимера.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 изображены примеры конструкций встречно-штыревых микроэлектродов: а) из 2 частей, б) из 3 частей.

На фиг. 2 представлены спектры электрохимического импеданса в присутствии различных суспензий Penicillium chrysogenum (в колониеобразующих единицах на 1 мл): 0; 120; 700; 1200; 2200; 2600.

На фиг. 3 представлена градуировочная зависимость относительного сопротивления полимера от содержания Penicillium chrysogenum в 5 мМ фосфатном буферном растворе.

Осуществление изобретения

В настоящем изобретении представлен микросенсор на основе встречно-штыревых электродов, модифицированных полимером поли(3-аминофенилборной кислотой), обладающей, в отличие от обычного полианилина, проводимостью в нейтральной среде, что позволяет проводить анализ при помощи спектроскопии электрохимического импеданса. Точность и достоверность определения концентрации микроорганизмов обеспечивается уменьшением сопротивления полимера в их присутствии, тогда как неспецифические процессы - дедопирование, деградация полимера и пр. - приводят к увеличению сопротивления, которое также наблюдается в случае, если вместо поли(3-АФБК) используется незамещенный полианилин. Разработанный микросенсор на физико-химическом уровне без использования дополнительной обработки сигналов импеданса позволяет отличать специфическое связывание, т.е. взаимодействие с микроорганизмами, от неспецифических или фоновых процессов.

Заявленное изобретение направлено на детектирование плесневых грибов в составе жидкой или воздушной среды при помощи электрохимических микросенсоров на основе поли(3-АФБК). Отличительная особенность селективного детектирования микроорганизмов обусловлена уменьшением сопротивления полимера в присутствии микроорганизмов. Данный эффект позволяет дифференцировать специфические взаимодействия (т.е. связывание полимера с определяемым объектом от неспецифических процессов, например дедопирования и деградации полимера), которые способствуют увеличению полимера, что противоположно эффекту, наблюдаемому при специфических процессах. Эффект уменьшения сопротивления полимерного покрытия в результате взаимодействия с определяемым объектом наблюдается при регистрации импеданса полимера, полученного в разработанных условиях для электрохимического синтеза поли(3-АФБК), которые способствуют формированию на поверхности электрода проводящего полимерного покрытия.

Синтез проводящего полимера проводится непосредственно на поверхности встречно-штыревых микроэлектродов в электрохимической ячейке с разделенными пространствами рабочего электрода, электрода сравнения и вспомогательного электрода. Встречно-штыревые микроэлектроды представляют собой как минимум две «гребенки» (фиг. 1), штыревая часть которых расположена друг от друга на расстоянии от 1 до 20 микрон, в качестве материала электрода может быть использовано золото, углерод и пр., а в качестве подложки - диэлектрические материалы, например диоксид кремния. Оптимальным условиям электрохимического синтеза проводящего полимера из 3-аминофенилборной кислоты отвечает полимеризация из водного раствора мономера в кислом растворе фторида натрия с концентрацией, по меньшей мере в 5 раз превышающей концентрацию мономера в диапазоне 0.02-0.1 М, в потенциодинамическом режиме с постоянным увеличением скорости окисления при фиксированном значении потенциала. Максимальное значение анодного потенциала развертки находится в диапазоне от 0.7 до 1.0 В, при котором не происходит деградации полимера в результате окисления, о чем можно судить по возрастанию тока окисления со временем осаждения.

Для создания кислой среды может быть использованы неорганические кислоты, содержащие одно- и двухзарядные анионы: соляная, серная и азотная кислоты и др. В качестве источника фторид-ионов могут быть использованы неорганические соли плавиковой кислоты, содержащие как катион металла, так и органический катион, например фторид калия, фторид натрия, фторид аммония и др.

Для получения микросенсора встречно-штыревой микроэлектрод погружают в рабочий отсек электрохимической ячейки с разделенными пространствами так, чтобы встречно-штыревая часть полностью находилась в ростовом растворе. После этого микросенсор подключают к потенциостату в качестве рабочего, а, кроме того, в соответствующие отсеки ячейки погружают вспомогательный электрод и электрод сравнения, также подключенные к потенциостату. После чего применяют развертку потенциала в потенциодинамическом режиме в условиях, указанных выше.

Полимерный материал микросенсора обладает аффинностью к функциональным группам полисахаридов и их производным на поверхности микроорганизмов: целлюлоза, хитин, глюкан и пр. Полисахариды и их производные встречаются в составе внешних мембран и клеточных стенок у различных микроорганизмов: бактерий, грибов, растений и пр. [Prescott's Microbiology, 9th ed., 2014]. Таким образом, данный микросенсор применим к детектированию различных типов микроорганизмов.

Сопротивление полученного полимера рассчитывается из спектров электрохимического импеданса, например, в водных растворах или в потоке аэрозоля. В присутствии микроорганизмов полимер демонстрирует уменьшение сопротивления, что связано исключительно со специфическим взаимодействием полимера с микроорганизмами. В случае неспецифических взаимодействий (блокировка поверхности пылью и мелкими неживыми объектами, дедопирование или деградация) сопротивление полимера наоборот возрастает. Таким образом, указанная особенность разработанного микросенсора позволяет проводить точный и правильный анализ.

Пример 1. Определение концентрации плесневых грибов Penicillium chrysogenum в жидкой среде

Электрополимеризацию 3-аминофенилборной кислоты проводят в режиме циклической вольтамперометрии из водного раствора, содержащего 0.05-1.0 М H₂SO₄ и 0.2 М NaF (в пятикратном избытке по отношению к 3-аминофенилборной кислоте). Электрохимическая ячейка с разделенными пространствами электродов для электрополимеризации содержит в качестве рабочего систему из двух или более золотых встречно-штыревых электродов как на фиг. 1, расположенную на подложке из диэлектрика, хлоридсеребряный электрод сравнения (в 1 М KCl) и стеклоуглеродный вспомогательный электрод. Верхняя граница диапазона развертки потенциалов не превышает 1.0 В относительно используемого хлорид серебряного электрода сравнения. Для регистрации спектров электрохимического импеданса электродов, модифицированных проводящей поли(3-аминофенилборной кислотой) использовали трехэлектродную ячейку с разделенным пространством рабочего и вспомогательного электродов и электрода сравнения. В качестве вспомогательного электрода использовали платиновую сетку цилиндрической формы, коаксиальную рабочему электроду. Спектры электрохимического импеданса регистрировали в 5 мМ фосфатном буферном растворе pH 7.0 в диапазоне частот от 1 Гц до 10 кГц, амплитуда колебаний напряжения составляла 5 мВ. Спектры импеданса проводящей поли(3-АФБК) представлены в координатах Найквиста (фиг. 2).

Сопротивление полимерной пленки рассчитывают из диаметра полуокружности, наблюдаемой при высоких частотах развертки. При внесении буферного раствора с плесневыми грибами в ячейку, содержащую микросенсор, диаметр высокочастотного полукруга, уменьшается. Это свидетельствует об уменьшении сопротивления полимера в результате взаимодействия с определяемыми микроорганизмами.

На фиг. 3 приведен градуировочный график зависимости сопротивления полимера, рассчитываемого из спектров импеданса в присутствии микроорганизмов, от содержания микроорганизмов. Из данной зависимости определяют соответствующие наблюдаемые константы связывания микроорганизмов с борными группами полимера, используя уравнение

где С - содержание микроорганизмов в колониеобразующих единицах на 1 мл, - нормированное сопротивление полимера, и - нормированное эталонное (при отсутствии микроорганизмов) сопротивление и сопротивление при бесконечно большом содержании микроорганизмов, определенное в результате аппроксимации экспериментальных данных, K_набл - наблюдаемая константа связывания полимера с плесневыми грибами.

Перед детектированием были взяты суспензии Penicillium chrysogenum в фосфатном буфере, указанном выше, с содержаниями 0, 120, 700, 2200 и 2600 КОЕ/мл. Для каждой суспензии путем погружения в нее микросенсора и последующей регистрации спектра импеданса определяли значение . Для каждого содержания такую процедуру повторяли трижды. В результате аппроксимации градуировочной зависимости набор значений от содержания грибов С указанным выше уравнением (1) определяли параметры и K_набл. Далее по значению сопротивления переноса заряда для неизвестной концентрации микробов с использованием полученного градуировочного графика было определено содержание микроорганизмов в исследуемом образце. Для подтверждения точности определения содержание микроорганизмов в пробе определяли путем отбора и посева неизвестного раствора с последующим подсчетом выросших колоний микроорганизмов [Шлегель Г. Общая микробиология, пер. с нем. М.: Мир. 1987, 576 с.].

Была взята суспензия с неизвестным заранее содержанием Penicillium chrysogenum. Из суспензии была отобрана проба для проведения посева на агаровые чашки, оставшая часть суспензии была использована для импедиметрического детектирования при помощи микрсоенсора. После погружения в суспензию микросенсора были зарегистрирован спектр импеданса, из высокочастотного участка которого было рассчитано сопротивление R_отн., которое составило 70±3%. По градуировочной зависимости было найдено значение концентрации плесневых грибов, равное 1156 КОЕ/мл.

Параллельно был проведен посев отобранной заранее части пробы на чашки Петри с агаром. Определенная по результатам посева концентрация составила 1100 КОЕ/мл.

Таким образом, при определенной из градуировочной зависимости концентрации 1156 КОЕ/мл, методом посева было получено содержание 1100 КОЕ/мл. Таким образом, достоверность составила 95%.

Общее время анализа неизвестной концентрации плесневых грибов составляет порядка 20-30 мин с учетом проведения трех повторных измерений.

Пример 2. Определение концентрации плесневых грибов Penicillium chrysogenum в составе аэрозоля

Электрополимеризацию 3-аминофенилборной кислоты проводили так, как описано в примере 1. Для получения градуировочной зависимости проводили регистрацию спектров импеданса микросенсора, помещенного в поток воздуха, прошедший через водную суспензию плесневых грибов с известным содержанием микроорганизмов. Далее определение проводили аналогично примеру 1. Общее время анализа в случае аэрозоля также составляет порядка 20-30 мин.

Таким образом, преимуществом заявленного микросенсора на основе полимерного материала является точность и достоверность определения микроорганизмов. Регистрируемый методом спектроскопии электрохимического импеданса эффект уменьшения сопротивления полимера в составе микросенсора обусловлен исключительно специфическими взаимодействиями полимера с микроорганизмами. При проведении определения по заявленной методике исключено влияние побочных процессов и конкурирующих реакций, которые всегда приводят к обратному эффекту увеличения сопротивления полимера.

Другими преимуществами изобретения является экспрессность анализа (в течение 20-30 мин), безреагентность, а также возможность масштабирования производства и невысокая себестоимость как микроэлектродных структур, так и полимерного покрытия. Сенсор может функционировать как в водной, так и в воздушной среде, поскольку полимер является проводящим и обеспечивает необходимый электрический контакт между микроэлектродными структурами, что открывает значительные возможности применения in situ.

Микросенсоры на основе поли(3-аминофенил борной кислоты) могут быть востребованы для определения концентрации микроорганизмов в различных объектах (модельные растворы, физиологические жидкости, медицинские препараты, пищевые объекты) в целях лабораторной и медицинской диагностики, контроля качества медицинских препаратов и объектов пищевой промышленности.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен микросенсор и способ для определения концентрации клеток плесневых грибов в водных и воздушных средах, а также способ получения данного микросенсора. Микросенсор содержит размещенную на диэлектрической подложке систему из встречно-штыревых микроэлектродов, где штыревая часть микроэлектродов расположена друг от друга на расстоянии от 1 до 20 микрон и область встречно-штыревой части микроэлектродов модифицирована полимером поли(3-аминофенилборной кислоты). Способ получения микросенсора включает электрополимеризацию мономера 3-аминофенилборной кислоты на встречно-штыревых микроэлектродах. Способ определения концентрации плесневых грибов включает размещение микросенсора в исследуемую водную среду или поток воздушной среды, регистрацию спектров электрохимического импеданса, определение из спектров сопротивления полимера поли(3-аминофенилборной кислоты) и определение количественного содержания плесневых грибов по градуировочной зависимости. Изобретения обеспечивают определение присутствия микроорганизмов с высокой точностью. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

1. Микросенсор для определения концентрации клеток плесневых грибов в водных и воздушных средах, включающий размещенную на диэлектрической подложке систему из по меньшей мере двух встречно-штыревых микроэлектродов, причем область встречно-штыревой части микроэлектродов модифицирована полимером поли(3-аминофенилборной кислоты), при этом штыревая часть микроэлектродов расположена друг от друга на расстоянии от 1 до 20 микрон.

2. Способ получения микросенсора по п. 1, характеризующийся тем, что синтез полимера поли(3-аминофенилборной кислоты) проводят путем электрополимеризации мономера 3-аминофенилборной кислоты на встречно-штыревых микроэлектродах в кислом растворе в присутствии фторид-ионов с постоянным увеличением скорости окисления мономера при фиксированном потенциале в электрохимической ячейке с разделенными пространствами рабочего электрода, электрода сравнения и вспомогательного электрода, с обеспечением максимального значения анодного потенциала от 0.7 до 1.0 В.

3. Способ определения концентрации плесневых грибов в водных и воздушных средах с использованием микросенсора по п. 1, полученного способом по п. 2, характеризующийся тем, что микросенсор помещают в исследуемую водную среду или поток воздушной среды, регистрируют спектры электрохимического импеданса, определяют из спектров сопротивление полимера поли(3-аминофенилборной кислоты) и определяют количественное содержание плесневых грибов по градуировочной зависимости, предварительно полученной для плесневых грибов.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что для получения градуировочной зависимости микросенсор помещают в исследуемую водную среду или поток воздушной среды, регистрируют спектры электрохимического импеданса с определением из спектров эталонного сопротивления, представляющего собой сопротивление полимера поли(3-аминофенилборной кислоты) до введения пробы с плесневыми грибами, и сопротивления при введении проб с известным различным содержанием плесневых грибов, после чего строят убывающую градуировочную зависимость относительного сопротивления, полученного путем деления сопротивления в присутствии различных проб.