БИОАКТИВНЫЙ ГИДРОГЕЛЬ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/17 

Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека и может быть использовано в медицине, ветеринарии и косметологии для регенерации кожи.

Известен [1] химически сшитый гель желатина, получаемый путем облучения (желатина) электронами в атмосфере кислорода, имеющий послойную структуру и предназначенный для культивирования клеток и контролируемого высвобождения биоактивного фактора. Недостатком [1] является трудоемкость и небезопасность способа получения геля, реализуемого, например, с применением ионизирующего излучения. Недостаток существенно ограничивает область применения [1].

Известен [2] гель желатина, получаемый с использованием фермента трансглутаминазы в качестве дополнительного сшивающего фактора и характеризующийся повышенной прочностью и термической стабильностью. Недостатком [2] является трудоемкость способа получения геля, реализуемого, например, с применением нестабильного и дорогостоящего ферментного препарата. Недостаток существенно ограничивает область применения [2].

Известна [3] рекомендованная к применению в медицине гемостатическая губка на основе желатина, получаемая посредством вспенивания и отвердевания раствора желатина и содержащая биологически активный(ые) компонент(ы) - антимикробный агент, хлорид кальция, метилурацил - в качестве гемостатического, антисептического и ранозаживляющего средства. Недостатком [3] является необходимость использования высокотоксичных для клеток соединений (формальдегид, поверхностно-активное вещество сульфонол). Недостаток существенно ограничивает область применения [3].

Наиболее близкими к заявляемому изобретению, прототипом, являются [4] химически сшитые гидрогелевые матриксы, состоящие из коллагена, денатурированного коллагена (желатина) и их смесей в концентрации 0,5-30,0 мас. %, одного и более сшивающих агентов в концентрации 0,1-2,0 мас. %, а также дополнительных компонентов из числа полимеров, пластификаторов и низкомолекулярных биологически активных веществ (далее по тексту - БАВ).

Существенным недостатком прототипа [4] является необходимость применения высоких концентраций сшивающего агента (средняя концентрация в исходной композиции 1,05 мас. %), что повышает токсичность и понижает биосовместимость гидрогелевого матрикса. Для устранения остаточных реагентов требуется промывка гидрогеля (прототипа). Пониженная биосовместимость матрикса при использовании в медицинской практике приводит к побочным клиническим проявлениям: индуцированию клеточного или тканевого отторжения материала, понижению его (материала) регенерирующей активности.

В прототипе [4] отсутствует указание на тип и особенности используемого желатина, что существенно затрудняет промышленное производство химически сшитых гидрогелей на его (желатина) основе для применения в медицинской практике. Исходя из этого, прототип [4] не содержит каких-либо технических решений, связанных с физико-химическими свойствами желатина. Выбор типа желатина, его свойств является существенным и необходимым фактором для применения заявленного технического решения в медицине, ветеринарии и косметологии.

В формуле изобретения прототипа [4] указано применение глутарового альдегида. В прототипе [4] в качестве одного из недостатков предшествующего уровня техники приводится остаточная токсичность глутарового альдегида, используемого для химической сшивки желатина и коллагена. Однако в поясняющих материалах [4] не обоснована применимость глутарового альдегида и иных сходных по механизму действия бифункциональных сшивающих агентов, а сами белковые матриксы, согласно приведенным в прототипе [4] примерам, получают посредством сшивки коллагена (желатина) с помощью смеси водорастворимого карбодиимида и N-гидроксисукцинимида, имеющих иной механизм действия по сравнению с альдегидами.

Таким образом, для применения химически сшитых гидрогелей на основе желатина в медицине, ветеринарии и косметологии существенными факторами являются:

- тип используемого в качестве сырья желатина, определяющего специфические для применения в медицине свойства;

- тип сшивающего агента и его безопасность для живых клеток организма.

Прототип [4] не раскрывает существенное и неочевидное специалистам в данной области техническое решение в соответствии с заявленным изобретением.

Совокупность недостатков существенно ограничивает область применения прототипа [4].

Заявленное техническое решение поясняется следующими материалами.

На Фиг. 1 (3 фото) показаны образцы биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б: фото 1-1 - биоактивный гидрогель, полученный при температуре полимеризации выше 0°С; фото 1-2 - биоактивный гидрогель, полученный при температуре полимеризации выше 0°С, содержащий пектин и цинк; фото 1-3 - биоактивный гидрогель, полученный при температуре полимеризации ниже 0°С. Фиг. 2 демонстрирует внешний вид биоактивного гидрогеля, получаемого при температуре полимеризации выше и ниже 0°С.

Фиг. 1 фото 1-1 иллюстрирует ПРИМЕР ВТОРОЙ (п. 2.1). Фиг. 1 фото 1-3 иллюстрирует ПРИМЕР ВТОРОЙ (п. 2.2) и ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ. Фиг. 1 фото 1-2 иллюстрирует ПРИМЕР ПЯТЫЙ.

На Фиг. 2 показан индекс набухания биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б, полученного при сшивке 20 мас. % желатина глутаровым диальдегидом (ГДА) в концентрации 0,2; 0,125; 0,1; 0,075; 0,05 мас. %. Фиг. 2 демонстрирует гидратационные свойства биоактивного гидрогеля, отражающие способность удерживать водные растворы, впитывать раневой экссудат и создавать влажное микроокружение в ране. Фиг. 2 иллюстрирует ПРИМЕР ТРЕТИЙ.

На Фиг. 3 показана трехмерная фотография биоактивного гидрогеля по данным лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, где светлые участки соответствуют стенкам гидрогеля, темные участки - порам в гидрогеле. Фиг. 3 демонстрирует, что биоактивный гидрогель имеет пористую структуру с открытыми порами со средним размером пор приблизительно от 40 до 200 микрометров. Фиг. 3 иллюстрирует ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ (п. 4.1).

На Фиг. 4 (3 фото) представлены фотографии окрашенных гематоксилином-эозином срезов (толщина среза = 7 мкм, увеличение объектива ×40) регенерирующей кожи крысы после травмы при действии биоактивного гидрогеля (стрелками указано наличие и расположение зернистых клеток с кератогиалиновыми гранулами): фото 4-1 - через 72 часа; фото 4-2 - через 168 часов; фото 4-3 - интактная (неповрежденная) кожа. Фиг. 4 (3 фото) демонстрирует стимулирующее действие заявленного гидрогеля на регенерацию эпителиальной ткани кожи. Фиг. 4 иллюстрирует ПРИМЕР ШЕСТОЙ.

На Фиг. 5 (4 фото) представлены фотографии окрашенных по Ван-Гизону срезов (толщина среза = 7 мкм, увеличение объектива ×40) регенерирующей кожи крысы после травмы при действии биоактивного гидрогеля: фото 5-1 - через 72 часа; фото 5-2 - через 168 часов; фото 5-3 - сосочковый и верх сетчатого слоя интактной (неповрежденной) кожи; фото 5-4 - глубокие слои сетчатого слоя интактной (неповрежденной) кожи. Фиг. 5 (4 фото) демонстрирует стимулирующее действие заявленного гидрогеля на регенерацию соединительной ткани кожи и синтетическую активность фибробластов кожи по сравнению с прототипом. Фиг. 5 иллюстрирует ПРИМЕР СЕДЬМОЙ.

В Таблице 1 показаны характеристики желатина типа А и желатина типа Б и необходимые для получения устойчивого биоактивного гидрогеля концентрации (мас. %) глутарового диальдегида и желатинов при температуре выше 0°С и ниже 0°С. Таблица 1 демонстрирует, что сшивка желатина типа Б при температуре ниже 0°С требует значительно меньших концентраций вышеуказанных компонентов. Таблица 1 иллюстрирует ПРИМЕРЫ ПЕРВЫЙ, ВТОРОЙ, ЧЕТВЕРТЫЙ.

В Таблице 2 показаны концентрации металлов (мкг/л) в химически растворенных образцах биоактивного гидрогеля, полученного с добавлением в раствор желатина различных соединений металлов и пектина. Таблица 2 демонстрирует введение активных металлов в состав заявленного гидрогеля. Таблица 2 иллюстрирует ПРИМЕР ПЯТЫЙ.

В Таблице 3 показан клеточный состав (в процентах от общего количества клеток в поле зрения; среднее арифметическое ± доверительный интервал) регенерирующей дермы кожи крыс через 72 часа (верхнее значение) и 168 часов (нижнее значение) после травмы. Таблица 3 демонстрирует отсутствие выраженной воспалительной реакции, интенсивное удаление некротизированных тканей и существенное ускорение заживления кожи после травмы. Таблица 3 иллюстрирует ПРИМЕР СЕДЬМОЙ.

Целью предполагаемого изобретения является разработка биоактивного гидрогеля для регенерации кожи на основе желатина типа Б, характеризующегося пониженным содержанием и расходом сшивающего агента и желатина, пониженной остаточной токсичностью сшивающего агента, повышенной биосовместимостью, повышенной регенеративной активностью.

Цель достигают получением биоактивного гидрогеля на основе желатина для регенерации кожи. Сущностью является биоактивный гидрогель для регенерации кожи на основе желатина и бифункционального сшивающего агента, характеризующийся тем, что для получения гидрогеля используют желатин типа Б, выделяемый методом щелочной обработки и имеющий изоэлектрическую точку в кислой области рН, и формируют гидрогель посредством химической сшивки желатина с бифункциональным сшивающим агентом, в качестве которого используют глутаровый диальдегид при содержании 0,05 мас. %. Биоактивный гидрогель дополнительно содержит анионный полимер и бивалентный металл в конечной концентрации не более 50 мМ.

Для получения биоактивного гидрогеля используют желатин типа Б из коллагена, выделяемый щелочной обработкой и имеющий изоэлектрическую точку (далее по тексту - ИЭТ) в кислой области рН, а химическую сшивку желатина выполняют бифункциональным сшивающим агентом в концентрации, не превышающей 0,5 мас. % в исходном растворе и 2,5 мас. % от массы желатина.

Заявленное изобретение поясняется нижеприведенными примерами. В примерах приведены отсылки на иллюстрирующие материалы (Фигуры, Таблицы).

ПРИМЕР ПЕРВЫЙ, показывающий отличительные характеристики используемых для получения гидрогеля из желатинов типа А и типа Б.

В Таблице 1 показаны характеристики желатина типа А и желатина типа Б и необходимые для получения устойчивого биоактивного гидрогеля концентрации (мас. %) глутарового диальдегида и желатинов при температуре выше 0°С и ниже 0°С. Таблица 1 иллюстрирует ПРИМЕР ПЕРВЫЙ, а также ПРИМЕРЫ ВТОРОЙ, ЧЕТВЕРТЫЙ (см. ПРИМЕРЫ ВТОРОЙ, ЧЕТВЕРТЫЙ).

Используют желатин типа А из коллагена, например пищевой желатин, выделяемый из кожи крупного рогатого скота методом кислотной обработки производства ОАО «Можелит» (Республика Беларусь). Желатины типа А имеют ИЭТ в щелочной области рН (выше 7,0) вследствие повышенного содержания катионных аминокислот, несущих положительно заряженные группы (Таблица 1).

Используют желатин типа Б из коллагена, например - из кожи крупного рогатого скота производства компании Sigma-Aldrich (США), выделяемый методом щелочной обработки. Желатины типа Б имеют ИЭТ в кислой области рН (ниже 7,0) вследствие повышенного содержания анионных аминокислот, несущих отрицательно заряженные группы (Таблица 1).

Экспериментально показано, что желатины типа Б из коллагена, отличающиеся методом выделения (щелочной метод) и, вследствие этого, имеющие анионную природу и значения ИЭТ при рН ниже 7,0, обладают существенным преимуществом перед желатинами типа А. Преимущество проявляется в уменьшении концентрации сшивающего агента, необходимой для получения устойчивого в физиологических условиях биоактивного гидрогеля, и, как следствие, в сохранении нативной структуры и биологических свойств желатина (см. также ПРИМЕРЫ ВТОРОЙ, ТРЕТИЙ И ЧЕТВЕРТЫЙ). Следствием уменьшения концентрации сшивающего агента является повышение биосовместимости и биологической активности заявленного гидрогеля.

Для изготовления заявленного гидрогеля могут быть использованы различные желатины, относящиеся к типу Б и выделяемые щелочным методом из содержащих коллаген тканей различных видов млекопитающих.

ПРИМЕР ВТОРОЙ, описывающий условия получения биоактивного гидрогеля посредством его сшивки бифункциональным агентом при нагревании.

На Фиг. 1 показаны образцы биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б: фото 1-1 - биоактивный гидрогель, полученный при температуре полимеризации выше 0°С; фото 1-2 - биоактивный гидрогель, полученный при температуре полимеризации выше 0°С, содержащий пектин и цинк; фото 1-3 - биоактивный гидрогель, полученный при температуре полимеризации ниже 0°С. Фиг. 1 фото 1-1 иллюстрирует ПРИМЕР ВТОРОЙ (п. 2.1). Фиг. 1 фото 1-3 иллюстрирует ПРИМЕР ВТОРОЙ (п. 2.2) и ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ (см. ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ). Фиг. 1 фото 1-2 иллюстрирует ПРИМЕР ПЯТЫЙ.

2.1 Растворяют желатин типа Б в водном буферном растворе в концентрации, не превышающей 25 мас. %, и подвергают автоклавированию для растворения и стерилизации. Из приготовленного раствора желатина типа Б формируют заявленный гидрогель посредством химической сшивки молекул желатина бифункциональным сшивающим агентом, например глутаровым диальдегидом (далее по тексту - ГДА), реагирующим с доступными аминосодержащими группами в аминокислотных остатках желатина.

Химически сшитый гидрогель желатина получают следующим образом. Смешивают раствор желатина с раствором ГДА (25 мас. %, Acros Organics, США) до конечных концентраций 1-25 мас. % (по желатину) и 0,025-1,000 мас. (по ГДА, Таблица 1).

Перемешанный раствор выливают в плоскую посуду, например чашку Петри диаметром 10 см. Реакцию полимеризации проводят, например - при температуре плюс 50°С в течение 2 часов. По завершении полимеризации получают применяемый для регенерации тканей заявленный гидрогель (Фиг. 1, фото 1-1).

При проведении реакции полимеризации раствора желатина типа Б при температуре ниже температуры замерзания растворителя (в случае воды - ниже нуля градусов Цельсия) получают применяемый для регенерации кожи биоактивный гидрогель, представленный на Фиг. 1, фото 1-3, см. ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ.

2.2 При равных условиях (ПРИМЕР ВТОРОЙ, п. 2.1) из раствора желатина типа А, в отличие от растворов желатина типа Б, биоактивный гидрогель не формируется; формирование биоактивного гидрогеля из желатина типа А возможно лишь при более чем десятикратном повышении концентрации ГДА (Таблица 1). Это приводит к существенному понижению биосовместимости гидрогеля на основе желатина типа А и ограничивает область его (гидрогеля) применения. Исходя из свойств, для применения в медицине, ветеринарии и косметологии оптимальным является применение в качестве сырья желатина типа Б.

Преимуществом применения желатина типа Б является существенное понижение необходимой и достаточной для получения устойчивого в физиологических условиях биоактивного гидрогеля концентрации ГДА (Таблица 1), что обеспечивает сохранение биосовместимости и биологической активности гидрогеля на основе желатина типа Б и расширяет область его (гидрогеля) применения.

ПРИМЕР ТРЕТИЙ, показывающий гидратационные свойства биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б.

Существенной характеристикой применяемых в медицине гидрогелей является индекс набухания.

Оценивают индекс набухания биоактивного гидрогеля в водных растворах следующим образом. Помещают образец полученного по ПРИМЕРУ ВТОРОМУ гидрогеля размером 2×2 см и толщиной 0,2 см в деионизованную воду и оставляют на 24 часа при температуре плюс 37°С. Удаляют избыток воды фильтровальной бумагой и взвешиванием определяют массу гидратированного образца (m_гидр.). Высушивают гидратированный образец в термостате при температуре +90°С и определяют массу сухого остатка (m_сух.). Рассчитывают индекс набухания по формуле: (m_гидр./m_сух.)×100%. Проводят измерения в трех повторностях.

На Фиг. 2 показан индекс набухания биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б, полученного при сшивке 20 мас. % желатина глутаровым диальдегидом (ГДА) в концентрации 0,2, 0,125, 0,1, 0,075, 0,05 мас. %. Результаты опыта показывают, что заявленный гидрогель на основе желатина типа Б имеет индекс набухания в диапазоне 1000-2000%, то есть содержание воды в гидратированном гидрогеле составляет в среднем от 90 до 95% от его (гидрогеля) массы (Фиг. 2). Степень гидратации повышается с уменьшением концентрации сшивающего агента и, следовательно, уменьшением количества сшивок в геле (Фиг. 2). Однако это не сопровождается понижением устойчивости биоактивного гидрогеля в физиологических условиях.

В клинической практике при повреждении кожи часто наблюдаются: высыхание раны с образованием струпа (поверхностной корки), замедляющего эпителизацию; при избыточной влажности - гибель эпителиальных клеток. В связи с этим, указанный диапазон значений (1000-2000%) индекса набухания биоактивного гидрогеля является одной из преимущественных характеристик заявленного гидрогеля, отражающей способность удерживать оптимальные для заживления ран количества воды, впитывать раневой экссудат и поддерживать рану в оптимальном для регенерации тканей умеренно влажном состоянии.

ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ, описывающий условия получения биоактивного гидрогеля из желатинов типов Б и А посредством их сшивки бифункциональным агентом при температуре ниже 0°С.

4.1 Модификацией биоактивною гидрогеля является гидрогель, получаемый путем проведения полимеризации желатина в условиях замораживания раствора. В отличие от прототипа [4], в заявленном изобретении химическую сшивку желатина проводят при разных температурах, например - при температуре ниже 0°С.

Из приготовленного раствора желатина типа Б формируют биоактивный гидрогель путем химической сшивки глутаровым диальдегидом. Биоактивный гидрогель получают способом, указанном в ПРИМЕРЕ ВТОРОМ, но реакцию полимеризации проводят при замораживании, например - при температуре минус 12°С. В случае криополимеризации после завершения реакции гидрогель размораживают и ополаскивают фосфатно-солевым буфером (далее по тексту - ФСБ).

На Фиг. 1 фото 1-3 показан образец биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б, полученный при температуре полимеризации ниже 0°С.

Анализируют структуру биоактивного гидрогеля методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на микроскопе LSM 780 (Carl Zeiss, Германия).

На Фиг. 3 показана трехмерная фотография биоактивного гидрогеля по данным лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, где светлые участки соответствуют стенкам гидрогеля, темные участки - порам в гидрогеле. Фиг. 3 иллюстрирует ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ (п. 4.1).

Анализ показывает, что полученный способом полимеризации биоактивный гидрогель на основе желатина типа Б имеет пористую структуру с размером пор в диапазоне от 40 до 200 мкм (Фиг. 3). Наличие пор является важной отличительной от прототипа [4] и существенной для медицины характеристикой биоактивного гидрогеля, которая способствует диффузии питательных веществ и росту клеток в его (биоактивном гидрогеле) объеме.

4.2. В отличие от раствора желатина типа Б, при равных условиях (ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ, п. 4.1) из растворов желатина типа А биоактивный гидрогель с порами не формируется; формирование биоактивного гидрогеля из растворов желатина типа А возможно лишь при более чем десятикратном повышении концентрации ГДА (Таблица 1). Повышенная же концентрация ГДА приводит к существенному понижению биосовместимости гидрогеля на основе желатина типа А, что ограничивает область его (гидрогеля на основе желатина типа А) применения.

ПРИМЕРЫ ВТОРОЙ, ТРЕТИЙ И ЧЕТВЕРТЫЙ показывают сущность предлагаемого способа получения биоактивного гидрогеля, основанного на сшивке желатина типа Б бифункциональным агентом в пониженной концентрации при температуре выше°С и ниже 0°С, имеющего существенные преимущества перед прототипом [4]: уменьшение степени химической модификации желатина, уменьшение остаточной токсичности сшивающего агента, снижение нормы расхода сшивающего агента. Эти особенности повышают биосовместимость заявленного биоактивного гидрогеля. Отсутствие необходимости промывки гидрогеля от остаточных реагентов повышает технологичность промышленного применения по сравнению с прототипом [4]. Получение биоактивного гидрогеля из желатина типа Б также позволяет снизить расход желатина. Преимущества заявленного биоактивного гидрогеля, по сравнению с прототипом [4], позволяют повысить эффективность его (гидрогеля) использования в медицине, ветеринарии, например - для ускорения посттравматической регенерации тканей при лечении ран.

ПРИМЕР ПЯТЫЙ, показывающий способ получения биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б, содержащего пектин и бивалентный металл.

Получают биоактивный гидрогель на основе желатина типа Б, содержащего пектин и бивалентный металл, путем добавления в полученный по ПРИМЕРУ ЧЕТВЕРТОМУ в раствор желатина типа Б биосовместимого отрицательно заряженного полимера, например - содержащего остатки галактуроновой кислоты пищевого пектина, и образующею дополнительные ионные сшивки между карбоксильными группами полимеров бивалентною металла, например - соли цинка. Добавляют к раствору желатина пищевой цитрусовый пектин (Е440) в количестве не более 10% массы желатина и сульфат цинка в конечной концентрации не более 50 мМ. Перемешанный раствор выливают в плоскую посуду, например - чашку Петри диаметром 10 см. Проводят химическую полимеризацию желатина с помощью ГДА, как описано в ПРИМЕРЕ ЧЕТВЕРТОМ, п. 4.1.

По завершении полимеризации получают применяемый для регенерации кожи заявленный гидрогель. На Фиг. 1, фото 1-2 показан образец биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б, полученный при температуре полимеризации выше 0°С, содержащий пектин и цинк.

Контролируют содержание металла в биоактивном гидрогеле методом спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на анализаторе Optima 2000 DV (Perkin Elmer, США). Для этого промывают синтезированный биоактивный гидрогель деионизированной водой, лиофильно-высушивают на сушке FreeZone 2.5 Plus (Labconco, США), взвешивают сухой остаток и переводят его в растворимую форму в растворе 2% деионизованной азотной кислоты.

В Таблице 2 показаны концентрации металлов (мкг/л) в химически растворенных образцах биоактивного гидрогеля, полученного с добавлением в раствор желатина различных соединений металлов и пектина. Таблица 2 демонстрирует введение активных металлов в состав заявленного гидрогеля. Образование дополнительных ионных сшивок и введение бивалентного металла приводит к расширению области применения гидрогеля, например, для ускоренного восстановления эпителиальной и соединительной тканей кожи - при введении цинка [5].

ПРИМЕР ШЕСТОЙ, показывающий стимулирующее действие биоактивного гидрогеля на регенерацию тканей, например - эпителия кожи.

Демонстрируют стимулирующее действие биоактивного гидрогеля на регенерацию тканей, например, на эксцизионной модели раневого дефекта кожи. Используют лабораторных животных, например 30 крыс-самцов линии Wistar массой 300±30 г (ООО «Питомник» Российской Академии медико-технических наук, РФ).

Проводят предоперационную эндотрахеальную наркотизацию животных изофлураном (4%, 2 мин, 1 л/мин, Abbott Laboratories, США). Вырезают на спине участок кожи диаметром (далее по тексту - ∅) 12 мм. Ограничивают края раны резиновыми шинами (внутренний ∅=12 мм, внешний ∅=25 мм, толщина = 0,5 мм) и фиксируют (шины) скобами с помощью степлера для кожи Appose™ ULC 35W (Covidien, США) для предотвращения затягивания раны за счет естественного посттравматического закрывания краев [6]. На поверхность раны накладывают полученный в соответствии с ПРИМЕРОМ ЧЕТВЕРТЫМ (п. 4.1) биоактивный гидрогель ∅=12 мм.

Проводят прижизненную перфузию (500 мл, 4% срормалин на 1× ФСБ) и осуществляют забор тканевых образцов путем иссечения скальпелем участка раны с зоны травмы с захватом ткани, локализованной под шиной (3 мм от края раны). Фиксируют образцы в 4% формалине, приготовленном путем разведения в 1*ФСБ 37% формалина (производства ТатХимПром, РФ).

Проводят гистологические исследования на срезах толщиной 7 мкм, приготовленных по стандартной методике [7]. Для анализа морфологического строения и клеточного состава регенерировавшей кожи срезы окрашивают гематоксилин-эозином (производства ООО Biovitrum, РФ).

Проводят измерение толщины эпидермиса на срезах кожи под общим увеличением (объектива и окуляра) микроскопа 400* не менее чем в десяти полях зрения, например, с помощью программного пакета для Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Статистическую обработку результатов проводят с помощью электронных таблиц Excel. Определяют средние арифметические и их доверительные интервалы для уровня вероятности 95% [8].

На Фиг. 4 (3 фото) представлены фотографии окрашенных гематоксилином-эозином срезов (толщина среза = 7 мкм, увеличение объектива ×40) регенерирующей кожи крысы после травмы при действии биоактивного гидрогеля (стрелками указано наличие и расположение зернистых клеток с кератогиалиновыми гранулами): фото 4-1 - через 72 часа; фото 4-2 - через 168 часов; фото 4-3 - интактная (неповрежденная) кожа. Фиг. 4 (3 фото) демонстрирует стимулирующее действие заявленного гидрогеля на регенерацию эпителиальной ткани кожи.

В результате визуального (под микроскопом) анализа гистологических препаратов, приготовленных с образцов кожи в группе животных с применением биоактивного гидрогеля, через 72 часа четко выявляется базальная мембрана и пласты эпителиальных клеток (Фиг. 4, фото 4-1), в отличие от животных без использования биоактивного гидрогеля, у которых видимая базальная мембрана и эпителиальные клетки отсутствуют. Результаты измерения толщины эпидермиса в срезах кожи, проведенных через 168 часов после травмирования, показывают различия между значениями толщины эпидермиса в варианте с заявляемым гидрогелем (Фиг. 4, фото 4-2), по сравнению с толщиной эпидермиса у интактных (неповрежденных, без травмы, контрольных) животных (Фиг. 4, фото 4-3). При наложении на рану заявленного биоактивного гидрогеля эпидермис более чем в 2 раза толще в зависимости от степени отдаленности от края раны (Фиг. 4, фото 4-2), чем в интактной коже (Фиг. 4, фото 4-3).

При применении заявленного биоактивного гидрогеля в качестве регенерирующего материала выявлены значительное количество слоев эпителиальных клеток новообразованного эпидермиса и четко сформированный зернистый слой клеток с многочисленными внутриклеточными кератогиалиновыми гранулами (Фиг. 4, фото 4-1 и фото 4-2, зернистые клетки с кератогиалиновыми гранулами указаны стрелками) по сравнению с интактной (неповрежденной) кожей (Фиг. 4 фото 4-3) и прототипом (иллюстрирующие материалы по регенерации эпителия в прототипе не обнаружены). Положительные последствия применения биоактивного гидрогеля подтверждают стимулирующеее влияние заявленного гидрогеля на процессы миграции и дифференцировки эпителиальных клеток in vivo. Наличие факта формирования эпителия по сравнению с прототипом [4], является существенным преимуществом применения заявленного биоактивного гидрогеля для посттравматической регенерации, так как способствует активному формированию грануляционной ткани, защищает новообразованную грануляционную ткань от механического повреждения и вторичной инфекции, а пористая структура биоактивного гидрогеля обеспечивает адекватное для регенерации кондиционирование раны и влажность.

ПРИМЕР СЕДЬМОЙ, показывающий стимулирующее действие биоактивного гидрогеля на регенерацию тканей, например соединительной ткани (дермы) кожи.

Демонстрируют стимулирующее действие биоактивного гидрогеля на регенерацию тканей, например, на модели раневого дефекта кожи. Используют лабораторных животных, например - 30 крыс-самцов линии Wistar массой 300±30 г (ООО «Питомник» Российской Академии медико-технических наук, РФ). Выполняют действия по ПРИМЕРУ ШЕСТОМУ с использованием регенерирующей соединительной ткани (дермы) кожи в качестве объекта действия заявленного биоактивного гидрогеля.

Осуществляют качественный и количественный анализ клеточного состава регенерирующей дермы, например микроскопически на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином (ООО Biovitrum, РФ) [7], с помощью Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия). Производят подсчет клеток регенерирующей дермы под общим увеличением (объектива и окуляра) микроскопа 400× не менее чем в десяти полях зрения на трех случайным образом отобранных микропрепаратах, полученных из одного и того же участка раны у шести разных животных.

В Таблице 3 показан клеточный состав (в процентах от общего количества клеток в поле зрения; среднее арифметическое ± доверительный интервал) регенерирующей дермы кожи крыс через 72 часа (верхнее значение) и 168 часов (нижнее значение) после травмы. Результаты показывают, что при использовании биоактивного гидрогеля через 72 часа количество лейкоцитов в регенерирующей дерме не превышает 16,4±0,9% от общего числа клеток (Таблица 3) в зависимости от зоны травмы. При этом не выявлено повышение числа лейкоцитов в зоне регенерирующей дермы через 168 часов после травмы (Таблица 3). Это свидетельствует об ускоренном завершении воспалительной фазы заживления (в период до 72 часов). В большинстве клинических случаев заживление ран сопровождается развитием интенсивного воспалительного процесса. Существенным, по сравнению с прототипом [4], преимуществом заявленного биоактивного гидрогеля является невыраженная воспалительная реакция. Результаты также показывают (Таблица 3), что в группе животных с применением заявленного биоактивного гидрогеля количество тканевых макрофагов максимально через 72 часа с последующим понижением к 168 часу. Это свидетельствует об интенсивном удалении некротизированных тканей, тканевого экссудата и раневого детрита.

Для выявления интенсивности синтетических процессов фибробластов в регенерирующей дерме и дифференцировки новообразованных волокон соединительной ткани от биоактивного гидрогеля используют метод окрашивания волокон по Ван-Гизону [7].

На Фиг. 5 (4 фото) представлены фотографии окрашенных по Ван-Гизону срезов (толщина среза = 7 мкм, увеличение объектива ×40) регенерирующей кожи крысы после травмы при действии биоактивного гидрогеля: фото 5-1 - через 72 часа; фото 5-2 - через 168 часов; фото 5-3 - сосочковый и верх сетчатого слоя интактной (неповрежденной) кожи; фото 5-4 - глубокие слои сетчатого слоя интактной (неповрежденной) кожи.

Результаты визуального анализа показывают, что применение заявленного биоактивного гидрогеля способствует формированию в новообразующейся дерме кожи коллагена и его низкомолекулярных предшественников (Фиг. 5, фото 5-1, фото 5-2), сопоставимого со структурой дермы интактной (неповрежденной) кожи (Фиг. 5, фото 5-3, фото 54). Это коррелирует с преобладанием выявленных при количественной оценке клеточных типов фибробластов (Таблица 3), которые, как известно [9], играют ведущую роль в синтезе компонентов внеклеточного вещества. Фиг. 5 демонстрирует стимулирующее действие заявленного гидрогеля на регенерацию соединительной ткани кожи и синтетическую активность фибробластов кожи по сравнению с прототипом (иллюстрирующие материалы по регенерации соединительной ткани по прототипу не обнаружены).

Вышеописанные результаты свидетельствуют о достижении более выраженного стимулирующего действия заявленного биоактивного гидрогеля на процесс заживления раны по сравнению с прототипом. Факты существенной оптимизации репаративного процесса в дерме и стимуляции ремоделирования кожи позволяют рекомендовать биоактивный гидрогель к применению при создании фармацевтических средств для регенерации кожи и разработке косметологических технологий.

Применение биоактивного гидрогеля на основе желатина типа Б не ограничивается случаями регенерации эпителиальной и соединительной тканей при повреждениях кожи. Применение биоактивного гидрогеля по заявленному изобретению приложимо для восстановления других тканей, регенерация которых происходит с участием указанных выше механизмов. Таким образом, заявленное изобретение может быть использовано в области медицины, ветеринарии и косметологии.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию новизны, предъявляемому к изобретениям, так как при анализе идентифицированных источников информации не выявлены иные гидрогели с признаками, совпадающими с существенными признаками, приведенными в формуле изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует критерию изобретательский уровень, предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию промышленная применимость, предъявляемому к изобретениям, поскольку может быть реализовано в промышленных условиях, испытано в условиях научно-исследовательской лаборатории и достигнута поставленная цель - разработан стимулирующий рост клеток и регенерацию поврежденных тканей биоактивный гидрогель на основе желатина типа Б и способ его получения, имеющий преимущества по сравнению с прототипом, а именно: понижено содержание и, следовательно, расход сшивающего агента для получения биоактивного гидрогеля, понижена остаточная токсичность сшивающего агента в биоактивном гидрогеле, повышена биосовместимость биоактивного гидрогеля, усилена регенеративная активность биоактивного гидрогеля в отношении тканей организма и способность биоактивного гидрогеля поддерживать рост клеток.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. WO 2008016163 А1, МПК A61K 38/22, A61K 47/42, В32В 9/02. Crosslinked gelatin gel, multilayered structure, carrier for bioactive factor, preparation for release of bioactive factor, and their production methods / Nichiban Kk, University Kyoto, T. Shiguro; K. Fukano; Y. Tabata. Опубликован 07.02.2008. Описание патента.

2. US Patent №5834232 А, МПК C12P 21/06, C12N 11/04, C12N 9/10, A61K 38/17. Cross-linked gelatin gels and methods of making them / Zymogenetics, Inc., P.D. Bishop, G. Lasser. Опубликован 10.11.1998. Описание патента.

3. Патент РФ RU №2226406, МПК A61L 15/34, A61L 15/32. Гемостатическая, антисептическая и ранозаживляющая губка / Л.Г. Шанакин, Д.Д. Жук, Т.П. Горбатенко. Опубликован 10.04.2004. Описание патента.

4. Евразийское патентное ведомство, патент ЕР №016776 В9, МПК A61L 15/32, A61L 15/28, A61L 15/24, A61L 15/44 A61K 9/48. Неадгезивные эластичные желатиновые матрицы / Ковалон Текнолоджиз Инк. (СА). ВалериоДицио, Фрэнк Дикосмо, Юэхуа Ксиао. Опубликован 30.07.2012. Описание патента.

5. Lansdown, А.В. Zinc in wound healing: theoretical, experimental, and clinical aspects / A.B. Lansdown, U. Mirastschijski, N. Stubbs, E. Scanlon, M.S. Agren // Wound Repear Regen. 2007, Vol. 15(1), P. 2-16.

6. Galliano, R.D. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing / R.D. Galliano, J. Michaels, M. Dobryansky, J.P. Levine, G.C. Gurtner // Wound repair and regeneration. 2004, V. 12(4), P. 485-492.

7. Э. Пирс Гистология. - M.: Иностранная литература, 1962, 964 с.

8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. - М.: ГрифиК, 2012, с. 889-940.

9. Metcalfe, A.D. Tissue engineering of replacement skin: the crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration / A.D. Metcalfe, M.W.J. Ferguson // J. R. Soc. Interface. 2007, V. 4, P. 413-437.

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии и дерматологии, и может быть использовано для получения биоактивного гидрогеля для регенерации кожи. Для получения гидрогеля используют желатин типа Б, выделяемый методом щелочной обработки и имеющий изоэлектрическую точку в кислой области рН. Формируют гидрогель посредством химической сшивки желатина с бифункциональным сшивающим агентом, в качестве которого используют глутаровый диальдегид при содержании 0,05 мас. %. Биоактивный гидрогель дополнительно содержит анионный полимер и бивалентный металл в конечной концентрации не более 50 мМ. Использование данного изобретения позволяет получить устойчивый в физиологических условиях биоактивный гидрогель для регенерации кожи при концентрации бифункционального сшивающего агента глутарового диальдегида 0,05 мас. %. 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 7 пр.

1. Биоактивный гидрогель для регенерации кожи на основе желатина и бифункционального сшивающего агента, отличающийся тем, что для получения гидрогеля используют желатин типа Б, выделяемый методом щелочной обработки и имеющий изоэлектрическую точку в кислой области рН, и формируют гидрогель посредством химической сшивки желатина с бифункциональным сшивающим агентом, в качестве которого используют глутаровый диальдегид при содержании 0,05 мас. %.

2. Биоактивный гидрогель по п. 1, дополнительно содержащий анионный полимер и бивалентный металл в конечной концентрации не более 50 мМ.