Способ диагностики и/или прогноза острого повреждения почек Российский патент 2018 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области общей биомедицины и, в частности, относится к способу диагностики и/или прогноза острого повреждения почек.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

МикроРНК представляют собой малые эндогенно закодированные РНК (рибонуклеиновая кислота) (22-25 нуклеотидов), способные распознавать информационные РНК и, таким образом, негативно регулировать экспрессию белка в РНК-индуцируемых комплексах выключения гена (RISCs, RNA-induced silencing complexes), благодаря частичной или полной комплементарности с целевыми мРНК. Большинство микроРНК транскрибируются РНК полимеразой II с отдельных генов или, как некоторые из них, с полицистронных транскриптов одновременно. Изначально они образуются в форме более длинных премикроРНК, которые процессируются в ядре рибонуклеазой III, транспортируются в цитоплазму посредством экспортина 5 и Ran (RAs-related Nuclear protein, RAs-связанные ядерные белки)-ГТФ (гуанозинтрифосфат)-зависимых механизмов и окончательно процессируются другой рибонуклеазой III до зрелой формы в цитоплазме.

Их функция имеет важное значение в большом количестве процессов, включая эмбриональное развитие, ответ на стресс или точную регуляцию физиологических процессов и, таким образом, сохранение гомеостаза тела.

Совсем недавно было показано, что микроРНК являются ключевыми регуляторами в быстром и точном клеточном ответе на любой тип стимулов, включая недостаток питания или гипоксию (Ivan M, Harris AL, Martelli F, Kulshreshtha R. Hypoxia response and microRNAs: no longer two separate worlds. J Cell Mol Med.; 12(5A): 1426-31, 2008).

Заявка на патент WO 2011012074 описывает ряд микроРНК, включая среди прочего miR-29a, в качестве плазматических маркеров рака печени, а также способ диагностики и оценки рака печени на основе детектирования по меньшей мере одной из указанных микроРНК.

Заявка на патент WO 2009036236 относится к ряду микроРНК, включая среди прочего miR-146a, в качестве плазматических маркеров рака печени, а также способ диагностики и/или оценки различных онкологических патологий на основе детектирования по меньшей мере одной из описанных микроРНК.

Akkina, S. et al., "MicroRNAs in renal function and disease", Translational Research, 2011 Apr, Vol. 157, No. 4, pg. 236-240 and Li, J.Y. et al., "Review: The role of microRNAs in renal disease", NEPHROLOGY (CARLTON), Sep 2010, Vol. 15, No. 6, p. 599-608, описывают участие микроРНК в физиологии и патологии почек.

JUAN, D. et al., "Identification of a microRNA panel for clear-cell renal cancer", UROLOGY, 2010 Apr, Vol. 75, No. 4, pages 835-41, описывает ряд микроРНК в качестве маркеров рака почки.

Острая почечная недостаточность (ΟΠΗ) представляет собой синдром, который характеризуется резким снижением гламерулярного фильтрата в течение нескольких дней или недель, и клинически выражается как неспособность выводить азотсодержащие продукты жизнедеятельности и регулировать гомеостаз жидкости и электролитов.

ΟΠΗ является одной из наиболее серьезных проблем среди заболеваний почек в развитом мире, так как является причиной высокой смертности около 50%. Около 30% случаев ΟΠΗ происходят у пациентов, поступивших в ОРИТ в результате полиорганной недостаточности. В последнем случае смертность возрастает до 80%.

Развитие ΟΠΗ также является одним из наиболее распространенных осложнений после оперативных вмешательств при сердечных заболеваниях, в количестве до 30000 в год в Испании, и более 1% указанных оперативных вмешательств проводят в данной больнице. Практически у всех пациентов, которые подвергаются оперативным вмешательствам, развивается определенная степень ΟΠΗ. Долгосрочное прогрессирование пациентов зависит от степени тяжести данной послеоперационной ΟΠΗ, в результате чего смертность близка к 60% в случаях, когда требуется диализ после оперативного вмешательства при сердечных заболеваниях (Candela-Toha А, Elias-Martin Ε, Abraira V et al. Predicting Acute Renal Failure after Cardiac Surgery: External Validation of Two New Clinical Scores. Clin J Am Soc Nephrol; 3:1260-1265, 2008). Кардиохирургия и трансплантация почек являются двумя «квази» экспериментальными ситуациями для изучения ΟΠΗ у человека с момента и во время регистрации ишемических стимулов и также может быть контролируемой. Вся данная статистика смертельных исходов заболевания значительно не изменилась за последние десятилетия, и до сих пор не существует эффективной терапии для предотвращения и/или лечения ΟΠΗ во всех данных ситуациях. В значительной степени это связано с отсутствием точных маркеров повреждения почек, помимо определения креатинина и мочевины в сыворотке крови, которые применяют до сих пор. Эти общепринятые маркеры не отражают напрямую повреждение клеток, а также участок ткани почки (канальцы или эндотелий), в котором произошло указанное повреждение, они являются лишь параметрами, указывающими на нарушенную функцию почек в результате повреждения (Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, et al., Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Renal Injury in Humans. Clin Transl Sci.; 1(3): 200-208, 2008). Фактически, возможно, чтобы пациенты с субклиническим повреждением почек не определены как таковые, по причине отсутствия существенного изменения уровней креатинина и мочевины в сыворотке крови. Таким образом, за последние годы осуществлялись различные исследования для определения и подтверждения эффективности новых маркеров ΟΠΗ, таких как NGAL (Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, нейтрофильный желатиназо-ассоциированный липокалин), IL18, KIM (Kidney Injury Molecule 1, молекула повреждения почек), Цистатин С, VEGF (Vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов) или CXCL10 (chemokine (С-Х-С motif), хемокин подсемейства С-Х-С), которые, по-видимому, работают как хорошие маркеры для популяции детей без значимых дополнительных патологий, но не для популяции взрослых пациентов (Vaidya VS, Waikar SS, Ferguson MA, et al., Urinary Biomarkers for Sensitive and Specific Detection of Acute Renal Injury in Humans. Clin Transl Sci. 1(3): 200-208, 2008).

Все описанное выше обосновывает необходимость выявления и определения эффективности новых биомаркеров прогрессирования повреждения почек, которые указывают на участок ткани, в котором происходит повреждение, а также на степень повреждения и/или восстановления, определение которых также является быстрым, простым и не требует проведения биопсии у пациента, которому они необходимы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу для получения данных, которые возможно применять для диагностики и/или прогноза острого повреждения почек, который включает определение уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93, miR-10a, в образце, полученном от субъекта.

В настоящем изобретении острое повреждение почек понимается как любое повреждение, вызванное острым снижением функции почек в течение часов или дней, как, например, уменьшение гломерулярного фильтрата, или накопление в сыворотке крови азотсодержащих продуктов, или неспособность регулировать гомеостаз.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики и/или прогноза острого повреждения почек (здесь и далее способ согласно настоящему изобретению), который включает определение по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, miR-93, miR-10a, в образце, полученном от субъекта, и сравнение указанного уровня экспрессии с контрольным значением, где изменение указанного уровня экспрессии является показателем острого повреждения почек.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения образец для анализа выбирают из крови, сыворотки крови или мочи.

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения снижение экспрессионного уровня miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 и/или miR-10a в сыворотке крови по отношению к контрольному уровню является показателем острого повреждения почек.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессию одной или нескольких микроРНК определяют с помощью количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессию микроРНК определяют с помощью микрочипов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления, способ согласно настоящему изобретению включает определение уровней экспрессии miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 и miR-10a одновременно. В другом более предпочтительном варианте осуществления изобретения, снижение уровня экспрессии по меньшей мере одной из микроРНК является показателем острого повреждения почек.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 и miR-10a для диагностики и прогнозирования острого повреждения почек.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 и miR-10a одновременно для диагностики и прогнозирования острого повреждения почек.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к набору реагентов для диагностики и/или прогнозирования острого повреждения почек (здесь и далее набор реагентов согласно настоящему изобретению) согласно способу согласно настоящему изобретению, включающему зонды и праймеры, необходимые для определения уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-26b, miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, mi-R93 и miR-10a.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к применению набора реагентов согласно настоящему изобретению для диагностики и/или прогнозирования острого повреждения почек.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 показывает экспрессию miR-26b в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

Фиг. 2 показывает экспрессию miR-29a в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

Фиг. 3 показывает экспрессию miR-454 в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

Фиг. 4 показывает экспрессию miR-146 в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

Фиг. 5 показывает экспрессию miR-27a в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

Фиг. 6 показывает экспрессию miR-93 в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

Фиг. 7 показывает экспрессию miR-10а в сыворотке крови у пациентов с ΟΠΗ с ишемической этиологией (ПИ) и токсической этиологией (ПТ) со времени постановки диагноза (Д0) до 7 дней после постановки диагноза по сравнению с экспрессией микроРНК у двух групп здоровых индивидуумов (здоровые), а) значение цикла амплификации, на котором экспрессию микроРНК детектировали во всех образцах (пересечение пороговой линии, СТ) по сравнению с синтетической микроРНК, применяемой в качестве внутреннего контроля методики, б) относительное значение экспрессии микроРНК у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми индивидуумами, которые приравнивают к 1 посредством экспоненциальной математической формулы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эксперимент для крупномасштабного исследования микроРНК изначально проводили с использованием РНК, полученной от пациентов с острым повреждением почек с различной этиологией. Образцы, применяемые для данного способа, включали:

- Два образца от пациентов с острым повреждением почек с ишемической этиологией во время максимального повреждения почек, определенного с помощью обычных клинических диагностических параметров, таких как креатинин в сыворотке крови.

- Два образца от данных пациентов через 7 или 10 дней после почечной недостаточности, когда функция органа восстановлена, также оценивали с помощью креатинина в сыворотке крови.

- Два образца от пациента с почечной недостаточностью, вызванной нефротоксическими веществами, один во время максимального повреждения, а другой - когда функция почек восстановлена.

- Образец от пациента с почечной недостаточностью, вызванной сепсисом, собранный во время максимального повреждения органа.

- Две группы, состоящие из 5 здоровых человек, которые применяли в качестве контроля.

Эксперимент для крупномасштабного исследования микроРНК в сыворотке крови осуществляли с помощью количественной ПЦР, применяя прибор Taqman Low Density Array (TLDAs) фирмы Applied Biosystems. При анализе полученных данных, отбирали интересующие микроРНК для исследования.

Данные по экспрессии отобранных микроРНК, полученные в предыдущем эксперименте, впоследствии были подтверждены. В этой связи применяли образцы от пациентов, отличных от тех, которые были перечислены выше, и они состоят из:

- Четыре пациента с острой почечной недостаточностью с ишемической этиологией, обозначенные как ПИ1, ПИ2, ПИ3, ПИ4. От каждого пациента применяли образцы, полученные от каждого пациента в день 0, время постановки диагноза, в 1, 3, 5 и 7 дни после постановки диагноза почечная недостаточность.

- Три пациента с острой почечной недостаточностью, вызванной нефротоксическими веществами, обозначенные как ПТ1, ПТ2, ПТ3. От каждого пациента применяли образцы, полученные в день 0, время постановки диагноза, в 1, 3, 5 и 7 дни после постановки диагноза почечная недостаточность.

- Две контрольные группы, каждая из которых состоит из 10 здоровых людей.

Для подтверждения данных осуществляли количественную ПЦР с применением индивидуальных зондов технологии LNA (Exiqon) для каждой микроРНК.

Как показано на Фиг. 1-4, экспрессия микроРНК в сыворотке крови снижается у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровыми контролями.

Фиг. 5 показывает, что экспрессия микроРНК miR-27a снижается у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровым контролем. Важно отметить, что экспрессия miR-27a в течение 7 дней была наиболее вариабельной среди пациентов, и некоторые из них имели тенденцию к восстановлению значений экспрессии до уровня здоровых индивидуумов.

Экспрессия miR-93 (Фиг. 6) снижается у пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровым контролем, и также следует отметить, что у некоторых пациентов в день 7 данная микроРНК демонстрирует тенденцию к восстановлению значений, близких к контролю.

Экспрессия miR-10а (Фиг. 7) снижается у некоторых пациентов с ΟΠΗ по сравнению со здоровым контролем, данная тенденция не наблюдалась у пациента с ишемией, и очень важно отметить, что на 7 день уровни экспрессии микроРНК восстановились у некоторых пациентов.

Помимо этого, для экспрессии микроРНК у различных пациентов были посчитаны значения площади под кривой с помощью анализа характеристической кривой (ROC-характеристики).

Таблица 1 показывает, что данные микроРНК имеют диагностическую ценность для ΟΠΗ, независимо от этиологии ΟΠΗ, их чувствительность и специфичность намного превышает данные показатели определения креатинина в сыворотке крови (маркер, который применяют в настоящее время).

Таблица 1: Анализ характеристической кривой для микроРНК у пациентов в ОРИТ (Отделение реанимации и интенсивной терапии) в день 0.

Данные таблицы 2 показывают, что данные микроРНК являлись более чувствительными и специфичными, чем креатинин, свидетельствуя, что несмотря на нормальные значения креатинина, почечная недостаточность сохраняется, таким образом, данные микроРНК имеют высокую прогностическую ценность в отношении прогрессирования данных пациентов в течение долгого времени в долгосрочную хроническую почечную недостаточность.

Таблица 2: Анализ характеристической кривой для микроРНК у пациентов в ОРИТ в день 7.

Данные таблицы 3 показывают, что изменение данных микроРНК указывает на предрасположенность к развитию ишемической ΟΠΗ после кардиохирургического вмешательства.

Таблица 3: Анализ характеристической кривой для микроРНК у пациентов после кардиохирургического вмешательства.

Данные таблицы 4 показывают, что изменение данных микроРНК являются ранними индикаторами развития ΟΠΗ после кардиохирургического вмешательства.

Таблица 4: Анализ характеристической кривой для микроРНК у пациентов сразу после кардиохирургического вмешательства.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек, включающий определение уровня экспрессии по меньшей мере miR-26b и сравнение указанного уровня экспрессии с контрольным значением, где снижение экспрессии является показателем острого повреждения почек или предрасположенности к развитию острого повреждения почек. Предложено применение in vitro набора реагентов и по меньшей мере miR-26b для диагностики и/или определения предрасположенности к развитию острого повреждения почек ишемической или токсической этиологии. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы диагностики и/или определения предрасположенности к развитию острого повреждения почек. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

1. Способ диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек, который включает определение уровня экспрессии по меньшей мере miR-26b в образце сыворотки крови или крови, собранной у пациента, и сравнение указанного уровня экспрессии с контрольным значением, где снижение указанного уровня экспрессии является показателем острого повреждения почек или предрасположенности к развитию острого повреждения почек.

2. Способ по п. 1, диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек ишемической или токсической этиологии.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где экспрессию микроРНК определяют с помощью количественной ПЦР.

4. Способ по любому из пп. 1 или 2, где уровень экспрессии микроРНК определяют с помощью РНК-микрочипов.

5. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что дополнительно включает определение уровней экспрессии miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, miR-93 и miR-10a одновременно.

6. Способ по п. 5, где снижение уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК является показателем острого повреждения почек.

7. Применение in vitro по меньшей мере miR-26b для диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек ишемической или токсической этиологии в образце сыворотки крови или крови, собранной у пациента.

8. Применение in vitro по п. 7, дополнительно включающее определение уровня экспрессии miR-29a, miR-454, miR-146a, miR-27a, miR-93 и miR-10a одновременно.

9. Применение in vitro набора реагентов для диагностики и/или определения у субъекта предрасположенности к развитию острого повреждения почек ишемической или токсической этиологии согласно способу по любому из пп. 1-6, включающего зонды и праймеры, необходимые для определения уровня экспрессии по меньшей мере miR-26b.