Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток Советский патент 1985 года по МПК C12N5/00 C12N11/00 

а

00 . . Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению микроносителей для и мoбилизaции и вьфащиваниА клеток рост которых BiOSMoaKH на поверхности носителя, : Использование микроносителей для культивирования позволяет выращиват значительные количества клеток в одном р еажторе, уйеньшает трудоем; кость процесса, позволяет достичь боиырей стерильности и тем самым открывает возможности использования методов выращивания клеток в пpo вJшпeнныx масштабах. Для культивирования клеток используются различные микроносители в частности, на основе декстрана, модифицированного коллагеном fl. Недостаткам микроносителя являются двустадийность его синтеза, невозможность его использования для культивирования некоторых типов клеток, а также ухудшение его характеристик при повторном использовании. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток, включающей получение желатиновьпс гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполяр органическ растворителе (хлороформ-толуол) , обработку гранул диальдегидами (глутаровым альдегид и их сепарирование. Способ предусматривает раздельно проведение всех стадий, двухкратное сепарирование, использование высоки концентраций глутарового альдегида Недостатками способа являются ег многостадийность, сложность, большо расход глутарового альдегида и недостатки целевого продукта (окрашивание геля при шкpocкoпиpoвaнии, неспеци4 1ческая сорбция по свободным альдегидным группам). Цель кзобретёния - упрощение пр :цесса и улучшение технологических характеристик целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получё ния желатиновьЕк микроносителей для .культивирования клеток, включа1ощем получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органкче;ском 82 растворителе, обработку гранул -, диальдегидами и их сепарирование, обработку гранул проводят 1,41,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раст-, вора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами. Б качестве диальдегидов можно использовать глутаровьй альдегид, диапьдегид азелаиновой кислоты, глиоксаль, терефталевый диальдегид. Обработка протекает в среде различных неполярных органических растворителей (машинного,трансформаторного масла, изооктана, толуола, ксилола, бензолаj хлороформа и др.) с последующим отмыванием реакционной среды и последующим фракционированием, выделяя частицы микроносителя с оптимальными размерами 100-250 мкм. В качестве восстанавливакнцих реагентов используются реагенты, воссТанавливашЦл связи и альдегидные группы, например боргидриды щелочных металлов, перекись водорода, атомарный водород, дитионит (гидросульфит) натрия и др.. Использование предлагаемого cftoсоба обеспечивает упрощение процесса получения носителя: уменьшается стадийность способа получения микроносителя (отпадает необходимость в стадиях выпаривания, повторного автоклавирования и приготовления трёхкомпонентной смеси), упрощается состав реакционной среды (вместо трехкомпонентной смеси по известному способу в предлагаемом используется однокомпонентная система), уменьшается общая продолжительность проведения процесса уменьшается расход поперечно сшивающего агента (вместо использования 20 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида на 1,5 г желатина по известному способу в гсредлагаемом способе на такое же количество желатина используется 3 МП 25%-ного раствора глутарового альдегида)t Использование предлагаемого способа позволяет заметно улучшить также качество микроносителя: обработка восстанавливающим реагентом позволяет обесцветить частицы носителя (тем самым улучшаются его технологические качества) и облегчает непрерывный анализ роста кле- .

ток на микроносителях} обработка восстанавливающим реагентом позволяет удалить несвязанные альдегидные группы ч тем самым увеличить специфичность взаимодействия носителя с клеткой , использование условия получения микроносителя позволяет получить носитель, который стабилен не только при комнатной температуре (20-25 ) , но и при более высоких температурах, что облегчает проведение различных операций (стерилизации, дальнейшего модифицирования) с ним.

Согласно предлагаемому способу получен микроноситель с плотностью и прозрачностью, близкой таковым у воды, значительной химической и механической стабильностью, с размерами частиц, обеспечивающими оптимальный рост клеток и шарообразной формой микросферы, обеспечивающей быctpoe прикрепление клеток к поверхности микроносителя и эффективный рост и распластьгаание клеток самого различного типа. Полученные микроносители не разрушаются обьгчными культуральньпут средами и позтому они могут быть использованы многократно. Рост культур клеток на них можно осуществить как а статических условиях, так и суспензионным методом в динамических условиях, т.е. в условиях глубинного культивирования клеток.

... .

При мер 1. 400 мл 15%-ного раствора желатина,полученного при 50С, суспендинуют в 2 л смеси, состоящей иэ машинного масла и изооктана (1:1 по объему), и интен сивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к смеси приливают 150 мп 25%-ного раствора глутарового альдегида конечная . концентрация 1,46% и перемешивают еще 20 мин. После этого носитель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаяом,горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ горячей водой. Получевный микроноситель заливают 1 л 21-ного раствора боргидрида натрия и ввдерживают 0,5 ч, затем фильтруют, промвают водой .и фра1кхщон1фуют, отбирая фракцию с размерами частиц 100250 мкм. Получают 540 г влажйого микроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 10% желатина.

Прим е р 2. 200 мл 25%-ного раствора желати 1а, пол -ченного при , суспендируют в 1 я смеси, состоящей из трансформаторного масла и ияооктана (1:1 по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к смеси прибавляют 75 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают еще 20 мин. Затем микроноситель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ.и еще горячей водой. Полученный носитель запивают 500 мл 10%-ного раствора перекиси водорода и вьщерживают 0,5 ч; затем фильтруют, промьюают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц 100-250 мкм. Получают 260 г влажного микроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 18% желатина.

П р и мер 3. 200 мл 20%-ного. раствора желатина, полученного при 50°С,суспендируют в 1 л ксилола и интенсивно перемешивают при комнатной температзфе в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, прибавляют 75 л 25%-ного глутарового альдегида и перемешивают еще 5 мин. Микроноситель отфильтровывают на сите 100 мкм, промывают петролейным эфиром, горячей водой в присутствий поверхностно-активных веществ и чистой горячей водой.Полученный микроноситель заливают 500 мл 0 5%-ного раствора гидросуль4 гта натрия и вьщеряонвают 1 ч , затем фильтруют, промьюают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц 100-250 мкм. Получают 200 г влажного никроносителя, содержащего (в пересчете на сухое в ество) 18% желатина.

и м е р А. 200 мл гОХ-иого аствора желатина суспендируют в 1 л ксилола и интенсивно перемеши-г ают в течение 3 кии. Затем, не станавливая нешалку к суспензии рибавляют 50 мп 35%-ного раствоa глиоксаля (конечная концентрация 1, и перемешивают еще 5 мин. алее обрабатывают согласно примеру . Получают 195 г микроносителя,со5держап;его l7% желатина (в пересчете на сухое вещество). Пример 5. 200 мл 20%-ного раствора желатина суспендируют в 1 л смеси, состоящей из машинного масла и изооктана (1:1 по объему),и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин Затем, не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 50 ш |0%-н го раствора терефтальевого диальде гида (конечная -концентрация 1,6%) в диоксане и перемешивают еще 60 мин. Полученные гранулы отфильт ровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз горячей водой. Полученный материал запивают 500 м раствора перекиси водорода и вьщерживают 0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц 100-250 мкм. Получают 180 г микроносителя, содержащего 17% лселатина (в пересчете на сухое веи ество) П р и м е р 6. 200 мл 20%-ного желатина суспендируют в 1 л смеси, состоящей из маи янного масла и изооктана (1:1 по объему), и интен сивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 80 мл 28%-ного раст вора свежеприготовленного диальдегида азелаиновой кислоты (конечная концентрация 1,75%) и перемешивают 20 мин. Полученные гранулы отфильт ровывают на сите 100 мкм и промывают Изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз водой. Гранулы заливают 500 мп 8%-ного раствора перекиси водорода и вьщержившот 0,5 ч, фильтруютj прог-ашают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размером частиц 100--250 мкм. Получают 190 г микроносителя с содержанием 17% желатина (в пересчет на сухое вещество), Микроносители, полученные согла но примерам содержат 10-18% желатина (в пересчете на cyicoe вещества) имеют сходные свойства и могут быть применены (д.пя размно жения клеток) с од1 Е11аковым успехом . 8 Выращивание различных типов клеток на предлагаемых микроносителях протекает следующим .образом. 10 мл плотного осадка микроносителей (предварительно стерилизованных автоклавированием), что обеспечивает культуральную поверхность около 2500 см, и 40.20 свежеизолированных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста суспендируют в 100 мл питательной среды 199 с 0,15% гидроЛизата лактальбумина, 5% телячьей сыворотки, 0,1% галактозы, 20 мм буфера HEPES (рН 7,4) и антибиотиками. Культивирование проводят в сосуде объемом 250 мл с подвешенной мешалкой при 37°С. В первые сутки культивирования число оборотов мешалки составляет 10 об/мин, на вторые и третьи сутки- 20-30 об/мин и далее 50-60 об/мин. Через 48 ч культивирования .заменяют 50-70% среды на свежую. Спустя 4-5 сут после начала культивирования на частицах микроносителей формируются плотные культуры клеток куриных эмбрионов. Концентрация клеток к этому времени достигает (2,,3) млн. кл/мл, т.е. за 4-5 сут их число возрастает ,в среднем в 6,5 раза. Клетки почек зеленых мартьшек ГКПЗМ) первого субпассажа культивируют на микроносителях в условиях, аналогичных описанным в примере 1, с той разницей, что посевная концентрация клеток в данном примере составляет 1,5-10 . кл/мл, концентрация сыворотки 10%. Через 4-5 сут культивирования концентрация клеток .достигает (1,5±0,22) млн. кл/мл, возрастая в среднем в 10,8 раза.Клетки диплоидной лин.ии И-21 змбриона человека, взятые на зфовне 24 и 28 пассажей., . выращивш.от на микроносителях, как описано выше, с той разницей, что вместо среды 199 используют основную среду Игла. Через 5 сут культивирования число клеток увеличивается в среднем в 7j6 раза, концентрация клеток при этом достигает (1,,11) млн кл/мл, Таким образом, преимущества при использовании предлагаемого способа заключаются в том, что он проще известного в осу1цествлении: меньше стадий, однокомпонентная система.

7 11615488

уменьшена продолжительность, процес-бедных альдегидных групп) которые

са;позволяет экомить сьфье (умень-обуславливают неспецнфическую адшен расход глутарового альдегида);сорбдию компонентов среды), прозра

улучшить качество целевого продукта,цен (чтопозволяет проводитьвизуальтак как полученный микроносительs ный контроль культур клеток на микроностабилен в широком диапазоне темпе-сителях),может быть использован для выратур (до ), не содержит сво-ращивания клеток многократно.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе, обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т личающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул проводят 1,4-1,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.