ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ Российский патент 2012 года по МПК C07K14/11 C07K16/08 C12N15/33 A61K39/42 A61P31/12 

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 60/968145, поданной 27 августа 2007, полное содержание которой приведено в настоящей заявке в качестве ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится в целом к области медицины и лекарственных препаратов. Конкретнее, изобретение относится к иммуногенным композициям, способам создания таких композиций и способам профилактики, лечения, уменьшения интенсивности, контролирования микробной или вирусной инфекции или ее симптомов и, в частности, инфекций дыхательных путей, таких как гриппозная или пневмококковая инфекция, или комбинации инфекций. Описываются последовательности мишеневых пептидных антигенов и другие эпитопы, которые являются консервативными для совокупности родственных микроорганизмов и даже неродственных микроорганизмов, а также иммуногенные композиции и способы их использования для составления и введения диагностических, терапевтических и профилактических средств для диагностирования, лечения и/или предупреждения заболевания.

Микроорганизмы и вирусные патогены являются первичным источником инфекционного заболевания у животных. Патогены и их хозяева постоянно адаптируются друг к другу при бесконечной конкуренции за выживание и размножение. Некоторые патогены стали чрезвычайно результативными в инфицировании млекопитающих-хозяев и выдерживании воздействия иммунного ответа хозяина, даже в течение периодов времени, составляющих годы или десятилетия. Одним примером чрезвычайно результативного патогена млекопитающих является вирус гриппа.

Вирусы гриппа являются этиологическими агентами инфекционной болезни дыхательных путей (обычно именуемой, и именуемой в настоящем описании, «гриппом»), которые, главным образом, поражают людей и других позвоночных. Инфицирование вирусом гриппа может вызвать легкое - тяжелое течение болезни и может даже приводить к смерти. Каждый год в Соединенных Штатах, в среднем, 5%-20% популяции заражается гриппом, более чем 200000 человек госпитализируются по причине осложнений инфекции, и приблизительно 36000 человек умирает из-за воздействия патогена.

Вирус гриппа распространяется от хозяина к хозяину через кашель или чихание с образованием переносимых по воздуху каплеобразных ядер клеток в качестве основных переносчиков инфекционного заболевания. У людей вирус обычно распространяется непосредственно от человека к человеку, хотя индивиды иногда могут стать инфицированными при непрямом контакте с поверхностями, содержащими вирус, и затем касании своего рта и носа. Большинство здоровых взрослых может инфицировать других, за день до развития первичных симптомов заболевания, и остается контагиозным вплоть до 5 дней после инфицирования. Неосложненное заболевание гриппом часто характеризуется внезапным началом системных и респираторных симптомов, включающих лихорадку, миалгию, головную боль, недомогание, непродуктивный кашель, фарингит, ринит или комбинацию одного или нескольких этих симптомов.

В настоящее время попытки контролировать распространение патогенного вируса гриппа в популяциях животных осуществляются с помощью вакцинации и/или лечения одним или несколькими противовирусными соединениями. Вакцины на основе инактивированных вирусов гриппа в настоящее время используются по всему миру, особенно в группах высокого риска, таких как младенцы, пожилые люди, индивидууму без соответствующей медицинской помощи и индивидуумы с ослабленным иммунитетом. Вирусы для вакцин обычно выращивают в фертильных куриных яйцах, инактивируют химическими способами и очищают. Вакцины обычно являются трехвалентными, включая репрезентативные вирусы гриппа А (H1N1 и H3N2) и штаммы вируса гриппа В. В вакцинные штаммы необходимо регулярно вносить изменения для сохранения эффективности, это действие координируется Всемирной организацией здравоохранения (WHO). Во время периодов между пандемиями обычно требуется минимум восемь месяцев, прежде чем скорректированная противогриппозная вакцина будет готова для продажи. Исторически, однако, вирусные пандемии распространяются на большей части континентов в пределах четырех-шести месяцев, и будущие вирусные пандемии, по-видимому, будут распространяться даже быстрее из-за увеличения международных поездок. Поэтому неизбежно, что эффективная вакцина, созданная обычными способами, будет недоступной или в большой нехватке во время первой волны любой будущей широко распространенной вспышки инфекции или пандемии.

Многочисленные вакцины, способные вызывать защитную иммунную реакцию, специфичную для таких различных вирусов/штаммов вируса гриппа, были созданы в последнем полустолетии. Они включают цельно-вирионные вакцины, субъединичные противовирусные вакцины, вакцины на основе поверхностных антигенов и живые аттенюированные противовирусные вакцины. Однако несмотря на то, что соответствующие препараты любого их этих типов вакцин способны вызывать системный иммунный ответ, живые аттенюированные противовирусные вакцины обладают превосходством, заключающимся в их способности стимулировать также местные защитные свойства слизистых оболочек дыхательного пути.

Из-за непрерывного возникновения (или повторного возникновения) различных штаммов вируса гриппа снова и снова требуются новые противогриппозные вакцины. Такие вакцины обычно создают, используя антигенные составляющие вновь возникающих штаммов вируса, поэтому в высокой степени желательны полипептиды и полинуклеотиды новых, вновь возникающих или заново повторно возникающих штаммов вируса (особенно последовательности генов антигенов).

Из-за большой скорости мутаций среди вирусов гриппа обычно считают, что пандемический грипп может, вероятно, возникнуть в любое время. Опасность следующей пандемии гриппа нельзя предсказать, но на основе моделирования высказывается мнение, что эффект пандемии на Соединенные Штаты, и мир в целом, мог бы быть значительным. По оценкам, в отсутствие каких-либо контрольных мер (вакцинации или лекарственных средств) в Соединенных Штатах пандемия «среднего уровня» могла бы вызвать 89000-207000 смертей, 314000-734000 госпитализаций, 18-42 миллиона визитов в медицинские пункты и еще 20-47 миллионов больных людей. Согласно оценкам Центров контроля и профилактики заболеваний (CDS) (Atlanta, GA, США) между 15% и 35% популяции США могло бы быть поражено при пандемии гриппа, а удар по экономике мог бы составить пределах 71-167 миллиардов долларов.

CDS и главные управления по профилактике заболеваний рекомендуют предупреждение гриппа благодаря ежегодной вакцинации против гриппа. Однако обычные вакцины обычно направлены на антигены HA и NA и не были ни универсально защитными, ни эффективными на 100% в предупреждении заболевания.

Без ограничения какой-либо теорией полагают, что антигенная изменчивость не позволяет вакцинам против гриппа быть универсально защитными или сохранять эффективность в течение многих лет. Делаются предположения, что неэффективность обычных вакцин может также быть обусловлена, отчасти, антигенным дрейфом и проистекающим разнообразием в пределах антигенных частей белков HA и NA, наиболее широко распознаваемых иммунной системой (т.е. иммунодоминантных антигенов). В результате многие люди могут обнаружить, что они являются чувствительными к вирусу гриппа без эффективного способа лечения, который имеется в распоряжении, поскольку у вируса гриппа постоянно увеличивается устойчивость к доступным в настоящее время лечениям. Этот сценарий, в частности, относится к вирусу H5N1, который является высоковирулентным, но против которого в настоящее время нет широкодоступной, имеющейся в продаже вакцины для иммунизации популяций чувствительных людей.

Имеющиеся в настоящее время противогриппозные вакцины, как правило, индуцируют иммунитет только к небольшому числу штаммов, по презумпции к тем штаммам, которые в настоящее время циркулируют у людей. Кроме того, для достижения защитной иммунной реакции некоторые вакцины должны вводиться с использованием высоких доз антигена. Это особенно верно в случае вакцин против H5N1. Кроме того, обычные противогриппозные вакцины обычно представляют эпитопы в том же порядке, в котором они обнаруживаются в природе, обычно представляя целые вирусные белки, в результате для создания эффективной вакцины требуются относительно большие количества белка. В результате, каждое введение включает увеличенные затраты, связанные с количеством дозы, и существуют возросшие затруднения в изготовлении доз, достаточных для вакцинации неограниченного круга лиц. Даже дополнительно, использование больших белков повышает риск нежелательных иммунных реакций у хозяина-реципиента.

Противовирусные соединения остаются основой для лечения заболеваний между пандемиями. В настоящее время они также являются единственной альтернативой для контролирования пандемий во время начального периода, когда в распоряжении нет вакцин. В продаже в настоящее время имеется два класса противовирусных соединений: ингибиторы М2, такие как амантадин и римантадин, и ингибиторы нейраминидазы (NA), которые включают оселтамивир (Tamiflu®, Roche Laboratories, Inc., Nutley, США) и занамивир (Relenza®, GlaxoSmithKline, Inc., Research Triangle Park, NC США). Оба класса молекул обладают доказанной эффективностью в предупреждении и лечении гриппа.

Ограниченная эффективность против возникающих штаммов, многочисленные побочные эффекты и риск образования устойчивых к лекарственным средствам штаммов, однако, остаются среди главных проблем, ограничивающих их масштабное применение в качестве химиопрофилактики. В частности, серотип H1N1 уже начал демонстрировать увеличенную устойчивость к оселтамивиру, и в недавнем исследовании, проведенном WHO, было показано, что 237 (14%) из 1703 вирусов H1N1 имеют мутацию, придающую устойчивость к лекарственному средству. Степени устойчивости были наибольшими в Норвегии (66% изолятов), Франции (40%) и Люксембурге (25%), и мутацию уже обнаружили в 18 из 37 стран, в которых анализировались вирусы. Мутацию наблюдали у 8% изолятов, изученных в Соединенных Штатах.

Предел современным вакцинам против вируса гриппа и противовирусным терапиям ставят значительные, фундаментальные недостатки, и сохраняется неудовлетворенная потребность в данной области техники в иммуногенной композиции, которая не так чувствительна к изменениям в микроорганизмах, например, вследствие антигенной изменчивости или дрейфа, которая, тем самым, могла бы оставаться эффективной для совокупности различных штаммов и подтипов вируса гриппа с течением времени. В частности, требуются новые терапевтические и/или профилактические средства для устранение будущих пандемий гриппа, и требуются новые вакцины, которые могут дополнять обычные вакцины для обеспечения более полной защиты от вирусных и микробных патогенов, таких как вирус гриппа, чем обычно доступная защита.

Было бы крайне желательно иметь мишеневые антигены или эпитопы, которые являются консервативными для совокупности типов, подтипов и/или штаммов вирусных и микробных патогенов, в частности, вируса гриппа, и легкими в производстве и хранении для того, чтобы увеличить объем выпуска и доступность вакцины; остаются эффективными в продолжение по крайней мере двух сезонов гриппа для того, чтобы снизить потребность в продукции; требуют меньших концентраций белка; уменьшают нежелательные иммунные реакции; усиливают защиту, даже когда возникает новый вирус человека, или происходят мутации в циркулирующих штаммах, или вызывают любую комбинацию указанных действий.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым и эффективным композициям, а также к способам их использования, которые могут преимущественно улучшить доставку терапевтических, диагностических и/или профилактических средств нуждающемуся в этом животному. Настоящее изобретение относится к композициям, которые предпочтительно обеспечивают взаимное усиление эффективности, получения и т.п., путем использования повторяющихся последовательностей мишеневых антигенов для обеспечения увеличения силы ответа на иммуноген и для увеличения вероятности эффективной защиты при меньшем числе введений и/или по крайней мере меньшей дозе, чем такая вероятность в случае использования обычных вакцин против вируса гриппа.

Поскольку описанные в настоящем изобретении вакцины менее чувствительны к антигенной изменчивости и дрейфу, чем обычные вакцины, введение описанных в настоящем описании иммуногенных композиций может также уменьшить или исключить необходимость в ежегодной вакцинации для сохранения защиты популяций пациентов от возможных вспышек инфекции на основе новых вирусных изолятов.

Кроме того, иммуногенные композиции по настоящему изобретению обычно и преимущественно могут обеспечить одну или несколько следующих возможностей: учитываемые факторы увеличенной безопасности, относительно длительный срок хранения отчасти вследствие минимизированной необходимости в изменении вследствие штаммо-специфической изменчивости и дрейфа, способность задавать иммунные ответы с высокой специфичностью для конкретных микробных эпитопов и способность к приготовлению вакцин против множества патогенов.

В общем и широком смысле настоящее изобретение относится к композициям, способам создания таких композиций и способам их применения для профилактики, лечения и/или контролирования вызываемого микроорганизмами или вирусами патологического процесса и инфекции. Описанные в настоящем описании композиции, а также способы их применения находят конкретное применение для лечения или предупреждения вызываемого вирусами группа и/или бактериями патологического процесса и инфекции, используя иммуногенные композиции и способы, превосходящие традиционные лечения, доступные в данной области техники.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композицием, а также способам их создания и применения при ряде лечебных и профилактических схем и, в частности, для лечения и предупреждения вирусных и бактериальных заболеваний у животного, предпочтительно у млекопитающего, такого как человек.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу индукции у животного иммунологической реакции на вирус гриппа. В общем и широком смысле этот способ включает введение одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в количестве и в течение периода времени, которые эффективны для индукции у животного иммунологической реакции на вирус гриппа. В одном из вариантов осуществления животным является млекопитающее и в предпочтительном варианте осуществления животным является человек.

Настоящее изобретением, кроме того, относится к способу профилактики или контроля вспышки вирусной инфекции или микробной инфекции (в частности, гриппозной и/или бактериальной инфекции) в отобранной популяции млекопитающих. Способ включает по крайней мере получение эффективного количества одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных или вакцинных композиций чувствительному или подверженному риску члену популяции в течение периода времени, достаточного для предупреждения вспышки такой инфекции в общей популяции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу стимулирования иммунной системы индивидуума для индукции защитной иммунной реакции против вирусной инфекции, такой как гриппозная инфекция. Такой способ, как правило, предусматривает по крайней мере введение индивидууму иммунологически эффективного количества одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в количестве и в течение периода времени, которые являются достаточными для стимулирования иммунной системы индивидуума. При осуществлении на практике этого способа введение композиции предпочтительно индуцирует обнаруживаемое количество противогриппозных антител у индивидуума и еще более предпочтительно делает индивидуума невосприимчивым к повторному инфицированию вирусом или инфицированию родственными по эпитопам вирусами.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции защитной иммунной реакции против вируса гриппа у нуждающегося в этом млекопитающего. Такой способ, как правило, включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему иммунологически эффективного количества одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в условиях и в течение периода времени, которые являются достаточными для индукции такой защитной иммунной реакции против одного или нескольких видов, штаммов или серотипов вируса гриппа.

Аналогично, настоящее изобретение также относится к способу доставки терапевтического или диагностического соединения исходной клетке-хозяину млекопитающего. В общем и широком смысле этот способ включает доставку такому млекопитающему эффективного для терапевтических или диагностических целей количества одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в условиях и в течение периода времени, которые являются эффективными для предоставления соединения по крайней мере исходной клетке, ткани, органу или системе органов в таком млекопитающем.

Дополнительно, настоящее изобретение также относится к способу введения профилактической противовирусной или противомикробной композиции в по крайней мере исходную клетку, ткань, орган или систему органов млекопитающего, который обычно включает предоставление такого млекопитающему эффективного для профилактических целей количества по крайней мере первой иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к иммуногенной композиции, содержащей мишеневый антиген, имеющий одну или несколько повторных пептидных последовательностей или фрагментов, вариантов или производных таких пептидных последовательностей (ниже взаимозаменяемо именуемых «пептид», «последовательность», «белок» или «аминокислотная последовательность»), которые являются консервативными для множества белков в одном и том же, или различных, вирионе(ах), вирусе(ах) или вирусной частице(ах). Последовательность может быть консервативной в рамках подтипов одного и того же типа вируса или в рамках различных типов вируса в то же самое время. Предпочтительно, вирусами являются вирусы гриппа. В одном предпочтительном варианте осуществления, в котором пептидная последовательность является консервативной в рамках различных частиц вирусов гриппа, вирусные частицы могут быть различными подтипами вируса гриппа (например, вирусами гриппа с изменяющимися составными частями HA или NA, такими как H1N1, H5N1, H3N2 и H2N2). Например, отобранная последовательность в белках М1 и М2 вируса гриппа H5N1 может соответствовать белкам М1 и М2, обнаруживаемым в других частицах H5N1, и может соответствовать такой же последовательности в белках М1 и М2 вируса гриппа H3N2. Кроме того, хотя белки HA или NA могут иметь высоковариабельные области, консервативные последовательности из HA или NA обнаружены в более чем одном штамме вируса гриппа или более чем одном подтипе (например, последовательности HA или NA являются консервативными для H5N1 и H1N1). В предпочтительном варианте осуществления консервативная последовательность присутствует в совокупности вариантов или штаммов (вирусных изолятов, экспрессирующих по существу одинаковые белки HA или NA, но в аминокислотных последовательностях белков HA или NA которых демонстрируется некоторый незначительный дрейф) одного подтипа вируса гриппа и более предпочтительно в по крайней мере двух подтипах вируса гриппа, например, подтипах вируса гриппа А.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенному пептиду или полипептиду, который включает по крайней мере одну антигенную детерминанту (эпитоп), которая включает одну или несколько повторно встречающихся пептидных последовательностей, каждая из которых является консервативной для множества гомологичных белков, т.е. консервативной в популяции штаммов или серотипов вируса гриппа, и фармацевтически приемлемый носитель. В приводимых в качестве примеров являющихся антигенами пептидах по крайней мере одна последовательность эпитопа повторена по крайней мере один раз, предпочтительно по крайней мере два раза, более предпочтительно по крайней мере три раза. В других вариантах осуществления по крайней мере одна последовательность эпитопа повторена четыре или более раз. Предпочтительно, пептидные последовательности идентичны пептидным последовательностям в гомологичных субъединицах белков по крайней мере двух циркулирующих вирусных изолятов. В каждом варианте полного раскрытия композиции могут включать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пептидные последовательности включают пептидные последовательности, происходящие из сегмента 7 генома (т.е. РНК) вируса гриппа, в то время как в более предпочтительном варианте осуществления пептидные последовательности включают по крайней мере части белков М1 и М2. В приводимом в качестве примера варианте осуществления пептидной последовательностью является MSLLTEVETPIRNE (SEQ ID NO:32).

В других предпочтительных вариантах осуществления пептидные последовательности включают пептидные последовательности, экспрессируемые с сегментов генома, кодирующих белки HA или NA. Предполагается, что такие последовательности менее затронуты подтипным дрейфом. Антигенные композиции, включающие последовательности специфичных для HA или NA эпитопов, включают, но без ограничения, такие аминокислотные последовательности, которые включают аминокислотную последовательность, выбираемую из GNLIAP (SEQ ID NO:6), GNFIAP (SEQ ID NO:4), GNLFIAP (SEQ ID NO:5), FVIREPFISCSHLEC (SEQ ID NO:3), HYEECSCY (SEQ ID NO:7) и DWSGYSGSFVQHPELTGLD (SEQ ID NO:1), или одну или несколько пептидных последовательностей, которые в значительной степени гомологичны любой из таких последовательностей, или любую их комбинацию, по существу состоят из или, в альтернативном случае, состоят из такой аминокислотной последовательности(ей). Такие композиции могут также дополнительно необязательно включать одну или несколько дополнительных антигенных композиций, представленных выше и еще где-нибудь в этой заявке, включающих, например, последовательности эпитопов, определенные на фигурах и примерах, ниже.

В некоторых вариантах осуществления мишеневый антиген, такой как дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, полисахарид, липопротеин или производное или любая их комбинация (в том числе их фрагменты или варианты), включает один или несколько стимулирующих Т-клетки эпитопов. Как правило, по крайней мере одна повторная пептидная последовательность мишеневого антигена содержится внутри одной и той же молекулы в качестве стимулирующих Т-клетки эпитопов. В случае стимулирующих Т-клетки эпитопов на основе белков по крайней мере одна повторная пептидная последовательность мишеневого антигена может содержаться внутри одного и того же полипептида в качестве стимулирующих Т-клетки эпитопов, может быть конъюгирована с ним или может быть связаны другими способами. Предпочтительно, по крайней мере одна повторная пептидная последовательность включена внутрь одного и нескольких стимулирующих Т-клетки эпитопов в полипептиде или рядом с таким(и) эпитопом(ами).

В некоторых вариантах осуществления мишеневые антигены, со связанными стимулирующими Т-клетки эпитопами или без них, могут включать один или несколько полисахаридов или их частей. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере одна пептидная последовательность мишеневого антигена конъюгирована с одним или несколькими полисахаридами. В других вариантах осуществления один или несколько полисахаридов конъюгирован с другими частями мишеневого антигена. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения выбирают из полисахаридных вакцин, вакцин на основе конъюгата белок-полисахарид или их комбинаций.

Кроме того, мишеневые антигены могут использоваться с любым адъювантом или частицей и могут находиться на поверхности любой частицы в соответствии с настоящим изобретением. Частица может быть микробом (таким как вирус, неполноценный вирус или бактерия, например, бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ), или микробным компонентом, или она может быть неорганическим твердым веществом (например, латексом или стеклянными бусами, микросферами, наносферами, микрочастицами, наночастицами, баллистическими частицами, квантовыми примесями и т.п.) или органической системой (например, липосомами).

Затем, мишеневые антигены могут находиться на поверхности клетки-хозяина. В предпочтительных вариантах осуществления это наблюдается посредством введения кодирующего мишеневый антиген генетического материала в клетку-хозяина с помощью переносчика, такого как микроб или вирус (например, БЦЖ, аденовирус, аденоассоциированный вирус, бакуловирус, вирус осповакцины, вирус герпеса, вирус гриппа, модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) и т.п.), или трансфекции частицами высокой энергии с последующей экспрессией мишеневого антигена на поверхности клетки. Кодирующий мишеневый антиген генетический материал может быть и не быть включен, и предпочтительно не включен, в геном клетки-хозяина.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам искусственного синтеза мишеневого антигена по настоящему изобретению с помощью in vitro химического синтеза, твердофазного белкового синтеза, in vitro (бесклеточной) трансляции белков, рекомбинантного синтеза белков или любой их комбинации. Мишеневый антиген можно экспрессировать в различных типах клеток, включающих бактерии, грибы, клетки насекомого, млекопитающего, дрожжи и т.п., или любую их комбинацию, и получить из таких типов клеток.

Мишеневый антиген включает по крайней мере один из следующих элементов: по крайней мере одну повторную пептидную последовательность, по крайней мере один Т-клеточный эпитоп, по крайней мере один полисахарид, по крайней мере один полинуклеотид, по крайней мере один структурный компонент или их комбинацию. По крайней мере один структурный компонент может включать одну или несколько из следующих составляющих: по крайней мере один линкерный сегмент, по крайней мере одну сахаросвязывающую составляющую, по крайней мере одну нуклеотидсвязывающую составляющую, по крайней мере одну белоксвязывающую составляющую, по крайней мере одну ферментативную составляющую или их комбинацию.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам создания иммуногенной композиции, предпочтительно, фармацевтической композиции, более предпочтительно, вакцины, в которой мишеневый антиген по настоящему изобретению находится вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, наполнителем или носителем.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам индукции у индивида детектируемого иммунного ответа против микроба. Один предпочтительный способ включает введение нуждающемуся в этом индивиду достаточного для индукции обнаруживаемого иммунного ответа количества вакцины, которая содержит один или несколько мишеневых антигенов по настоящему изобретению. Предпочтительно мишеневый антиген включает одну или несколько повторно встречающихся пептидных последовательностей, каждая из которых является консервативной для множества гомологичных белков во множестве микробных частиц, например вирусных частиц, имеющих гомологичные белки, содержащие антигены. Предпочтительно, способ дополнительно включает введение мишеневых антигенов вместе с фармацевтически приемлемым носителем и оценку индивида для обнаружения иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам вакцинации индивида против вируса гриппа, который включает введение нуждающемуся в вакцинации против гриппа пациенту эффективного для терапевтических или профилактических целей количества противогриппозной вакцины, которая содержит мишеневый антиген, содержащий одну или несколько повторно встречающихся пептидных последовательностей, каждая из которых является консервативной для множества гомологичных белков во множестве частиц вирусов гриппа, и фармацевтически приемлемый носитель, для обеспечения у пациента обнаруживаемого иммунного ответа против вируса гриппа.

Настоящиее изобретение относится к способам и иммуногенным композициям для профилактики, лечения и контролирования у хозяев микробного заболевания или микробной инфекции и его симптомов. В некоторых вариантах осуществления микробное заболевание или микробная инфекция включает заболевание вирусной этиологии, а в конкретных вариантах осуществления заболевание, вызванное вирусом гриппа. В других вариантах осуществления микробное заболевание или микробная инфекция включает заболевание бактериальной этиологии, и в конкретных вариантах осуществления заболевание, вызванное инфицированием пневмококком.

Настоящее изобретение также относится к иммуностимулирующим мишеневым антигенам, содержащим по крайней мере части одного или нескольких являющихся белками или субъединицами белков полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, или их фрагменты, или варианты, или производные, которые идентичны, по существу идентичны аминокислотным последовательностям по крайней мере частей гомологичных белков, или субъединиц белков, обнаруживаемых во множестве микробных частиц, высококонсервативны или консервативны для указанных частей. Предпочтительно, гомологичные белки или субъединицы белков обнаруживаются в микробных частицах дикого типа или популяциях микробных частиц дикого типа, хотя в некоторых вариантах осуществления микробные частицы могут быть сконструированными, подвергнутыми культивированию или намеренно мутированными или любой их комбинацией. Гомологичные белки или субъединицы белков, дикого ли типа или нет, в совокупности именуют «отобранными полипептидами». Предпочтительно, отобранные полипептиды характеризуются инвариантными, почти инвариантными или в значительной степени гомологичными по крайней мере частями их аминокислотных последовательностей в рамках субъединиц гомологичных белков для множества различных микробных частиц или консерватизмом по крайней мере таких частей. Аминокислотные последовательности инвариантных, почти инвариантных, высококонсервативных или консервативных частей отобранных полипептидов в совокупности именуют в настоящем описании «пептидными последовательностями».

Иммуностимулирующие мишеневые антигены и антигенные композиции, включающие их, предпочтительно, используют для создания вакцины, предпочтительно, в качестве компонентов вакцины. Вакцины по настоящему изобретению относятся к иммуногенным эпитопам, которые индуцируют у хозяина иммунитет благодаря гуморальному (образованию В-клеток) или клеточно-опосредованному (Т-клетками) иммунному ответу, или обоим ответам. Полагают, что используемые в вакцине иммуностимулирующие мишеневые антигены, обладающие признаками изобретениями, будут давать усиленный ответ на иммуногены in vivo по сравнению с соответствующими обычными вакцинами. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что ответ на иммуногены - консервативные вирусные (микробные) эпитопы, вызванный обладающей признаками изобретения вакциной, усилен по сравнению с обычными вакцинами благодаря эффективной презентации иммуногенных эпитопов (пептидных последовательностей, полисахаридов и т.п.) иммунной системе хозяина. Иммуногенный потенциал мишеневого антигена может также быть увеличен с помощью повтора всей или части консервативной иммуногенной последовательности(ей) один или более раз в вакцине. Природа повторных последовательностей мишеневых антигенов по настоящему изобретению может иметь следствием нуклеотидные или аминокислотные последовательности, которые являются уникальными по сравнению с природной нуклеотидной или пептидной последовательностью исходного микроба(ов).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вакцина может быть основана на одной или нескольких последовательностях консервативных пептидных антигенов, общих для по крайней мере множества штаммов и, предпочтительно, для множества подтипов конкретного типа вируса. Предпочтительно, настоящее изобретение в таких вариантах осуществления относится к вакцине, основанной на консервативном антигене вируса гриппа, общем для всех штаммов конкретного типа или подтипа вируса гриппа, даже более предпочтительно для всех штаммов вируса гриппа А. Такие вакцины по настоящему изобретению могут обеспечить терапевтический и/или профилактический эффект, в том числе одиночный курс прививки, перекрестную защиту от новых штаммов в высокой степени дивергентной популяции вирусов и защиту в течение ряда лет (или периода большей продолжительности, чем в случае обычных вакцин).

Настоящее изобретение также относится к композиции для применения для профилактики вирусного или микробного заболевания, а также к композиции для применения для лечения или диагностики такого заболевания. Настоящее изобретение также относится к применению одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций для получения лекарственного средства для профилактики или лечения и, в частности, к применению для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики одного или нескольких заболеваний, или одного или нескольких их симптомов, у млекопитающего и, в частности, у человека.

Применение одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций для получения лекарственного средства для профилактики или лечения одного или нескольких заболеваний, включающих, например, вирусную или микробную инфекцию, у человека также является важным аспектом настоящего изобретения. Составление таких композиций для применения для введения в клетку-хозяина животного и, в частности, клетку-хозяина млекопитающего также обеспечивается настоящим изобретением. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к составлению таких композиций для применения для введения человеку или в одну или более отобранных клеток, тканей, органов человека-хозяина in situ, или in vitro, или ex situ.

Настоящее изобретение также относится к применению одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций для получения лекарственного средства или вакцины для профилактики или предупреждения заболевания, в том числе для создания одной или нескольких вакцин, подходящих для введения с профилактической целью для профилактики или уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов микробной или вирусной инфекций, включающих, например, гриппозную и бактериальную инфекции, в частности.

Настоящее изобретение также относится к способам предоставления терапевтического или профилактического иммуногенного соединения исходной клетке в млекопитающем, при этом способ обычно включает предоставление нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества описанной в настоящем описании иммуногенной композиции, которая включает по крайней мере один терапевтический или профилактический активный ингредиент, и в течение периода времени, который являются эффективным для обеспечения требуемой терапии и/или профилактики в избранном млекопитающем.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, подходящим для введения в одну или несколько клеток-хозяев. В конкретных вариантах осуществления клеткой-хозяином является клетка-хозяин млекопитающего, в то время как в других вариантах осуществления она является клеткой человека. В других предпочтительных аспектах клетка-хозяин находится внутри тела человека или находится в пределах по крайней мере исходной ex vivo ткани или множества клеток, которые совместимы при трансплантации в тело такого человека в качестве части типичного протокола ex vivo лечения или т.п.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, включающим антигенные пептиды и полипептиды, которые состоят из эпитопов, являющихся консервативными для популяции различных штаммов или серотипов вируса гриппа. Используемый в настоящем описании термин «консервативный для совокупности вирусных (гриппозных) штаммов» относится к идентичному, схожему или гомологичному химическому соединению в группе некоторых, предпочтительно большинства и наиболее предпочтительно по существу всех серотипов и/или штаммов, имеющих общий серотип, вируса гриппа А. Например, вирусные частицы, случайно выбранные из популяции вируса гриппа А, имеющего различные серотипы, такие как, например серотип H1N1 вируса гриппа А и серотип H3N2 вируса гриппа А, могли бы содержать по крайней мере один белок, или его область, который является консервативным для множества уникальных штаммов вируса гриппа А. Штаммы вируса гриппа обычно относятся к вирусным изолятам, которые могут варьировать до некоторой степени (например, они подверглись дрейфу) и могут экспрессировать белки HA и/или NA, но со слегка различными первичными аминокислотными последовательностями HA или NA.

Консервативные области в NA или HA могут также давать иммунитет перекрестного подтипа. В качестве примера, консервативные эпитопы в NA(N1) могут дать усиленный иммунитет к H5N1 и H1N1. Что касается схожих или гомологичных химических соединений в группе подтипов и/или штаммов в пределах подтипа вируса гриппа А, предпочтительно, когда они идентичны на по крайней мере приблизительно 80%, предпочтительно на по крайней мере приблизительно 90%, более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 95%. В других вариантах осуществления эти схожие или гомологичные соединения идентичны (инвариантны) на по крайней мере приблизительно 96%, на по крайней мере приблизительно 97%, на по крайней мере приблизительно 98%, на по крайней мере приблизительно 99% или 100%.

По крайней мере одна пептидная последовательность внутри мишеневого антигена, в целом или ее часть, является также предпочтительно консервативной в гомологичных белках (например, субъединицах белков) по крайней мере двух вирусных частиц, предпочтительно частиц вирусов гриппа. Используемый в этом контексте термин «молекула» включает одну или несколько белковых или аминокислотных последовательностей, обнаруживаемых в вирусе, предпочтительно вирусе гриппа. Как продемонстрировано на фиг. 1, белки включают, например, белки, представленные в структуре вируса, такие как HA, NA, белки-полимеразы (PB1, PB2, PA), матриксные белки (M1, M2) и нуклеопротеин («NP»). Предпочтительно, консервативные пептидные последовательности являются консервативными в по крайней мере двух или более белках из М1, М2, HA, NA или одном или более являющихся полимеразами белках, и, предпочтительно, в большинстве или даже всех предшествующих белках.

В некоторых вариантах осуществления пептидные последовательности повторены в последовательном порядке. В других вариантах осуществления последовательности повторены, хотя разбросаны среди подпоследовательностей или других пептидов (например, спейсеров), или иммуногенных (например, стимулирующего Т-клетки эпитопа), или неиммуногенных по природе. В еще одном варианте осуществления они могут быть консервативной пептидной последовательностью из одного белка вируса гриппа вперемежку с последовательностями из других родственных белков вируса гриппа, включающих, например, белки М2, HA и NA. Такие последовательности могут при этом находиться вперемежку с одним или повторными консервативными эпитопами или с одним или повторными стимулирующими Т-клетки эпитопами.

В еще одном варианте осуществления отобранные из неродственных микробов пептиды могут быть объединены в один мишеневый антиген. Например, последовательности вируса гриппа (отобранные пептиды) могут находиться вперемежку с консервативными последовательностями или эпитопами, отобранными из других микробов, таких как S. pneumococcus или S. aureus. Предпочтительные белки, из которых могут быть отобраны предпочтительные пептиды, включают PspA, PspC, HA, NA, M2e, белок D H.influenza, коагулазу и т.д.

Как используется в настоящем описании, в некоторых аспектах «гомология» пептидных последовательностей составляет по крайней мере приблизительно 80%, предпочтительно по крайней мере приблизительно 85%, предпочтительно по крайней мере приблизительно 90%, предпочтительно по крайней мере приблизительно 93%, предпочтительно по крайней мере приблизительно 94%, предпочтительно по крайней мере приблизительно 95%, предпочтительно по крайней мере приблизительно 96%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 97%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 98%, даже более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 99% и, наиболее предпочтительно, приблизительно 100%, по сравнению с установленной пептидной последовательностью. Как правило, вывод о «гомологии» в группе белков делают на основе схожести последовательностей. В других аспектах гомология белковых последовательностей охватывает белки, предусматривающие такую же функцию и/или имеющие такой же являющийся антителом рецептор или функциональную характеристику связывания, как и установленная пептидная последовательность.

В настоящем изобретении любая комбинация или повторы последовательностей высококонсервативных пептидных эпитопов могут использоваться при составлении антигенных пептидов, полипептидов или вакцин для обеспечения одной или нескольких требуемых иммуногенных характеристик. Следовательно, в пределах объема настоящего изобретения находится включение всех последовательностей консервативных областей гомологичных микробных или вирусных белков, субъединиц, гомологов и подобного рода.

Например, включены вирусные белки, гомологичные для совокупности подтипов, такие как М1 и М2 вируса гриппа, Н1 и Н2 вируса гриппа, N2 и N3 вируса гриппа, Н5 и Н1 вируса гриппа, или подобные. Подобным образом, в настоящее изобретение также включены вирусные белки, гомологичные для совокупности штаммов одного и того же подтипа или изолятов штамма, или любой комбинации вышеуказанного.

Настоящее изобретение можно адаптировать для включения в высокой степени различных составляющих вируса гриппа, обеспечивая, тем самым, более разнообразную профилактику против вируса. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции включают иммуногенные активности против белков HA, белков NA или, предпочтительно, против обоих белков. Конкретнее, композиции и способы введения композиций включают антигены, которые являются обычно консервативными для совокупности подтипов вируса гриппа, предпочтительно, эпитопы из белков М2, НА или NA вируса гриппа А.

В некоторых вариантах осуществления, когда уместно, как это могло бы быть понятно среднему специалисту в данной области техники, иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут включать введение животному однократной дозы или, в альтернативном случае, могут включать введение животному многократных и/или следующих одна за другой доз с течением времени. В альтернативном случае иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут также вводиться вместе с одной или несколькими противовирусными композициями и/или одним или несколькими отличными иммуногенами или вакцинными композициями.

Доза вакцины будет зависеть от возраста вакцинируемого индивида, а также веса, пола и заболевания индивида и пути введения, требуемого эффекта и конкретного используемого конъюгата (например, пептида, пептида, нагруженного на носитель, и т.п.), и средние специалисты в данной области техники смогут без труда скорректировать дозу, как требуется, на основе этих и других обычных факторов дозирования.

Вакцины и иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить избранному животному, используя любую из ряда общепринятых методик, включающих, например, но без ограничения, парентеральный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, чрескожный, внутрикожный, подкожный, чрескожный, внутримышечный, местный, интраназальный или другой подходящий путь, включающий, но без ограничения, введение путем инъекции, ингаляции, инсуффляции или проглатывание.

Еще одно достоинство настоящего изобретения может включать иммуногенные композиции, которые могут дополнять профилактический или терапевтический эффект(ы) обычных вакцин, таких как вакцины против вируса гриппа, и, следовательно, иммуногенное соединение можно вводить вместе с одной или несколькими обычными вакцинами для усиления иммунитета к вирусу гриппа или патогенному микробу. Конкретнее, иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут вводиться в качестве бустера одной или нескольких обычных вакцин, включающих, например, но без ограничения, обычные вакцины против вируса гриппа, или в виде системы, комбинированной с такой вакциной(ами).

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут быть предоставлены в чистом виде, например, в виде первичной противомикробной вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции и вакцины используют в способе усиления примирования, в частности, если иммунный ответ, индуцированный введением однократной дозы инактивированной вакцины, не является достаточно сильным или устойчивым для обеспечения требуемого уровня защиты. Следовательно, иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению формируют и адаптируют для защиты от типов микробов, таких как штаммы вируса гриппа, которые присутствуют в примирующей вакцине, и, предпочтительно также, по-видимому, усиливают перекрестную защиту от других микробов, таких как другие подтипы и типы вируса гриппа. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что это происходит путем стимулирования иммунных ответов на консервативные эпитопы, обеспечивая, тем самым, дополнительную защиту от дрейфа и/или изменчивости вируса гриппа. Бустер-иммунизация (бустинг) обычно включает многократное введение для усиления иммунного ответа на антиген вакцины. Способ «усиления примирования» представляет собой введение одного и того же антигена в двух различных векторах, например, предоставляемых друг за другом. В этом способе воздействия антигена в первом векторе «примирует» иммунную систему; повторное подвергание воздействию того же антигена во втором векторе усиливает ответ. Этот способ был также назван «гетерологичным бустингом» для отличия его от обычного способа гомологичного бустинга, в котором две или более доз одной и той же вакцины предоставляют последовательно с использованием одного и того же вектора.

При бустинге, являющемся предпочтительным, используют план двухступенчатой доставки вакцины для стимулирования сильных клеточных иммунных ответов (ответов, основанных на Т-клетках, в отличие от В-клеточных ответов - образовании антител). В некоторых вариантах осуществления способ усиления примирования включает ДНК-вакцину, такую как вариант вакцины против гриппа, например, обычную вакцину против гриппа, предлагаемую ежегодно, на ступени примирования и основанный на вирусе подход для бустинга. Способы усиления примирования широко известны и объяснены, например, в Schneider et al., 2002; Gonzalo et al., 2002, Tanghe, 2001, и патенте США № 6500432 (все из которых включены в данное описание в целом путем ссылки на них).

Антигены и вакцины по настоящему изобретению можно необязательно составить с одной или несколькими другими вакцинами или антигенными композициями для получения «комбинации» или «поливалентных» композиций и вакцин, как известно средним специалистам в данной области техники. Затем можно вакцинировать пациента комбинированной вакциной или последовательно, или одновременно для создания иммунного ответа против консервативного вируса гриппа, а также других антигенов в комбинированных вакцинах.

Другой важный аспект настоящего изобретения относится к способам применения описанных в настоящем описании иммуногенных композиций для доставки одного или нескольких терапевтических средств для лечения или уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов инфекции или заболевания у млекопитающего. Такие способы обычно включают введение нуждающемуся в этом млекопитающему и, в частности, человеку одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в количестве и в течение периода времени, которые являются достаточными для лечения, уменьшения интенсивности или уменьшения тяжести, продолжительности или степени такого заболевания или такой инфекции у такого млекопитающего.

Способы и композиции по настоящему изобретению можно также использовать для предупреждения, профилактики и/или вакцинации животного с наличием, подозрением на наличие, подверженного риску развития одной или нескольких инфекций и/или заболеваний, или у которого диагностировано одна или несколько инфекций и/или заболеваний, или до, во время, или после диагностирования или начала одного или нескольких клинических симптомов заболевания или одного или нескольких его симптомов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу создания иммунного ответа или Т-клеточной иммунной реакции у животного и, в частности, у млекопитающего, предпочтительно, человека. В широком смысле способ относится к введению животному по крайней мере первой иммуногенной композиции, которая включает по крайней мере первый выделенный пептид или по крайней мере первый сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий такой пептид, причем пептид включает первую непрерывную аминокислотную последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52, а конкретнее, непрерывная аминокислотная последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO:52 является особенно предпочтительной.

Настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам и полипептидам, которые могут иметь любую промежуточную длину в предпочтительных интервалах, таким как, например, пептиды, длина которых составляет приблизительно 75, приблизительно 70, приблизительно 65, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 50, приблизительно 45, приблизительно 40, приблизительно 35, приблизительно 30, приблизительно 25, приблизительно 20 или даже приблизительно 15 аминокислот или около этого, а также пептиды, имеющие промежуточные длины, включающие все целые числа внутри этих интервалов (например, в альтернативном случае длина пептидов может составлять приблизительно 79, приблизительно 78, приблизительно 77, приблизительно 76, приблизительно 74, приблизительно 73, приблизительно 72, приблизительно 71 и т.д. аминокислот). В конкретных вариантах осуществления, когда предпочтительным является пептид меньшей длины, его длина может составлять 9 или приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или даже приблизительно 20 аминокислот или около этого при условии, что пептид включает по крайней мере первую непрерывную аминокислотную последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52.

Одиночный иммуногенный пептид или полипептид может содержать только одну из непрерывных аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем описании, или в альтернативном случае одиночный пептид может включать множество непрерывных аминокислотных последовательностей в соответствии с любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52. В действительности, пептид может включать множество одинаковых непрерывных аминокислотных последовательностей, или он может включать одну или несколько различных непрерывных аминокислотных последовательностей, описанных в SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52. Например, одиночный пептид длиной, составляющей от 9 до приблизительно 50 аминокислот, мог бы включать один пептидный эпитоп, описанный в настоящем описании, или мог бы включать 2, 3, 4 или даже 5 последовательностей отличных эпитопов, описанных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52. Альтернативно, одиночный пептид длиной, составляющей от 9 до приблизительно 50 аминокислот, мог бы включать 2, 3, 4 или даже 5 идентичных последовательностей эпитопов, описанных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52.

В одном из приводимых в качестве примера варианте осуществления пептидная композиция содержит по крайней мере первый выделенный иммуногенный пептид длиной, составляющей от 9 до приблизительно 80 аминокислот, или по крайней мере первый сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий такой иммуногенный пептид, причем пептид включает по крайней мере две или более непрерывных аминокислотных последовательностей, выбираемых из группы, состоящей из любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52.

Помимо антигенных пептидов и полипептидов, которые включают одиночный пептидный эпитоп, настоящее изобретение также относится к полипептидным композициям, которые включают 3, 4, 5, 6 или более пептидных эпитопов и/или полинуклеотидов, кодирующих такие поливалентные иммуногенные пептидные композиции. Композиции, включающие такие множества разновидностей пептидных эпитопов, особенно желательны при составлении терапевтических агентов, которые включают множество антигенов, имеющих (а) две или более различных непрерывных аминокислотных последовательностей, описанных в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52, и/или множество полинуклеотидов, кодирующих такие иммуногенные пептидные композиции; или (b) два или более повтора по крайней мере первой последовательности эпитопа или антигена, которая включает, по существу состоит или, альтернативно, состоит из аминокислотных последовательностей в соответствии с любой одной или несколькими из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52, и/или множество полинуклеотидов, кодирующих такие антигенные пептиды. Независимо от источника конкретных являющихся антигенными пептидами и полинуклеотидами соединений, настоящим изобретением, в частности, предусматривается применение одного, двух, трех или четырех отличных пептидов, полинуклеотидов или их производных, вплоть до множества таких соединений и в том числе такое множество.

Дополнительными пептидами в таких композициях могут быть все пептиды приблизительно одинакового размера и/или с приблизительно одинаковой первичной аминокислотной последовательностью, или в альтернативном случае пептиды могут значительно отличаться по длине и/или первичной аминокислотной последовательности. Такие композиции могут, кроме того, включать один или несколько дополнительных компонентов, таких как, например, фармацевтически приемлемый наполнитель, буфер или реагент, подробно описанный в настоящем описании ниже. Такие композиции могут также необязательно содержать по крайней мере первый иммуностимулятор или по крайней мере первый адъювант, описанный в настоящем описании. Такие иммуностимуляторы и адъюванты, предпочтительно, усиливают Т-клеточную иммунную реакцию у человека и могут, предпочтительно, включать монтанид, цитокин, адъювант Ribi, сапонин, микрофлюидизированный адъювант, иммуностимулирующий комплекс, инактивированный токсин или любую их комбинацию. Как подробнее описывается в настоящем описании ниже, композиции можно составить для диагностических или терапевтических применений, включающих их включение в один или несколько диагностических, терапевтических или профилактических наборов для комплектования клиник и/или перепродажи, при этом эти композиции подходят для введения млекопитающему, такому как человек, любым подходящим путем введения, но парентеральный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, интраназальный, чрескожный и оральный пути являются особенно предпочтительными.

Композиции могут, кроме того, необязательно содержать одно или несколько маркирующих веществ, одно или несколько диагностических средств, один или несколько контрольных реагентов и/или одно или несколько терапевтических средств. В случае диагностических средств композиция может, кроме того, необязательно включать одну или несколько обнаруживаемых меток, которые можно использовать как в in vitro, так и/или in vivo в диагностических, терапевтических и профилактических методиках.

Как отмечено выше, пептиды по настоящему изобретению могут содержать один или несколько вариантов аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем описании. Как используется в настоящем описании, «вариант» пептида представляет собой пептид, который отличается от конкретной первичной аминокислотной последовательности таким наличием одной или нескольких замен, делеций, добавлений и/или вставок, что иммуногенность пептида в значительной степени сохраняется (т.е. способность варианта к взаимодействию с антигенспецифическими антисыворотками и/или Т-клеточными линиями или клонами не уменьшается в значительной степени относительно природного пептида). Другими словами, способность варианта к взаимодействию с антигенспецифическими антисыворотками и/или Т-клеточными линиями или клонами может быть увеличена или не изменена относительно пептида, из которого был получен вариант.

Предпочтительно, биологическая активность варианта пептида не будет уменьшена более чем на приблизительно 1%, и все еще предпочтительно, она не будет уменьшена более чем на приблизительно 2%, относительно биологической активности немодифицированного пептида. Более предпочтительно, биологическая активность варианта пептида не будет уменьшена более чем на приблизительно 3%, и все еще более предпочтительно, она не будет уменьшена более чем на приблизительно 4%, 5%, 6%, 7%, 8% или 9%, относительно биологической активности немодифицированного пептида. Еще более предпочтительно, биологическая активность варианта пептида не будет уменьшена более чем на 10%, и еще более предпочтительно, она не будет уменьшена более чем на приблизительно 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%, относительно биологической активности соответствующего немодифицированного пептида.

На основе гомологии последовательностей в %, предпочтительные варианты пептидов по настоящему изобретению включают пептиды, длина которых составляет от 9 до приблизительно 100 аминокислот, и которые включают по крайней мере область первой последовательности, которая идентична на по крайней мере 75% по крайней мере одной из аминокислотных последовательностей, описанных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52, и более предпочтительно, пептиды, которые содержат по крайней мере область первой последовательности, которая идентична на по крайней мере 80%, более предпочтительно, на по крайней мере 85% и, даже более предпочтительно, на по крайней мере 90% по крайней мере одной из аминокислотных последовательностей, описанных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52. Особенно предпочтительными вариантами пептидов по настоящему изобретению являются пептиды, которые содержат по крайней мере область первой последовательности, которая идентична на по крайней мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по крайней мере одной из аминокислотных последовательностей, описанных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52.

Обычно такие варианты пептидов можно получить путем модифицирования одной из пептидных последовательностей, описанных в настоящем описании, и, в частности, путем модифицирования первичной аминокислотной последовательности одного или нескольких пептидных эпитопов, описанной в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52. Эти эквивалентные по биологической функции пептиды могут включать первичные аминокислотные последовательности, которые отличаются от исходных пептидных последовательностей, описанных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52, наличием одной или нескольких консервативных аминокислотных замен.

В связи с настоящим изобретением было установлено, что можно осуществить относительное небольшое количество консервативных или нейтральных замен (например, 1 или 2) внутри последовательности пептидных эпитопов, описанных в настоящем описании, без изменения в значительной степени биологической активности пептида. В некоторых случаях замена одной или нескольких аминокислот в конкретном пептиде может увеличить или иначе улучшить способность пептида к вызову иммунного ответа или Т-клеточной иммунной реакции у животного, которому предоставлена композиция, включающая модифицированный пептид, или полинуклеотид, кодирующий этот пептид. Как правило, подходящие замены можно идентифицировать, используя компьютерные программы, как описано в настоящем описании ниже, и эффект таких замен можно подтвердить на основе способности модифицированного пептида к взаимодействию с антисыворотками и/или Т-клетками, как описывается в настоящем описании. Соответственно, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления пептид, использующийся в описанных в настоящем описании способах диагностики и лечения, может включать первичную аминокислотную последовательность, в которой один или два или более аминокислотных остатков (в зависимости от длины) или исключены, или заменены одной или двумя или более аминокислотами для замены из условия, чтобы способность модифицированного пептида к взаимодействию с антигенспецифическими антисыворотками и/или Т-клеточными линиями или клонами была не значительно меньше, чем способность немодифицированного пептида. Такие примерные замены, предпочтительно, находятся внутри одного или нескольких МНС-связывающих сайтов в пептиде.

Как описано выше, предпочтительными вариантами пептидов являются пептиды, которые содержат одну или две или более консервативных замен. «Консервативная замена» представляет собой замену, при которой аминокислоту используют вместо другой аминокислоты со схожими свойствами из условия, чтобы в соответствии с ожиданиями среднего специалиста в области химии пептидов вторичная структура и гидрофобность пептида были по существу не изменены на основе предоставленного в настоящем описании руководства. Как правило, замены аминокислот можно осуществить на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности, амфипатической природе остатков или любой их комбинации. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают, без ограничения, аспарагиновую кислоту и глютаминовую кислоту, положительно заряженные аминокислоты включают, без ограничения, лизин и аргинин, а аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, имеющими схожие величины гидрофильности, включают, без ограничения, лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глютамин; и серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Примеры замен аминокислот, которые представляют консервативную замену, включают (1) замену одного или нескольких остатков Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser или Thr одним или несколькими остатками из этой же группы; (2) замену одного или нескольких остатков Cys, Ser, Tyr или Thr одним или несколькими остатками из этой же группы; (3) замену одного или нескольких остатков Val, Ile, Leu, Met, Ala или Phe одним или несколькими остатками из этой же группы; (4) замену одного или нескольких остатков Lys, Arg или His одним или несколькими остатками из этой же группы; и (5) замену одного или нескольких остатков Phe, Tyr, Trp или His одним или несколькими остатками из этой же группы.

Вариант может также, или альтернативно, содержать неконсервативные замены, например, при замещении одного из аминокислотных остатков из группы (1) аминокислотным остатком из группы (2), группы (3), группы (4) или группы (5). Варианты можно также (или альтернативно) модифицировать, например, с помощью делеции или добавления аминокислот, которые оказывают минимальное воздействие на иммуногенность, вторичную структуру и гидрофобность природного пептида.

Наборы, содержащие одну или несколько описанных в настоящем описании иммуногенных композиций или включающие таковые фармацевтические композиции и инструкции в отношении использования набора для терапевтического, профилактического и/или другого клинического воплощения(ий), также представляют предпочтительные аспекты описания настоящего изобретения. Такие наборы могут включать одну или несколько описанных иммуногенных композиций или вакцин, или самих по себе, или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими соединениями, лекарственными препаратами и т.п. Наборы в соответствии с настоящим изобретением могут быть упакованы для коммерческого распространения или могут, кроме того, необязательно включать одно или несколько средств доставки композиции(й) животному (например, шприцы, средства для инъекции или т.п.). Такие наборы могут быть терапевтическими наборами для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности инфекции или заболевания или их симптомов и могут включать инструкции в отношении использования набора в терапевтической, профилактической или диагностической схеме или протоколе лекарственного лечения.

Контейнер(ы) для таких наборов может, как правило, включать по крайней мере один пузырек, пробирку, флакон, бутылочку, шприц или другой контейнер, в который иммуногенный пептид или вакцинная композиция(и) может быть помещен и, предпочтительно, подходящим образом распределен по аликвотам для введения животному. Если также требуется вторая иммуногенная композиция или первое противовирусное или противомикробное соединение, набор может также содержать вторую иммуногенную композицию или первое противовирусное или противомикробное соединение во втором отличном контейнере или в единственном контейнере с разрушаемым или неразрушаемым барьером для изоляции двух компонентов. Альтернативно, множество отличных иммуногенных композиций(и) и/или отличных противовирусных или противомикробных соединений(я) можно приготовить в одной композиции и можно упаковать в один контейнер, пузырек, флакон, шприц, катетер, канюлю, бутылочку, пробирку, ампулу или другой подходящий контейнер. Набор может также включать больший контейнер, такой как коробка, который включает отмеченные выше контейнеры вместе с другим оснащением, инструкциями и т.п.

Другие важные аспекты настоящего изобретения относятся к способам применения описанных в настоящем описании иммуногенных композиций (а также включающих их композиций) для получения лекарственных средств для профилактики, лечения или уменьшения интенсивности заболевания или его симптомов у животного, такого как являющееся позвоночным млекопитающее. Применение описанных в настоящем описании иммуногенных композиций также предусматривается при терапии и/или профилактики одного или нескольких заболеваний микробной или вирусной этиологии.

Такое применение, как правило, включает введение нуждающемуся в этом животному одной или нескольких описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в количестве и в течение периода времени, достаточных для профилактики, лечения или контролирования одного или нескольких заболеваний или их симптомов у пораженного животного. Часть настоящего изобретения также образуют композиции, включающие одну или несколько описанных в настоящем описании иммуногенных композиций, и, в частности, композиции, которые, кроме того, содержат по крайней мере первый фармацевтически приемлемый наполнитель, для применения для лечения или профилактики одного или нескольких заболеваний микробной или вирусной этиологии.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде одновалентных или, альтернативно, в виде двухвалентных, трехвалентных или даже поливалентных иммуногенов или вакцин. Одновалентный иммуноген будет, предпочтительно, включать одиночный антигенный пептид или полипептид по настоящему изобретению (или полинуклеотид, который кодирует и способен к экспрессии такого антигенного пептида или полипептида), который способен к вызову иммунного ответа после введения в организм млекопитающего. Альтернативно, одновалентная иммуногенная композиция может включать фрагмент, вариант или производное антигенного пептида или полипептида, который способен к вызову иммунного ответа у млекопитающего, или полинуклеотид, который кодирует и способен к экспрессии такого антигенного фрагмента, варианта или производного и, следовательно, вызову такого иммунного ответа у такого млекопитающего.

Двухвалентный иммуноген или вакцинная композиция будет, предпочтительно, включать (или в форме антигенного полипептида, или в виде полинуклеотида, который кодирует и способен к экспрессии такого антигенного полипептида) два различных, происходящих из вируса гриппа или микробов антигенных полипептидов, их фрагментов, вариантов или производных, при этом каждый из них способен к вызову иммунного ответа у млекопитающего. Трехвалентная или, кроме того, поливалентная иммуногенная композиция или вакцина будет включать три или более антигенных пептидов, соответственно, (или пептидных эпитопов или их фрагментов, вариантов или производных), или в выделенной форме, или кодируемых одним или более полинуклеотидами по настоящему изобретению. Такие поливалентные композиции могут включать индивидуальные пептидные эпитопы или, альтернативно, могут включать одиночную полипептидную последовательность, которая включает две или более последовательностей пептидных эпитопов внутри первичной аминокислотной последовательности полипептида.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть приготовлены сами по себе или могут необязательно, кроме того, включать вектор, подходящий для введения в являющегося млекопитающим хозяина и, предпочтительно, для экспрессии в нем. Такой вектор может необязательно включать один или несколько подходящих промоторов, энхансеров, посттранскрипционных или посттрансляционных регуляторных элементов и т.п. (или любую требуемую комбинацию из двух или более таких элементов) для содействия в экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине млекопитающего и трансляции кодируемой последовательности иммуногенного пептида или полипептида в количестве и в течение периода времени, достаточных для индукции иммунного ответа у такого млекопитающего.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для упрощения понимания принципов настоящего изобретения далее будут приведены ссылки на варианты осуществления, или примеры, проиллюстрированные на чертежах, а для описания этого будут использоваться конкретные формулировки. Несмотря на это следует понимать, что приведенные варианты осуществления объема настоящего изобретения не предназначены для ограничения. Предполагаются любые изменения или дополнительные модификации в описанных вариантах осуществления и любые дополнительные применения принципов настоящего изобретения, описанного в настоящем описании, которые, по-видимому, будут очевидны среднему специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Нижеприведенные чертежи образуют часть описания настоящего изобретения и приведены для демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять исходя из следующего описания, взятого в соединении с сопроводительными чертежами, в которых те же номера позиций означают те же элементы, и в которых

Фиг. 1 представляет собой генетическое изображение частицы вируса гриппа, на котором белки М2, HA и NA показаны на поверхности молекулы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 2 представлены некоторые сведения о некоторых пептидных последовательностях, обнаруживаемых внутри белков М2 и М1 частицы вируса гриппа, а также в других белках вируса гриппа, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 3 представляет собой графическую иллюстрацию образования IgG против H3N2 в сыворотках на 28 день после начального примирования (иммунизации) тестируемых групп вводимым интраназально или внутримышечно H3N2 или вводимым внутримышечно живым H1N1.

Фиг. 4 представляет собой графическую иллюстрацию образования IgG против H1N1 в сыворотках на 28 день после начального примирования (иммунизации) тестируемых групп вводимым интраназально или внутримышечно вирусом гриппа.

Фиг. 5 представляет собой графическую иллюстрацию образования IgG против живого H3N2 в экспериментальных группах с течением времени, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, и, в частности, описанными в примере 2.

Фиг. 6 представляет собой графическую иллюстрацию количества нейтрализующих антител, образуемых в ответ на живой H3N2 (Wuhan) в экспериментальных группах с течением времени, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, и, она демонстрирует, что антигенный пептид PF2001 повышает образование ингибирующих вирус антител.

На фиг. 7 описываются приводимые в качестве примеров эпитопы NA в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 8 демонстрируется общий вид презентации предпочтительного эпитопа NA на полипептиде NA.

На фиг. 9 демонстрируется общий вид презентации предпочтительного эпитопа HA на полипептиде HA. Первичные аминокислотные последовательности консервативных эпитопов НА Н1, Н3, Н5 были совмещены, используя 75 полевых штаммов вируса гриппа А Н1 и Н3 и несколько репрезентативных штаммов Н5, последовательности НА которых имеются в научной литературе. Были также включены последовательности вакцинного и ссылочного штаммов Н3 и Н1, а также пептиды Н5, представляющие монофилетические группы 1, 1', 2 и 3. Трехмерную структуру белка 2007/08-вакцинного штамма H3N2 A/Wisconsin/67/2005 предсказывали на основе ближайшего гомолога, имеющегося в базе данных по последовательностям белков с использованием Swiss PDF Viewer. Консервативные остатки, наблюдаемые при совмещении последовательностей, отмечены в зрелом белке НА.

На фиг. 10А и фиг. 10В демонстрируются результаты вакцинации PF2001 и пептидом М2е против вируса гриппа А (H3N2) в соответствии с настоящим изобретением. Фиг. 10А представляет собой ELISA в планшете с H2N2, для групп животных 1-7 в день 0, 28 и 42; в то время как фиг. 10В представляет собой ELISA в планшете с H1N1, для групп животных 1-7 в день 0, 28 и 42. Показанные группы животных соответствуют группам, изложенным в примерах и в комментарии к фиг. 5.

На фиг. 11А и фиг. 11В демонстрируются результаты вакцинации групп животных 1-7 в день 0, 28 и 42, полученные при проверке сывороток хлопковых хомяков в соответствии с настоящим изобретением на вирусе гриппа А H1N1 New Caledonia (фиг. 11А) и H3N2 Wuhan (фиг. 11В).

Фиг. 12 представляет собой графическую иллюстрацию эффектов дозы антигенного пептида на средние для группы значения оптической плотности для сывороток, проверенных на BSA-конъюгированном пептиде № 5907, 5910, 5911, 5912 и 5914 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 13 представляет собой графическую иллюстрацию эффектов дозы антигенного пептида на средние для группы значения оптической плотности для сывороток (в разведении 1:100) при проверке на вирусе гриппа Wuhan, на которой сравниваются значения до иммунизации со значениями дня 42 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 14 представляет собой графическую иллюстрацию индукции INF-гамма в спленоцитах (представленной в виде кратного увеличения после индукции в течение 72 ч пептидом 5910 или вирусом гриппа Wuhan), на которой сравниваются дозы in vitro введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 15 представляет собой графическую иллюстрацию индукции INF-гамма в спленоцитах (представленной в виде кратного увеличения после индукции в течение 72 ч пептидом 5911 или вирусом гриппа Wuhan), на которой сравниваются дозы in vitro введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 16 представляет собой диаграмму средних для группы значений оптической плотности при проверке на PF2001 (для сывороток в разведении 1:100), на которой сравниваются дозы in vitro введения в 5 или 20 мкг, в день 0, 14, 28 и 42 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 17 представляет собой диаграмму средних для группы значений оптической плотности при проверке на Pn14 (для сывороток в разведении 1:100), на которой сравниваются дозы in vitro введения в 5 или 20 мкг, в день 0, 14, 28 и 42 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 18 представляет собой диаграмму значений оптической плотности сывороток (в разведении 1:100) восьми индивидуальных мышей при проверке на вирусе гриппа Wuhan, на которой сравниваются дозы in vitro введения в 5 или 20 мкг, в день 0 и 42 в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 19 демонстрируется индукция INF-гамма в спленоцитах мыши, представленная в виде кратного увеличения относительно контроля, после обработки в течение 72 ч пептидом 5907 относительно in vitro концентрации пептида, при сравнении доз in vivo введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 20 демонстрируется индукция INF-гамма в спленоцитах мыши, представленная в виде кратного увеличения относительно контроля, после обработки в течение 72 ч пептидом 5910 относительно in vitro концентрации пептида, при сравнении доз in vivo введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 21 демонстрируется индукция INF-гамма в спленоцитах мыши, представленная в виде кратного увеличения относительно контроля, после обработки в течение 72 ч пептидом 5911 относительно in vitro концентрации пептида, при сравнении доз in vivo введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 22 демонстрируется индукция INF-гамма в спленоцитах мыши, представленная в виде кратного увеличения относительно контроля, после обработки в течение 72 ч пептидом 5912 относительно in vitro концентрации пептида, при сравнении доз in vivo введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 23 демонстрируется индукция INF-гамма в спленоцитах мыши, представленная в виде кратного увеличения относительно контроля, после обработки в течение 72 ч пептидом 5914 относительно in vitro концентрации пептида, при сравнении доз in vivo введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 24 демонстрируется индукция IL-4 в спленоцитах мыши, представленная в виде кратного увеличения относительно контроля, после обработки в течение 72 ч пептидом 5907 относительно in vitro концентрации пептида, при сравнении доз in vivo введения в 5 или 20 мкг в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 25 иллюстрируются результаты средних значений оптической плотности до иммунизации и в день 42, полученные при проверке на вирусе гриппа Wuhan сывороток в разведении 1:100, полученных при использовании пяти антигенных пептидных композиций, описанных в настоящем описании, пептида 5907, 5910, 5911, 5912 и 5914 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 26А, фиг. 26В и фиг. 26С демонстрируют множественные совмещения аминокислотных последовательностей подтипов вируса гриппа А: вирусных штаммов Н1 (фиг. 26А), Н3 (фиг. 26В) и Н5 (фиг. 26С), представляющих высококонсервативную область пептидного эпитопа GNL(P)IAP белков. Для каждого подтипа представлены репрезентативные ссылочные и вакцинные штаммы на протяжении нескольких лет. Звездочкой (*) отмечены нынешние и прежние вакцинные штаммы вируса гриппа.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Ниже описаны иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения. Для большей ясности не все признаки фактического осуществления приводятся в этом описании изобретения. Конечно, будет понятно, что при разработке любого такого фактического осуществления должны быть приняты многочисленные конкретные для осуществления решения для достижения конкретных целей изобретателя, такие как соответствие ограничивающим условиям, связанным с системой и бизнесом, которые будут меняться от одного осуществления к другому. Кроме того, будет понятно, что такие работы по разработке, вероятно, будут сложными, и требующими много времени, но будут, вероятно, рутинной процедурой для средних специалистов в данной области техники, пользующихся этим описанием изобретения.

Благодаря настоящему изобретению обеспечиваются многочисленные преимущества по сравнению с предшествующим уровнем техники. Следующие преимущества, технологии и примеры, как правило, обсуждаются в настоящем описании со ссылкой на вирус гриппа, хотя они применимы ко всем видам и комбинациям микроорганизмов, в том числе вирусам. В отличие от обычной вакцины против гриппа, обладающей эффективностью, которая является в высокой степени штаммо-специфической и, следовательно, ограниченной, настоящее изобретение индуцирует иммунитет к совокупности типов, подтипов и штаммов вируса гриппа, даже если они подвергаются изменчивости или дрейфу. В отличие от обычных вакцин, которые необходимо получать ежегодно для борьбы с конкретными штаммами вируса гриппа и, как правило, не используются год за годом, настоящее изобретение как правило можно использовать для индукции иммунной защиты против вируса гриппа в течение больших периодов времени или периодически в качестве бустера. Как используется в настоящем описании, должно быть понятно, что получение или индукция иммунитета также включает повышение ранее существовавшего иммунитета, вызванного обычными вакцинами, или природного иммунитета. Поскольку вакцина по настоящему изобретению включает последовательности эпитопов из пептидов вируса гриппами, имеющих консервативные, высококонсервативные, почти инвариантные или инвариантные аминокислотные последовательности, устраняется необходимость в ежегодном штаммо-специфическом изменении состава. При включении консервативных эпитопов из различных белков микроорганизмов (например, в случае вируса гриппа эпитопов из М2, НА и NA, и т.д.) иммунный ответ может быть расширен для множества отдельных антигенных локусов микроорганизма, уменьшая, тем самым, вероятность того, что микроорганизм будет подвергаться результативному мутированию во избежание иммунного ответа, вызванного введенной вакциной.

С помощью исследований на мышах было установлено, что моноклональные антитела против природных полипептидных последовательностей, присущих эктодомену матриксного белка 2 («М2е»), предоставляют иммунитет к множеству подтипов вируса гриппа А (Gemini Science, Inc., частное сообщение). Кроме того, установлено, что пептидные последовательности, происходящие из отобранных полипепдов Plasmodium falciparum и Plasmodium berghei (двух этиологических факторов малярии у людей и мышей), синтезированные коллинеарно с помощью твердофазного белкового синтеза (SPPS) с двумя универсальными для людей Т-клеточными эпитопами из столбнячного анатоксина, эпитопами 830-843 и 947-967 (Р2 и Р30), способны к стимулированию PBL человека и Т-клеточных клонов, специфичных для столбнячного анатоксина (Valmori et al., 1992).

Обычные противомикробные вакцины обычно направлены на эпитопы или антигены, которые являются в высокой степени специфичными для штамма или типа. Соответственно, производители обычных вакцин должны знать о конкретных, циркулирующих в текущий момент штаммах или микробных типах (подтипах), которые должны быть охвачены для того, чтобы приготовить вакцину, которая будет обеспечивать эффективный иммунитет против циркулирующих микробов в популяции. С помощью исследований, в которых использовалась липотейхоевая кислота (LTA), было установлено, что антитела против антигена, консервативного для многих бактерий, вызывают характерный для определенной группы и защитный иммунитет против ряда бактерий.

Поскольку существует множество штаммов и подтипов вируса гриппа, а вакцины, разрешенные в настоящее время для использования у человека, фокусируются на всем вирионе или вирусных субъединицах, которые индуцируют иммунитет к некоторым, но не всем, штаммам или подтипам вируса гриппа, требовалось разработать новые поливалентные противогриппозные вакцины гриппа.

Путем идентификации и отбора консервативных эпитопов или областей из белков в пределах различных подтипов вируса гриппа отобранные аминокислотные последовательности можно было бы получить (или отдельно, или в комбинации с другими антигенами вируса гриппа, или даже другими микробными антигенами) с образованием вакцин или вакцинных композиций против множества подтипов вируса гриппа (или множества микробов), пригодных для предупреждения инфекции, вызванной рядом различных видов, с помощью единственной вакцины.

Мишеневые антигены были составлены, используя белки вируса гриппа, включающие белки M1, M2, PB1, PB2, PA, HA и NA. Были идентифицированы консервативные области из эктодомена М2, М2е, и как HA, так и NA.

ВИРУС ГРИППА

Грипп обычно вызывается инфекцией двух родов вируса гриппа: Influenzavirus А и Influenzavirus В. Третий род вируса гриппа, Influenzavirus С, существует в виде одного вида, вируса гриппа С, который вызывает только слабые, общие, схожие с простудой симптомы у чувствительных млекопитающих.

Инфицирование вирусом гриппа А и вирусом гриппа В обычно начинается с поверхностей слизистых оболочек верхних дыхательных путей чувствительных млекопитающих. Репликация вирусов в основном ограничивается верхними дыхательными путями, но может распространяться на нижние дыхательные пути и вызывать очаговую пневмонию, которая может быть летальной.

Вирус гриппа А, в частности, имеет множество различных серотипов. В настоящее время известно 16 вариаций HA и 9 вариаций NA в пределах вирусов гриппа А, что дает, таким образом, 144 возможных серотипов «HN» вируса гриппа А, основываясь на вариациях в пределах только этих двух белков. Полагают, что только небольшое число этих комбинаций циркулирует внутри чувствительных популяций в любое конкретное время. После возникновения и распространения нового штамма или серотипа вируса гриппа историческая тенденция такова, что он закрепляется в чувствительной популяции и затем переносится или «циркулирует» в течение многих лет, вызывая сезонные эпидемии гриппа.

Три рода вируса гриппа: Influenzavirus А, Influenzavirus В и Influenzavirus С находятся в составе семейства Orthomyxoviridae. Каждый из этих родов содержит единственный вид вируса гриппа: род Influenzavirus А состоит из одного вида, вируса гриппа А, который включает все штаммы вируса гриппа, в настоящее время циркулирующие среди людей, включающие, например, но без ограничения, серотипы H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2 и H10N7.

Род Influenzavirus В состоит из одного вида, вируса гриппа B, только один серотип которого известен в настоящее время. Вирус гриппа В является почти исключительно патогеном человека, но значительно менее распространенным и менее генетически разнообразным, чем штаммы вируса гриппа А. Вследствие ограниченного генетического разнообразия у большинства людей обнаруживается некоторая степень иммунитета к вирусу гриппа В в раннем возрасте, однако частота мутаций вируса является достаточно высокой для препятствования длительному иммунитету у большинства людей, но не достаточно высокой, чтобы допустить пандемическую инфекцию, вызванную вирусом гриппа В, в популяциях людей.

Род Influenzavirus С также состоит из одного вида, названного вирусом гриппа С, только один серотип которого известен в настоящее время. Известно, что этот серотип инфицирует как приматов, так и свиней, и хотя инфицирования вирусом гриппа С являются редкими, возникающая в результате болезнь может быть тяжелой. Однако эпидемии, вызванные вирусом гриппа С, не являются нечастыми в популяциях, подвергнутых его воздействию, вследствие его быстрой передаваемости среди людей, имеющих близкий контакт.

«Вирус гриппа человека» обычно относится к тем серотипам вируса гриппа, которые передаются среди людей. Известно только три серотипа HN вируса гриппа А, которые широко циркулируют среди людей в настоящее время: H1N1, H2N2 и H3N2. Многие люди приобрели по крайней мере некоторую степень иммунитета к этим подтипам. Однако известно, что все вирусы гриппа часто мутируют и изменяются. Известно, что вирусы гриппа инфицируют водоплавающую птицу и свинью и циркулируют среди этих хозяев, образуя место образования новых подтипов и штаммов, независимое от популяций людей. Поскольку многие серотипы (и, в частности, вновь возникающие подтипы) имеют нулевой или низкой уровень распространения в популяциях людей, у этих популяций людей нет природного иммунитета против них, или они обладают незначительным иммунитетом. Такую популяцию именуют популяцией, не подвергавшейся воздействию таких серотипов. Соответственно предполагают, что вирусы гриппа с течением времени адаптируются с образованием одного и нескольких высоковирулентных штаммов, которые будут инфицировать не подвергавшихся воздействию людей и распространяться среди них, как широко сообщалось в ведущих мировых изданиях.

Например, сообщалось о высоковирулентном подтипе H5N1 вируса гриппа (именуемом людьми вирусом «птичьего гриппа»), достаточно мутировавшим, чтобы стать трансмиссивным от птиц-хозяев людям. Поскольку в прошлом этот подтип ограничивался инфицированием популяцией птиц, для создания иммунитета внутри популяции людей существует незначительное наследие инфицирования или его нет. Поэтому предполагают, что популяция людей является в высокой степени чувствительной к другим штаммам Influenzavirus, например, H5N1.

На сегодняшний день серотип H5N1, по-видимому, не мутировался достаточно, чтобы стать трансмиссивным от человека к человеку. Тем не менее, поскольку вирусы гриппа постоянно адаптируются, существует опасение, что возникнет вирус H5N1 или другой вирулентный штамм или серотип вируса гриппа, который будет способен к инфицированию людей и легкому распространению от одного человека к другому. Предполагают, что если бы вирус H5N1 приобрел способность к легкому распространению от человека к человеку, то начнется всемирная вспышка заболевания (т.е. пандемия), по-видимому, приводя к миллионам смертей.

Ежегодные вспышки гриппа возникают в результате «антигенного дрейфа». Антигенный дрейф вызван мутациями внутри антигенных (т.е. стимулирующих иммунитет) частей вирусных белков в рамках вирусных подтипов, циркулирующих в популяциях хозяев, которые меняют способность хозяина к распознанию и эффективной защите от инфицирующего вируса, даже когда вирус циркулировал в сообществе в течение нескольких лет. Антигенный дрейф, который снижает существующий иммунитет в популяции хозяев, обычно происходит внутри так называемых «иммунодоминантных» антигенов или областей. Иммунодоминантными антигенами являются такие относящиеся к патогену антигены, которые наиболее легко и наиболее быстро распознаются иммунной системой хозяина и, следовательно, ответственны за подавляющее большинство общего иммунного ответа на проникающий патоген. Как правило, иммунодоминантные антигены существуют в пределах областей патогена, которые наиболее подвержены воздействию внешних условий, т.е. находятся на внешних поверхностях или выступающих элементах патогена, а значит, наиболее легко доступны иммунной системе хозяина.

В случае вируса гриппа иммунодоминантные белки HA и NA выступают относительно основного капсида вирусной частицы, а значит, они имеют склонность к взаимодействию наиболее сильно с внутренней средой хозяина и к влиянию на иммунный ответ хозяина. Абсолютно установлено, что возникающие в геноме микроба мутации, защищающие микроба от иммунной системы хозяина, затрагивают иммунодоминантные антигены.

С другой стороны, неиммунодоминантными антигенами являются такие антигены, которые способны к вызову иммунного ответа, но ответственны только за небольшую степень общего иммунного ответа. Полагают, что это происходит, потому что неиммунодоминантные антигены по крайней мере отчасти защищены от иммунной системы хозяина, как в случае антигена, который находится в углублении или складке микробной поверхности или окружен выступающими элементами микроба. В случае вируса гриппа неиммунодоминантные антигены, встречающиеся близко от поверхности капсида, защищены от иммунной системы иммунодоминантными выступами HA и NA относительно поверхности. Неиммунодоминантные антигены имеют склонность к меньшей демонстрации мутации в ответ на иммунное давление, чем иммунодоминантные антигены.

Антигенная изменчивость возникает, когда происходит резкое или внезапное, крупное изменение вируса. Антигенная изменчивость в Influenzavirus, как правило, вызвана возникновением новых комбинаций белков HA и/или NA на поверхности вируса, т.е. созданием нового подтипа вируса гриппа. Возникновение нового подтипа вируса гриппа А, воздействию которого большая часть популяции мира не была подвергнута, является первым шагом к пандемии. Если новый подтип вируса гриппа также обладает способностью к легкому распространению от человека к человеку, можно ожидать полномасштабную пандемию, приводящую к вспышке гриппа по всему миру, при которой будут инфицированы миллионы людей.

ШТАММЫ ВИРУСА ГРИППА А

Приводимые в качестве примеров штаммы вируса гриппа А, для которых антигенные композиции и вакцины по настоящему изобретению будут особенно эффективны, могут включать, но без ограничения, A/Aichi/2/68, A/Alaska/6/77, A/Alice, A/Ann Arbor/6/60, A/Bayern/7/95, A/Beijing/352/89, A/Beijing/353/89, A/Bethesda/1/85, A/California/10/78, A/Chick/Germany/N/49, A/Chile/1/83, A/Denver/1/57, A/Dunedin/6/83, A/Equine/Miami/1/63, A/FM/1/47, A/Great Lakes/0389/65, A/Guizhou/54/89, A/Hong Kong/77, A/Hong Kong/8/68, A/Hong Kong/483/97, A/Johannesburg/33/94, A/Kawasaki/9/86, A/Kiev/59/79, A/Korea/1/82, A/Korea/426/68, A/Leningrad/13/57, A/Los Angeles/2/87, A/MaI/302/54, A/Memphis/8/88, A/Nanchang/933/95, A/New Jersey/8/76, A/NT/60/68, A/NWS/33, A/Peking/2/79, A/Port Chalmers/1/73, A/PR/8/34, A/Shanghai/11/87, A/Shanghai/16/89, A/Shanghai/31/80, A/Singapore/1/57, A/Singapore/6/86, A/South Carolina/1/181918, A/Swine/1976/31, A/Swine/Iowa/15/30, A/Swine/New Jersey/8/76, A/Sydney/5/97, A/Taiwan/1/86, A/Taiwan/1/86A1, A/Texas/35/91, A/Texas/36/91, A/USSR/90/77, A/Victoria/3/75, A/Vietnam/1203/04, A/Washington D.C./897/80, A/Weiss/43, A/WS/33, A/WSN/33, A/Wuhan/359/95, A/Wyoming/1/87 и A/Yamagata/32/89, а также их производные, варианты или гомологи.

Приводимые в качестве примеров серотипы вируса гриппа В включают, но без ограничения, B/Allen/45, B/Ann Arbor/1/86, B/Bangkok/163/90, B/Beijing/184/93, B/Brigit, B/GL/1739/54, B/Hong Kong/330/2001, B/Hong Kong/5/72, B/Lee/40, B/Maryland/1/59, B/Mass/3/66, B/Oman/16296/2001, B/Panama/45/90, B/R22 Barbara, B/R5, B/R75, B/Russia/69, B/Shandong/7/97, B/Sichuan/379/99, B/Taiwan/2/62, B/Tecumseh/63/80, B/Texas/1/84, B/Victoria/2/87 и B/Yamagata/16/88, а также их производные, варианты или гомологи.

Полинуклеотидные и полипептидные последовательности из этих штаммов содержаться в общедоступных базах данных Национального центра биотехнологической информации (Национальная медицинская библиотека, Национальный институт здравоохранения, Bethesda, MD, США), и вирусные штоки можно получить из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, США) или, они общедоступны иначе.

АНТИГЕННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ

В предпочтительных вариантах осуществления, без ограничения какой-либо теорией, вакцина по настоящему изобретению направлена на консервативные белки-мишени, или эпитопы, частицы вируса гриппа, которые подвергаются воздействию иммунной системы хозяина и способны взаимодействовать с ней, такие как эктодомен матриксного белка 2 (М2е) или различные другие компоненты белков М2 и/или М1, белков HA и NA. Эти эпитопы, как правило, включают высококонсервативные пептидные последовательности, в значительной степени исключая, тем самым, некоторые, или предпочтительно многие, не являющиеся высококонсервативными пептидные последовательности белков HA и NA - мишени, или эпитопы, которые подвержены антигенной изменчивости. Белки HA и NA индуцируют сильные гуморальные иммунные ответы при использовании обычных вакцин, и последние отличны от первичных эпитопов консервативных сегментов, что делает возможной изменчивость или дрейф вируса гриппа А для действия в обход или минимизации иммунитета, вызванного обычной вакциной. Эти конструкции вакцин, воплощающие один аспект настоящего изобретения, индуцируют иммунитет к консервативным эпитопам.

В некоторых вариантах осуществления консервативные аминокислотные последовательности пептидов по настоящему изобретению присутствуют в более чем одной субъединице белка вируса. Например, у некоторых вирусов гриппа некоторые аминокислотные последовательности из белка М2 идентичны аминокислотным последовательностям в белки М1, такие как область вируса гриппа, обычно именуемая сегментом 7 РНК. Сегмент 7 РНК включает открытые рамки считывания, как они могли бы пониматься средним специалистом в данной области техники, двух матриксных генов, М1 и М2, которые являются высококонсервативными среди штаммов вируса гриппа. мРНК М1 коллинеарна с РНК вируса гриппа, в то время как мРНК М2 кодируется подвергнутым сплайсингу транскриптом. Аминокислотные остатки 1-9 М2е и М1 кодируются одними и теми же нуклеотидами в одной и той же рамке считывания, а аминокислотные остатки 10-23 М2е и 293-252 М1 - в различных рамках считывания. Белки, кодируемые этими мРНК, разделяют 9 начальных аминокислот, а также имеют участок из 14 аминокислот, кодируемых перекрывающими рамками считывания. В некоторых вариантах осуществления вакцина, следовательно, представляет собой ДНК-вакцину, которая включает кДНК, образованную из РНК мишеневого антигена.

Кроме того, белок М1 является высококонсервативным белком из 252 аминокислот. Он является самым распространенным белком в вирусной частице, выстилающим внутренний слой вирусной мембраны и контактирующим с вирусным рибонуклеопротеиновым (RNP) ядром. Установлено, что М1 имеет несколько функций, включающих регуляцию ядерного экспорта вирусных RNP (vRNP), и делая возможным перенос частиц vRNP в ядро при инфицировании, и предотвращая вновь экспортированные частицы vRNP от повторного вхождения в ядро. Пептидная последовательность SLLTEVET (SEQ ID NO:37) является консервативной в белке М1, как продемонстрировано на фиг. 2.

Белок М2 из 97 аминокислот является гомотетрамерным интегральным мембранным белком, который проявляет активность ионного канала. Активность ионного канала, проявляемая М2, важна как во время сбрасывания оболочки вирионом, так и во время вирусного почкования. Хотя полагают, что белок М2 является относительно минорным компонентом частицы вируса гриппа, он в изобилии экспрессируется в инфицированных клетках во время вирусной инфекции. Как продемонстрировано на фиг. 2, 24-аминокислотный эктодомен М2е, который является областью, экспонированной на поверхности молекулы вируса гриппа, имеет следующую первичную аминокислотную последовательность: MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO:36).

Настоящее изобретение относится отчасти к последовательностям полипептидов и пептидных эпитопов, которые идентичны на по крайней мере 80% или больше, на по крайней мере 85% или больше, на по крайней мере 90% или больше, на по крайней мере 95% или больше, 97% или больше, 98% или больше или 99% или больше одной или нескольким описанным в настоящем описании последовательностям иммуногенных пептидов.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют одну или несколько таких пептидных последовательностей. В таких случаях предпочтительно, когда полинуклеотидные последовательности гомологичны на по крайней мере приблизительно 80% или больше, на по крайней мере приблизительно 85% или больше, на по крайней мере приблизительно 90% или больше, на по крайней мере приблизительно 95% или больше, 97% или больше, 98% или больше или 99% или больше полинуклеотиду, который кодирует одну или несколько конкретно представленных в настоящем описании последовательностей иммуногенных пептидов.

В настоящем изобретении антигенные эпитопы предпочтительно содержат последовательности, состоящие из по крайней мере 6-15, или любого целого числа между ними, или по крайней мере 20, или по крайней мере 25 или более непрерывных аминокислот одной или нескольких пептидных последовательностей, описанных в настоящем описании, и, в частности, последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52.

Предпочтительно, длина выделенных аминокислотных последовательностей, которые включают одну или несколько последовательностей эпитопов, описанных в настоящем описании, по существу состоят или, альтернативно, состоят из такой последовательности(ей), будет составлять от приблизительно 8 до приблизительно 150 аминокислот, альтернативно, от приблизительно 10 до приблизительно 120 аминокислот, от приблизительно 12 до приблизительно 100 аминокислот, от приблизительно 14 до приблизительно 90 аминокислот, от приблизительно 16 до приблизительно 80 аминокислот, от приблизительно 18 до приблизительно 70 аминокислот, от приблизительно 20 до приблизительно 60 аминокислот, от приблизительно 22 до приблизительно 50 аминокислот, или, альтернативно, от приблизительно 24 до приблизительно 40 аминокислот.

Иммуногенные пептиды и полипептиды по настоящему изобретению в различных вариантах осуществления могут иметь длину, составляющую по крайней мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 аминокислот или больше, в том числе, например, те полипептиды, длина которых составляет по крайней мере приблизительно 100, приблизительно 120, приблизительно 140, приблизительно 160, приблизительно 180 или приблизительно 200 аминокислот.

Аминокислотные последовательности антигенных эпитопов, а также включающие их иммуногенные пептиды и полипептиды могут кодироваться полинуклеотидными последовательностями, длина которых предпочтительно составляет по крайней мере приблизительно 18 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 30 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 45 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 60 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 75 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 90 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 105 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 120 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 135 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 160 нуклеотидов, по крайней мере приблизительно 175 нуклеотидов или больше, в том числе, например, полинуклеотиды, длины которых составляют по крайней мере приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600 или приблизительно 700 или больше нуклеотидов.

Антигенные эпитопы, а также содержащие их иммуногенные пептиды и полипептиды могут быть линейными, т.е. составленным из непрерывных аминокислот в полипептиде, или могут быть результатом трехмерной упаковки сворачивания первичной аминокислотной последовательности с образованием третичной структуры, т.е. когда эпитоп составлен из не являющихся непрерывными аминокислот, которые становятся пространственно приближенными друг к другу в результате образования вторичной и/или третичной структуры полипептида, который включает последовательность эпитопа.

Предпочтительно, повторные антигенные эпитопы в соответствии с настоящим изобретением (или сами по себе, или в комбинации с одним или несколькими гетерологичными, стимулирующими Т-клетки эпитопами) могут быть коллинеарно представленными, мультимерными, и/или сшитыми благодаря химической связи (т.е. конъюгированными) для образования иммуногенной композиции. Такие иммуногенные композиции могут включать один или несколько пептидов-антигенов и в некоторых вариантах осуществления будут включать предпочтительно две или даже три или более последовательностей антигенов, которые могут представлять собой один и тот же повторяемый антиген во множестве копий или, альтернативно, два или более отличных антигенов, которые можно получить из различных штаммов, видов или организмов. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции по настоящему изобретению будут включать первый антиген и второй отличный антиген, который повторен в иммуногенной композиции два или более раз. Альтернативно, в других вариантах осуществления, иммуногенная композиция будет включать три повтора одного антигена, четыре повтора одного антигена или даже пять или более повторов одного антигена. В некоторых случаях каждый повтор может представлять идентичную копию антигена, повторенную множество раз. В другом случае последовательности повторов могут быть в значительной степени гомологичны друг другу (но не обязательно являться идентичными копиями одной и той же первичной аминокислотной последовательности). В действительности, в некоторых случаях может быть желательным составление иммуногена, который содержит три повторных антигенных мотива, которые на по крайней мере приблизительно 95% или более идентичны друг другу по первичной аминокислотной последовательности. Схематически иллюстративные комбинации индивидуальных эпитопов, которые можно использовать для создания иммуногенного полипептида или вакцины, можно представить следующим образом:

А+А - две идентичные копии одного антигена;

А+В - два отличных антигена;

А+В+В - два отличных антигена + вторая идентичная копия одного из антигенов;

А+А+В+В - две идентичных копии каждого из двух отличных антигенов;

А+А' - две неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности-повторы одного антигена;

А+А'+B+B' - две неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности-повторы каждого из двух отличных антигенов;

А+А'+A''+A''' - четыре неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности повторов одного антигена.

В случае множества антигенов важно отметить, что они могут быть расположены в любом порядке относительно друг друга в общей последовательности иммуногенного пептида или полипептида. Таким образом, полипептидный иммуноген, который содержит две неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности-повторы каждого из двух отличных антигенов, может содержать первичную аминокислотную последовательность, в которой индивидуальные эпитопы могут располагаться в любой комбинации. Используя схематическое условное обозначение, принятое выше, такая композиция могла бы содержать эпитопы, расположенные линейно в иммуногенном полипептиде любым возможным образом:

---------A-B-B'-A'---------

---------A-B-A'-B'---------

---------A-B'-B-A'---------

---------A-B'-A'-B---------

---------A-A'-B-B'---------

---------A-A'-B'-B---------

---------A'-A-B'-B---------

---------A'-A-B-B'---------

---------A'-B-B'-A---------

---------A'-B-A'-B'---------

---------A'-B'-A'-B---------

---------A'-B'-B-A'---------

---------B-B'-A'-A---------

---------B-B'-A-A'---------

---------B-A'-A-B---------

---------B-A'-B-A---------

---------B-A-B'-A'---------

---------B-A'-B'-A---------

---------B'-A-B'-B---------

---------B'-A-B-B'---------

---------B'-B-B'-A---------

---------B'-B-A-B'---------

---------B'-A'-A-B---------

---------B'-A'-B-A---------

Следует обратить внимание, что число аминокислотных остатков, предшествующих, прерывающих или следующих за каждой из последовательностей антигенных пептидов в общей первичной последовательности иммуногенной композиции, может изменяться от композиции к композиции и от комбинации антигенов к комбинации антигенов. Число «спейсерных» аминокислот между двумя или более последовательностями эпитопов может составлять любой целесообразный диапазон, включающий, например, от 1 или 2 аминокислот до 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или даже 10 или более аминокислот между смежными эпитопами.

Схематически, имммуногенную композицию, содержащую консенсусный мотив, имеющий две неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности-повтора каждого из двух отличных антигенов, можно было бы представить следующим образом:

(Xaa)_n-эпитоп А-(Xaa)_n-эпитоп B'-(Xaa)_n-эпитоп A'-(Xaa)_n-эпитоп B-(Xaa)_n.

Подобным образом, схематическим представлением имммуногенной композиции, содержащей консенсусный мотив, имеющий две идентичные и три неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности-повтора одного антигена, могло быть следующее представление:

(Xaa)_n-эпитоп А-(Xaa)_n-эпитоп A'-(Xaa)_n-эпитоп A-(Xaa)_n-эпитоп A'''-(Xaa)_n-эпитоп A''-(Xaa)_n.

Подобным образом, схематическим представлением иммуногенной композиции, содержащей консенсусный мотив, имеющий первый антиген, второй антиген и четыре неидентичные (но в значительной степени гомологичные) последовательности-повтора третьего антигена, могло быть следующее представление:

(Xaa)_n-эпитоп А-(Xaa)_n-эпитоп В-(Xaa)_n-эпитоп С-(Xaa)_n-эпитоп С''-(Xaa)_n-эпитоп С'-(Xaa)_n-С'''-(Xaa)_n.

где Xaa представляет собой любую аминокислоту, а n представляет собой число аминокислот в спейсере/линкере, соединяющем вместе различные эпитопы в одну первичную последовательность пептида/полипептида.

В других вариантах осуществления иммуногены по настоящему изобретению могут быть также представлены на полисахариде или другом подходящем носителе или остове. Полагают, без ограничения какой-либо теорией, что структура такой вакцины будет обладать большей иммуногенностью и индуцировать большую иммунологическую память у хозяина, способствуя, тем самым, увеличению иммунного ответа вследствие увеличенной локальной концентрации антигена, с которым сталкиваются клетки иммунной системы. Иммуногены, упорядоченные таким образом, могут использоваться в вакцинах на основе конъюгатов этого изобретения.

Другое альтернативное представление иммуногенов включает димерные молекулы или их димерные части. В этом формате для сшивания двух или более пептидов с образованием димера, тримера, тетрамера и т.п. может использоваться связь, предпочтительно ковалентная. Вакцины на основе конъюгатов, в которых пептиды упорядочены таким образом, могут быть более антигенными, чем вакцины, созданные с использованием конъюгатов соответствующих мономерных пептидов. Хотя средние специалисты в данной области техники на основе предоставленного в настоящем описании руководства могут представить себе и приготовить многочисленные иммуногены в соответствии с настоящим изобретением, некоторые из примеров включают следующие иммуногены (где А, В и С означают различные пептидные последовательности): M2A/M2B/M2A/T-клеточный эпитоп/M2B/M2A, NAA/M2A/T-клеточный эпитоп/M2A/NAA/PB1A/PB2B, NAA/M2A/HAA, HAA/NAA/T-клеточный эпитоп/HAA/NAA, NAA/NAB/M2A/M2B/T-клеточный эпитоп, NAA/NAB/NAA/NAB/NAA/NAB, NAA/NAB/NAC/NAA/NAB/NAC, HAA/M2A/T-клеточный эпитоп/M2B/NAA, HAA/M2B/PB1A/PB2A/T-клеточный эпитоп/M2A/NAA, или любую их комбинацию, в том числе их смеси. Мишеневые антигены и иммуногенные композиции, полученные в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, представляют эпитопы в порядке и расположениях, не обнаруживаемых в природе.

ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ

Настоящее изобретение также относится к любому полинуклеотиду, который кодирует один или несколько иммуногенных пептидов или полипептидов, описанных в настоящем описании, или который комплементарен такому полинуклеотиду. Такие полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут быть молекулами ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но необязательно, присутствовать внутри полинуклеотида по настоящему изобретению, и полинуклеотид может, но необязательно, быть связан с другими молекулами и/или материалами-подложками.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут кодировать пептидные эпитопы или антигены, или могут кодировать взятый в целом иммуногенный пептид или полипептид, который включает множество индивидуальных эпитопов и/или более маленьких пептидных антигенов, или могут кодировать вариант одного или нескольких таких пептидов или полипептидов, описанных в настоящем описании. Варианты полинуклеотида могут содержать одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок из условия, чтобы иммуногенность кодируемого пептида не уменьшалась, относительно природного иммуногенного белка. Эффект на иммуногенность кодируемого пептида можно, как правило, оценить, как описано в настоящем описании. Предпочтительные варианты пептида содержат замены, делеции, вставки и/или добавления аминокислот не более чем в приблизительно 20%, более предпочтительно не более чем в приблизительно 15% и все еще более предпочтительно не более чем в приблизительно 10% или 5% или меньше положений аминокислот относительно соответствующей природной немодифицированнной аминокислотной последовательности.

Подобным образом, полинуклеотиды, кодирующие такие варианты пептида, должны предпочтительно содержать замены, делеции, вставки и/или добавления нуклеотидов не более чем в приблизительно 20%, более предпочтительно не более чем в приблизительно 15% и все еще более предпочтительно не более чем в приблизительно 10% или 5% или меньше положений нуклеотидов относительно соответствующей полинуклеотидной последовательности, кодирующей природную немодифицированнную аминокислотную последовательность. Некоторые варианты полинуклеотида, конечно, могут быть в значительной степени гомологичны или по существу идентичны соответствующей области нуклеотидной последовательности, кодирующей немодифицированный пептид. Такие варианты полинуклеотида способны к гибридизации с природной последовательностью ДНК, кодирующей один или несколько антигенных пептидов, описанных в настоящем описании, (или комплементарной последовательностью) в умеренно жестких, в высокой степени жестких, в очень высокой степени жестких условиях.

Подходящие умеренно жесткие условия включают, например, предварительную промывку в растворе, содержащем приблизительно 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при температуре, составляющей от приблизительно 50ºС до приблизительно 60^οС, в 5X SSC в течение ночи с последующими промывками при приблизительно 60ºС-65ºС в течение 20 мин дважды с использованием каждого из 2Х, 0,5Х и 0,2Х SSC, содержащего 0,1% SDS. Подходящие в высокой степени жесткие условия включают, например, предварительную промывку в растворе, содержащем приблизительно 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при температуре, составляющей от приблизительно 60ºС до приблизительно 70ºС, в 5X SSC в течение ночи с последующими промывками при приблизительно 65ºС-70ºС в течение 20 мин дважды с использованием каждого из 2Х, 0,5Х и 0,2Х SSC, содержащего 0,1% SDS. Репрезентативные примеры в очень высокой степени жестких условий могут включать, например, предварительную промывку в растворе, содержащем приблизительно 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при температуре, составляющей от приблизительно 70ºС до приблизительно 75ºС, в 5X SSC в течение ночи с последующими промывками при приблизительно 70ºС до приблизительно 75ºС в течение 20 мин дважды с использованием каждого из 2Х, 0,5Х и 0,2Х SSC, содержащего 0,1% SDS. Такие гибридизующиеся последовательности ДНК также находятся в объеме этого изобретения.

Средним специалистам в данной области техники будет понятно, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих конкретную первичную аминокислотную последовательность. Некоторые из этих полинуклеотидов поддерживают минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого природного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые изменяются вследствие различий в частотах использования кодонов, прямо предусмотрены настоящим изобретением.

Кодирующие иммуногенные пептиды полинуклеотиды можно синтезировать с помощью любого способа, известного в данной области техники, в том числе химического синтеза (например, твердофазного фосфорамидитного химического синтеза). Модификации в полинуклеотидную последовательность могут быть также введены, используя стандартные методики мутагенеза, такие как сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов. Альтернативно, молекулы РНК можно создать с помощью in vitro или in vivo транскрипции последовательностей ДНК, кодирующих описанную в настоящем описании иммуногенную композицию, при условии, что ДНК включена в вектор с подходящим промотором РНК-полимеразы (таким как Т7 или SP6). Определенные сегменты можно использовать для получения кодируемого пептида, описанного в настоящем описании. Помимо этого, или альтернативно, сегмент можно вводить пациенту при условии, что кодируемый пептид образуется in vivo (например, при трансфекции антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, кДНК-конструкцией, кодирующей один или несколько иммуногенных пептидов, и введении пациенту трансфецированных клеток).

Полинуклеотиды, кодирующие иммуногенный пептид, можно, как правило, использовать для продукции пептида in vitro или in vivo. Любой полинуклеотид можно дополнительно модифицировать для увеличения стабильности in vivo. Возможные модификации включают, но без ограничения, добавление фланкирующих последовательностей на 5'-конец, 3'-конец или оба конца, использование фосфоротиоатных или 2'-О-метильных, а не фосфодиэфирных связей в остове, и/или включение необычных оснований, таких как инозин, квеозин и вибутозин, а также ацетил-, метил, тио- и других модифицированных форм аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, или их комбинацию.

Описанные в настоящем описании нуклеотидные последовательности могут быть соединены с рядом других нуклеотидных последовательностей, используя общепринятые методы рекомбинантных ДНК. Например, полинуклеотид можно клонировать в любой из ряда векторов для клонирования, включающих одну или несколько плазмид, фагемид, производных фага лямбда и космид. Представляющие особый интерес векторы включают экспрессионные векторы, реплицирующиеся векторы, векторы для получения зондов и векторы, используемые для секвенирования. Как правило, вектор будет содержать начало репликации, функционирующее в по крайней мере одном организме, подходящие сайты для рестрикционных эндонуклеаз и один или несколько селектируемых маркеров. Другие элементы будут зависеть от желаемого применения и будут очевидны средним специалистам в данной области техники.

В пределах некоторых вариантов осуществления полинуклеотиды можно так составить, чтобы позволить их вхождение в клетку млекопитающего и экспрессию в ней. Такие композиции особенно полезны для профилактических и терапевтических целей, описанных ниже. Средним специалистам в данной области техники будет понятно, что существует множество способов успешного выполнения экспрессии полинуклеотида в клетке-мишени, и может использоваться любой подходящий способ. Например, полинуклеотид может быть включен в вирусный вектор, такой как, но без ограничения, вирус гриппа, аденовирус, бакуловирус, парвовирус, вирус герпеса, аденоассоциированный вирус, ретровирус, флавивирус, вирус осповакцины или поксвирус (например, поксвирус птиц). Методики включения ДНК в такие векторы хорошо известны средним специалистам в данной области техники. Вирусные векторы могут дополнительно переносить или включать ген для селектируемого маркера (для помощи в идентификации или отборе трансдуцированных клеток) и/или направляющую составляющую, такую как ген, кодирующий лиганд для рецептора на конкретной клетке-мишени, для придания вектору специфичности в отношении мишени. Направленную доставку можно также выполнить, используя антитело, с помощью способов, известных средним специалистам в данной области техники.

В некоторых случаях иммуногенные пептиды по настоящему изобретению, или кодирующие их полинуклеотиды, могут входить в состав инактивированного, убитого, аттенюированного, химерного или рекомбинантного вирусного вектора, или одного или нескольких вирионов, или вирусных частиц, включающих такие полинуклеотиды, особенно когда они предусматриваются для применимой композиции в качестве компонента вакцины или т.п.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к включению одного или нескольких терапевтических или профилактических средств в рецептуру фармацевтически приемлемой композиции для введения в клетку или животному, или саму по себе, или в комбинации с одним или несколькими другими способами профилактики и/или лечения. Средним специалистам в данной области техники хорошо известно включение в рецептуру фармацевтически приемлемых наполнителей и растворенных носителей, как и разработка подходящих схем введения доз и лечения для применения конкретных композиций, описанных в настоящем описании, при ряде схем лечения.

При некоторых обстоятельствах желательной будет доставка описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в подходящим образом составленных фармацевтических носителях при использовании одного или нескольких стандартных путей доставки, включающих, например, введение подкожно, внутрь глаза, в стекловидное тело, парентерально, внутривенно, интрацеребровентрикулярно, внутримышечно, подоболочечно, орально, внутрибрюшинно, чрескожно, местно, с помощью пероральной или назальной ингаляции или с помощью прямого введения в одну или несколько клеток, тканей или органов. Способы введения могут также включать способы, которые описаны в патентах США № 5543158, 5641515 и 5399363, каждый из которых включен в данное описание в целом путем ссылки. Растворы активных соединений в виде свободного основания, или фармакологически приемлемых солей, могут быть приготовлены в стерильной воде или могут быть подходящим образом смешаны с одним или несколькими поверхностно-активными веществами, такими как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсионные системы могут также быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, маслах или их смесях. При обычных условиях хранения и использования эти препараты предпочтительно могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Для введения инъецируемого водного раствора, например, раствор можно подходящим образом забуферить, при необходимости, а жидкому разбавителю сначала придать изотоничность с использованием адекватной соли или глюкозы. Эти конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи, стерильная водная среда, которая может использоваться, будет известна средним специалистам в данной области техники, принимая во внимание описание настоящего изобретения. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и или добавить к 1000 мл раствора для введения в подкожную клетчатку, или инъецировать в планируемое место инфузии (см., например, «Remington's Pharmaceutical Sciences» 15^th Edition, pages 1035-1038 и 1570-1580). Некоторая вариация дозы будет неизбежно иметь место в зависимости от состояния подвергаемого лечению индивида. Отвечающий за введение человек будет определять, в любом случае, соответствую дозу для отдельного индивида. Кроме того, для введения человеку препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, требуемым Отделом по стандартам биопрепаратов Управления по надзору за пищевыми продуктами и медикаментами.

Стерильные инъецируемые композиции можно приготовить включением описанных в настоящем описании иммуногенных композиций в требуемом количестве в соответствующий растворитель с несколькими другими ингредиентами, перечисленными выше, в соответствии с требованиями, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсионные системы можно приготовить включением отобранного, подвергнутого стерилизации активного ингредиента(ов) в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые других ингредиенты из перечисленных выше ингредиентов. Описанные в настоящем описании композиции можно также составить в нейтральную или солевую форму. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образуемые при использовании свободных аминогрупп белка), которые образуются присоединением неорганических кислот, таких как, например, соляная или фосфорная кислота, или таких органических кислот, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образуемые при использовании свободных карбоксильных групп, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или гидроокись железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После составления растворы будут вводить совместимым с лекарственной композицией образом и в таком количестве, которое является эффективным для намеченного применения. Композиции легко ввести в ряд лекарственных форм, таких как инъецируемые растворы, препараты для местного применения, пероральные композиции, включающие капсулы с замедленным высвобождением, гидрогели, коллоидные растворы, липкие гели, средства для чрескожного введения, композиции для введения в нос или путем ингаляции и т.п.

Количество иммуногенной композиции(й) и время, требуемое для введения такой иммуногенной композиции(й), будет находиться в компетентности среднего специалиста, извлекающего пользу из идей настоящего изобретения. Однако вероятно, что введение терапевтически эффективного, фармацевтически эффективного и/или профилактически эффективного количества описанных в настоящем описании иммуногенных композиций может быть успешно выполнено с помощью однократного введения, такого как, например, однократная инъекция количества доставляемого агента, достаточного для обеспечения требуемого эффекта для пациента, подвергающегося такой процедуре. В альтернативном случае, при некоторых обстоятельствах, может быть желательным предоставление многократных или последовательных введений иммуногенных композиций, или в течение относительно короткого, или даже относительно продолжительного периода времени, который может быть определен врачом, осуществляющим наблюдение за введением таких композиций отобранному индивидууму.

Как правило, включения одного или нескольких активных ингредиентов в рецептуру описанных в настоящем описании иммуногенных композиций будут содержать количество, эффективное для выбранной терапии или профилактики. Предпочтительно композиция может содержать по крайней мере приблизительно 0,0001% или по крайней мере приблизительно 0,001%, или по крайней мере приблизительно 0,01%, или по крайней мере приблизительно 0,1% каждого активного ингредиента, хотя процент активного ингредиента(ов) может, конечно, меняться, и активные ингредиенты могут условно присутствовать в количествах, составляющих от приблизительно 0,2 до приблизительно 80% в весовом или объемном отношении или от приблизительно 0,5 до приблизительно 70% в весовом или объемном отношении, или более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 50% в весовом или объемном отношении, исходя из общего состава. Конечно, количество активного соединения(й) в каждой иммуногенной композиции можно ввести в рецептуру таким образом, что подходящая доза будет получена в любой конкретной стандартной дозе соединения. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологическое t_1/2, путь введения, срок годности при хранении продукта, а также другие фармакологические факторы будут предусматриваться средним специалистом в области приготовления таких фармацевтических композиций, и фактически может быть желательным ряд схем введения доз и лечения.

Описанные в настоящем описании иммуногенные композиции никоим образом не ограничиваются применением только для людей, или даже приматами, или млекопитающими. Однако в предпочтительных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для введения млекопитающему, включающему человека, в одной или нескольких терапевтических и/или профилактических схемах. Описанные в настоящем описании композиции могут быть также приготовлены для введения с ветеринарной целью, включающего, например, введение отобранному домашнему скоту, экзотическим или одомашненным животным, домашним животным (включающим любимых домашних животных и т.п.), не являющимся людьми приматам, а также находящимся в зоопарке или иначе находящимся в неволе представителям и т.п.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению предпочтительно вводят способом, совместимым с лекарственной композицией, и в количестве, которое является профилактически или терапевтически эффективным и предпочтительно иммуногенным. Вводимое количество зависит от различных обычных факторов: подвергаемого лечению индивида, в том числе, например, способности иммунной системы пациента к установлению иммунного ответа, и степени желаемой защиты. Подходящие диапазоны доз могут быть порядка нескольких сотен микрограмм (мкг) активного ингредиента в каждой дозе (например, на каждую вакцинацию), при этом предпочтительный диапазон составляет от приблизительно 0,1 мкг до 2000 мкг (хотя также предусматриваются даже большие количества, такие как, например, в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг), например, в диапазоне от приблизительно 0,5 мкг до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 1 мкг до 500 мкг и особенно в диапазоне от приблизительно 10 мкг до приблизительно 100 мкг. Подходящие схемы начального введения и бустер-инъекции также являются переменными при титровании и других методах определения дозы, но их типизирует начальное введение с последующими необязательными, но предпочтительными вакцинациями или другими периодическими введениями.

В некоторых вариантах осуществления доза могла бы находиться в составе диапазона от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 мг общего белка или мишеневого антигена. В одном приводимом в качестве примера варианте осуществления диапазон дозы вакцины составляет от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 10 мкг. Однако дозу можно предпочтительно установить на основе количества доставляемого пептида. В любом из двух случаев эти диапазоны являются только рекомендациями, от которых средний специалист в данной области техники может отклоняться в соответствии с общепринятыми схемами введения доз. Точные дозы могут быть определены путем оценки иммуногенности полученного конъюгата у подходящего хозяина, так чтобы доставлялась иммунологически эффективная доза. Иммунологически эффективной доза является доза, которая стимулирует иммунную систему пациента с установлением обнаруживаемого иммунного ответа на иммуногенную композицию или вакцину. Предпочтительно получают уровень иммунологической памяти, достаточный для обеспечения длительной защиты от заболевания, вызываемого микробной инфекцией. Иммуногенные композиции или вакцины по настоящему изобретению могут быть предпочтительно приготовлены с адъювантом. Под «длительной» предпочтительно подразумевается в течение периода времени, составляющего по крайней мере приблизительно 6 месяцев, в течение по крайней мере приблизительно 1 года, предпочтительно в течение по крайней мере приблизительно 2-5 лет или даже по крайней мере от приблизительно 2 до приблизительно 10 лет или дольше.

Выбор времени введения дозы зависит от факторов, которые известны средним специалистам в данной области техники или без труда устанавливаются ими, в частности, с помощью предоставленного в настоящем описании руководства. После начального введения впоследствии могут быть введены одна или несколько бустер-доз для индукции более сильного иммунитета, для поддержания или даже увеличения титра антител, специфичных в отношении вводимого иммуногена, или того и другого. Примером схемы введения доз могло бы быть введение дозы в день 1, второй дозы через 1 или 2 месяца, третьей дозы через или 4, 6, или 12 месяцев и введение дополнительных бустер-доз в течение длительных временных рамок или по мере необходимости. Предпочтительной схемой введения доз могло бы быть введение композиции по настоящему изобретению в день 1, в то время как другой предпочтительной схемой введения доз могло бы быть введение композиции по настоящему изобретению в день 1 вместе со вторым введением 1-14 месяцами позже. Кроме того, вакцины по настоящему изобретению могут использоваться в качестве бустеров для других вакцин, ранее введенных пациенту, таких как обычная вакцина против гриппа. В таких случаях можно следовать графику усиления примирования, известному средним специалистам в данной техники.

В некоторых вариантах осуществления нуждающемуся в профилактике или лечении индивиду вводят количество иммуногенной полипептидной композиции или включающей ее вакцины, которое является достаточным для индукции обнаруживаемого ответа у животного, подвергаемого введению. Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению предпочтительно содержат по крайней мере первый антигенный эпитоп, в том числе одну или несколько повторно встречающихся пептидных последовательностей, причем каждая пептидная последовательность является консервативной для по крайней мере множества микробных и/или вирусных видов, штаммов и серотипов, вместе с по крайней мере одним фармацевтически приемлемым разбавителем, вектором, буфером, наполнителем или носителем, или их комбинацией. После введения индивида можно повергнуть оценке с определением того, существует ли обнаруживаемый иммунный ответ.

СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ АНТИГЕННЫХ ПЕПТИДОВ И ПОЛИПЕПТИДОВ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Пептиды по настоящему изобретению можно получить, используя любые методы, имеющиеся в распоряжении средних специалистов в данной области техники, такие как химический и биохимический синтез. Примеры методов химического синтеза пептидов предоставлены Lee, Peptide and Protein Drug Delivery, New York, N.Y., Dekker (1990); Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1988, и Sambrook et al. (1989), каждый из которых включен в данное описание в целом путем ссылки.

Мишеневые антигены по настоящему изобретению можно получить синтетическим или природным способом, например, в виде вакцины на основе рекомбинантных белков, или с использованием их комбинации. «Вакцина на основе рекомбинантных белков» является вакциной, активный ингредиент которой содержит по крайней мере один белковый антиген, продуцированный с помощью рекомбинантной экспрессии. Антигены вакцины можно продуцировать в бактериях, клетках млекопитающих, клетках бакуловирусов и/или клетках растений, или их гибридах, например. Приводимый в качестве примера способ продуцирования противогриппозных вакцин включает выращивание выделенного штамма в куриных яйцах с эмбрионами.

Обладающие признаками изобретения мишеневые антигены, или их части, можно получить или изготовить полностью синтетически, например, с помощью бесклеточных систем трансляции или химического синтеза белка, в клетках, которые включают бактерии (например, Escherichia coli, Bacillus spp.), в клетках млекопитающих или инертных клетках, грибах или т.п. Мишеневые антигены по настоящему изобретению можно получить любыми путями, которые хорошо известны средним специалистам в данной области техники или имеются в их распоряжении, включающими, например, рекомбинантную продукцию in vivo и химический синтез, такой как SPPS и т.п. Рекомбинантная продукция in vivo относится к получению белка из культур эукариотических или прокариотических клеток, которые содержат, обычно внутри плазмиды под контролем регуляторных последовательностей, гетерологичные нуклеотидные кодирующие последовательности, кодирующие один или несколько антигенных пептидов или полипептидов по настоящему изобретению.

Средние специалисты в данной области техники будут способны приготовить такую плазмиду, используя генетический код для определения нуклеотидной последовательности, необходимой для кодирования требуемой полипептидной последовательности, вместе с хорошо известными регуляторными последовательностями и имеющимися в продаже плазмидными векторами, особенно в соединении с предоставленным в настоящем описании руководством. Такие системы широко известны в данной области техники, и стандартные методы рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования, пригодные к эксплуатации в связи с настоящим изобретением, известны в данной области техники и подробнее описываются, например, Sambrook и др. (1989). SPSS является хорошо известным способом получения полипептидов в автоматизированных условиях, полностью свободных от любой биологической системы. Для обзора SPSS и прикладной химии см. John M. Stewart и Janice D. Young, Solid-Phase Peptide Synthesis, Second Ed., 1984 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, США). Недавние патенты, направленные на инструментальные средства и устройство для SPSS, включают патенты США № 4746490, 4668476, 4816513 и 5186898, каждый из которых включен в данное описание в целом путем ссылки.

Средние специалисты в данной области техники обычно хорошо представляют себе, как приготовить вакцины на основе пептидов, и такое приготовление может быть выполнено с помощью ряда имеющихся методов, включающих, например, методы, описанные в патентах США № 4608251, 4601903, 4599231, 4599230 и 4596792, и обычно методы, представленные в Remington's Pharmaceutical Sciences. 16^th Edition, A. Osol, (ed.), Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980) и Remington's Pharmaceutical Sciences. 19^th Edition, A.R. Gennaro, (ed.), Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1995), каждый из которых прямо включен в данное описание в целом путем ссылки.

Антигены, эпитопы и иммуногенные композиции, описанные в настоящем описании, можно приготовить любым способом, имеющимся в распоряжении средних специалистов в данной области техники, хотя в одном предпочтительном варианте осуществления мишеневые антигены, или составляющие их повторные консервативные пептидные последовательности, получают синтетически с помощью твердофазного белкового синтеза (SPPS). Необязательно повторные консервативные пептидные последовательности, кроме того, представляют вместе с одним или повторными экземплярами дополнительных иммуногенных компонентов. Такие дополнительные компоненты могут быть включены в мишеневые антигены с помощью коллинеарной экспрессии (т.е. синтеза слитых белков) или с помощью химической конъюгации, которые хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления мишеневые антигены представлены на клетках, организмах и/или неполноценных организмах (например, БЦЖ или аденоподобных вирусных частицах, включающих, например, члены Parvoviridae) или в них для обеспечения усиленного иммунного ответа. Кроме того, мишеневые антигены можно даже синтезировать in vivo в качестве продуктов генетического воздействия на клетки-хозяева, т.е. при содержании внутри векторов (например, рекомбинантного вирусного вектора), на переносчике (т.е. в покровном слое баллистической частицы), или в качестве вакцины на основе «голой» ДНК или РНК.

Методы создания рекомбинантных вакцин и доставки РНК/ДНК-вакцин широко известны в данной области техники, могут использовать в связи с настоящим изобретением и описываются, например, в патентах США № 7223408 и 6603998, каждый из которых включен в данное описание в целом путем ссылки. В отношении общих лабораторных методик приводится ссылка на Sambrook и др. (1989), который также включен в данное описание путем ссылки.

Приводимые в качестве примеров пептидные эпитопы, пригодные для осуществления на практике настоящего изобретения, включают, но без ограничения, пептиды определенной длины, которая может составлять от приблизительно 6 до приблизительно 100 аминокислот, альтернативно, от приблизительно 8 до приблизительно 90 аминокислот, еще альтернативно, от приблизительно 10 до приблизительно 80 аминокислот или от приблизительно 12 до приблизительно 70 аминокислот, еще альтернативно, от приблизительно 14 до приблизительно 60 аминокислот или от приблизительно 16 до приблизительно 50 аминокислот, или от приблизительно 18 до приблизительно 40 аминокислот, или от приблизительно 20 до приблизительно 30 аминокислот, или любое определенное целое число в пределах одного или нескольких перечисленных диапазонов в качестве каждого конечного положения. Альтернативно, каждая из выделенных последовательностей эпитопов, пригодных для создания иммуногенных пептидных и полипептидных композиций, описанных в настоящем описании, может предпочтительно включать первичную аминокислотную последовательность, длина которой составляет от приблизительно 6 до 35 аминокислот, альтернативно, от приблизительно 8 до 30 аминокислот или, альтернативно, от приблизительно 10 до 20 аминокислот, хотя предполагается, что более длинные или более короткие пептидные эпитопы находятся в объеме описания настоящего изобретения, по существу состоять или, альтернативно, состоять из такой последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из выделенных последовательностей эпитопов будет включать последовательность, длина которой составляет приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45 или приблизительно 50 или более аминокислот, по существу состоять или, альтернативно, состоять из такой последовательности.

Длины приводимых в качестве примеров иммуногенных пептидов или полипептидов, включающих одну или несколько раскрытых в настоящем описании последовательностей антигенных эпитопов, будут составлять от приблизительно 12 до приблизительно 400 аминокислот, альтернативно, от приблизительно 18 до приблизительно 350 аминокислот, все еще альтернативно, от приблизительно 24 до приблизительно 300 аминокислот или от приблизительно 30 до приблизительно 250 аминокислот, все еще альтернативно, от приблизительно 30 до приблизительно 200 аминокислот или от приблизительно 36 до приблизительно 150 аминокислот, или от приблизительно 42 до приблизительно 100 аминокислот, или любое определенного целое число в пределах одного или нескольких перечисленных диапазонов в качестве каждого конечного положения.

Подобным образом, в некоторых применениях каждый из иммуногенных пептидов или полипептидов, содержащих одну или несколько раскрытых в настоящем описании последовательностей антигенных эпитопов, может предпочтительно содержать аминокислотную последовательность, длина которой составляет от приблизительно 50 до 60 аминокислот, альтернативно, от приблизительно 60 до 70 аминокислот, альтернативно, от приблизительно 70 до 80 аминокислот, от приблизительно 80 до 90 аминокислот или, альтернативно, приблизительно 90-100 аминокислот, хотя предполагается, что более длинные или более короткие пептидные эпитопы находятся в объеме описания настоящего изобретения, по существу состоять или, альтернативно, состоять из такой последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждый из иммуногенных пептидов или полипептидов, включающих одну или несколько раскрытых в настоящем описании последовательностей антигенных эпитопов, может предпочтительно включать аминокислотную последовательность, длина которой составляет приблизительно 30, приблизительно 60, приблизительно 90, приблизительно 120, приблизительно 150, приблизительно 180, приблизительно 210, приблизительно 240 или приблизительно 270 или около этого аминокислот, по существу состоять или, альтернативно, состоять из такой последовательности.

АДЪЮВАНТЫ

Предпочтительно некоторые из полипептидов по настоящему изобретению являются достаточно иммуногенными, чтобы обеспечить профилактический эффект вакцины. Для других, однако, иммунный ответ можно увеличить, если иммуногенная композиция, кроме того, включает адъювант. Термин «адъювант» имеет свое обычное значение в области вакцинной технологии, т.е. вещество или композицию вещества, которое 1) само не способно к установлению специфического иммунного ответа против иммуногена вакцины, но которое 2) тем не менее способно усиливать иммунный ответ против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация самим по себе адъювантом не обеспечивает иммунный ответ против иммуногена, а вакцинация иммуногеном может вызвать или может не вызывать иммунный ответ против иммуногена, но вакцинация (или другая профилактика, или лечение) иммуногеном в комбинации с адъювантом индуцирует иммунный ответ против иммуногена, который сильнее ответа, индуцированного только иммуногеном.

Различные способы достижения адъювантного эффекта для вакцины и других композиций известны и могут применяться в связи с настоящим изобретением. Общие принципы и способы, подходящие для применения в соответствии с настоящим изобретением, детализируются в “The Theory and Practical Application of Adjuvants” Duncan E.S. Stewart-Tull (Eds.), John Wiley & Sons Ltd, Malden, MA, США (1995) и в “Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants” Gregoriadis et al., (Eds.), Plenum Press, New York, NY, США (1995), описание каждого из которых включено в данное описание путем ссылки.

Предпочтительные адъюванты включают адъюванты, которые связаны со «стимуляцией иммунной системы» и предпочтительно вызывают ее. Стимуляция иммунной системы означает, что вещество или композиция вещества проявляют общий, неспецифический иммуностимулирующий эффект. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) разделяют способность к стимуляции иммунной системы. Тенденцией эффекта использования иммуностимулирующего агента является увеличение «настороженности» иммунной системы, означая, что одновременная или последующая иммунизация иммуногеном может индуцировать значительно более эффективный ответ по сравнению с отдельным применением иммуногена. Полный адъювант Фрейнда («CFA») является предпочтительным адъювантом для использования в связи с вакцинами по настоящему изобретению. Другие предпочтительные адъюванты включают адъюванты, которые могли бы порождать уровни усиленного защитного иммунитета через или клеточную, или гуморальную систему.

Неограничивающие примеры адъюванта для применения в настоящем изобретении включают один или несколько иммунонаправленных адъювантов, иммуномодулирующие адъюванты, такие как токсин, цитокин и производное микобактерий, неполный адъювант Фрейнда, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, Stimulon® QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA, США), MPL® (3-деацилированный монофосфоририллипид А; Corica Corp., Hamilton, MT, США) и интерлейкин-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA, США), масляную композицию, полимер, мицеллообразующий адъювант, сапонин, иммуностимулирующую комплексную матрицу (матрицу ISCOM), частицу, DDA, ДНК-адъюванты, инкапсулирующий адъювант или любые адъюванты, описанные в патентах США № 7357936, 7090853, 6793928, 6780421, 6759241, 6713068, 6572866, 6534065, 6451325, 6440423, 6306404, 6060068, 6033673, 5800810, 5795582, 5785975, 5679356, 5503841 и 5182108, полное описание каждого из которых прямо включено в данное описание в целом путем ссылки на них.

Некоторые адъюванты являются предпочтительно стимулирующими Т-клетки по природе. Предпочтительные адъюванты включают адъювант в виде детоксифицированного термолабильного энтеротоксина E.coli и т.п. Можно также использовать адъюванты на основе алюминия, включающие гидроксид алюминия и более предпочтительно фосфат алюминия. Адъюванты (т.е. носители) могут также включать стерильные жидкости, такие как вода, солевой раствор, минеральное масло, растительное масло, соевое масло, арахисовое масло или любая их комбинация.

Адъювант может также включать один или несколько таких агентов, как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (квасцы), используемый обычно в виде приблизительно 0,05%-1% раствора в забуференном солевом растворе, смесь синтетических полимеров сахаров (например, Carbopol® Noveon, Inc. Cleveland, OH, США), используемая в виде 0,25% раствора, агрегат белка в вакцине, полученный с помощью тепловой обработки при температурах, находящихся в диапазоне от приблизительно 70ºС до приблизительно 101ºС, в течение периодов времени приблизительно от 30 сек до приблизительно 2 мин, соответственно, а также возможен агрегат, полученный при помощи сшивающих агентов. Можно также использовать агрегат, полученный при активации при использовании подвергнутых действию трипсина антител (включающих, например, Fab-фрагменты) под действием алюминия, смесь с бактериальными клетками, такими как C. parvum, или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульсию в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как маннида моноолеат (Aracel-A®, Sigma Chemicals Co.), или эмульсию, такую как эмульсия, приготовленная с использованием 20% раствора перфторированного заменителя крови (например, Fluosol-DA®) или любую их комбинацию. Также является предпочтительной смесь с жирами, такими как сквален и IFA.

Антигенные композиции по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с одним или несколькими носителями или представлены на них. В публикации заявки на патент США № 2004/0223976, которая включена в данное описание путем ссылки на нее, обсуждаются примерные способы конъюгации. Используемым для конъюгации носителем может быть гриб, бактерия, вирус или вирусоподобная частица или ее часть, белок или белковый комплекс (например, полноценная или неполноценная капсидная частица), полисахарид (отмеченный выше) или полисахаридный комплекс, полинуклеотид или полинуклеотидный комплекс (двойная спираль, тройная спираль, петля шпильки и т.п.), органический или неорганический полимер, микробусинка или микросфера, наночастица или наносфера, баллистическая частица и любая их комбинация. Как используется в настоящем описании, «белок-носитель» означает иммуногенный или неиммуногенный белок, с которым конъюгирован пептид и одна или несколько полипептидных последовательностей, полисахаридов и/или других антигенов. Различные иммуногенные белки-носители известны в данной области техники и могут использоваться в вакцинах на основе конъюгатов. Предпочтительные белки-носители включают, но без ограничения, белковый комплекс внешней мембраны (ОМРС) Neisseria meningitides, белок столбнячного анатоксина, белки вируса гепатита В (включающие, например, поверхностный белок-антиген [HBsAg] и ядерный белок-антиген [HB CoreAg]), гемоцианин лимфы улитки (KLH), капсидные белки ротавируса и белок L1 VLP папилломавируса быка или VLP папилломавируса человека, например, VLP HPV типа 6, 11 или 16, и т.п., или их фармацевтически приемлемые соли, или любую комбинацию вышеприведенных белков. В некоторых вариантах осуществления эпитопы могут быть образованы в виде слитых полипептидов/белков, образованных между полипептидом вируса гриппа и 1) одним или несколькими повторами микробных пептидов, 2) лигандами для рецепторов дальнего порядка (включающими, например, профиллин и флагеллин), или 3) взаимодействующими с рецепторами молекулами, включающими, например, CpG.

Обладающие признаками изобретения мишеневые антигены можно представить на поверхности микробов, например, БЦЖ, аденовируса, аденоподобного вируса или даже неполноценных вирусных частиц, таких как часть вышеприведенных или других вирусных частиц.

КОМПОЗИЦИИ АНТИГЕННЫХ ПЕПТИДОВ С АДЪЮВАНТАМИ

Хотя антигенные композиции по настоящему изобретению могут быть составлены сами по себе (т.е. из пептидов и повторных пептидов) и в комбинации друг с другом, в других вариантах осуществления они могут быть составлены в виде полисахаридных вакцин, белок-полисахаридных вакцин, конъюгированных вакцин или вместе в виде слитых белков (например, с использованием последовательностей НА или NA, или обеих этих последовательностей). Конъюгаты могут принимать форму микробного или вирусного антигена. Как используется в настоящем описании, «микробный или вирусный антиген» относится к последовательности антигена или эпитопа микроорганизма или вируса и включает, но без ограничения, вызывающие инфекционные заболевания или патогенные вирусы, бактерии, дрожжи, грибы, паразиты, амебы или любую их комбинацию. Такие антигены могут включать сам интактный вирус или микроорганизм, а также их природные изоляты, фрагменты, капсиды, клеточные фракции, мембранные компоненты, лизаты или производные, а также синтетические или рекомбинантные соединения, которые идентичны или схожи (т.е. в значительной степени гомологичны) с природным (т.е. in vivo или in situ) антигеном, полученным из такого микроорганизма или вируса. Во всех таких случаях антиген предпочтительно будет вызывать иммунный ответ у по крайней мере первого животного (и предпочтительно млекопитающего) после презентации иммунной системе животного-хозяина.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, включающих иммуногены и вакцины, являющиеся поливалентными или направленными против множества микробов, иммуноген будет предпочтительно содержать по крайней мере два отличных антигена, по крайней мере один из которых является специфическим для конкретного микроба или вируса. В случае внутривидовых поливалентных иммуногенов такие композиции будут предпочтительно содержать по крайней мере два различных эпитопа или антигена, которые вызывают иммунный ответ против двух или более видов конкретного организма. Альтернативно, в случае межвидовых поливалентных иммуногенов такие композиции будут предпочтительно содержать по крайней мере два отличных эпитопа или антигена, которые вызывают иммунный ответ против по крайней мере одного вида одного организма, а также вызывают иммунный ответ против по крайней мере одного вида второго отличного организма.

Приводимые в качестве примеров внутривидовые поливалентные иммуногены включают, но без ограничения, композиции, которые включают антигены, специфичные для двух или более штаммов одного вида вируса (например, двух или более штаммов вируса гриппа) или двух или более штаммов одного вида бактерии (например, двух или более штаммов Staphylococcus).

Приводимые в качестве примеров межвидовые поливалентные иммуногены включают, но без ограничения, композиции, которые включают антигены, специфичные для двух различных видов организма (например, одного вирусного вида и одного бактериального вида (например, вируса гриппа и Escherichia), двух различных вирусных видов (например, вируса гриппа и вируса лихорадки денге), двух различных бактериальных видов (например, Streptococcus и Clostridium).

Соединение является схожим с природным антигеном микроорганизма, если оно индуцирует иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный) против природного антигена микроорганизма. Такие антигены используются обычно в данной области техники и хорошо известны средним специалистам, и могут включать гриб, бактерию, вирус или вирусоподобную частицу или их часть, или их комбинацию. Как правило, если вакцинация конъюгатом снижает уровень инфицирования или тяжесть возникающего в результате заболевания, пептид и конъюгат считается пригодным для создания вакцины.

Например, описанные в настоящем описании антигены могут быть конъюгированы с полисахаридами, такими как PRP, стафилококковый, менингококковый или пневмококковый полисахарид, для обеспечения усиленного иммунного ответа в популяции с менее чем оптимальный иммунитетом, или когда такой подход является в других отношениях эффективным. Вакцины на основе конъюгатов, в некоторых вариантах осуществления, характеризуются созданием, которое включает конъюгацию полисахаридного антигена с белком. Эта конъюгация может преобразовать Т-клеточнонезависимый углеводный антиген в Т-клеточнозависимый антиген, что увеличивает иммунологическую реакцию на полисахарид. Иммунологическая реакция на полипептид, получаемая при предоставлении ряда повторных антигенных мишеней на пневмококковом полисахаридном остове, может преимущественно обеспечить перекрестное связывание на процессирующих антигены клетках иммунной системы хозяина. Конъюгирование белка вируса гриппа с полисахаридом, таким как PRP, может улучшить универсальную защиту от бактерий Haemophilus influenzae, и поэтому вакцина по настоящему изобретению может быть применимой в странах, особенно развивающихся странах, в которых получение широко распространенной защиты от H. influenzae, а также вируса гриппа является полезным. Другие возможные источники полисахаридов и производных полисахаридов могут включать бактериальные виды, такие как, но без ограничения, Pneumococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp., Klebsiella spp., Neisseria spp. и другие менингококковые виды, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. или любую их комбинацию. Средний специалист в данной области техники, особенно ввиду предоставленного в настоящем описании руководства, мог бы легко представить себе другие полисахариды, липополисахариды, липотейхоевые кислоты, липопептиды, их производные или другие относящиеся к микробам антигенные соединения, которые можно подвергнуть конъюгации с одной или несколькими иммуногенными пептидными композициями по настоящему изобретению для образования поливалентной и/или направленной против множества микробов вакцины. Кроме того, любой способ, имеющийся в распоряжении средних специалистов в данной области техники, может использоваться для конъюгирования иммуногенов и вакцин по настоящему изобретению с непептидными соединениями, такими как полисахариды, липиды, липопептиды и т.п. или любой их комбинацией.

Белки могут содержать один или несколько Т-клеточных эпитопов, которые делают их Т-клеточнозависимыми антигенами, способными к вызову помощи Т-клеток при использовании в качестве антигена вакцины. Антигенный пептид и иммуностимулирующие аминокислотные последовательности, происходящие из дифтерийного и столбнячного анатоксина, или любой другой Т-клеточный эпитоп из любого источника, или части или комбинации любого из вышеприведенных или других источников, могут также использоваться при составлении иммуногенов и вакцин в соответствии с настоящим изобретением. Например, вакцина может включать пептид, имеющий по крайней мере одну и предпочтительно две или более последовательностей М2, или его иммуногенную часть, вместе с по крайней мере одним и предпочтительно двумя стимулирующими Т-клетки эпитопами из столбнячного токсина, предпочтительно связанных с образованием иммуногена.

В некоторых вариантах осуществления предпочтительным является составления конъюгатов пептид М2-белок с использование иммуногенов из вируса гриппа В и/или иммуногенов из бактериальных видов, таких как Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и H. influenzae, вирусных видов, например, рода Orthohepadnavirus (включающего, например, вирус гепатита А, В и С), папилломавируса человека, рода Flavivirus (включающего, например, вирус лихорадки денге), Lyssavirus (включающего, например, вирус бешенства), Morbillivirus (включающего, например, вирус кори), Simplexvirus (включающего, например, вирус простого герпеса), Polymavirus, Rubulavirus (включающего, например, вирус эпидемического паротита), Rubivirus (включающего, например, вирус краснухи), Varicellovirus (включающего, например, авипоксвирус), Rotavirus, Cytomegalovirus, или любого другого иммуногена или любой их комбинации. Кроме того, вакцина по настоящему изобретению может быть объединена с другими антигенные компонентами вируса гриппа А, включающими, например, эпитопы, происходящие из белков гемагглютинина и нейраминидазы, или включать их. Таким образом может быть создана комбинированная вакцина. Комбинированные вакцины могут обеспечить преимущества, заключающиеся в увеличенном удобстве для пациента и меньших затратах на введение вследствие необходимости меньшего количества вакцинаций.

Антигенные композиции по настоящему изобретению могут быть подвергнуты конъюгации с носителями, используя любой способ конъюгирования в данной области техники. Например, конъюгирование можно успешно выполнить, используя сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sSMCC), N-[ε-малеимидокапроилокси]сульфосукцинимидный эфир (sEMCS), N-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), глутаральдегид, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDCI), бис-диазобензидин (BDB) или N-ацетилгомоцистеина тиолактон (NAHT) или их комбинацию.

Кроме того, стафилококковые белки можно использовать в качестве белков-носителей в конъюгатах с полисахаридом или LTA по настоящему изобретению. В качестве белков-носителей могут использоваться описанные ниже стафилококковые белки, например, ламининовый рецептор, SitC/MntC/связывающийся с компонентами слюны белок, EbhA, EbhB, связывающийся с эластином белок (EbpS), EFB (FIB), SBI, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, липазу GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, связывающийся с вибронектином белок, связывающийся с фибриногеном белок, коагулазу, Fig, MAP, иммунодоминантный АВС-переносчик, IsdA, IsdB, переносчик Mg2⁺, HarA, SitC, ABC-переносчик Ni - альфа-токсин (HIα), H35R-мутант α-токсина, активирующий RNA III белок (RAP), MRPII и аутолизин, или их фрагменты.

Новым белком-носителем, который мог бы быть особенно предпочтительным для использования в связи с противостафилококковой вакциной, является стафилококковый α-анатоксин. Природную форму можно подвергнуть конъюгации с полисахаридом, поскольку процесс конъюгации имеет тенденцию к снижению токсичности. Предпочтительно в качестве носителей можно использовать генетически детоксифицированный α-токсин, такой как варианты H35L (с заменой в результате мутации гистидина на лейцин в положении 35 аминокислоты) или H35R (с заменой в результате мутации гистидина на аргинин в положении 35 аминокислоты), поскольку остаточная токсичность является более низкой. Альтернативно, α-токсин детоксифицируют химически путем обработки сшивающим агентом, таким как формальдегид или глутаральдегид. Генетически детоксифицированный α-токсин можно также необязательно химически детоксифицировать путем обработки одним или несколькими сшивающими агентами для снижения или исключения токсичности.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция по настоящему изобретению включает микробные полисахариды. Полисахариды являются полисахаридами природного размера или, альтернативно, могут быть доведены до требуемого размера с помощью, например, микрофлюидизации, обработки ультразвуком или химической обработки. Настоящее изобретение также относится к олигосахаридам, происходящим из полисахаридов типа 5 и типа 8 S. aureus. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция по настоящему изобретению, кроме того, включает полисахарид PIA (или PNAG). PIA (или PNAG) может иметь различные размеры, изменяющиеся от свыше 400 кДа до 75-40 кДа, до 10-75 кДа, до олигосахаридов, состоящих из 30 повторных единиц (1→6)-β-D-глюкозамина, замещенного N-ацетильными и О-сукцинильными составляющими. В дополнительных вариантах осуществления иммуногенная композиция по настоящему изобретению включает антиген 336 S. aureus, в альтернативном случае в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также можно включить полисахариды типа I, II и III из S. epidermidis.

Полипептиды могут быть связаны с полисахаридом(ами)-носителем с помощью любого известного способа (например, из публикации заявки на патент США US2005/0169941, патентов США № 4372945, 4474757 и 4356170, каждый из которых прямо включен в данное описание в целом путем ссылки). Химические способы конъюгации с использованием CDAP или реагирования аминогрупп с оксигруппами можно выполнить в соответствии с общепринятыми способами, включающими, например, способы, изложенные в публикации РСТ-заявки № WO95/08348 и публикации заявки на патент США US2005/0169941, которые прямо включены в данное описание в целом путем ссылки на них.

Вкратце, в способе конъюгации с использованием CDAP предпочтительно используется цианирующий реагент 1-цианодиметиламинопиридиния тетрафторборат (CDAP) для синтеза конъюгатов полисахарид-белок. Реакцию цианирования проводят в относительно мягких условиях, при которых исключается гидролиз чувствительных к щелочным условиям полисахаридов. Этот синтез делает возможным прямое связывание с белком-носителем. Полисахарид растворяют в воде или солевом растворе. CDAP растворяют в ацетонитриле и немедленно добавляют к раствору полисахарида. CDAP реагирует с гидроксильными группами полисахарида с образованием эфира циановой кислоты. После стадии активации добавляют белок-носитель. Аминогруппы лизина реагируют с активированным полисахаридом с образованием изомочевинной ковалентной связи. После реакции связывания добавляют глицин в большом избытке для блокирования остаточных активированных функциональных групп. Продукт затем пропускают через колонку для гель-фильтрации для удаления не вступившего в реакцию белка-носителя и остаточных агентов. В одном варианте LTA подвергают конъюгации, используя способ реагирования аминогрупп с оксигруппами, описанный в публикации заявки на патент США 2005/0169941, которая прямо включены в данное описание в целом путем ссылки на нее.

В способе активации носителя малеимидом конъюгацию успешно выполняют, используя сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (sSMCC) или N-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS). Способ, в котором используется sSMCC, широко используется и является в высокой степени специфичным (см., например, Meyer et al., [2002], описание которого прямо включено в данное описание в целом путем ссылки на него). sSMCC сшивает SH-группу остатка цистеина с аминогруппой остатка лизина в белке-носителе.

В дальнейшей, приводимой в качестве примера реакции конъюгации, конкретнее в реакции конъюгации, в которой используется sSMCC, носитель можно сначала активировать путем связывания реагента sSMCC с амином, например, остатками лизина, носителя. После отделения активированного носителя от избытка реагента и побочного продукта добавляют цистеинсодержащий пептид, и связывание происходит при добавлении SH-группы к малеимидной функциональной группе активированного носителя. При использовании способа, в котором используется MBS, конъюгация пептида с носителем может происходить через схожий механизм.

Конъюгация с использованием sSMCC может быть в высокой степени специфичной для SH-групп. Следовательно, присутствие по крайней мере одного остатка цистеина в пептидной последовательности или полипептиде, как правило, необходимо для легкой конъюгации. Если пептид не имеет остатка цистеина, его предпочтительно следует добавить в пептид, предпочтительно к N-концу или С-концу. Если желаемый эпитоп в пептиде содержит цистеин, конъюгация не должна проводиться с помощью способа, в котором используется sSMCC-активированный носитель. Если пептид содержит более одного остатка цистеина, пептид не должен подвергаться конъюгации с носителем, используя sSMCC, хотя предпочтительно sSMCC включают, если избыточный цистеиновый остаток может быть замещен или модифицирован.

В предпочтительных вариантах осуществления связь не должна мешать желаемому эпитопу в пептиде. Любые остатки цистеина в пептиде предпочтительно отделены от последовательности желаемого эпитопа расстоянием, составляющим по крайней мере одну аминокислоту в качестве спейсера или линкера.

В другой реакции конъюгации в соответствии со способами по настоящему изобретению используется N-ацетил-DL-гомоцистеина тиолактон (NAHT). Например, тиолактон можно использовать для введения тиольной функциональной группы в ОМРС, чтобы сделать возможной конъюгацию с малеимидированными или бромацетилированнными пептидами (см., например, Tolman et al., 1993; Conley et al., 1994).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения реакции конъюгации для связывания пептида с белком могут включать введение и/или использование собственных нуклеофильных групп на реагирующем веществе и введение и/или использование собственных электрофильных групп в другом реагирующем веществе. Например, нуклеофильную тиольную группу можно ввести в белок-носитель (предпочтительно ОМРС), а затем добавить электрофильные группы (предпочтительно алкилгалиды или малеимид) к пептиду. Получаемый в результате конъюгат имеет тио-эфирные связи, соединяющие пептид и носитель. Прямое взаимодействие пептидной электрофильной группы (малеимида или алкилгалида) с собственными нуклеофильными группами (предпочтительно первичными аминами или тиолами) белка-носителя может приводить к вторичным аминным и тио-эфирным связям. Альтернативные схемы включают добавление малеимидной группы или алкилгалида к носителю, и введение концевого цистеина в пептид и/или использование собственных тиолов пептидов может приводить к образованию тио-эфирных связей, когда желательно.

ВКЛЮЧАЮЩИЕ АНТИТЕЛА КОМПОЗИЦИИ

Антигенные полипептидные композиции по настоящему изобретению особенно полезны для продукции антител, специфичных для полипептидов, описанных в настоящем описании, и/или полипептидов, кодируемых полинуклеотидами по настоящему изобретению, включающих те, которые описаны в настоящем описании, и их консервативные варианты. Антитела, специфичные для этих полипептидов, применимы, например, и для диагностических, и для терапевтических/профилактических целей, т.е. связанных с активностью, распространением и экспрессией мишеневых полипептидов.

Как используется в настоящем описании, «антитело» относится к белку, включающему один или несколько полипептидов, в основном или отчасти кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Общепризнанные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей κ, λ, α, γ, δ, ε и µ, а также бесчисленное количество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи относят или к κ, или к λ. Тяжелые цепи относят к γ, µ, α, δ или ε, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Антитела включают, например, но без ограничения, поликлональные антитела, моноклональные антитела, много- или одноцепочечные антитела, включающие одноцепочечные Fv (sFv или scFv)-антитела, в которых вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены вместе (напрямую или через пептидный линкер) с образованием непрерывного полипептида, и гуманизированные или химерные антитела.

Антитела, специфичные для полипептидов по настоящему изобретению, можно создать с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Такие антитела могут включать, но без ограничения, поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты и фрагменты, продуцируемые Fab-экспрессирующей библиотекой. Многочисленные способы продукции поликлональных и моноклональных антител известны средним специалистам в данной области техники и могут быть адаптированы для получения антител, специфичных для полипептидов по настоящему изобретению и/или полипептидов, кодируемых полинуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению (см., например, Coligan Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY, Paul (ed.) (1991); (1998) Fundamental Immunology Fourth Edition, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, USA; Stites et al. (Eds.) Basic and Clinical Immunology (4^th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, USA и приведенные там ссылки; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY, USA, 1989; и Kohler and Milstein (1975)).

Для некоторых применений может быть желательным приготовление «гуманизированных» антител. Способы приготовления химерных (гуманизированных) антител хорошо известны средним специалистам в данной области техники, и их примеры приводятся, например, в патентах США № 4634664, 4634666 и 5482856, каждый из которых прямо включен в данное описание в целом путем ссылки на него.

В конкретных вариантах осуществления антитела, либо моноклональные, либо поликлональные, могут специфически связываться с по крайней мере первым иммуногенным пептидом или полипептидом, описанным в настоящем описании, и, в частности, с одной или несколькими из последовательностей антигенных пептидов, представленных в любой из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52. Методы создания и получения характеристик антител широко известны в данной области техники, особенно при использовании предоставленного в настоящем описании руководства. Способы создания моноклональных антител (мАт) обычно начинаются в таких же направлениях, как и при создании поликлональных антител. Вкратце, поликлональное антитело готовят путем иммунизации животного иммуногенной композицией в соответствии с настоящим изобретением и получения антисывороток от этого иммунизированного животных. Широкий диапазон видов животных можно использовать для получения антисывороток. Как правило, используемым для получения антисыворок животным является кролик, мышь, крыса, хомяк, морская свинка или коза. Для получения поликлональных антител предпочтительным выбором является кролик из-за относительно большого объема крови у него.

Как это хорошо известно в данной области техники, иммуногенность конкретной композиции может варьировать. Поэтому часто необходимо дополнительно повышать активность иммунной системы хозяина, что может достигаться соединением пептидного или полипептидного иммуногена с носителем. Приводимыми в качестве примеров и предпочтительными носителями являются гемоцианин лимфы улитки (KLH) и бычий сывороточный альбумин (BSA). В качестве носителей можно также использовать другие альбумины, такие как овальбумин, мышиный сывороточный альбумин или кроличий сывороточный альбумин. Способы конъюгирования полипептида по настоящему изобретению с белком-носителем хорошо известны средним специалистам в данной области техники и включают, например, использование глутаральдегида, N-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного эфира, карбодиимида и бис-диазотированного бензидина, или любой их комбинации.

Количество иммуногенной композиции, используемое для продукции поликлональных антител, изменяются в зависимости от природы иммуногена, а также используемого для иммунизации животного. Любой из описанных в настоящем описании путей можно использовать для введения иммуногена. Продукцию поликлональных антител можно контролировать путем отбора образца крови иммунизированного животного в различные моменты времени после иммунизации. Можно также предоставить вторую, бустер-иммунизацию. Процесс бустинга и определения титра повторяют до достижения подходящего титра. Когда получают требуемый уровень иммуногенности, у иммунизированного животного можно взять кровь, и сыворотку - выделять и хранить, и/или животное можно использовать для создания мАт.

мАт можно легко приготовить через использование хорошо известных методов, таких как методы, приведенные в качестве примеров в патенте США № 4196265, который прямо включен в данное описание в целом путем ссылки на него. Как правило, этот метод включает иммунизацию подходящего животного композицией отобранного иммуногена, например, очищенным или частично очищенным подавляющим опухоли белком, полипептидом или пептидом. Композицию для иммунизации предпочтительно вводят способом, эффективным для стимуляции продуцирующих антитела клеток. Предпочтительными животными являются грызуны, такие как мыши и крысы, однако также можно использовать кролика, клетки овечьего узкорота. Использование крыс может обеспечить определенные преимущества, но предпочтительными являются мыши, при этом мышь BALB/c является наиболее предпочтительной и наиболее регулярно используемой, поскольку она дает больший процент стабильных слияний.

После иммунизации соматические клетки, обдающие потенциалом в отношении продукции антител, особенно В-лимфоциты (В-клетки), отбирают для использования в протоколе создания мАт. Эти клетки можно получить из взятых при биопсии кусочков селезенки, небных миндалин или лимфатических узлов, или из образца периферической крови. Предпочтительными являются клетки селезенки и клетки периферической крови, первые, поскольку они являются богатым источником продуцирующих антитела клеток, которые находятся на стадии делящихся плазмабластов, а последние из двух, поскольку периферическая кровь является легкодоступной. Часто иммунизации будет подвергаться группа животных, и будут извлекать селезенку животного с наибольшим титром антител, а лимфоциты селезенки - получать с помощью гомогенизации селезенки с использованием шприца. Обычно селезенка иммунизированной мыши содержит приблизительно 5×10⁷ - 2×10⁸ лимфоцитов.

Продуцирующие антитела В-лимфоциты из иммунизированного животного можно затем слить с иммортализованными миеломными клетками, обычно клетками такого же вида животного, что и животное, которое было иммунизировано. Линии миеломных клеток, подходящие для использования в способах слияния с получением гибридом, предпочтительно являются не продуцирующими антитела, характеризуются большой способностью к слиянию и недостатками ферментов, которые придают им неспособность к росту в определенных селективных питательных средах, которые поддерживают рост только желаемых слитых клеток (гибридом).

Можно использовать любую из ряда миеломных клеток, которые известны средним специалистам в данной области техники. Например, если иммунизированным животным является мышь, можно использовать P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 и S194/5XX0 Bul; в случае крыс можно использовать R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F и 4B210; и применительно к слияниям с клетками человека пригодны все из U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 и UC729-6.

Одной предпочтительной мышиной миеломной клеткой является линия миеломных клеток NS-1 (также называемая P3-NS-1-Ag4-1), которую можно без труда получить из репозитория клеток человека - генетических мутантов NIGMS при запросе номера линии клеток в базе данных репозитория - GM3573. Другой линией мышиных миеломных клеток, которую можно использовать, является линия устойчивых к 8-азагуанину мышиных миеломных клеток, не являющихся продуцентами, Sp2/0, которая широко используется в данной области техники и известна средним специалистам в области антител.

Способы создания гибридов продуцирующих антитела клеток селезенки или лимфатических узлов и миеломных клеток обычно включают смешивание соматических клеток с миеломными клетками в пропорции 2:1, хотя пропорция может варьировать от приблизительно 20:1 до приблизительно 1:1, соответственно, в присутствии агента или агентов (химических или электрических), которые ускоряют слияние клеточных мембран. В данной области техники были описаны способы слияния, в которых используется вирус Сендай, и способы, в которых используется полиэтиленгликоль (PEG), например, 37% (об/об) PEG.

В способах слияния обычно получают жизнеспособные гибриды с низкими частотами, приблизительно 1×10^-6-1×10^-8. Однако это не представляет проблему, поскольку жизнеспособные слитые гибриды обычно развиваются из родительских, неслитых клеток (в частности, неслитых миеломных клеток, которое могли бы обычно продолжать делиться бесконечно) при культивировании в селективной среде. Селективной средой обычно является среда, которая содержит агент, который блокирует de novo синтез нуклеотидов в средах для культуры тканей. Приводимыми в качестве примеров и предпочтительными агентами являются аминоптерин, метотрексат и азасерин, и их комбинации. Аминоптерин и метотрексат блокируют de novo синтез пуринов и пиримидинов, в то время как азасерин блокируют только синтез пуринов. При использовании аминоптерина или метотрексата среду дополняют гипоксантином или тимидином в качестве источника нуклеотидов (среда НАТ). При использовании азасерина среду дополняют гипоксантином.

Предпочтительной селективной средой является НАТ. Только клетки, способные к эксплуатации нуклеотидных спасательных путей, могут выживать в среде НАТ. Миеломные клетки имеют дефект в ключевых ферментах спасательного пути, например, гипоксантин-фосфорибозилтрансфере (HPRT), и они не способны выживать. В-клетки могут эксплуатировать этот путь, но они имеют ограниченное время жизни в культуре и обычно погибают в пределах приблизительно двух недель. Поэтому только клетки, которые могут выжить в селективных средах, являются гибридами, образованными из миеломных клеток и В-клеток.

Это культивирование обеспечивает популяцию гибридом, из которой отбирают специфические гибридомы. Как правило, отбор гибридом выполняют с помощью культивирования клеток при разведении до одного клона в планшетах для микротитрования, с последующей проверкой супернатантов индивидуальных клонов (через приблизительно две или три недели) на желаемую реакционную способность. Анализ должен быть чувствительным, простым и быстрым, таким как радиоиммуноанализ, ферментные иммуноанализы, реакции цитотоксичности, анализ бляшкообразования, иммуносорбентные анализы с иммобилизованными на мембране антигенами или антителами и т.п.

Отобранные гибридомы можно было бы затем подвергнуть серийному разведению и клонированию в индивидуальные антителопродуцирующие клеточные линии, клоны которых можно затем неограниченно размножить для обеспечения мАт. Линии клеток можно использовать для продукции мАт двумя основными способами. Образец гибридомы можно инъецировать (часто в брюшинную полость) гистосовместимому животному типа, который использовался для обеспечения соматических и миеломных клеток для первоначального слияния. У подвергнутого инъекции животного развиваются опухоли, секретирующие специфическое моноклональное антитело, продуцируемое гибридом - слитыми клетками. Жидкости организма животного, такие как сыворотка или асцитическая жидкость, можно затем откачать путем пункции для обеспечения мАт в высокой концентрации. Индивидуальные клеточные линии можно было бы подвергнуть культивированию in vitro, когда мАт естественно секретируются в среды для культивирования клеток, из которых их можно легко получить в высоких концентрациях. мАт, продуцированные любым из двух способов, можно в дальнейшем очистить, при желании, используя фильтрацию, центрифугирование и различные хроматографические способы, такие как HPLC или аффинная хроматография.

ЭКСПРЕССИОННЫЕ ВЕКТОРЫ

Настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, включающему по крайней мере один полинуклеотид, кодирующий иммуногенный пептид или полипептид по настоящему изобретению. Используемый в настоящем описании термин «функционально связанный» означает, что промотор соединен с функциональной последовательностью нуклеиновой кислоты таким образом, что транскрипция функциональной последовательности нуклеиновой кислоты контролируется и регулируется этим промотором. Способы функционального связывания промотора с функциональной нуклеиновой кислотой хорошо известны средним специалистам в данной области техники.

Выбор того, какой экспрессионный вектор использовать и, в конечном счете, с каким промотором функционально связывать кодирующую полипептид область, напрямую зависит от желаемых функциональных свойств, например места и выбора момента времени для экспрессии белка, и трансформируемой клетки-хозяина. Существуют хорошо известные ограничения, связанные с областью конструирования молекул рекомбинантных ДНК. Однако вектор, пригодный для осуществления на практике настоящего изобретения, способен к управлению экспрессией функциональной РНК, с которой он функционально связан.

РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность ДНК через сайт, в котором имеет место полиаденилирование. Как правило, последовательности ДНК, находящиеся на немного сотен пар оснований ниже (3') сайта полиаденилирования, служат для терминации транскрипции. Эти последовательности ДНК имеют в настоящем описании районы терминации транскрипции. Эти районы необходимы для эффективного полиаденилирования транскрибируемой информационной РНК (мРНК).

Было разработано множество способов для функционального связывания сегмента(ов) нуклеиновой кислоты с вектором посредством использования комплементарных липких концов или тупых концов. Такие способы обычно используются в молекулярных областях и хорошо известны средним специалистам в этих областях. Например, комплементарные гомополимерные участки можно добавить к встраиваемому сегменту ДНК или к векторной ДНК. Вектор и сегмент ДНК затем соединяются с помощью образования водородных связей между комплементарными гомополимерными концевыми участками с образованием молекул рекомбинантных ДНК.

ОПОСРЕДОВАННАЯ ЛИПОСОМАМИ, НАНОКАПСУЛАМИ И МИКРОЧАСТИЦАМИ ДОСТАВКА

В некоторых вариантах осуществления авторы настоящего изобретения предусматривают использование этосом, липосом, липидных комплексов, ниосом, фосфолипидов, нанокапсул, наносфер, микрочастиц, микрокапсул, микросфер, липидных частиц, липидных везикул, трансферосом, поверхностно-активных веществ и т.п., или любой их комбинации, для введения иммуногенных композиций по настоящему изобретению, или кодирующих их нуклеиновых кислот, в подходящие клетки-хозяева. Предпочтительно композиции или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению по крайней мере в значительной степени, предпочтительно полностью, содержатся внутри этих лекарственных форм или связаны с ними до доставки пациенту для эффективности диагностики, профилактики или лечения.

Такие композиции могут также быть предпочтительными при введении фармацевтически приемлемых композиций нуклеиновых кислот, которые кодируют одну или несколько иммуногеннных пептидных композиций, описанных в настоящем описании. Средние специалисты в данной области техники обычно знакомы с приготовлением и использованием липосом, и липосомы, микрочастицы, нанокапсулы и т.п. стали более масштабно использоваться для направленной доставки терапевтических композиций к клеткам-хозяевам (см., например, патент США № 5741518, который прямо включен в данное описание в целом путем ссылки на него). Кроме того, был представлен обзор различных способов приготовления липосом и липосомоподобных везикул в качестве возможных носителей лекарственных средств (патенты США № 5567434, 5552157, 5565213, 5738868 и 5795587, каждый из которых прямо включен в данное описание в целом путем ссылки на него).

Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и самопроизвольно образуют двухслойные концентрические везикулы (также называемые многослойными везикулами (MLV)). Диаметр MLV обычно составляет от приблизительно 25 нм до приблизительно 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию небольших однослойных везикул (SUV) диаметром в диапазоне от приблизительно 200 до приблизительно 500 ангстрем, содержащих водный раствор в центральной части. Липосомы имеют сходство с клеточными мембранами, и предусматривается их применение в связи с настоящим изобретением в качестве носителей иммуногенных пептидных и полипептидных композиций, описанных в настоящем описании. Они в значительной степени пригодны, поскольку водо- и липидрастворимые вещества могут задерживаться в них, т.е. в водных пространствах или внутри самого бислоя, соответственно. Липосомы, липидные комплексы и т.п. могут также использоваться для сайт-специфической доставки одного или нескольких терапевтических, профилактических или диагностических средств, описанных в настоящем описании, путем избирательного изменения липосомного состава для конкретного намеченного введения.

Фосфолипиды могут образовывать ряд структур, отличных от липосом, после диспергирования в воде, в зависимости от молярного соотношения липида и воды. При низких соотношениях липосомы могут быть предпочтительными структурами. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов. Липосомы могут проявлять низкую проницаемость для ионных и полярных веществ, но при повышенных температурах подвергаются фазовому переходу, который заметно изменяет их проницаемость. Фазовый переход включает смену плотно упакованной, упорядоченной структуры, известной как гелеобразное состояние, на неплотно упакованную, менее упорядоченную структуру, известную как жидкое состояние. Это происходит при характеристической температуре фазового перехода и приводит к увеличению проницаемости для ионов, сахаров и лекарственных средств.

Способность к задерживанию растворенных веществ варьирует между различными типами липосом. Например, MLV являются умеренно эффективными в задерживании растворенных веществ, но SUV проявляют чрезвычайную неэффективность. Однако SUV дают преимущество, заключающееся в гомогенности и воспроизводимости распределения по размерам, а компромиссное решение между размером и эффективностью задерживания дают большие однослойные везикулы (LUV). Их готовят путем выпаривания простого эфира, и они могут быть в три-четыре раза эффективнее в задерживании растворенных веществ, чем MLV.

Направленная доставка не является, как правилом, ограничением в контексте настоящего изобретения. Однако если желательна специфическая доставка одной или нескольких иммуногенных композиций, имеются способы для выполнения этого. Можно использовать антитела, которые связываются с поверхностью липосомы и направляют антитело и его лекарственное содержимое к специфическим антигенным рецепторам, находящимся на поверхности конкретного типа клеток. В качестве сайтов распознавания можно также использовать углеводные детерминанты (гликопротеиновые или гликолипидные компоненты клеточной поверхности, играющие роль в межклеточном распознавании, взаимодействии и адгезии), поскольку они обладают способностью к направлению к конкретным типам клеток. В основном предполагается, что могли бы использоваться внутривенные введения липосомных препаратов, но также могут использоваться другие пути введения, описанные в настоящем описании.

Альтернативно, настоящим изобретением предусматриваются препараты иммуногенных композиций по настоящему изобретению в форме фармацевтически приемлемых нанокапсул. Для использования в настоящем изобретении предусматриваются биодеградируемые наночастицы из полиалкилцианоакрилата, которые удовлетворяют этим требованиям. Такие частицы можно легко изготовить, как описано (см., например, патент США № 5145684, который прямо включен в данное описание в целом путем представления ссылки на него).

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ СПОСОБЫ ДОСТАВКИ

Помимо описанных в настоящем описании способов доставки, следующие методы также предусматриваются в качестве альтернативных способов доставки описанных в настоящем описании иммуногенных композиций, а также кодирующих их полинуклеотидов, к являющимися мишенями клеткам или выбранным тканям и органам животного и, в частности, к клеткам, органам или тканям являющегося позвоночным млекопитающего, а конкретнее, примата, такого как человек. Сонофорез (т.е. ультразвук) использовался и описан в патенте США № 5656017 в качестве средства увеличения скорости и эффективности проникновения лекарственного средства в кровеносную систему и через нее. Другими предусмотренными альтернативными способами доставки лекарственного средства являются внутрикостная инъекция (патент США № 5779708), микросхемные средства (патент США № 5797898), трансдермальные матрицы (патенты США № 5770219 и 5783208) и средство, управляемое при обратной связи (патент США № 5697899), все из которых прямо включены в данное описание в целом путем ссылки на них.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭКВИВАЛЕНТЫ

Для получения функциональных вариантов, которые обладают желаемыми антигенными характеристиками, в частности, что касается улучшенной доставки терапевтических генных конструкций к выбранным клеткам, тканям или органам млекопитающего для лечения, предупреждения и профилактики различных заболеваний и нарушений, а также способов уменьшения интенсивности симптомов таких заболеваний, можно осуществить модификации и изменения в структуре полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению. Такие модификации могут использоваться для облегчения экспрессии одного или нескольких экзогенных терапевтических и/или профилактических полипептидов, представляющих интерес, способами, известными средним специалистам в молекулярных областях, включающих, например, опосредованную вектором генную терапию. Как отмечено выше, один из основных аспектов настоящего изобретения включает создание одной или нескольких мутаций в специфических полинуклеотидных последовательностях, которые кодируют одну или несколько поливалентных иммуногенных пептидных или полипептидных композиций, описанных в настоящем описании. В некоторых случаях результирующая пептидная или полипептидная последовательность изменена при осуществлении этих мутаций, или в других случаях последовательность пептида или полипептида не изменена при осуществлении одной или более мутаций в кодирующем полинуклеотиде для получения модифицированных иммуногенов с улучшенными свойствами относительно свойств, обусловленных последовательностями дикого типа.

Если желательно изменить аминокислотную последовательность полипептида для создания эквивалента, или даже улучшенной молекулы второго поколения, аминокислотные замены можно успешно выполнить путем изменения одного или нескольких кодонов кодирующей ДНК-последовательности, в соответствии с таблицей 3.

Например, определенные аминокислоты можно использовать вместо других аминокислот в структуре белка без существенной утраты способности к взаимодействию - связыванию с такими структурами, как, например, антигенсвязывающие области антител или сайты связывания на молекулах субстратов. Поскольку именно способность к взаимодействию и природа белка определяют биологическую функциональную активность белка, определенные замены в аминокислотной последовательности можно осуществить в последовательности белка и, конечно, лежащей в ее основе кодирующей ДНК-последовательности, и, тем не менее, получить белок со схожими в значительной степени, или схожими или даже идентичными свойствами. Следовательно, предполагается, что различные замены можно осуществить в описанных в настоящем описании полинуклеотидных последовательностях без существенной утраты биологической применимости или активности, так что можно получить биологически функционально эквивалентный белок.

При осуществлении таких замен во внимание может приниматься индекс гидрофобности аминокислоты. В данной области техники обычно предполагается важность индекса гидрофобности аминокислоты в придании белку интерактивной биологической функции. Обычно признают, что относительно гидрофобный характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру результирующего белка, которая в свою очередь определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и т.п. Для каждой аминокислоты установлен индекс гидрофобности на основе ее гидрофобности и зарядных характеристик, и такими индексами являются: для изолейцина (+4,5), валина (+4,2), лейцина (+3,8), фенилаланина (+2,8), цистеина/цистина (+2,5), метионина (+1,9), аланина (+1,8), глицина (-0,4), треонина (-0,7), серина (-0,8), триптофана (-0,9), тирозина (-1,3), пролина (-1,6), гистидина (-3,2), глютамата (-3,5), глютамина (-3,5), аспартата (-3,5), аспарагина (-3,5), лизина (-3,9) и аргинина (-4,5).

При осуществлении таких замен замещение аминокислот, индексы гидрофобности которых находятся в пределах приблизительно ±2, является предпочтительным, замещение аминокислот, индексы гидрофобности которых находятся в пределах приблизительно ±1, является особенно предпочтительным, и замещение аминокислот, индексы гидрофобности которых находятся в пределах приблизительно ±0,5, является наиболее предпочтительным. В данной области техники также предполагается, что замещение подобных аминокислот можно эффективно осуществить на основе гидрофильности. В патенте США № 4554101, который прямо включен в данное описание в целом путем ссылки на него, утверждается, что наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определяемая гидрофильностью его смежных аминокислот, связана с биологическими свойствами этого белка.

Как детализировано в патенте США № 4554101, следующие величины гидрофильности установлены для аминокислотных остатков: аргинина (+3,0), лизина (+3,0), аспартата (+3,0±1), глютамата (+3,0±1), серина (+0,3), аспарагина (+0,2), глютамина (+0,2), глицина (0), треонина (-0,4), пролина (-0,5±1), аланина (-0,5), гистидина (-0,5), цистеина (-1,0), метионина (-1,3), валина (-1,5), лейцина (-1,8), изолейцина (-1,8), тирозина (-2,3), фенилаланина (-2,5), триптофана (-3,4). Предполагается, что аминокислоту можно использовать вместо другой аминокислоты, имеющей схожую величину гидрофильности, и все еще получить биологически эквивалентный и, в частности, иммунологически эквивалентный белок. Как изложено выше, замены аминокислот обычно, таким образом, основываются на относительной схожести замещающих групп - боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и т.п. Примерные замены, при которых принимаются во внимание несколько из вышеприведенных характеристик, хорошо известны средним специалистам в данной области техники и включают аргинин и лизин; глютамат и аспартат; серин и треонин; глютамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.

СРАВНЕНИЕ, ИДЕНТИЧНОСТЬ И ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Термины «идентичные» или «идентичность» в процентах в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют точно определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, после сравнения и совмещения для максимального соответствия, определенный, используя один из алгоритмов для сравнения последовательностей, описанных ниже (или другие алгоритмы, имеющиеся в распоряжении средних специалистов), или визуальный просмотр.

Выражение «в значительной степени идентичные», в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов (например, последовательностей антигенных полипептидов или полинуклеотидных последовательностей, кодирующих их), относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые имеют идентичность нуклеотидов или аминокислотных остатков, составляющую по крайней мере приблизительно 90%, предпочтительно 91%, наиболее предпочтительно 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или более, после сравнения и совмещения для максимального соответствия, определенную, используя алгоритм для сравнения последовательностей или визуальный просмотр. Такие «в значительной степени идентичные» последовательности обычно считают «гомоличными», без упоминания фактического родства. Что касается пептидов и полипептидов, предпочтительно, когда «в значительной степени идентичность» существует по всему участку аминокислотной последовательности, длина которого составляет по крайней мере приблизительно 10, по крайней мере приблизительно 20, по крайней мере приблизительно 30, по крайней мере приблизительно 40, по крайней мере приблизительно 50 аминокислот или более, даже вплоть до полной длины (или почти полной длины) двух сравниваемых пептидных или полипептидных последовательностей. Что касается полинуклеотидов, кодирующих такие антигенные пептиды и полипептиды, предпочтительно, когда «в значительной степени идентичность» существует по всему участку последовательностей нуклеиновых кислот, длина которого составляет по крайней мере приблизительно 30, по крайней мере приблизительно 60, по крайней мере приблизительно 90, по крайней мере приблизительно 120, по крайней мере приблизительно 150 нуклеотидов или более, даже вплоть до полной длины (или почти полной длины) двух сравниваемых полинуклеотидных последовательностей.

При сравнении последовательностей и определении гомологии обычно одна последовательность служит в качестве контрольной последовательности, с которой сравнивают тестовые последовательности. При использовании алгоритма для сравнения последовательностей контрольную и тестовые последовательности вводят в компьютер, устанавливают, если необходимо, координаты последовательностей и устанавливают параметры программы алгоритма для сравнения последовательностей. Затем можно использовать алгоритм для сравнения последовательностей для расчета идентичности в процентах тестовой последовательности(ей) контрольной последовательности, на основе установленных параметров программы.

Оптимальное совмещение последовательностей для сравнения можно провести, например, с помощью алгоритма для локальной гомологии (см., например, Smith and Waterman, 1981), алгоритма для совмещения на основе гомологии (см., например, Needleman and Wunsch, 1970), способа сравнения схожести путем поиска (см., например, Pearson and Lipmann, 1988), компьютеризованных разработок алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, США, или с помощью визуального просмотра.

Одним примером алгоритма, который подходит для определения идентичности последовательностей и схожести последовательностей в процентах, является алгоритм BLAST (Altschul et al., 1990) и матрица замен BLOSUM62 (см., например, Henikoff and Henikoff, 1989). Программа для выполнения анализов BLAST общедоступна благодаря Национальному центру биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Помимо расчета идентичности последовательностей в процентах, алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Atschul, 1993). Другим примером пригодного алгоритма для совмещения последовательностей является программа PILEUP, которая производит совмещение множества последовательностей из группы родственных последовательностей, используя постепенные, попарные совмещения. Она может представить дерево, демонстрирующее кластерные связи, используемые для производства совмещения. В PILEUP используется упрощенный вариант способа сравнения путем постепенного совмещения (см., например, Feng and Doolittle, 1987). Используемый способ схож со способом, описанным Higgins и Sharp (1989).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Используемые в настоящем описании термины «примерно» и «приблизительно» являются взаимозаменяемыми и, как следует обычно понимать, относятся к диапазону чисел вблизи конкретного числа, а также всем числам в упомянутом диапазоне чисел (например, «приблизительно 5-15» означает «приблизительно от 5 до 15», кроме особо оговоренных случаев). Кроме того, следует понимать, что все численные диапазоны в настоящем описании включают всю совокупность целых чисел в пределах этого диапазона. Используемый в настоящем описании термин «антиген» или «иммуноген» означает вещество, которое индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, аттенюированный или живой, субъединицу или часть организма, рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами, кусочек или фрагмент ДНК, способный к индукции иммунного ответа после презентации животному-хозяину, белок, полипептид, пептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно, иммуноген или антиген может включать токсин или анатоксин. Как правило, антиген включает любое иммуногенное вещество, т.е. любое вещество, которое вызывает иммунный ответ (например, продукцию специфических молекул антител) после введения в ткани чувствительного животного, и которое способно к специфическому связыванию с антителом, которое продуцируется в ответ на введение антигена. Антиген может распознаваться иммунной системой, индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или индуцировать клеточный иммунный ответ, приводящие к активации В- и/или Т-лимфоцитов. Антиген может включать один эпитоп, или два или более эпитопов. Антиген может включать один или несколько природных или синтетических иммуногенных компонентов и может необязательно вводиться в одном или нескольких адъювантах или любом другом описанном в настоящем описании варианте осуществления, или с ними.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к белку, который связывается с другими молекулами (антигенами) посредством вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, V_H и V_L, соответственно. Термин «антитело» относится к любой молекуле иммуноглобулина, включающей, например, но без ограничения, IgM, IgG, IgA, IgE, IgD и любой их подкласс или любую их комбинацию. Термин «антитело» также означает функциональный фрагмент молекул иммуноглобулинов, включающий, например, но без ограничения, Fab-, Fab'-, (Fab')₂, Fv-, Fd-, scFv- и sdFv-фрагменты, если прямо не оговорено иное. Например, используемый в настоящем описании термин «антитело М2» или «антитело против М2» означает антитело, которое специфически связывается с белком М2 или его частью (эпитопом).

Как используется в настоящем описании, «антигенный полипептид» или «иммуногенный полипептид» представляет собой полипептид, который после введения позвоночному взаимодействует с молекулами иммунной системы позвоночного, т.е. является антигенным, и/или индуцирует иммунный ответ у позвоночного, т.е. является иммуногенным. Примеры антигенных и иммуногенных полипептидов по настоящему изобретению включают, но без ограничения, например, HA, NP, PB1, PB2, NS1, NS2, M1, NA, PA, M2, в том числе внеклеточный фрагмент М2 (М2е), или любой из вышеприведенных полипептидов или их фрагментов или вариантов. Выделенные антигенные и иммуногенные полипептиды по настоящему изобретению, помимо полипептидов, кодируемых полинуклеотидами по настоящему изобретению, могут быть предоставлены в виде рекомбинантного белка, очищенной субъединицы, вирусного вектора, экспрессирующего белок, или могут быть представлены в форме вакцины на основе инактивированного вируса гриппа, например, живой аттенюированной противовирусной вакцины, вакцины на основе убитого при нагревании вируса и т.п.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «носитель» включает любой растворитель(и), дисперсионную среду(ы), покровный материл(ы), разбавитель(и), буфер(ы), агент(ы) для придания изотоничности, раствор(ы), суспензию(и), коллоидный раствор(ы), инертный материал(ы) или т.п., или любую их комбинацию, который является фамацевтически приемлемым для введения релевантному животному. Использование одного или нескольких носителей для доставки химических соединений, вообще, и пептидов и эпитопов, в частности, хорошо известно средним специалистам в фармацевтических областях. За исключением случаев, когда общепринятая среда или агент являются не совместимыми с активным ингредиентом, предусматривается их использование в терапевтических, профилактических и диагностических композициях. Один или несколько дополнительных активных ингредиентов можно также включить в одну или несколько описанных в настоящем описании иммуногенных композиций, или назначить вместе с ними.

Используемый в настоящем описании термин «циркулирующие» относится к микробам, которые существуют в популяции встречающихся в природе, диких хозяев для этого микроба и могут быть обычно выделены из наличных популяций хозяев. В некоторых вариантах осуществления термин «циркулирующие» может относиться к микробам, которые когда-то существовали в популяции диких хозяев, но которые после стали редкими в наличных популяций хозяев или исчезнувшими из них. Вирус птичьего гриппа (H5N1), например, является микробом, циркулирующим в настоящее время в популяциях птиц по всему миру, но он не циркулирует широко среди людей, тогда как вирус испанского гриппа был микробом, который циркулировал в 1918, но о котором неизвестно, что он циркулирует в настоящее время. Циркулирующие в настоящее время в популяции людей вирусы, такие как H1N1 и H3N2, отличаются от «лабораторных вирусов», которые, как установлено, были изменены (т.е. генетически сконструированы или мутированы) благодаря вмешательству человека.

Как используются в настоящем описании, «консервация» или «консервативный» относится к устойчивости последовательностей, или подпоследовательностей внутри последовательностей, нуклеотидов или предпочтительно полипептидов к антигенной изменчивости и дрейфу в динамике времени, например, год от года. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения консервация в динамике времени означает уменьшенную степень рекомбинации и числа, или значения, точечных мутаций и других мутаций в отобранных полипептидах, и предпочтительно в пептидных последовательностях по настоящему изобретению, по сравнению со степенью мутаций для остальных частей полипептидов или белков, из которых выбраны отобранные полипептиды. В некоторых вариантах осуществления может считаться в случае вакцин, созданных с использованием мишеневых антигенов, имеющих конкретные пептидные последовательности, что чем выше демонстрируемая в этих конкретных пептидных последовательностях консервация аминокислотной последовательности гомологичных вирионных субъединичных компонентов, т.е. структур антигенных эпитопов, для чем большего диапазона штаммов, подтипов или типов вирусов, тем больше эффект вакцинаций на основе одного курса. Как правило, предполагается, что такая вакцина обеспечивает более широкий диапазон защиты, чем обычная вакцина. Однако вследствие наличия расплывчатой связи между неиммунодоминантностью и консервацией последовательности можно также ожидать, что вакцина для наиболее широкого диапазона защиты будет менее защищающей от одного или нескольких штаммов на основе «на каждый эпитоп». Использование повторных пептидных последовательностей (т.е. увеличение числа эпитопов) эффективно компенсирует это различие. В некоторых вариантах осуществления консервативная область обычно остается инвариантной пептидной или нуклеотидной последовательностью в динамике времени. Консервативные области могут содержать консервативные мутации, которые не влияют на функцию полипептида или полинуклеотида или, в случае эпитопов, способность этого эпитопа к стимуляции иммунного ответа у хозяина. В некоторых вариантах осуществления «консервативную» аминокислотную замену определяют как замену, которая не вызывает в значительной степени неблагорипятный эффект на общие физические и/или биологические или иммуногенные свойства полипептида. В некоторых вариантах осуществления консервативные области обеспечивают одну и ту же или по существу одну и ту же биологическую функцию в динамике времени. Поскольку консервативные эпитопы устойчивы к мутагенному изменению, иммуногенная природа эпитопа может сохраняться.

Используемый в настоящем описании термин «эпитоп» относится к такой части конкретного иммуногенного вещества, которая является мишенью антитела или рецептора клеточной поверхности, т.е. связывается с ними, иммунной системы, которая установила иммунный ответ на конкретное иммуногенное вещество, определяемый с помощью любого способа, известного в данной области техники. Кроме того, эпитоп можно определить как часть иммуногенного вещества, которая вызывает образование антител или индуцирует Т-клеточную реакцию у животного, определяемые с помощью любого способа, имеющегося в данной области техники (см., например, Geysen et al., 1984). Эпитоп может быть частью любого иммуногенного вещества, такого как белок, полинуклеотид, полисахарид, органический или неорганический химический продукт, или любая их комбинация. Термин «эпитоп» может также использоваться взаимозаменяемо с термином «антигенная детерминанта» или «антигенный детерминирующий сайт».

Используемый в настоящем описании термин «экспрессия» относится к биологической продукции продукта, кодируемого кодирующей последовательностью. В большинстве случаев полинуклеотидная (т.е. ДНК) последовательность, включающая кодирующую последовательность, транскрибируется с образованием информационной РНК (мРНК). Информационная РНК затем подвергается трансляции с образованием полипептидного продукта, обладающего релевантной биологической активностью. Процесс экспрессии может, кроме того, включать стадии процессинга РНК-продукта транскрипции, такие как сплайсинг для удаления интронов, и/или посттрасляционный процессинг полипептидного продукта.

Используемый в настоящем описании термин «встречающийся в природе», применительно к объекту, относится к тому факту, что объект можно обнаружить в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (в том числе вирусах), который можно выделить из источника в природе, и которая не была намеренно модифицирована рукой человека в лаборатории, является встречающейся в природе. Как используются в настоящем описании, лабораторные линии грызунов, которые, возможно, были селективным образом выведены в соответствии с классической генетикой, считаются встречающимися в природе животными.

Как используется в настоящем описании, термин «гетерологичная» определяют по отношению к заранее определенной, упоминаемой последовательности гена. Например, относительно последовательности структурного гена гетерологичный промотор определяют как промотор, который не встречается в природе как промотор, примыкающий к упоминаемому структурному гену, но который размещен с помощью лабораторной манипуляции. Подобным образом, гетерологичный ген или сегмент нуклеиновый кислоты определяют как ген или сегмент, который не встречается в природе как ген или сегмент, примыкающий к упоминаемому промотору и/или энхансерным элементам.

Используемый в настоящем описании термин «гомология» относится к степени комплементарности между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями. Слово «идентичность» может заменять слово «гомология», когда первая последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность имеет точно такую же первичную последовательность, как и вторая последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность. Гомологию последовательностей и идентичность последовательностей можно определить путем анализа двух или более последовательностей, используя алгоритмы и компьютерные программы, известные в данной области техники. Такие способы можно использовать для определения того, является ли конкретная последовательность идентичной или гомологичной другой отобранной последовательности.

Как используется в настоящем описании, термин «гомологичная», при упоминании полинуклеотидов или полипептидов, означает последовательности, которые имеют одинаковую основную структуру, несмотря на возникновение из различных источников. Например, белок М2 вирусов гриппа является высококонсервативным для множества серотипов вируса гриппа А, несмотря на вирусную изменчивость и дрейф, а значит, считается гомологичным белком в этой группе. Кроме того, белки М1 и М2 вируса гриппа имеют различные функции, но имеют гомологичные фрагменты или части, имеющие одинаковую структуру, эти части М1 и М2 являются гомологичными. Как правило, гомологичные белки происходят из близкородственных генетических последовательностей или генов. Напротив, «аналогичным» полипептидом является полипептид, который имеет такую же функцию, что и полипептид из отличного вида или организма, но имеет значительно отличную форму для выполнения этой функции. Аналогичные белки, как правило, происходят их генов, которые не являются близкородственными.

Термин «клетка-хозяин» означает клетку, которая содержит один или несколько гетерологичных полипептидов и/или полинуклеотидов. Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки, такие как E. coli, или эукариотические клетки, такие как дрожжи, клетки насекомых, земноводных, птиц или млекопитающих, включающие, например, но без ограничения, клетки человека. Приводимые в качестве примеров клетки-хозяева включают, например, но без ограничения, клетки почки Африканской зеленой мартышки (например, клетки Vero), клетки почки детеныша хомячка (BHK), клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки первичной куриной почки (PCK), клетки Мадин-Дарби почки собаки (MDCK), клетки Мадин-Дарби почки быка (MDBK), клетки 293, клетки COS и т.п. Культивирование и размножение таких клеток находится в компетентности среднего специалиста в данной области техники, особенно основываясь на представленном в настоящем описании руководстве в отношении настоящего изобретения.

Термины «идентичные» или «идентичность» в процентах, в контексте двух или более пептидных последовательностей, относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют точно определенный процент аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, после сравнения и совмещения для максимального соответствия во всем окне сравнения, что определяют, используя алгоритм для сравнения последовательностей или совмещение вручную и визуальный просмотр.

Используемые в настоящем описании термины «иммунизировать» или «иммунизация» или схожие термины относятся к приданию способности устанавливать значительный иммунный ответ против мишеневого антигена или эпитопа, когда он представлен на микробе или в виде выделенного эпитопа или антигена. Этими терминами не требуется в обязательном порядке абсолютный иммунитет, а скорее вызываемый иммунный ответ, который в значительной степени выше базовой линии, например, когда иммуногенные композиции по настоящему изобретению не вводят, или когда вводят обычную (противогриппозную) вакцину. Например, считают, что млекопитающее иммунизировано против мишеневого антигена, если клеточный и/или гуморальный иммунный ответ, предпочтительно значительный ответ, на мишеневый антиген возникает после применения композиций по настоящему изобретению или в соответствии со способами по настоящему изобретению.

Используемый в настоящем описании термин «иммунологическая реакция» на композицию или вакцину обозначает развитие клеточного и/или антителоопосредованного иммунного ответа в животном-хозяине. Как правило, иммунологическая реакция включает (но не ограничивается этим) один или несколько следующих эффектов; (а) образование антител; (b) образование В-клеток; (с) образование Т-клеток-хелперов, и/или (d) образование цитотоксических Т-клеток, срецифически направленных на конкретный антиген или гаптен.

Используемый в настоящем описании термин «функционально связанные» относится к установлению функциональной зависимости двух или более полинуклеотидов или двух или более последовательностей нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если установлена ее функциональная зависимость от другой последовательности нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию кодирующей последовательности. «Функционально связанные» означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот являются, как правило, непрерывными или по существу непрерывными и, если необходимо соединить две кодирующие белки области, непрерывными и в рамке считывания. Поскольку энхансеры обычно функционируют, когда отделены от промотора несколькими тысячами оснований, а интронные последовательности могут иметь переменную длину, некоторые полинуклеотидные элементы, однако, могут быть функционально связанными, но не являются непрерывными.

«Транскрипционная единица» относится к полинуклеотидной последовательности, которая включает по крайней мере первый структурный ген, функционально связанный с по крайней мере первой действующей в цис-положении промоторной последовательностью и необязательно связанный функционально с одной или несколькими другими действующими в цис-положении последовательностями нуклеиновых кислот, необходимыми для эффективной транскрипции последовательностей структурных генов, и по крайней мере первый дистальный регуляторный элемент, который может быть необходим для соответствующей тканеспецифической и связанной с развитием транскрипции последовательности структурного гена с функциональным нахождением под контролем промотора и/или энхансерных элементов, а также любые дополнительные цис-последовательности, которые необходимы для эффективной транскрипции и трансляции (например, сайт(ы) полиаденилирования, контролирующая стабильность мРНК последовательность(и) и т.п.).

Используемый в настоящем описании термин «иммуногенная» также относится к аминокислотной последовательности или части аминокислотной последовательности внутри белка, полипептида или пептида, которая вызывает иммунологическую реакцию у животного-хозяина.

Используемый в настоящем описании термин «иммуногенный белок», «иммуногенный пептид» или «иммуногенный полипептид» относится к белкам, пептидам и полипептидам, которые являются иммунологически активными в том смысле, что после введения хозяину белка он способен индуцировать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против этого белка. Предпочтительно, когда фрагмент белка является таким фрагментом, который обладает иммунологической активностью, по существу одинаковой с иммунологической активностью целого белка. Таким образом, фрагмент белка в соответствии с настоящим изобретением содержит по крайней мере один эпитоп или антигенную детерминанту, или по существу состоит или состоит из такого эпитопа или антигенного эпитопа. Термин «эпитоп» относится к белковому сайту, способному к индукции иммунной реакции гуморального типа (образованию В-клеток) и/или клеточного (Т-клеточного) типа.

Выражения «выделенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу, или в значительной степени, не содержит компоненты, которые обычно сопровождают материал, когда он находится в своем природном состоянии. Таким образом, выделенные пептиды в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно не содержат материалы, обычно связанные с пептидами в их in situ окружении.

«Связывание» или «соединение» относится к любому известному в данной области техники способу функционального соединения пептидов, включающему, но без ограничения, рекомбинантное слияние, ковалентное связывание, дисульфидное связывание, ионное связывание, водородное связывание, электростатическое связывание и т.п.

Термин «патоген» определяется в настоящем описании как любого сорта инфекционный агент, включающий, например, вирусы, прионы, простейшие, паразиты, а также микробы, такие как бактерии, дрожжи, плесневые грибы, грибы и т.п.

В настоящем описании устанавливается, что «различные», при упоминании микробов или микробных частиц, включает как различные виды микробов, так и различные индивидуальные примеры или экземпляры одного и того же вида. В целях приведения примеров будут обсуждаться комбинации различных вирусов. Приводимые в качестве примеров микробы включают вирусы, такие как вирус гриппа, другие ортомиксовирусы, риновирус и поксвирусы кур, например, или любой другой вызывающий инфекционное заболевание вирус.

Как используется в настоящем описании, термин «моноклональное», при использовании по отношению к антителу, относится к антителу, которое основано на одном клоне, получено или происходит из одного клона, включающего любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон. Термин «моноклональное антитело» часто сокращают до «мАт» в единственном или множественном числе.

Как используются в настоящем описании, термины «М2», «белок М2», «пептид М2», «последовательность М2» и «домен М2» используются взаимозаменяемо, когда имеется в виду вся последовательность белка М2 или ее часть (например, подпоследовательность, такая как внеклеточный домен), выделенная из, основанная на или присутствующая в любом встречающемся в природе или искусственно полученном штамме или изоляте вируса гриба. Следовательно, термин «М2» и т.п. включает встречающиеся в природе варианты последовательности М2, образованные с помощью мутации во время цикла жизни вируса или образованные в ответ на селективное давление (например, лекарственную терапию, рост тропизма или инфективности в отношении клеток-хозяев, т.п.), а также рекомбинантно или синтетически полученные последовательности М2. Соответствующие определения применимы для «М1», «белка М1», «последовательности М1» и «домена М1». Соответствующие определения также применимы для субъединиц белков НА и NA.

Используемый в настоящем описании термин «мотив» относится к схеме группы остатков в пептиде определенной длины, обычно пептиде из приблизительно 8 до приблизительно 13 аминокислот для мотива HLA класса I и приблизительно 6 до приблизительно 25 аминокислот для мотива HLA класса II, которая распознается конкретной молекулой HLA. Пептидные мотивы являются обычно различными для каждого белка, кодируемого каждой аллелью HLA человека, и отличаются характером первичных и вторичных ведущих остатков.

Используемый в настоящем описании термин «пациент» (также взаимозаменяемо именуемый «хозяином» или «индивидом») относится к любому хозяину, который может получить одну или несколько описанных в настоящем описании фармацевтических композиций. Предпочтительно, индивидом является позвоночное животное, которое, как предполагается, означает любой вид животного (и предпочтительно вид млекопитающего, такой как человек). В некоторых вариантах осуществления «пациент» относится к любому хозяину-млекопитающему, включающему, но без ограничения, человека и не являющихся людьми приматов, жвачных животных, представителей псовых, козлиных, свинковых, вороньих, покрытых иглами животных, лошадиных, кошачьих, козлиных, кроличьих, заячьих, волчих, крысиных, овечьих представителей, представителей свиней, лис и т.п., в том числе домашний скот, представителей зоопарков, экзотических животных, а также домашних животных, любимых домашних животных и любого животного, находящегося под попечением практикующего ветеринарного врача. Пациент может быть пациентом любого возраста, в котором пациент способен отвечать на иммунизацию вакциной по настоящему изобретению путем образования иммунного ответа. В конкретных вариантах осуществления пациентом-млекопитающим является предпочтительно человек.

Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным частицам и композициям, которые не вызывают аллергическую или схожую нежелательную реакцию после введения млекопитающему и, в частности, после введения человеку. Как используется в настоящем описании, «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не дает какие-либо нежелательные токсические эффекты. Примеры таких солей включают, но без ограничения, кислотно-аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, например соляной кислотой, бромисто-водородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п., и соли, образованные органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памовая (эмбоновая) кислота, альгиновая кислота, нафтойная кислота, полиглютаминовая кислота, нафталинсульфокислота, нафталиндисульфокислота, полигалактуроновая кислота, соли, образованные поливалентными катионами металлов, такими как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., и соли, образованные органическим катионом, образуемым из N,N'-дибензилэтилендиамина или этилендиамина, и любые их комбинации.

Используемый в настоящем описании термин «плазмида» относится к конструкции, которая составлена из генетического материала (т.е. нуклеиновых кислот). Как правило, плазмида содержит начало репликации, которое функционирует в бактериальных клетках-хозяевах, например, Escherichia coli, и селектируемые маркеры для выявления бактериальных клеток-хозяев, включающих плазмиду. Плазмиды по настоящему изобретению могут включать описанные в настоящем описании генетические элементы с таким расположением, что встроенная кодирующая последовательность может транскрибироваться и транслироваться в эукариотических клетках. Кроме того, плазмида может включать последовательность из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако такие вирусные последовательности являются обычно недостаточными для управления включением плазмиды в вирусную частицу или допуска такого включения, и поэтому плазмида является невирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, плазмида является молекулой замкнутой кольцевой ДНК.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «полипептид» охватывает единственный «полипептид», а также множественные «полипептиды» и включает любую цепь или цепи из двух или более аминокислот. Таким образом, все используемые в настоящем описании термины, включающие, но без ограничения, «пептид», «дипептид», «трипептид», «белок», «фермент», «аминокислотную цепь» и «непрерывную аминокислотную последовательность», включены в определение «полипептида», и термин «полипептид» может использоваться вместо, или взаимозаменяемо с, любого их этих терминов. Термин, кроме того, включает полипептиды, которые подверглись одной или нескольким посттрансляционным модификациям, включающим, например, но без ограничения, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию, протеолитическое расщепление, посттрансляционный процессинг, или модификации включением одной или нескольких не встречающихся в природе аминокислот. По всему описанию настоящего изобретения использовались обычные однобуквенные и трехбуквенные сокращения аминокислот, следуя общепринятой номенклатуре в данной области техники: алалин (A, Ala), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), аспарагиновая кислота (D, Asp), цистеин (C, Cys), глютамин (Q, Gln), глютаминовая кислота (E, Glu), глицин (G, Gly), гистидин (H, His), изолейцин (I, Ile), лейцин (L, Leu), метионин (M, Met), фенилаланин (F, Phe), пролин (P, Pro), серин (S, Ser), треонин (T, Thr), триптофан (W, Trp), тирозин (Y, Tyr), валин (V, Val) и лизин (K, Lys). Предпочтительно, когда описанные в настоящем описании аминокислотные остатки находятся в изомерной форме «L». Однако остатки в изомерной форме «D» могут использоваться вместо любого L-аминокислотного остатка при условии сохранения желаемых свойств полипептида. Все аминокислотные последовательности, представленные в настоящем описании, находятся в обычной ориентации слева направо от амино-конца к карбоксильному концу.

«Белок» используется в настоящем описании взаимозаменяемо с «пептидом» и «полипептидом» и включает как пептиды, так и полипептиды, продуцированные синтетически, рекомбинантно или in vitro, и пептиды и полипептиды, экспрессированные in vivo после введения последовательностей нуклеиновых кислот индивиду-хозяину, являющемуся животным или человеком. Предполагается, что термин «полипептид» предпочтительно относится ко всем длинам аминокислотных цепей, включающим короткие пептиды длиной от приблизительно 2 до приблизительно 20 аминокислотных остатков, олигопептиды длиной от приблизительно 10 до приблизительно 100 аминокислотных остатков и полипептиды длиной приблизительно 100 аминокислотных остатков или больше. Кроме того, предполагается, что термин включает ферменты, т.е. функциональные биомолекулы, содержащие по крайней мере один аминокислотный полимер. Полипептиды и белки по настоящему изобретению также включают полипептиды и белки, которые являются посттрансляционно модифицированными или были подвергнуты пострансляционной модификации(ям) и включают сахар или любую производную(е) или конъюгат(ы), добавленные к остовной аминокислотной цепи.

Как используется в настоящем описании, «защитная иммунная реакции» или «терапевтическая иммунная реакция» относится к реакции CTL и/или HTL на антиген, которая в какой-то мере предотвращает или по крайней мере частично задержит развитие заболевания или его симптомов, побочных эффектов или его прогрессирование. Иммунный ответ может также включать образование антител, которому способствовала стимуляция Т-клеток-хелперов.

Используемый в настоящем описании термин «повтор» или «повторный» означает изложенный или представленный снова. В соответствии с настоящим изобретением одна или несколько пептидных последовательностей повторяются в мишеневом антигене по крайней мере еще один раз, т.е. представлены дважды, предпочтительно по крайней мере три раза и более предпочтительно по крайней мере четыре раза. Они также упоминаются в настоящем описании как повторенные дважды (т.е. представленные дважды), повторенные три раза (т.е. представленные три раза) и т.п. В некоторых вариантах число повторов ограничивается максимальным физическим размером мишеневого антигена, который является полезным для применения индивиду или сдерживает функционирование иммунной системы индивида. Другими словами, максимальное число повторных сегментов, т.е. максимальное число повторов индивидуальных пептидных последовательностей или число различных пептидных последовательностей, или тех и других, огранивается пределом, в котором доставка антигена отрицательно отражается, или профилактический и/или терапевтический эффект антигена отрицательно отражается.

Термин «последовательность», при упоминании аминокислот, относится ко всей или части линейной последовательности аминокислот от N-конца к С-концу в пределах конкретной аминокислотной цепи, например, полипептида или белка; «подпоследовательность» означает любой участок из идущих подряд аминокислот внутри последовательности, например, по крайней мере 3 идущих подряд аминокислот внутри конкретной белковой или полипептидной последовательности. В отношении нуклеотидных цепей «последовательность» и «подпоследовательность» имеют схожие значения, относящиеся к последовательности нуклеотидов от 5' к 3'.

Используемым в настоящем описании термином «в значительной степени гомологичные» охватываются последовательности, которые схожи с установленными последовательностями из условия, чтобы антитела, индуцированные против пептидов, имеющих установленные последовательности, взаимодействовали с пептидами, имеющими в значительной степени гомологичные последовательности. В некоторых вариантах количество обнаруживаемых антител, индуцированных гомологичной последовательностью, равно количеству обнаруживаемых антител, индуцированных установленной последовательностью. В других вариантах количества обнаруживаемых индуцированных антител являются в значительной степени схожими, предусматривая, тем самым, иммуногенные свойства. Например, термин «в значительной степени гомологичные» может относиться к идентичности на по крайней мере приблизительно 75%, предпочтительно на по крайней мере приблизительно 80% или более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 85% или по крайней мере приблизительно 90%, и даже более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 95%, более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 97%, более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 98%, более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 99% и даже все еще более предпочтительно на по крайней мере по существу 100% или полностью на 100% (т.е. инвариантности).

Используемый в настоящем описании термин «вакцина» относится к композиции, которая содержит композицию по настоящему изобретению и которая находится в форме, которую можно вводить любому позвоночному, предпочтительно животному, предпочтительно млекопитающему и более предпочтительно человеку. Как правило, вакцина включает порошок, или ее готовят из порошка, в общепринятом солевом или забуференном водном растворителе, в котором суспендируют или растворяют композицию по настоящему изобретению. В этой форме композиция по настоящему изобретению может обычно использоваться для предупреждения, контролирования или в других отношениях лечения заболевания или его симптомов. После введения хозяину вакцина способна вызывать иммунный ответ, предпочтительно обнаруживаемый иммунный ответ, включающий, но без ограничения, образование антител, цитокинов и/или активацию цитотоксических Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток, Т-клеток-хелперов, дендритных клеток и/или другие клеточные реакции. Вакцина по настоящему изобретению включает пептидные последовательности вируса гриппа, предпочтительно консервативные пептидные последовательности вируса гриппа и более предпочтительно повторные консервативные пептидные последовательности вируса гриппа. Вакцины по настоящему изобретению могут включать адъювант или любой другой носитель, отмеченный в настоящем описании, или могут вводиться в такой адъювант или носитель или вводиться вместе с таким адъювантом или носителем.

Вакцины и иммуногенные композиции по настоящему изобретению обеспечивают иммунный ответ у пациента после иммунизации. Используемый в настоящем описании термин «иммунный ответ» относится к гуморальному иммунному ответу и/или клеточной иммунной реакции, приводящим к активации или пролиферации В- и/или Т-лимфоцитов. В некоторых случаях, однако, иммунные ответы могут быть небольшой интенсивности и стать обнаруживаемыми только при использовании по крайней мере одного вещества в соответствии с настоящим изобретением. Термин «адъювант» относится к агенту, используемому для стимуляции иммунной системы живого организма, так что одна или несколько функций иммунной системы усиливаются и направляются на иммуногенный агент.

Используемые в настоящем описании термины «лечение», «лечить» или «подвергнутый лечению» относятся к лечению или уменьшению интенсивности одного или нескольких симптомов заболевания, или снижению степени или тяжести заболевания, или его симптома, или до или после того, как его развитие поражает пациента. При использовании по отношению к инфекционному заболеванию, например, термины относятся к лечению или схеме лечения, которые уменьшают тяжесть инфекции, или уменьшают, или убавляют, или отсрочивают один или несколько симптомов болезни, свойственных инфекции, а также к увеличению способности инфицированного индивидуума к борьбе с инфекцией, в том числе, например, к уменьшению и/или устранению инфекции из организма индивидуума, или к уменьшению или предотвращению ухудшения заболевания.

Используемый в настоящем описании термин «млекопитающее» относится к классу теплокровных позвоночных животных, имеющих, у самки, секретирующие молоко органы для кормления молодняка. Млекопитающие включают, но без ограничения, людей, обезьян, многих четвероногих животных, китов, дельфинов и летучих мышей. Для целей настоящего изобретения предпочтительным млекопитающим является человек.

Термин «иммуногенно эффективное количество» имеет свое обычное значение в данной области техники, т.е. количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунный ответ, который вступает в значительную борьбу с патогенными агентами, разделяющими иммунологические признаки с иммуногеном. Этот термин также включает или терапевтически, или профилактически эффективные количества, или как те, так и другие.

Используемые в настоящем описании термины «предупреждение» или «вакцинация» относятся к профилактике или к частичному или полному подавлению инфекции, или к уменьшению или отсрочке начала одного или нескольких заболеваний, или одного или нескольких его симптомов, у индивида, который может быть предрасположен к нему, но который еще не подвергнут ему, или у которого еще не диагностировано его наличие. При использовании по отношению к инфекционному заболеванию, например, термины относятся к профилактическому введению одного или нескольких иммуногенных пептидов по настоящему изобретению, тенденцией которого является увеличение устойчивости индивида к инфицированию патогеном, или, другими словами, которое уменьшает вероятность того, что индивид будет инфицирован патогеном, или, в случае инфицирования, будет отсрочивать симптомы, уменьшать тяжесть инфицирования или уменьшать симптомы болезни, свойственные инфекции, или вызывать любую комбинацию этих эффектов.

Каждый из терминов «предупреждение» или «лечение» включает контролирование конкретной инфекции, заболевания, состояния или его симптома у пациента, а также любое полезное изменение возможного состояния или течения заболевания или состояния, или любых его симптомов. Контролирование может быть направлено на некоторые или все его симптомы с фактическим воздействием на лежащую в основе инфекцию или любое заболевание или состояние, являющееся ее результатом, или без такого воздействия.

Термин «рекомбинантный» означает, что материал (например, полинуклеотид или полипептид) был искусственно или синтетически (неприродно) изменен под воздействием человека. Изменение можно выполнить на материале в его природном окружении или в природном состоянии или на материале, удаленном из такого окружения. В частности, вирус гриппа, например, является рекомбинантным, когда его получают с помощью экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Например, «рекомбинантной нуклеиновой кислотой» является нуклеиновая кислота, созданная с помощью рекомбинирования нуклеиновых кислот, например, во время клонирования, ДНК-перестановки или других способов, или с помощью химического или другого мутагенеза; «рекомбинантным полипептидом» или «рекомбинантным белком» является полипептид или белок, который получают при экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты; а «рекомбинантный вирус», например, «рекомбинантный вирус гриппа», получают при экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

Как используется в настоящем описании, термин «вариант», при использовании в контексте полинуклеотида или полипептида, относится к полинуклеотиду или полипептиду, который отличается от полинуклеотида или полипептида дикого типа наличием мутации(й), замены(замен), вставки(ок), делеции(й) одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот или любой их комбинации. В зависимости от контекста термин «мутант» также используется для обозначения отклонения от последовательности полинуклеотида или полипептида дикого типа. Мутант может появиться естественно (т.е. в результате происходящей в природе мутации в нем), быть созданным неспецифическим, спонтанным или специфическим образом рукой человека в конкретной полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Обычно варианты белка или пептида часто включают замену одной или нескольких природных аминокислот другой аминокислотой(ами) в одном или нескольких положениях в пределах белка или пептида.

Термин «например» используется только ради примера, без умышленного ограничения, и не должен толковаться как ссылка только на те элементы, которые явно перечислены в описании изобретения.

В соответствии с долголетним договором по патентному закону слова «a» и «an», при использовании в этой заявке, в том числе формуле изобретения, обозначают «один или несколько».

Должно быть также понятно, как правило, в отношении любого компонента в настоящем описании, например, антигена, пептида, полисахарида и т.п., что эти термины включают его часть, которая может быть меньше целого или равна ему, а также включают комбинации одинаковых или различных типов.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры включены для демонстрации иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения. Средним специалистам в данной области техники должно быть понятно, что способы, описанные в следующих примерах, представляют способы, которые, как обнаружено, функционируют хорошо при осуществлении на практике настоящего изобретения, и поэтому можно считать, что они являются предпочтительными вариантами для осуществления его на практике. Однако средние специалисты в данной области техники должны, с учетом описания настоящего изобретения, понимать, что в конкретные описанные в настоящем описании варианты осуществления можно внести множество изменений и все еще получить подобный или схожий результат без отступа от сущности и объема настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1 - ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИМИРОВАНИЯ

Эта модель для исследования вакцин была предназначена для идентификации способов индукции иммунитета и примирования для создания иммунитета против вируса гриппа перед гетерологичным или гомологичным бустингом и для оценки способности различных антигенов к такой индукции и примированию. Хлопковым хомякам вводили цельный живой или инактивированный вирион (H3N2 или H1N1) интраназально в виде инфицирования дыхательных путей. Живой вирус H3N2 вводили внутримышечно, а инактивированный H3N2 вводили внутримышечно или интраназально. Живой вирус H1N1 вводили исключительно интраназально для предоставления возможности сравнения образования антител. В выбранных случаях совместно вводили полный адъювант Фрейнда (CFA). Проведенный в «планшете с H3N2» иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA) для определения IgG против живого вируса H3N2 показан на фиг. 3. Проведенный в «планшете с H1N1» ELISA для определения IgG против живого вируса H1N1 показан на фиг. 4.

Внутримышечная иммунизация живым вирусом может быть все равно, что интраназальная иммунизация живым вирусом или другие новые способы примирования, описанные в настоящем описании, и может применяться для иммунизации.

Как продемонстрировано на фиг. 3 и фиг. 4, результаты означали, что живой вирус давал достаточное образование IgG на 28 день после заражения как живым вирусом H3N2, так и живым вирусом H1N1. Живая противовирусная вакцина также вызывала увеличенное образование антител с перекрестной реактивностью. Т.е. инактивированная вакцина индуцировала образование достаточно гомологичных IgG, но Ат обладали меньшей перекрестной реактивностью.

ПРИМЕР 2 - ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА H3N2 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕПТИДОВ PF2001 И M2e

Синтетический пептид из 39 аминокислот (обозначенный в настоящем описании «PF2001» и также альтернативно именуемый в настоящем описании «пептидом 5906» или «SEQ ID NO:44») получали и вводили тестируемым индивидам, как описано. Эту вакцину создавали, используя две перекрывающиеся пептидные последовательности из М2е и последовательности Т-клеточного эпитопа из токсина C. tetani. Конечный продукт представлял собой синтетический слитый полипептид, содержащий два отличных эпитопа М2, т.е. пептидные последовательности, распознаваемые мАт в виде IgG, и одну последовательность Т-клеточного эпитопа. PF2001 синтезировали, используя стандартный SPPS, который был масштабирован для увеличения объема выпуска. Первичной аминокислотной последовательностью этого иммуногенного пептида из 39 аминокислот является SLLTEVETPIRNEWGLLTEVETPIRYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:44). Тестируемые в этом исследовании соединения также включали последовательность полного пептида М2е, обе последовательности вводили в концентрации мишени, составляющей 0,2 мг/мл.

Общий in vivo протокол для анализа бустинга для PF2001 продемонстрирован ниже.

День Порядок действий 0 1. 28 молодых взрослых хлопковых хомяков с жестким мехом (Sigmodon hispidus, возрастом 6-8 недель) делили на 7 групп, по 4 животных в каждой группе. Все животные были с ушной биркой, и у всех животных брали кровь до иммунизации Группа животных Иммунизация/бустинг (путь введения) 1 100 мкг PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (×2 внутримышечно) 2 100 мкг PF2001 в PBS (×2 внутримышечно) 3 Живой (Wuhan) H3N2 (интраназально)/100 мкг PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) 4 УФ-инактивированный H3N2 (внутримышечно)/100 мкг PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) 5 100 мкг М2е с добавлением CFA в качестве адъюванта (×2 внутримышечно) 6 УФ-инактивированный H3N2 (×2 внутримышечно) 7 Живой (Wuhan) H3N2 (×2 интраназально)

  Иммунизировать всех животных указанными препаратами, как указано выше. 14 2. У всех животных брали кровь проколом венозного сплетения орбиты глаза. 21 3. У всех животных брали кровь проколом венозного сплетения орбиты глаза. 28 4. Всех животных подвергали бустер-иммунизации указанными препаратами, и брали кровь проколом венозного сплетения орбиты глаза. 35 5. У всех животных брали кровь проколом венозного сплетения орбиты глаза. 42 6. У всех животных брали кровь до конца и умерщвляли.

Тестируемые животные, молодые взрослые хлопковые хомяки, были поделены на 7 групп, по четыре индивида в каждой группе, для введения доз, отмеченных выше. Все животные были с ушной биркой, и у всех животных брали кровь до иммунизации с требуемыми временными интервалами, например, один раз в неделю. Всех животных иммунизировали указанными тестируемыми соединениями в день 0 (фиг. 10А и фиг. 10В). Вторую иммунизацию (или инфекционное заражение) выполняли в день 28 после начального примирования, как отмечено (фиг. 5). Хомяков группы 1 примировали 100 мкг PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) в день 0 и бустер-иммунизировали 100 мкг PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) в день 28. Хомяков группы 2 примировали 100 мкг PF2001 в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS) (внутримышечно) в день 0 и бустер-иммунизировали 100 мкг PF2001 в PBS (внутримышечно) в день 28. Хомяков группы 3 иммунизировали живым вирусом гриппа H3N2 (Wuhan) (интраназально) в день 0 и бустер-иммунизировали PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) в день 28. Хомяков группы 4 иммунизировали инактивированным ультрафиолетовым излучением вирусом гриппа H3N2 (Wuhan) (внутримышечно) и бустер-иммунизировали 100 мкг PF2001 с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) в день 28. Хомяков группы 5 примировали 100 мкг М2е с добавлением CFA в качестве адъюванта (внутримышечно) в день 0 и бустер-иммунизировали 100 мкг М2е в адъюванте CFA (внутримышечно) в день 28. Хомяков группы 6 иммунизировали инактивированным ультрафиолетовым излучением вирусом гриппа H3N2 (Wuhan) (внутримышечно) в день 0 и заражали тем же вирусом (внутримышечно) в день 28. Хомяков группы 7 иммунизировали живым вирусом гриппа H3N2 (Wuhan) (интраназально) в день 0 и заражали тем же вирусом (интраназально) в день 28.

Из каждой группы животных получали сыворотки для анализа образования антител в дни 14, 21, 28, 35 и 42. Титры IgG против живого вируса H3N2 определяли, используя ELISA, и результаты в день 0, день 28 и день 42 продемонстрированы на фиг. 5, фиг. 10А и фиг. 10В: уровни IgG были выявлены во всех группах иммунизации пептидами (1 и 2). Вводимый дважды PF2001 в PBS или PF2001, конъюгированный с CFA, создавал титр, схожий с титром в группе 6 (иммунизированной инактивированным H3N2, вводимым внутримышечно). В день 42 перекрестная реактивность была выявлена в группах иммунизации пептидами, при этом группа 4 (с примированием инактивированным H3N2 (внутримышечно), когда бустер-иммунизацию осуществляли, используя 100 мкг PF2001 в CFA) имела титр, равный титру в группе 6 к 42 дню.

Как показано на фиг. 5 и фиг. 11В, две дозы вакцины на основе небольшого синтетического пептида вируса гриппа (PF2001) вызывали увеличение титра нейтрализующих антител в виде IgG, которые распознавали природные эпитопы М2 на живом вирусе H3N2 (планшет с H3N2) после каждой иммунизации. Таким образом, эта вакцина на основе небольшого синтетически полученного пептида индуцировала антитела, которые были способны распознавать и связываться с природными эпитопами антигена М2 живых вирусов гриппа. Кроме того, этот небольшой синтетический пептид был иммуногенным и поднимал титр антител у примированных и непримированных животных даже в отсутствие адъюванта. Две дозы антигена PF2001 превосходили две инъекции М2е в отношении индукции IgG, которые могли связываться с живым вирусом H3N2. Эти данные говорят о том, что перекрывающиеся эпитопы создают повторение определенных эпитопов и могут усилить индукцию антител в ответ на повторы эпитопов. Были также индуцированы подъемы титра антител в виде IgG против живого вируса H1N1, дополнительно демонстрируя, что индуцированные вакциной на основе небольшого синтетического М2е антитела, которые связываются с эпитопами М2 на живом вирусе гриппа, противодействуют подтипам с различными белками НА и NA.

Кроме того, как продемонстрировано на фиг. 5, PF2001 был также способен повысить иммунитет у животных, которые ранее имели гриппозную инфекцию дыхательных путей или ранее были подвергнуты внутримышечной иммунизации инактивированным цельным вирионом. Тогда как два инфицирования дыхательных путей живым H3N2, т.е. заражения, вызывали наибольший подъем титра антител в виде IgG против вируса гриппа, было неожиданным, что бустинг вакциной на основе пептида после инфицирования вирусом гриппа был схож с двумя подверганиями дыхательных путей воздействию живого H3N2.

Вакцина на основе пептида PF2001 повышала титр ингибирующих вирус H3N2 антител у животных, ранее инфицированных H3N2. Кроме того, титры ингибирующих антител были также повышены у животных, которые были ранее иммунизированы вакциной на основе инактивированного H3N2.

Эти исследования продемонстрировали, что вакцина на основе синтетического пептида, имеющего уникальную последовательность, не обнаруживаемую в природе, может индуцировать иммунитет к вирусу гриппа для совокупности штаммов или серотипов, которые имеют неидентичные первичные аминокислотные последовательности НА и NA. Кроме того, эти индуцированные антитела ингибировали репликацию вируса гриппа in vitro и распознавали эпитопы на живом вирусе гриппа, который они инактивировали. Важно, что в приведенных в качестве примеров исследованиях вакцина на основе пептида PF2001 была введена эффектно, и с адъювантом, и без него, и, как установлено, обеспечивала усиленный иммунитет при использовании такого немного количества доз, как одна или две дозы пептидной вакцины. Кроме того, эти исследования продемонстрировали, что неприродные синтетические пептиды можно с успехом использовать в качестве бустера для ранее примированных индивидуумов, т.е. индивидуумов, у которых было заболевание гриппом, или которым вводили или вакцину на основе инактивированного вируса гриппа внутримышечно, или вакцину на основе живого вируса гриппа интраназально, и что иммуногенная композиция PF2001 может повысить титры ингибирующих вирус гриппа антител in vivo.

Как продемонстрировано на фиг. 11В, нейтрализующие антитела против вируса гриппа H3N2 (Wuhan) образовывались в день 28 и день 42 после бустинга. При проверенных титрах (разведении 1:100) нейтрализующие антитела против H1N1 не были выявлены (не продемонстрированные данные). В день 28 нейтрализующие антитела были выявлены в группах 3, 4, 6 и 7 (фиг. 11В), причем интраназальные заражения живым вирусом гриппа создавали наибольшие титры, по сравнению с инактивированным вирусом гриппа, доставляемым внутримышечно. В образцах сывороток, полученных в день 42, были выявлены повышенные уровни нейтрализующих антител в группах 3, 4, 6 и 7, при этом наибольшее образование антител наблюдалось в группе 7 (примированной в день 0 и подвергнутой бустер-иммунизации в день 28 живым вирусом H3N2). Следовательно, иммунизация и примирование живыми иммуногенами могут быть лучше иммунизации и примирования вакцинами на основе пептидов или других иммуногенов.

Сывороточные антитела в виде IgG, индуцированные у хлопковых хомяков с помощью этого консервативного пептида, связывались с природными эпитопами, представленными на живых вирусах гриппа двух различных серотипов. Удивительно, что небольшие линейные фрагменты, которые включают PF2001, также индуцировали Ат, сильно связывающиеся с природными пептидными эпитопами вируса гриппа; более того, был получен гуморальный ответ как на примирование PF2001, так и на бустер-иммунизацию PF2001, независимо от того, вводился ли пептид только в солевом растворе, или c добавлением в качестве адъюванта CFA. Эти исследования продемонстрировали, что PF2001 способен к вызову у млекопитающего иммунного ответа против как H3N2, так и H3N2 при использовании добавления адъюванта к пептиду или без такого добавления.

Живой H3N2, вводимый интразально (интраназальная иммунизация или инфицирование вирусами дыхательных путей), давал в результате более высокие уровни сывороточных IgG в день 28 по сравнению с инактивированным цельным вирионом (иммунизацией вакциной на основе инактивированного вируса), инъецируемым внутримышечно, как определено с помощью ELISA, проведенном в дни 0, 28 и 42. Несмотря на то, что обе схемы примировали для бустинга с использованием вакцины на основе консервативного пептида, интраназальное примирование живым вирусом было лучше внутримышечной иммунизации инактивированным вирусом. Эти результаты демонстрируют, что синтетическая пептидная вакцина по настоящему изобретению может также использоваться для эффективного усиления иммунного ответа на предшествующую обычную вакцину. Иммунный ответ, наблюдаемый при использовании PF2001, был схож с ответом, наблюдаемым при использовании бустер-иммунизации цельным инактивированным вирионом или обычной вакциной на основе инактивированного вируса гриппа.

Внутримышечная иммунизация хлопковых хомяков целой молекулой М2е после добавления в качестве адъюванта CFA не давала какого-либо конкретного преимущества над иммунизацией небольшими, включающими эпитопы пептидными фрагментами в индукции IgG против природных белков живого вируса гриппа. Было неожиданным, что пептидная вакцина, в которой используются небольшие фрагменты целой молекулы М2е, синтезированные в неприродной форме, индуцировала образование антител в виде IgG против природных эпитопов в живом организме, даже без адъюванта, и имела лучший бустерный эффект по сравнению с бустерным эффектом, обеспечиваемым последовательностью природного М2е. Эти данные говорят о том, что консервативные эпитопы с новыми характерами расположения, не наблюдаемыми в природе, могут эффективно или более эффективно создать иммунный ответ у индивида, чем обычные вакцины, в которых используются природные белки и последовательности, и их можно синтезировать с другим микробным пептидом (например, Т-клеточным эпитопом столбнячного анатоксина).

ПРИМЕР 3 - ВКЛЮЧАЮЩИЙ МНОЖЕСТВО ЭПИТОПОВ НА АНТИГЕН

С помощью SPPS был приготовлен мишеневый антиген множества микробов, имеющий следующую аминокислотную последовательность (дефисы, разделяющие отобранные пептидные последовательности, введены для удобства читателя и не являются составными частями пептида): GNLFIAP-GNLFIAP-QYIKANSKFIGITE-GNLFIAP (также именуемый в настоящем описании «пептидом 5907», SEQ ID NO:15). Этот мишеневый антиген из 35 аминокислот включает повторный измененный эпитоп НА (GNLFIAP, также именуемый в настоящем описании «пептидом 5910», SEQ ID NO:5), объединенный со стимулирующим Т-клетки эпитопом столбнячного токсина (QYIKANSKFIGITE, SEQ ID NO:53). Вакцина, приготовленная на основе этого синтетического полипептида, повышала иммунный ответ против как вируса гриппа H1N1, H3N2, так и H5N1 после введения тестируемым индивидам в качестве первичной вакцины или в качестве бустера после примирования живым вирусом (инфицирования), цельно-вирионной вакциной, или вакциной на основе синтетического пептида.

ПРИМЕР 4 - ВКЛЮЧАЮЩИЙ МНОЖЕСТВО ЭПИТОПОВ NA АНТИГЕН

С помощью SPPS был приготовлен мишеневый антиген множества микробов, имеющий следующую последовательность (дефисы, разделяющие отобранные пептидные последовательности, введены для удобства читателя и не являются составными частями пептида): HYEECSCY-DWSGYSGSFVQHPELTGL-HYEECSCY-QYIKANSKFIGITE (также именуемый в настоящем описании «пептидом 5908», SEQ ID NO:16). Этот мишеневый антиген включает первый повторный, происходящий из NA пептидный эпитоп (HYEECSCY, также именуемый в настоящем описании «пептидом 5911», SEQ ID NO:7) вперемежку со вторым происходящим из NA пептидным эпитопом (DWSGYSGSFVQHPELTGL, также именуемым в настоящем описании «пептидом 5912», SEQ ID NO:11), которые связаны со стимулирующим Т-клетки пептидным эпитопом столбнячного токсина (QYIKANSKFIGITE, SEQ ID NO:53). Вакцина, приготовленная на основе этого синтетического полипептида, повышала иммунный ответ против как штаммов вируса гриппа H1N1, H3N2, так и H5N1 после введения тестируемым индивидам в качестве первичной вакцины или в качестве бустера после примирования живым вирусом (инфицирования), цельно-вирионной вакциной, или вакциной на основе синтетического пептида.

ПРИМЕР 5 - ВКЛЮЧАЮЩИЕ МНОЖЕСТВО ЭПИТОПОВ НА, NA И М2 АНТИГЕННЫЕ ПЕПТИДЫ

С помощью SPPS был приготовлен мишеневый антиген множества микробов, имеющий следующую аминокислотную последовательность (дефисы, разделяющие отобранные пептидные последовательности, введены для удобства читателя и не являются составными частями пептида): GNLFIAP-GNLFIAP-HYEECSCY-HYEECSCY-QYIKANSKFIGITE-HYEECSCY-TPIRNE-TPIRNE (SEQ ID NO: 14). Этот мишеневый антиген включает повторные отобранные пептидные последовательности, происходящие из НА, NA и М2, объединенные со стимулирующим Т-клетки эпитопом столбнячного токсина. Вакцина, приготовленная на основе этого синтетического полипептида, повышала иммунный ответ против как вируса гриппа H1N1, H3N2, так и H5N1 после введения тестируемым индивидам в качестве первичной вакцины или в качестве бустера после примирования живым вирусом (инфицирования), цельно-вирионной вакциной, или вакциной на основе синтетического пептида.

ПРИМЕР 6 - ВКЛЮЧАЮЩИЕ МНОЖЕСТВО ЭПИТОПОВ ВИРУСНЫЕ/БАКТЕРИАЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ И КОНЪЮГАТЫ

Помимо профилактики и лечения заболеваний вирусной и другой микробной этиологии (и, в частности, гриппа) отдельно, настоящее изобретение также относится к антигенным композициям, вакцинам и включающим их композициям, которые включают две или более последовательностей эпитопов, каждая из которых происходит из отличного организма.

В настоящем примере демонстрируется, что пептид PF2001 можно было успешно конъюгировать с полисахаридом пневмококка типа 14, и результирующая вакцина индуцировала антитело против как пневмококка, так и против вируса гриппа. Доза в 20 мкг индуцировала сильный гуморальный ответ против пневмококка типа 14 в день 28 и день 42, и обе дозы в 5 и 10 мкг индуцировали образование антител против вируса гриппа, которые связываются с природными антигенами в цельном вирионе H3N2. У некоторых мышей, иммунизированных дозой в 20 мкл, развивались очень высокие титры. Эти данные показали, что вакцину на основе консервативных эпитопов, которая включала как бактериальные, так и вирусные эпитопы, можно подвергнуть конъюгации с получением мультимерной вакцины против множества микробов.

Экспериментальный протокол:

День Порядок действий 0 1. Все животные были с ушной биркой, у всех животных брали кровь до иммунизации, и их подвергали первичной иммунизации.
Группа А, 5 мкг/мышь; Группа В, 20 мкг/мышь.
Иммунизации осуществляли внутримышечно в PBS с использованием 60% Titermax Gold®. 14 2. У всех животных брали кровь проколом венозного сплетения орбиты глаза. 28 3. Всех животных подвергали бустер-иммунизации указанными препаратами, и брали кровь проколом венозного сплетения орбиты глаза.

42 4. У всех животных брали кровь до конца и умерщвляли.   5. Культуру спленоцитов объединяли в соответствии с группой.
6. Культуры обрабатывали антигенным пептидом. 45 7. Собирали супернатанты для последующей оценки IFN-γ и IL-4.

Все образцы сывороток хранили при -80ºС. Все образцы супернатантов хранили при -20ºС. Гибридный антиген готовили следующим образом. PIA выделяли из штамма MN8m S. aureus, как описано в публикации заявки РСТ WO 2004/43407 (которая прямо включена в данное описание в целом путем ссылки на нее), и доводили до требуемого размера 50 кДа с помощью химического расщепления, как описано в публикации заявки РСТ WO 2003/53462 (которая прямо включена в данное описание в целом путем ссылки на нее). PIA 50 кДа и антиген САР конъюгировали с полисахаридом пневмококка типа 14 (альтернативно, можно использовать полирибозофосфат [PRP] типа В H. influenzae), используя способ реагирования аминогрупп с оксигруппами, описанный в публикации заявки на патент США 2005/0169941 (которая прямо включена в данное описание в целом путем ссылки на нее). Мишеневый антиген включал повторные пептидные последовательности эпитопов НА и NA вируса гриппа, связанные с полисахаридом PIA Staphylococcus aureus, полисахаридом пневмококка (или, альтернативно, Haemophilus influenzae), которые объединены со стимулирующим Т-клетки эпитопом столбнячного токсина.

Вакцина, приготовленная на основе этого поливалентного мишеневого антигена-конъюгата, повышала иммунный ответ против трех штаммов вируса гриппа H1N1, H5N1 и H3N2, а также бактериальных видов, S. aureus, H. influenzae и Pneumococcus spp., после введения тестируемым индивидам в качестве первичной вакцины или в качестве бустера после примирования живым вирусом (инфицирования), цельно-вирионной вакциной, или вакциной на основе синтетического пептида.

Образцы сывороток от индивидуальных мышей, проверенные в разведении 1:100, обычно демонстрировали увеличение оптической плотности при сравнении значений сывороток до иммунизации со значениями, полученными с использованием сывороток в день 42 (таблица 1). Однако эти увеличения были, как правило, недостаточно высокими. Семь сывороток продемонстрировали трехкратные или более увеличения, или одна сыворотка, мыши 930 (иммунизированной 5 мкг пептида, конъюгированного с BSA), имела значение оптической плотности, составляющее 1,758 в день 42. Средние значения для каждой группы представлены в таблице 2.

Каждая из мышей продемонстрировала увеличение ответа на Pn14 с дня 0 до дня 42 (фиг. 20). Сравнение ответов до иммунизации и в день 42 представлено в таблице 3.

Как наблюдалось при использовании анализа для пептидов, значения оптических плотностей, как правило, увеличивались относительно значений до иммунизации (таблица 4). Значения оптических плотностей для четырнадцати мышей, включающих шесть из восьми мышей, иммунизированных пептидом 5910 (SEQ ID NO:5) в BSA, увеличивались по крайней мере трехкратно.

Результаты определения многочисленных характеристик ряда иммуногенных пептидов суммированы в следующих таблицах и фигурах, прилагаемых к этому описанию. Как отмечено в отношении ELISA с использованием Wuhan, наиболее сильную индукцию IFN-γ наблюдали при использовании супернатантов из группы, иммунизированной пептидом 5910 (SEQ ID NO:5). Более слабую индукцию получали при использовании других пептидов, особенно пептида 5911 (SEQ ID NO:7). За исключением клеток из группы, иммунизированной пептидом 5907 (SEQ ID NO:15), обнаруживаемый уровень IL-4 не был установлен в каких-либо супернатантах, независимо от разведения, in vivo обработки или in vitro обработки. Индукция IL-4 для группы, иммунизированной пептидом 5907, хотя и детектируемая, была ниже результатов для не подвергнутого обработке контроля.

Обнаруживаемый уровень IL-4 не был установлен в каких-либо супернатантах, независимо от разведения, in vivo обработки или in vitro обработки. IFN-γ был обнаружен только в группе В1 (20 мкг вакцины in vivo и 20 мкг PF2001 in vitro) в разведениях 1:2 и 1:5 и в группе В2 (20 мкг вакцины in vivo и 10 мкг PF2001 in vitro) в разведении 1:2. Как установлено в анализе PF2001, у мыши 8682 не было ответа на Wuhan. Все остальные индивидуальные сыворотки демонстрировали увеличение значений оптических плотностей со дня 0 до дня 42.

Для демонстрации эффективности небольших консервативных областей или эпитопов вируса гриппа в индукции иммунитета против природных антигенов в целом вирусе гриппа, несколько консервативных областей HA и NA конъюгировали с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин или его часть, например, описанная в SEQ ID NO:53 (или альтернативно, без добавления бычьего сывороточного альбумина [BSA] в качестве адъюванта). Один конъюгат включал новую синтетическую последовательность GNLFIAP (SEQ ID NO:5, пептид 5910). Мышей иммунизировали конъюгатами белок-консервативные пептиды вируса гриппа, и антитела против цельного вириона Н3 определяли до 42 дня и в день 42.

Кроме того, IFN-γ клеток селезенки определяли в качестве показателя индуцированного клеточно-опосредованного иммунитета против вируса гриппа. Образование антител против природных белков HA и NA возрастало для всех конструкций консервативных эпитопов в дозах 5 мкг и 20 мкг. Неожиданно, что синтетическая конструкция GNLFIAP (SEQ ID NO:5) после конъюгации с BSA индуцировала на достаточном уровне образование антител, которые связывались с природным вирусом гриппа, при использовании доз в 5 мкг и 20 мкг. Кроме того, наблюдалась индукция IFN-γ, что говорит о том, что по крайней мере некоторые из этих консервативных областей могут индуцировать клеточно-опосредованный иммунитет (CMI), когда на клетки воздействуют природные антигены в вирусе гриппа. Снова, уникальный синтетический пептид GNLFIAP (SEQ ID NO:5) (сравни, что его последовательность отлична от последовательности природного эпитопа вируса гриппа) вызывал индукцию IFN-γ на достаточном уровне. Эти данные указывают на то, что небольшие консервативные эпитопы и области в антигенах, сопровождающихся изменчивостью и дрейфом, могут индуцировать иммунитет против вируса гриппа и могут быть полезны при разработке в высокой степени перекрестно-реагирующих вакцин. Кроме того, эти данные продемонстрировали, что конъюгация этих небольших консервативных пептидов с носителя, такими как белки, обеспечивает способ создания вакцины на основе консервативных областей, обеспечивающей полиспецифический иммунитет против микробов.

Таблица 1
Индивидуальные значения оптических плотностей сывороток для протестированных пептидов Идентификатор мыши Группа Пептид Доза на каждую инъекцию До иммунизации день 14 день 29 день 42 900 1 5907 20 мкг 0,077 0,072 0,080 0,161 901 1 5907 20 мкг 0,082 0,088 0,141 0,230 902 1 5907 20 мкг 0,108 0,090 0,093 0,156 903 1 5907 20 мкг 0,065 0,069 0,073 0,114 904 2 5907 5 мкг 0,080 0,096 0,160 0,165 905 2 5907 5 мкг 0,073 0,061 0,098 0,099 906 2 5907 5 мкг 0,084 0,079 0,099 0,139 907 2 5907 5 мкг 0,075 0,073 0,071 Нет образца 908 3 5910 20 мкг 0,081 0,104 0,296 0,279 909 3 5910 20 мкг 0,083 0,081 0,077 0,164 910 3 5910 20 мкг 0,087 0,078 0,133 0,175 911 3 5910 20 мкг 0,083 0,144 0,302 0,333 912 4 5910 5 мкг 0,100 0,089 0,099 0,123 913 4 5910 5 мкг 0,110 0,090 0,226 0,306 914 4 5910 5 мкг 0,097 0,086 0,085 0,680 915 4 5910 5 мкг 0,308 0,186 0,149 0,162 916 5 5911 20 мкг 0,099 0,102 0,145 0,180 917 5 5911 20 мкг 0,109 0,136 0,240 0,304 918 5 5911 20 мкг 0,151 0,106 0,152 0,218 919 5 5911 20 мкг 0,121 0,123 0,170 0,158 920 6 5911 5 мкг 0,126 0,184 0,201 0,392 921 6 5911 5 мкг 0,187 0,503 0,303 0,497 922 6 1911 5 мкг 0,174 0,216 0,161 0,199 923 6 5911 5 мкг 0,137 0,154 0,188 0,300 924 7 5912 20 мкг 0,100 0,091 0,098 0,155 925 7 5912 20 мкг 0,098 0,082 0,146 0,189 926 7 5912 20 мкг 0,090 0,103 0,099 0,168 927 7 5912 20 мкг 0,123 0,088 0,096 0,111 928 8 5912 5 мкг 0,090 0,287 0,175 0,154 929 8 5912 5 мкг 0,094 0,109 0,137 0,167 930 8 5912 5 мкг 0,107 0,230 0,700 1,758 931 8 5912 5 мкг 0,156 0,147 0,138 0,154 932 9 5914 20 мкг 0,165 0,213 0,175 0,284 933 9 5914 20 мкг 0,133 0,150 0,214 0,480 934 9 5914 20 мкг 0,123 0,153 0,141 0,646 935 9 5914 20 мкг 0,165 0,180 0,156 0,234 936 10 5914 5 мкг 0,110 0,117 0,248 0,388 937 10 5914 5 мкг 0,133 0,123 0,136 0,264 938 10 5914 5 мкг 0,136 0,156 0,219 0,357 939 10 5914 5 мкг 0,126 0,118 0,121 0,127 Жирный шрифт свидетельствует о трехкратном увеличении относительно значения оптической плотности (ОП) сыворотки до иммунизации.
Последовательности пептидов:
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 2
Сводка значений оптических плотностей сывороток для протестированных пептидов Группа № Пептида Доза на каждую инъекцию Средние значения оптических плотностей До иммунизации день 14 день 29 день 42 1 5907 20 мкг 0,083 0,080 0,097 0,165 2 5907 5 мкг 0,078 0,077 0,107 0,134 3 5910 20 мкг 0,083 0,102 0,202 0,237 4 5910 5 мкг 0,154 0,113 0,140 0,318 5 5911 20 мкг 0,132 0,171 0,229 0,342 6 5911 5 мкг 0,156 0,264 0,213 0,347 7 5912 20 мкг 0,100 0,130 0,123 0,155 8 5912 5 мкг 0,130 0,162 0,325 0,693 9 5914 20 мкг 0,146 0,174 0,171 0,411 10 5914 5 мкг 0,126 0,128 0,181 0,284 Последовательности пептидов:
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 3
Значения оптических плотностей индивидуальных сывороток, протестированных на штамме вируса гриппа Wuhan № Группы № Пептида Доза на каждую инъекцию До иммунизации день 42 Идентификатор мыши № Группы № Пептида Доза на каждую инъекцию До иммунизации день
42 1 5907 20 мкг 0,091 0,224 920 6 5911 5 мкг 0,067 0,154 1 5907 20 мкг 0,097 0,394 921 6 5911 5 мкг 0,060 0,174 1 5907 20 мкг 0,102 0,174 922 6 5911 5 мкг 0,073 0,136 1 5907 20 мкг 0,071 0,119 923 6 5911 5 мкг 0,063 0,165 2 5907 5 мкг 0,084 0,212 924 7 5912 20 мкг 0,077 0,132 2 5907 5 мкг 0,062 0,082 925 7 5912 20 мкг 0,084 0,431 2 5907 5 мкг 0,068 0,250 926 7 5912 20 мкг 0,057 0,093 2 5907 5 мкг 0,063 0,039 927 7 5912 20 мкг 0,086 0,068 3 5910 20 мкг 0,069 0,546 928 8 5912 5 мкг 0,063 0,086 3 5910 20 мкг 0,070 0,096 929 8 5912 5 мкг 0,060 0,100 3 5910 20 мкг 0,071 0,271 930 8 5912 5 мкг 0,062 0,527 3 5910 20 мкг 0,092 0,385 931 8 5912 5 мкг 0,083 0,090 4 5910 5 мкг 0,076 0,449 932 9 5914 20 мкг 0,099 0,156 4 5910 5 мкг 0,092 0,341 933 9 5914 20 мкг 0,132 0,408 4 5910 5 мкг 0,068 0,288 934 9 5914 20 мкг 0,068 0,296 4 5910 5 мкг 0,109 0,088 935 9 5914 20 мкг 0,080 0,182 5 5911 20 мкг 0,065 0,747 936 10 5914 5 мкг 0,062 0,172 5 5911 20 мкг 0,069 0,194 937 10 5914 5 мкг 0,059 0,329 5 5911 20 мкг 0,084 0,154 938 10 5914 5 мкг 0,090 0,239 5 5911 20 мкг 0,070 0,134 939 10 5914 5 мкг 0,083 0,096 Жирный шрифт свидетельствует о трехкратном или более увеличении относительно значения оптической плотности сыворотки до иммунизации. Последовательности пептидов:
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 4
Индукция IFN-γ и IL-4 в культурах спленоцитов после культивирования в течение 72 часов с иммуногенными пептидами выборки In vivo пептидный иммуноген In vitro обработка клеток селезенки (мкг/мл) Кратное увеличение относительно контроля Результаты для IFN-γ Результаты для IL-4 In Vivo Rx
20 мкг In Vivo Rx
5 мкг In Vivo Rx
20 мкг In Vivo Rx
5 мкг 5907 20 1,908 1,354 0,393 BDL 5907 10 1,516 1,349 0,139 BDL 5907 5 0,995 0,734 0,257 BDL 5907 2.5 1,052 0,698 0,170 BDL 5907 Wuhan 1,077 0,510 0,110 BDL 5910 20 4,782 3,315 BDL BDL 5910 10 3,856 2,440 BDL BDL 5910 5 2,935 1,018 BDL BDL 5910 2,5 2,771 1,218 BDL BDL 5910 Wuhan 1,347 1,133 BDL BDL 5911 20 0,936 2,449 BDL BDL 5911 10 1,440 1,818 BDL BDL 5911 5 1,428 1,494 BDL BDL 5911 2,5 1,043 1,380 BDL BDL 5911 Wuhan 2,208 0,959 BDL BDL 5912 20 1,744 0,282 BDL BDL 5912 10 1,996 0,159 BDL BDL 5912 5 1,495 0,235 BDL BDL 5912 2,5 1,779 0,237 BDL BDL 5912 Wuhan 1,067 0,126 BDL BDL 5914 20 1,477 0,425 BDL BDL 5914 10 1,524 2,252 BDL BDL 5914 5 0,947 0,954 BDL BDL 5914 2,5 1,028 1,173 BDL BDL 5914 Wuhan 0,086 0,086 BDL BDL BDL = Ниже детектируемого предела. Последовательности пептидов (все приготовленные в BSA): 5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15); 5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5); 5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7); 5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11); и 5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20).

Таблица 5
Индукция IFN-γ в спленоцитах после 72 часов обработки пептидом Группа In vivo пептидный иммуноген In vivo доза Обработка пептидом клеток селезенки Rx (мкг/мл) Расчетный IFN-γ
(нг/мл) Кратное увеличение относительно контроля 1 5907 20 мкг 20 2566,60 1,91 1 5907 20 мкг 10 2038,96 1,52 1 5907 20 мкг 5 1338,40 1,00 1 5907 20 мкг 2,5 1415,51 1,05 1 5907 20 мкг Ни одного 1345,11 1,00 1 5907 20 мкг Вирус 1448,19 1,08 2 5907 5 мкг 20 528,85 1,35 2 5907 5 мкг 10 526,97 1,35 2 5907 5 мкг 5 286,74 0,73 2 5907 5 мкг 2,5 272,64 0,70 2 5907 5 мкг Ни одного 390,68 1,00 2 5907 5 мкг Вирус 199,14 0,51 3 5910 20 мкг 20 1336,30 4,78 3 5910 20 мкг 10 1077,69 3,86 3 5910 20 мкг 5 820,23 2,94 3 5910 20 мкг 2,5 774,23 2,77 3 5910 20 мкг Ни одного 279,45 1,00 3 5910 20 мкг Вирус 376,39 1,35 4 5910 5 мкг 20 434,97 3,32 4 5910 5 мкг 10 320,18 2,44 4 5910 5 мкг 5 133,62 1,02 4 5910 5 мкг 2,5 159,78 1,22 4 5910 5 мкг Ни одного 131,20 1,00 4 5910 5 мкг Вирус 148,62 1,13 7 5912 20 мкг 20 679,78 1,74 7 5912 20 мкг 10 777,72 2,00 7 5912 20 мкг 5 582,48 1,49 7 5912 20 мкг 2,5 693,25 1,78 7 5912 20 мкг Ни одного 389,71 1,00 7 5912 20 мкг Вирус 415,72 1,07 8 5912 5 мкг 20 44,63 0,28 8 5912 5 мкг 10 25,14 0,16 8 5912 5 мкг 5 37,15 0,23 8 5912 5 мкг 2,5 37,46 0,24 8 5912 5 мкг Ни одного 158,39 1,00 8 5912 5 мкг Вирус 19,95 0,13 9 5914 20 мкг 20 1038,05 1,48 9 5914 20 мкг 10 1071,16 1,52 9 5914 20 мкг 5 665,78 0,95 9 5914 20 мкг 2,5 722,92 1,03 9 5914 20 мкг Ни одного 702,95 1,00 9 5914 20 мкг Вирус 607,53 0,86 10 5914 5 мкг 20 201,52 0,43 10 5914 5 мкг 10 1067,12 2,25 10 5914 5 мкг 5 452,13 0,95 10 5914 5 мкг 2,5 555,82 1,17 10 5914 5 мкг Ни одного 473,87 1,00 10 5914 5 мкг Вирус 409,40 0,86 Вирус = 200 мкл Wuhan 0307 359/95.
Клетки селезенки инкубировали с пептидом или вирусом при указанных концентрациях в течение 72 часов. Клетки селезенки из мыши 39 культивировали отдельно. Селезенка этой мыши была необычно большой.
Последовательности пептидов (все в BSA):
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 6
Индукция IFN-γ в спленоцитах после 72 часов обработки пептидом Группа In vivo пептидный иммуноген In vivo доза Обработка пептидом клеток селезенки Rx (мкг/мл) Расчетный
IFN-γ
(нг/мл) Кратное увеличение относительно контроля 5 5911 20 мкг 20 306,375 0,94 5 5911 20 мкг 10 471,373 1,44 5 5911 20 мкг 5 467,554 1,43 5 5911 20 мкг 2,5 341,46 1,04 5 5911 20 мкг Ни одного ND   5 5911 20 мкг Вирус 722,79 2,21 6 5911 5 мкг 20 801,569 2,45 6 5911 5 мкг 10 594,95 1,82 6 5911 5 мкг 5 488,89 1,49 6 5911 5 мкг 2,5 451,753 1,38 6 5911 5 мкг Ни одного 327,311 1,00 6 5911 5 мкг Вирус 314,035 0,96 39 5914 5 мкг 20 BDL   39 5914 5 мкг 10 BDL   39 5914 5 мкг 5 BDL   39 5914 5 мкг 2,5 BDL   39 5914 5 мкг Ни одного BDL   39 5914 5 мкг Вирус BDL   Вирус = 200 мкл Wuhan 0307 359/95. Клетки селезенки инкубировали с пептидом или вирусом при указанных концентрациях в течение 72 часов.
Клетки селезенки из мыши 39 культивировали отдельно.
Селезенка этой мыши была необычно большой.
BDL = Ниже детектируемого предела.
ND = не определено.
Последовательности пептидов (все в BSA):
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 7
Индукция IFN-γ в спленоцитах после 72 часов обработки пептидом. In vivo пептидный иммуноген Обработка пептидом клеток селезенки Rx (мкг/мл) Кратное увеличение относительно контроля 20 мкг
In Vivo 5 мкг
In Vivo 5907 20 1,908 1,354 5907 10 1,516 1,349 5907 5 0,995 0,734 5907 2,5 1,052 0,698 5910 20 4,782 3,315 5910 10 3,856 2,440 5910 5 2,935 1,018 5910 2,5 2,771 1,218 5911 20 0,936 2,449 5911 10 1,440 1,818 5911 5 1,428 1,494 5911 2,5 1,043 1,380 5912 20 1,744 0,282 5912 10 1,996 0,159 5912 5 1,495 0,235 5912 2,5 1,779 0,237 5914 20 1,477 0,425 5914 10 1,524 2,252 5914 5 0,947 0,954 5914 2,5 1,028 1,173 Вирус = 200 мкл Wuhan 0307 359/95.
Клетки селезенки инкубировали с пептидом или вирусом при указанных концентрациях в течение 72 часов.
Клетки селезенки из мыши 39 культивировали отдельно.
Селезенка этой мыши была необычно большой.
Последовательности пептидов (все в BSA):
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 8
Индукция IL-4 в спленоцитах после 72 часов обработки пептидом. Группа In vivo пептидный иммуноген In vivo доза Обработка пептидом клеток селезенки Rx (мкг/мл) Расчетный IL4
(нг/мл) Кратное увеличение относительно контроля 1 5907 20 мкг 20 53,21 0,39 1 5907 20 мкг 10 18,82 0,14 1 5907 20 мкг 5 34,85 0,26 1 5907 20 мкг 2,5 23,01 0,17 1 5907 20 мкг Ни одного 135,47 1,00 1 5907 20 мкг Вирус 14,26 0,11 2 5907 5 мкг 20 BDL NA 2 5907 5 мкг 10 18,99 NA 2 5907 5 мкг 5 BDL NA 2 5907 5 мкг 2,5 BDL NA 2 5907 5 мкг Ни одного BDL NA 2 5907 5 мкг Вирус BDL NA 3 5910 20 мкг 20 1,49 NA 3 5910 20 мкг 10 BDL NA 3 5910 20 мкг 5 BDL NA 3 5910 20 мкг 2,5 BDL NA 3 5910 20 мкг Ни одного BDL NA 3 5910 20 мкг Вирус BDL NA 4 5910 5 мкг 20 BDL NA 4 5910 5 мкг 10 BDL NA 4 5910 5 мкг 5 BDL NA 4 5910 5 мкг 2,5 BDL NA 4 5910 5 мкг Ни одного BDL NA 4 5910 5 мкг Вирус BDL NA 7 5912 20 мкг 20 BDL NA 7 5912 20 мкг 10 BDL NA 7 5912 20 мкг 5 BDL NA 7 5912 20 мкг 2,5 BDL NA 7 5912 20 мкг Ни одного BDL NA 7 5912 20 мкг Вирус BDL NA 8 5912 5 мкг 20 BDL NA 8 5912 5 мкг 10 BDL NA 8 5912 5 мкг 5 BDL NA 8 5912 5 мкг 2,5 BDL NA 8 5912 5 мкг Ни одного BDL NA 8 5912 5 мкг Вирус BDL NA 9 5914 20 мкг 20 BDL NA 9 5914 20 мкг 10 BDL NA 9 5914 20 мкг 5 BDL NA 9 5914 20 мкг 2,5 BDL NA 9 5914 20 мкг Ни одного BDL NA 9 5914 20 мкг Вирус BDL NA 10 5914 5 мкг 20 BDL NA 10 5914 5 мкг 10 BDL NA 10 5914 5 мкг 5 BDL NA 10 5914 5 мкг 2,5 BDL NA 10 5914 5 мкг Ни одного BDL NA 10 5914 5 мкг Вирус BDL NA Вирус = 200 мкл Wuhan 0307 359/95.
Клетки селезенки инкубировали с пептидом или вирусом при указанных концентрациях в течение 72 часов.
Клетки селезенки из мыши 39 культивировали отдельно.
Селезенка этой мыши была необычно большой.
BDL = Ниже детектируемого предела.
NA = не применимо.
Последовательности пептидов (все конъюгированные с BSA):
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 9
Индукция IL-4 в спленоцитах после 72 часов обработки пептидом Группа In vivo пептидный иммуноген In vivo доза Обработка пептидом клеток селезенки Rx (мкг/мл) Расчетный IL-4
(нг/мл) Кратное увеличение относительно контроля 5 5911 20 мкг 20 BDL NA 5 5911 20 мкг 10 BDL NA 5 5911 20 мкг 5 BDL NA 5 5911 20 мкг 2,5 BDL NA 5 5911 20 мкг Ни одного BDL NA 5 5911 20 мкг Вирус 1,49 NA 6 5911 5 мкг 20 BDL NA 6 5911 5 мкг 10 BDL NA 6 5911 5 мкг 5 BDL NA 6 5911 5 мкг 2,5 BDL NA 6 5911 5 мкг Ни одного BDL NA 6 5911 5 мкг Вирус BDL NA 39 5914 5 мкг 20 BDL NA 39 5914 5 мкг 10 BDL NA 39 5914 5 мкг 5 BDL NA 39 5914 5 мкг 2,5 BDL NA 39 5914 5 мкг Ни одного BDL NA 39 5914 5 мкг Вирус BDL NA Вирус = 200 мкл Wuhan 0307 359/95.
Клетки селезенки инкубировали с пептидом или вирусом при указанных концентрациях в течение 72 часов.
Клетки селезенки из мыши 39 культивировали отдельно.
Селезенка этой мыши была необычно большой.
Последовательности пептидов (все в BSA):
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 10
Индукция IL-4 в спленоцитах после 72 часов обработки пептидом In vivo пептидный иммуноген Обработка пептидом клеток селезенки (мкг/мл) Кратное увеличение относительно контроля 20 мкг
In Vivo 5 мкг
In Vivo 5907 20 0,393 NA 5907 10 0,139 NA 5907 5 0,257 NA 5907 2,5 0,170 NA 5910 20 NA NA 5910 10 NA NA 5910 5 NA NA 5910 2,5 NA NA 5911 20 NA NA 5911 10 NA NA 5911 5 NA NA 5911 2,5 NA NA 5912 20 NA NA 5912 10 NA NA 5912 5 NA NA 5912 2,5 NA NA 5914 20 NA NA 5914 10 NA NA 5914 5 NA NA 5914 2,5 NA NA Вирус = 200 мкл Wuhan 0307 359/95.
Клетки селезенки инкубировали с пептидом или вирусом при указанных концентрациях в течение 72 часов.
Клетки селезенки из мыши 39 культивировали отдельно.
Селезенка этой мыши была необычно большой.
Последовательности пептидов (все в BSA):
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 11
Сравнение определяемых с помощью ELISA значений оптической плотности индивидуальных сывороток, в разведении 1:100, проверенных на PF5906 (пептида 5906) и полисахариде Pn14 Идентификатор мыши Доза День 14 День 28 День 42 5906 Pn14 5906 Pn14 5906 Pn14 6876 5 мкг 0,091 0,089 0,114 0,095 0,368 0,398 6877 5 мкг 0,214 0,226 0,597 0,448 0,546 0,523 6878 5 мкг 0,231 0,248 0,259 0,260 0,381 0,351 6879 5 мкг 0,174 1,023 0,228 0,693 0,287 0,744 6880 20 мкг 0,140 0,116 0,197 0,252 0,192 0,375 6881 20 мкг 0,635 0,615 0,317 2,829 0,677 3,480 6882 20 мкг 0,061 0,106 0,077 0,941 0,088 0,638 6883 20 мкг 0,088 0,111 0,684 0,646 1,229 0,840 Последовательность пептида PF2001 (пептида 5906):
SLLTEVETPIRNEWGLLTEVETPIRQYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:44)

Таблица 12
Определяемые с помощью ELISA значения оптической плотности индивидуальных сывороток, в разведении 1:100, проверенных на вирусе гриппа Wuhan Идентификатор мыши Вакцина Доза (мкг) Оптическая плотность Среднее значение Оптическая плотность Среднее значение До иммунизации До иммунизации День 42 День 42 876 5906-Pn14 5 мкг 0,082 0,084 0,083 0,312 0,309 0,311 877 5906-Pn14 5 мкг 0,086 0,084 0,085 0,516 0,463 0,490 878 5906-Pn14 5 мкг 0,088 0,087 0,088 0,341 0,312 0,327 879 5906-Pn14 5 мкг 0,096 0,098 0,097 0,262 0,345 0,304 880 5906-Pn14 20 мкг 0,0942 0,096 0,095 0,162 0,152 0,157 881 5906-Pn14 20 мкг 0,082 0,089 0,086 0,629 0,569 0,599 882 5906-Pn14 20 мкг 0,072 0,071 0,072 0,081 0,081 0,081 883 5906-Pn14 20 мкг 0,087 0,079 0,083 1,129 1,088 1,109 Последовательность пептида (PF2001 (пептида 5906), конъюгированная с Pn14):
SLLTEVETPIRNEWGLLTEVETPIRQYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:44)

Таблица 13
Уровни IFN-γ и IL-4 в супернатантах культур клеток селезенки Сводка результатов для IFN-γ и IL-4 Дополнительный идентификатор In vivo доза In vitro индуктор In vitro доза Разведение для анализа IFN ОП Расчетный IFN-γ (пг/мл) Разведение для анализа IL4 ОП Расчетный IL4 (пг/мл) A1 5 мкг 5906 20 мкг 2 0,049 BDL 2 0,111 BDL A1 5 мкг 5906 20 мкг 5 0,044 BDL 4 0,120 BDL A2 5 мкг 5906 10 мкг 2 0,046 BDL 2 0,112 BDL A2 5 мкг 5906 10 мкг 5 0,045 BDL 4 0,121 BDL A3 5 мкг 5906 5 мкг 2 0,046 BDL 2 0,114 BDL A3 5 мкг 5906 5 мкг ND ND ND 4 0,126 BDL A4 5 мкг Pn14 20 2 0,043 BDL 2 0,116 BDL A4 5 мкг Pn14 20 ND ND ND 4 0,123 BDL A5 5 мкг Wuhan 0,1 мл 2 0,044 BDL 2 0,117 BDL A5 5 мкг Wuhan 0,1 мл 5 0,046 BDL 4 0,110 BDL A6 5 мкг никакая NA 2 0,056 BDL 2 0,117 BDL A6 5 мкг никакая NA ND ND ND 4 0,113 BDL B1 20 мкг 5906 20 мкг 2 0,098 98,651 2 0,128 BDL B1 20 мкг 5906 20 мкг 5 0,074 128,681 4 0,120 BDL B2 20 мкг 5906 10 мкг 2 0,081 64,887 2 0,135 BDL B2 20 мкг 5906 10 мкг 5 0,060 BDL 4 0,112 BDL B3 20 мкг 5906 5 мкг 2 0,061 BDL 2 0,108 BDL B3 20 мкг 5906 5 мкг ND ND ND 4 0,119 BDL B4 20 мкг Pn14 20 2 0,043 BDL 2 0,116 BDL B4 20 мкг Pn14 20 ND ND ND 4 0,125 BDL B5 20 мкг Wuhan 0,1 мл 2 0,050 BDL 2 0,116 BDL B5 20 мкг Wuhan 0,1 мл 5 0,047 BDL 4 0,139 BDL B6 20 мкг никакая NA 2 0,062 BDL 2 0,113 BDL B6 20 мкг никакая NA ND ND ND 4 0,138 BDL Стандарт IFN         Стандарт IL4 Концентрация ОП         Концентрация ОП 1000 0,990         1800 2,023 500 0,568         900 1,384 250 0,318         450 0,822 125 0,176         150 0,376 62,5 0,110         50 0,204 31,25 0,079         25 0,173 15,625 0,067         12,5 0,160 никакая 0,052         никакая 0,143 Последовательность пептида PF2001 (пептида 5906):
SLLTEVETPIRNEWGLLTEVETPIRQYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:44)

Таблица 14
Сводка индивидуальных результатов анализа ответов против Wuhan. Сыворотки в разведении 1:100 Идентификатор мыши Группа Пептид Доза на каждое введение Оптическая плотность До иммунизации День 42 900 1 5907 20 мкг 0,091 0,224 901 1 5907 20 мкг 0,087 0,394 902 1 5907 20 мкг 0,102 0,174 903 1 5907 20 мкг 0,071 0,119 904 2 5907 5 мкг 0,084 0,212 905 2 5907 5 мкг 0,062 0,082 906 2 5907 5 мкг 0,068 0,250 907 2 5907 5 мкг 0,063 0,039 908 3 5910 20 мкг 0,069 0,546 909 3 5910 20 мкг 0,070 0,096 910 3 5910 20 мкг 0,071 0,271 911 3 5910 20 мкг 0,092 0,385 912 4 5910 5 мкг 0,076 0,449 913 4 5910 5 мкг 0,092 0,341 914 4 5910 5 мкг 0,068 0,288 915 4 5910 5 мкг 0,109 0,088 916 5 5911 20 мкг 0,065 0,747 917 5 5911 20 мкг 0,069 0,194 918 5 5911 20 мкг 0,084 0,154 919 5 5911 20 мкг 0,070 0,134 920 6 5911 5 мкг 0,067 0,154 921 6 5911 5 мкг 0,060 0,174 922 6 5911 5 мкг 0,073 0,136 923 6 5911 5 мкг 0,063 0,165 924 7 5912 20 мкг 0,077 0,132 925 7 5912 20 мкг 0,084 0,431 926 7 5912 20 мкг 0,057 0,093 927 7 5912 20 мкг 0,086 0,068 928 8 5912 5 мкг 0,063 0,086 929 8 5912 5 мкг 0,060 0,100 930 8 5912 5 мкг 0,062 0,527 931 8 5912 5 мкг 0,083 0,090 932 9 5914 20 мкг 0,099 0,156 933 9 5914 20 мкг 0,132 0,408 934 9 5914 20 мкг 0,068 0,296 935 9 5914 20 мкг 0,080 0,182 936 10 5914 5 мкг 0,062 0,176 937 10 5914 5 мкг 0,059 0,329 938 10 5914 5 мкг 0,090 0,239 939 10 5914 5 мкг 0,083 0,096 Последовательности пептидов (все конъюгированные с BSA):
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

Таблица 15
Сводка усредненных результатов анализа ответов против Wuhan. Сыворотки в разведении 1:100 Группа Пептид Доза на каждое введение Оптическая плотность Среднеквадратическое отклонение До иммунизации День 42 До иммунизации День 42 1 5907 20 мкг 0,088 0,227 0,013 0,119 2 5907 5 мкг 0,069 0,146 0,010 0,101 3 5910 20 мкг 0,075 0,324 0,011 0,190 4 5910 5 мкг 0,086 0,291 0,018 0,151 5 5911 20 мкг 0,072 0,307 0,008 0,294 6 5911 5 мкг 0,065 0,157 0,006 0,016 7 5912 20 мкг 0,076 0,181 0,013 0,169 8 5912 5 мкг 0,067 0,201 0,011 0,217 9 5914 20 мкг 0,094 0,260 0,028 0,115 10 5914 5 мкг 0,073 0,210 0,015 0,099 Последовательности пептидов (все конъюгированные с BSA):
5907 GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15)
5910 GNLFIAP (SEQ ID NO:5)
5911 HYEECSCY (SEQ ID NO:7)
5912 DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11)
5914 KSCINFCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20)

ПРИМЕР 7 - ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОТОБРАННЫХ ПЕПТИДОВ HA И N1

Внутри белков нейраминидазы (N1) H1N1 и H5N1 существуют три гомологичных области. Последовательности N1 получены при множественных совмещениях 83 полноразмерных последовательностей NA. Репрезентативные последовательности H1N1 и H5N1 человека, другого млекопитающего, т.е. кошачьего и птичьего происхождения, довольно разнообразны и включают современные и старые штаммы, берущие начало до 1983. Птичьи штаммы были получены из ряда видов, т.е. курицы, гуся, утки, лебедя, канюка, грифа, чайки, сокола, ворона, хохлатой майны и баклага. В совмещение множества последовательностей также были включены A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1), вакцинный компонент вируса гриппа А человека, недавно выделенный 2007-08, и A/New Caledonia/20/99, вакцинный компонент вируса гриппа А H1N1, циркулирующего в настоящее время.

Совмещения множества последовательностей и трансляции первичных белков были выполнены, используя MegAlign® (версию 5.06, DNAStar, Inc., Madison, WI, США). Трехмерные структуры создавали, используя последовательность пептидного антигена NA New Caledonia/20/1999, с помощью версии 3.7 Deep viewer/Swiss PDB Viewer и на основе установленной рентгеновской структуры A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), описанной Lou (2006).

На фиг. 7 изображены три области внутри последовательности глобулярной головки белка NA, которые являются консервативными для всех 83 штаммов. Интересно отметить, что первичная аминокислотная последовательность и результирующий трехмерный белок являются часто двумя отдельными объектами из-за свойств аминокислот, например, суммарного заряда, R-группы, полярности. Например, все остатки NA в положениях 118, 119, 178, 371, 292, 152, 222, 276, 246 и 151 разбросаны на всем протяжении первичной последовательности NA. Однако при свертывании в конечное конформационное трехмерное состояние все они ютятся в довольно непосредственной близости и функционируют совместно для связывания сиаловой кислоты, как показано на фиг. 8.

В индивидуальном порядке варианты выбора могли бы быть важны, поскольку они представляют консервативные эпитопы для совокупности этих чрезвычайно разнообразных штаммов. Тем, что делает их даже более захватывающими в качестве возможных иммунологических «горячих» точек, является то, что, несмотря на то, что они разделены расстоянием в соответствующей им первичной аминокислотной последовательности, они приближены друг к другу в соответствии со свернутой структурой.

Подобным образом, последовательности НА были получены при множественных совмещениях 75 полноразмерных последовательностей Н1 и Н3, полученных из базы данных последовательностей вируса гриппа Los Alamos и базы данных PubMed (Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека, Национальный институт здравоохранения, Bethesda, MD, США). На фиг. 9 показано положение отобранного эпитопа в полноразмерной молекуле НА.

ПРИМЕР 8 - АНАЛИЗ ПЕПТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ МНОЖЕСТВА ВИРУСНЫХ ИЗОЛЯТОВ

По крайней мере две высококонсервативные пептидные области гемагглютинина (НА) вируса гриппа А были идентифицированы благодаря множественному совмещению последовательностей нескольких тысяч штаммов. Последовательности были получены, используя Web-сайт Influenza Virus Resource (доступный по: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html) и представляют штаммы, полученные из являющихся людьми, птицами и/или млекопитающими источников.

Множественное совмещение первичных аминокислотных последовательностей выполняли, используя >2000 полевых штаммов вируса гриппа А Н1 и Н3 и репрезентативных штаммов Н5, последовательности НА которых имеются в научной и медицинской литературе. Были также включены последовательности вакцинного и ссылочного штаммов Н3 и Н1 и пептиды Н5, представляющие монофилетические группы 1, 1', 2 и 3. Трехмерную структуру белка вакцинного штамма H3N2 A/Wisconsin/67/2005 конструировали на основе ближайшего гомолога, имеющегося в базе данных по последовательностям белков, с использованием Swiss PDF Viewer. Консервативные остатки, наблюдаемые при совмещении последовательностей, отмечены в зрелом белке НА.

При совмещениях множества последовательностей консервативные области были идентифицированы, используя пакет программ LaserGene® (DNAStar Inc.). Эпитоп белка GNLIAP (SEQ ID NO: 6), соответствующий положениям 249-254 аминокислот Н3, был совершенно консервативным (100%) в НА вируса гриппа Н3 и Н1 (5000 из 5000 заданий на поиск данных, включающих являющиеся людьми, свиньями и птицами источники).

Эпитоп белка GNFIAP (SEQ ID NO:4) является высококонсервативным в Н5. Область GNLIAP (SEQ ID NO:6) частично обнаруживается на дистальной поверхности НА1 и не находится в пределах предположенных ранее антигенных/иммунодоминантных сайтов (А-Е). Кроме того, последовательность YIWGVHHP (SEQ ID NO:52), соответствующая положениям 178-185 аминокислот Н3, была высококонсервативной (93%) в Н3 (7090 из 7600 заданий на поиск данных, включающих являющиеся людьми, свиньями и птицами источники), и внутри этой области последовательность WGVHHP (SEQ ID NO:50) была также высококонсервативной (86%) в вирусе гриппа Н1 (2336 из 2710 заданий на поиск данных, включающих являющиеся людьми, свиньями и птицами источники). Сердцевинная последовательность WGIHHP (SEQ ID NO:49) была также высококонсервативной (83%) в штаммах Н5 (2049 из 2470 заданий на поиск данных, включающих штаммы человека и птиц).

ПРИМЕР 9 - ПРИМЕРЫ ВЫСОКОКОНСЕРВАТИВНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ЭПИТОВ ДЛЯ МНОЖЕСТВА ВИРУСНЫХ ИЗОЛЯТОВ

На фиг. 26А, фиг. 26В и фиг. 26С демонстрируются примеры высококонсервативных последовательностей эпитопов для множества подтипов вируса гриппа А, включающих нынешние и прежние вакцинные штаммы. Показаны консенсусные последовательности (SEQ ID NO:58), (SEQ ID NO:69) и (SEQ ID NO:71) для каждого из эпитопов Н1 (фиг. 26А), Н3 (фиг. 26В) и Н5 (фиг. 26С), соответственно.

Эти данные демонстрируют возможность создания мономерных и полимерных иммуногенных композиций, которые могут быть активными против множества отличных микробных и/или вирусных видов, благодаря отбору консервативных мишеней-эпитопов.

ПРИМЕР 10 - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ

В следующем примере суммировано множество экспериментальных способов, используемых в упомянутых выше исследованиях.

Синтетические мишеневые пептидные антигены синтезировали на смоле (9-флуоренилметил)хлорформиате (Fmoc)-Glu(tBu)-Wang, используя схему защиты группами Fmoc/tBu, в микроволновом пептидном синтезаторе CEM Liberty. Диметилформамид (DMF) (ThermoFisher Scientific, Pittsburgh, PA, США) был первичным используемым растворителем. Защищенные аминокислоты включали в пептид через активное образование сложного эфира, используя о-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU) (GL Biochem, Ltd. GLS, Shanghai, Китай) и диизопропилэтиламин (DIEA) (Chem-Impex International, Inc., Wood Dale, IL, США) в DMF. Все Fmoc-защищенные аминокислоты поставлялись GL Biochem, Ltd. Используемыми группами, защищающими боковые цепи, были следующие группы: Asn, Cys, His и Gln защищали тритилом (trt); Glu и Ser защищали трет-бутилом (tBu); Lys защищали трет-бутилоксикарбонилом (Boc); Arg защищали 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонилом (Pbf); и Ala, Leu, Phe, Val и Gly использовали без защиты боковых цепей. N-концевые защитные Fmoc-группы удалили с использованием 20% пиперидина (American Bioanalytical, Natick, MA, США) в DMF. Пептиды отщепляли от твердой подложки, и одновременно снимали защиту с боковых цепей, используя 92% трифторуксусной кислоты (Halocarbon Products Corp., River Edge, NJ, США), 2% анизола, 2% дитиотреитола, 2% триизопропилсилана (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, США) и 2% воды.

Описанные в настоящем описании синтетические пептиды очищали в 600-см полупрепаративной HPLC системе (Waters Corporation, Milford, MA, США), используя колонку Vydac® размером 22 мм×250 мм с С₁₈ диаметром 120 Ангстрем (W.R. Grace and Co., Deerfield, IL, США) и растворители: 0,1% TFA/воде (А) и 0,1% TFA/ацетонитриле (ACN) (B). Пептиды очищали в градиенте 35%-50% ацетонитрила в течение 60 мин. Анализ с использованием аналитической HPLC всех фракций проводили, используя Alliance 2695 HPLC (Waters Corporation) с колонкой размером 2,1 мм×30 мм SymmetryShield® RP18 размером 3,5 мкм.

Анализ с помощью времяпролетной масс-спектрометрии лазерной десорбции/ионизации c использованием матрицы (MALDI-ToF) неочищенных и очищенных пептидов проводили, используя систему ABI Voyager® DE Pro® (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Неочищенный пептид каждого синтеза и чистый пептид растворяли в 50% ацетонитриле/воде и наносили пробу с использованием матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Sigma-Aldrich). Положительно заряженные ионы выявляли, используя линейный детектор, который был откалиброван с использованием стандартов в виде брадикинина и ангиотензина.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СПЛЕНОЦИТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ:

1. Для каждой группы мышей, повергаемых умерщвлению, приготовить одну стерильную 50-мл коническую пробирку с 30 мл DMEM, EMEM или HBSS, содержащей 1Х пенициллина-стрептомицина. Держать конические пробирки на льду.

2. Умертвить четыре мыши (т.е. одну группу) путем асфиксии с использованием СО₂.

3. Пропитать кожу каждой мыши 70% этиловым спиртом и прикрепить мышь к препаровальной доске.

4. Взять у каждой мыши кровь с помощью прокола сердца для минимизации количества эритроцитов в конечном препарате.

5. Вскрыть и осторожно удалить селезенку и перенести ее в 50-мл коническую пробирку.

6. Возвратить все конические пробирки на лед.

7. Перенести селезенки и среду в сито для клеток в стерильной 100-мл чашке Петри.

8. Используя сито для клеток и поршень от 5-мл шприца, осторожно протереть селезенки сквозь сито для клеток до тех пор, пока не останется только капсула.

9. Перенести суспензию клеток в новую 50-мл коническую пробирку через фильтр для клеток Falcon и осадить клетки с помощью центрифугирования при 1000×g в течение 10 мин при 4ºС.

10. Удалить супернатант и лизировать эритроциты с помощью добавления 1 мл раствора для лизиса эритроцитов (Sigma Chemical) на 60-75 сек. Осторожно вращать пробирку для подвергания всех эритроцитов воздействию буфера для лизирования.

11. Быстро добавить в пробирку 40 мл EMEM или HBSS, содержащей 1Х пенициллина-стрептомицина.

12. Взять образец клеток для их подсчета. Использовать для подсчета разведение 1:200.

13. Осадить клетки с помощью центрифугирования, как указано выше.

14. Подсчитать клетки во время центрифугирования.

15. После центрифугирования отбросить супернатант и суспендировать клетки до концентрации 2×10⁶ клеток/мл в DMEM, содержащей 10% FBS и 1Х пенициллина-стрептомицина.

16. Засеять 4 мл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток (=10×10⁶ клеток в каждой лунке).

16. Обработать клетки добавлением 1 мл соответствующего пептида в концентрации 100, 50, 25 мкг/мл пептида в 4 мл суспензии, уже находящейся в планшете, что приводит к конечным концентрациям пептида, составляющим 20, 10 и 5 мкг/мл. В одну лунку вносят 900 мкл DMEM без сыворотки и 100 мкл Wuhan 359/95, и в одну лунку вносят 100 мкл 100 мкг/мл полисахарида Pn14, и в одну лунку вносят только 1 мл DMEM без сыворотки.

17. Через семьдесят два часа после обработки перенести супернатанты из каждой лунки в 15-мл стерильную коническую пробирку.

18. Осадить клетки с помощью центрифугирования при 1000×g при 4ºС.

19. Перенести 400-600 мкл супернатанта в каждую из 6 микропробирок и хранить образцы при -20ºС или ниже.

21. Держать образцы замороженными до их оценки на IL-4 и IFN-γ или другие цитокины.

ELISA АНТИТЕЛ ПРОТИВ ПЕПТИДОВ

Индивидуальные сыворотки проверяли в конечном разведении 1:100 (в PBS-T) в планшетах Nunc Maxisorp®, покрытых пептидом, соответствующим конъюгату пептид-BSA, используемому для введения, в концентрации 1 мкг/мл в PBS (100 мкл/лунку). Сто микролитров разведенной сыворотки подвергали взаимодействию с покрытым планшетом в течение 30-60 мин при комнатной температуре, и не связавшийся материал удалили промывкой три раза PBS-T. Антитела против пептидов выявляли, используя меченные пероксидазой козьи антитела против IgG мыши (γ-специфические), разведенные 1:10000 в PBS-T (100 мкл/лунку; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, США). После инкубации в течение 30 мин лунки промывали пять раз PBS-T для удаления не связавшегося материала, и в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата (TMB; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, США). Этой реакции предоставляли возможность происходить в течение 15 мин в темноте, и ее останавливали добавлением 100 мкл раствора для остановки TMB в каждую лунку (Kirkegaard & Perry). Оптическую плотность определяли при 450 нм.

ELISA АНТИТЕЛ ПРОТИВ WUHAN

Индивидуальные сыворотки дня 0 и дня 42 проверяли в конечном разведении 1:100 (в PBS-T) в планшетах Nunc Maxisorp®, покрытых живым Wuhan в разведении 1:500 в PBS (100 мкл/лунку). Разведенные сыворотки подвергали взаимодействию с покрытым планшетом в течение 30-60 мин при комнатной температуре, и не связавшийся материал удалили промывкой три раза PBS-T. Антитела против Wuhan выявляли, используя меченные пероксидазой козьи антитела против IgG мыши (γ-специфические), разведенные 1:10000 в PBS-T (Jackson ImmunoResearch). После инкубации в течение 30 мин лунки промывали пять раз PBS-T для удаления не связавшегося материала, и добавляли субстрат (TMB; Kirkegaard & Perry). Этой реакции предоставляли возможность происходить в течение 15 мин в темноте, и ее останавливали добавлением раствора для остановки TMB (Kirkegaard & Perry). Оптическую плотность определяли при 450 нм.

ELISA IL-4 И IFN-γ

Анализы IL-4 (набор DuoSet®, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, США) и IFN-γ (набор BioSource CytoSet®, Invitrogen Corp.) выполняли на супернатантах объединенных культур клеток селезенок, полученных из мышек в день 42 эксперимента. Объединенные культуры обрабатывали в течение 72 часов соответствующим пептидом в концентрации 20, 10, 5 или 2,5 мкг/мл или Wuhan 0307 359/95 (1:50), или не обрабатывали.

АНАЛИЗ IFN-γ

1. Приготовить раствор для покрытия путем разведения антитела для покрытия.

2. Покрыть планшеты 100 мкл на лунку раствора для покрытия. Закрыть планшеты и инкубировать в течение ночи (12-18 ч) при 4ºС.

3. Удалить аспирацией жидкость из лунок и промыть раз >400 мкл буфера для промывки на каждую лунку. После промывки перевернуть и выпустить жидкость на фильтровальную бумагу для удаления избытка жидкости.

4. Блокировать планшет с помощью 300 мкл на лунку буфера для анализа в течение 1 часа при комнатной температуре.

5. Удалить жидкость аспирацией, перевернуть и выпустить жидкость на фильтровальную бумагу для удаления избытка жидкости.

6. Приготовить стандарты и разведения образцов в буфере для анализа.

7. Пипетировать 100 мкл стандартов (в двух повторах), образцов и контролей в намеченные лунки.

8. Немедленно после стадии 7 добавить 50 мкл рабочего антитела для обнаружения в каждую лунку. Закрыть планшет и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.

9. Удалить аспирацией жидкость и промыть 5 раз, используя способ стадии 3.

10. Добавить 100 мкл рабочего раствора стрептавидин-HRP в каждую лунку. Закрыть планшет и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.

11. Удалить аспирацией жидкость и промыть 5 раз, используя способ стадии 3.

12. Добавить в каждую лунку 100 мкл субстрата TMB. Инкубировать планшет без крышки для планшета в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре.

13. Добавить в каждую лунку 100 мкл раствора для остановки.

14. Измерить оптическую плотность при 450 нм (контрольная оптическая плотность: 650 нм) в пределах 30 мин после добавления раствора для остановки. Рассчитать результаты, используя подбор кривой с помощью двойного логарифма или четырехпараметрического алгоритма.

РЕАГЕНТЫ И ВИРУСНЫЕ ШТОКИ

Конъюгаты PF2001-Pn14 и полисахарид Pn14 были предоставлены Fina BioSolution, LLC (Rockville, MD, США). Вирус гриппа A/Wuhan/359/95 был предоставлен Virion Systems, Inc. (Rockville, MD, США). Вирусный шток был первоначально приготовлен NovaVax из клеток MDCK. Штоки хранили при -80ºС и имели титр 10⁸ TCID₅₀ на мл.

Все анализы проводили в соответствии с инструкциями производителей.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРИВОДИМЫХ В КАЧЕСТВЕ ПРИМЕРОВ ПЕПТИДНЫХ АНТИГЕНОВ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Неограничивающий перечень приводимых в качестве примеров пептидных эпитопов, которые можно использовать при осуществлении на практике настоящего изобретения и, в частности, при составлении поливалентных антигенных пептидов и полипептидов, является следующим:

DWSGYSGSFVQHPELTGLD (SEQ ID NO:1)

ETPIRNE (SEQ ID NO:2)

FVIREPFISCSHLEC (SEQ ID NO:3)

GNFIAP(SEQ ID NO:4)

GNLFIAP (SEQ ID NO:5) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5910»)

GNLIAP (SEQ ID NO:6)

HYEECSCY (SEQ ID NO:7) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5911»)

LLTEVETPIR (SEQ ID NO:8)

LLTEVETPIRN (SEQ ID NO:9)

LLTEVETPIRNE (SEQ ID NO:10)

DWSGYSGSFVQHPELTGL (SEQ ID NO:11) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5912»)

EVETPIRNE (SEQ ID NO:12)

FLLPEDETPIRNEWGLLTDDETPIRYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:13)

GNLFIAPGNLFIAPHYEECSCYHYEECSCYQYIKANSKFIGITEHYEECSCYTPIRNETPIRNE (SEQ ID NO:14)

GNLFIAPGNLFIAPQYIKANSKFIGITEGNLFIAP (SEQ ID NO:15) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5907»)

HYEECSCYDWSGYSGSFVQHPELTGLHYEECSCYQYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:16) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5908»)

ITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDP (SEQ ID NO:17) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5913»)

IWGIHHP (SEQ ID NO:18)

IWGVHHP (SEQ ID NO:19)

KSCINRCFYVELIRGR (SEQ ID NO:20) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5914»)

LLTEVETPIRNESLLTEVETPIRNEWG (SEQ ID NO:21)

LLTEVETPIRNEW (SEQ ID NO:22)

LLTEVETPIRNEWG (SEQ ID NO:23)

LTEVETPIRNE (SEQ ID NO:24)

LTEVETPIRNEW (SEQ ID NO:25)

LTEVETPIRNEWG (SEQ ID NO:26)

MSLLTEVET (SEQ ID NO:27)

MSLLTEVETP (SEQ ID NO:28)

MSLLTEVETPI (SEQ ID NO:29)

MSLLTEVETPIR (SEQ ID NO:30)

MSLLTEVETPIRN (SEQ ID NO:31)

MSLLTEVETPIRNE (SEQ ID NO:32)

MSLLTEVETPIRNETPIRNE (SEQ ID NO:33)

MSLLTEVETPIRNEW (SEQ ID NO:34)

MSLLTEVETPIRNEWG (SEQ ID NO:35)

MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO:36)

SLLTEVET (SEQ ID NO:37)

SLLTEVETPIRNE (SEQ ID NO:38)

SLLTEVETPIRNEW (SEQ ID NO:39)

SLLTEVETPIRNEWG (SEQ ID NO:40)

SLLTEVETPIRNEWGTPIRNE (SEQ ID NO:41)

SLLTEVETPIRNEWGTPIRNETPIRNE (SEQ ID NO:42)

SLLTEVETPIRNEWGTPIRNETPIRNETPIRNE (SEQ ID NO:43)

SLLTEVETPIRNEWGLLTEVETPIRQYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:44) (также именуемая в настоящем описании, альтернативно, «PF2001» или «пептидом 5906»)

TEVETPIRNE (SEQ ID NO:45)

TPIRNE (SEQ ID NO:46)

VETPIRNE (SEQ ID NO:47)

VTREPYVSCDPKSCINRCFYVELIRGRVTREPYVSCDPWYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:48) (также именуемая в настоящем описании «пептидом 5909»)

WGIHHP (SEQ ID NO:49)

WGVHHP (SEQ ID NO:50)

YIWGIHHP (SEQ ID NO:51)

YIWGVHHP (SEQ ID NO:52)

QYIKANSKFIGITE (SEQ ID NO:53)

PIRNEWGCRCNDSSD (SEQ ID NO:54)

SIELE (SEQ ID NO:55)

MSLLTEVETYVLSIVP (SEQ ID NO:56)

MQRFK (SEQ ID NO:57)

NGNLIAPRYAFALSRGFGFGIITSNAPMDE (SEQ ID NO:58)

NGNLIAPRYAFALSRGFGFGIINSNAPMDK (SEQ ID NO:59)

NGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDK (SEQ ID NO:60)

NGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDK (SEQ ID NO:61)

NGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMGE (SEQ ID NO:62)

NGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMNE (SEQ ID NO:63)

NGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDE (SEQ ID NO:64)

NGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDE (SEQ ID NO:65)

NGNLIAPRYAFALSRGFGSGIITSNAPMDE (SEQ ID NO:66)

NGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDE (SEQ ID NO:67)

NGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNSPMDE (SEQ ID NO:68)

NSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCN (SEQ ID NO:69)

NSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCK (SEQ ID NO:70)

DAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSEL (SEQ ID NO:71)

DAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSEV (SEQ ID NO:72)

DAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSEL (SEQ ID NO:73)

DAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSEL (SEQ ID NO:74)

DAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSEL (SEQ ID NO:75)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Следующие ссылки при условии, что они обеспечивают примерные методические или другие детали, дополнительные к изложенным в настоящем описании деталям, прямо включены в данное описание в целом путем ссылки на них.

Патент США № 7357936, озаглавленный “Adjuvant systems and vaccines.”

Патент США № 7223409, озаглавленный “DNA-based vaccine against the encephalitis alphaviruses.”

Патент США № 7090853, озаглавленный “Noscapine derivatives as adjuvant compositions and methods of use thereof.”

Патент США № 6793928, озаглавленный “Vaccines with an LTB adjuvant.”

Патент США № 6780421, озаглавленный “Adjuvant for a vaccine composition.”

Патент США № 6759241, озаглавленный “Adjuvant comprising a lipopolysaccharide antagonist.”

Патент США № 6713068, озаглавленный “Live recombined vaccines injected with adjuvant.”

Патент США № 6603998, озаглавленный “Delivery of macromolecules into cells.”

Патент США № 6572866, озаглавленный “Nerve growth factor as a vaccine adjuvant.”

Патент США № 6534065, озаглавленный “Influenza vaccine composition with chitosan adjuvant.”

Патент США № 6500432, озаглавленный “Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination.”

Патент США № 6451325, озаглавленный “Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion.”

Патент США № 6440423, озаглавленный “Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant.”

Патент США № 6306404, озаглавленный “Adjuvant and vaccine compositions containing monophosphoryl lipid A.”

Патент США № 6060068, озаглавленный “Human IL-2 as a vaccine adjuvant.”

Патент США № 6033673, озаглавленный “Double mutant enterotoxin for use as an adjuvant.”

Патент США № 5800810, озаглавленный “Human IL-2 as a vaccine adjuvant.”

Патент США № 5795582, озаглавленный “Adjuvant properties of poly(amidoamine) dendrimers.”

Патент США № 5785975, озаглавленный “Adjuvant compositions and vaccine formulations comprising same.”

Патент США № 5679356, озаглавленный “Use of GM-CSF as a vaccine adjuvant.”

Патент США № 5641515, озаглавленный “Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin.”

Патент США № 5543158, озаглавленный “Biodegradable injectable nanoparticles.”

Патент США № 5503841, озаглавленный “Human IL-2 as a vaccine adjuvant.”

Патент США № 5399363, озаглавленный “Surface modified anticancer nanoparticles.”

Патент США № 5186898, озаглавленный “Automated polypeptide synthesis apparatus.”

Патент США № 5182109, озаглавленный “Vaccine preparation comprising a bacterial toxin adjuvant.”

Патент США № 4816513, озаглавленный “Automated polypeptide synthesis process.”

Патент США № 4746490, озаглавленный “Solid phase peptide synthesizer.”

Патент США № 4668476, озаглавленный “Automated polypeptide synthesis apparatus.”

Патент США № 4608251, озаглавленный “LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues.”

Патент США № 4601903, озаглавленный “Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease.”

Патент США № 4599231, озаглавленный “Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants.”

Патент США № 4596792, озаглавленный “Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin.”

Патент США № 4474757, озаглавленный “Synthetic vaccine and process for producing same.”

Патент США № 4372945, озаглавленный “Antigen compounds.”

Патент США № 4356170, озаглавленный “Immunogenic polysaccharide-protein conjugates.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0181914, озаглавленная “Novel vaccine composition.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0181905, озаглавленная “Nanoemulsion vaccines.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0145373, озаглавленная “A-beta immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0118531, озаглавленная “Avian influenza viruses, vaccines, compositions, formulations, and methods.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0107687, озаглавленная “Feline vaccines against avian influenza.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0107665, озаглавленная “Extracellular matrix materials as vaccine adjuvants for diseases associated with infectious pathogens or toxins.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0075708, озаглавленная “Broad spectrum anti-viral therapeutics and prophylaxis.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0069821, озаглавленная “Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants.”

Публикация заявки на патент США № 2008/0032921, озаглавленная “Inducing immune responses to influenza virus using polypeptide and nucleic acid compositions.”

Публикация заявки на патент США № 2005/0169941, озаглавленная “Use of amino-oxy functional groups in the preparation of protein-polysaccharide conjugate vaccines.”

Публикация заявки на патент США № 2004/0223976, озаглавленная “Influenza virus vaccine.”

Публикация РСТ-заявки № WO95/08348.

Публикация РСТ-заявки № WO2003/53462.

Публикация РСТ-заявки № WO2004/43407.

Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990.

Conley et al., Vaccine 12:445-451, 1994.

Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360, 1987.

Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915, 1989.

Higgins and Sharp, Comput. Appl. Biosci., 5:151-153, 1989.

Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, 1993.

Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975.

Lou, M., Nature, 443:37-38, Sept. 2006.

Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970.

Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988.

Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981.

Tolman et al., Int. J. Pep. Prot. Res., 41:455-466, 1993.

Все композиции и способы, описанные и заявленные в настоящем описании, могут быть созданы и осуществлены без чрезмерного экспериментирования ввиду описания настоящего изобретения. Хотя композиции и способы этого изобретения были описаны относительно приводимых в качестве примеров вариантов осуществления, для средних специалистов в данной области техники будет несомненным, что можно внести изменения в композиции, способы и в стадии или в последовательность стадий способа, описанных в настоящем описании, без отхода от идеи, сущности и объема настоящего изобретения. Конкретнее, будет очевидным, что некоторыми агентами, которые являются как химически, так и физиологически родственными, можно использовать вместо описанных в настоящем описании агентов с достижением одинаковых или схожих результатов. Подразумевается, что все такие схожие замены и модификации, очевидные средним специалистам в данной области техники, находятся в пределах сущности, объема и идеи настоящего изобретения, определяемых прилагаемой формулой изобретения. Соответственно, исключительные права, которые желают получить путем патентования, являются теми, которые описаны в формуле изобретения, приведенной ниже.

Описаны иммуногенные пептиды, композиции и способы их применения для лечебно-профилактических целей и/или уменьшения интенсивности против инфекционного заболевания, вызванного вирусом гриппа, содержащие две аминокислотные последовательности, отличные друг от друга. Описан выделенный полинуклеотид, кодирующий иммуногенный пептид. Изобретение охватывает выделенное антитело, которое специфично по отношению к пептиду. Композиция по изобретению на основе иммуногенного пептида применяется для получения лекарственного средства или вакцины. Способы по изобретению касаются индукции иммунологической реакции против вируса гриппа, профилактики или контроля вспышки инфекции, вызываемой вирусом гриппа, в популяции млекопитающих, и индукции защитной иммунной реакции против вируса гриппа у млекопитающего. Изобретение обеспечивает эффективные композиции и улучшенную доставку терапевтических и/или профилактических средств млекопитающему. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 30 ил., 15 табл., 10 пр.

1. Пептид, который вызывает иммунный ответ против вируса гриппа у млекопитающего, содержащий:
первую аминокислотную последовательность, которая по существу, по крайней мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO:44; и
вторую аминокислотную последовательность, которая по существу, по крайней мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:44, где первая последовательность отличается от второй последовательности.

2. Пептид по п.1, в котором каждая из аминокислотных последовательностей, первая или вторая, по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:44.

3. Пептид по п.1, в котором первая аминокислотная последовательность специфична в отношении первого штамма или серотипа вируса гриппа, а вторая аминокислотная последовательность специфична в отношении второго, отличного от первого, штамма или серотипа вируса гриппа.

4. Пептид по п.1, дополнительно содержащий первую последовательность Т-клеточного эпитопа, которая содержит столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, полисахарид или липопротеин.

5. Выделенный полинуклеотид, который кодирует иммуногенный пептид по п.1.

6. Выделенный полинуклеотид по п.5, содержащийся внутри рекомбинантного экспрессионного вектора.

7. Выделенный полинуклеотид по п.6, где рекомбинантный вектор экспрессии представляет собой рекомбинантный вирус.

8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое образуется в результате иммунного ответа на пептид по п.1.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8, которое выбрано из группы, состоящей из антитела человека, химерного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела человека, гуманизированного антитела, антигенсвязывающего фрагмента гуманизированного антитела, химерного гуманизированного антитела, антигенсвязывающего фрагмента химерного гуманизированного антитела, антигенсвязывающего фрагмента химерного гуманизированного антитела, поликлональной сыворотки, моноклонального антитела, Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')₂-фрагмента и Fv-фрагмента.

10. Фармацевтическая композиция, содержащая
(а) активный иммуногенный компонент, содержащий:
(i) иммуногенный пептид по любому из пп.1-4;
(ii) выделенный полинуклеотид по любому из пп.5-7; или
(iii) выделенное антитело по п.8 или 9, или любую их комбинацию; и
(b) буфер, разбавитель или носитель.

11. Композиция по п.10, составленная для введения млекопитающему.

12. Применение композиции по п.10 для получения лекарственного средства или вакцины для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов вирусной инфекции у млекопитающего и, предпочтительно, человека.

13. Способ индукции иммунологической реакции против вируса гриппа у млекопитающего, предусматривающий введение композиции по п.10 в количестве, эффективном для индукции иммунологической реакции.

14. Способ профилактики или контроля вспышки инфекции, вызываемой вирусом гриппа, в выбранной популяции млекопитающих, предусматривающий введение чувствительному или подверженному риску представителю популяции композиции, которая содержит иммуногенный пептид по п.1 в количестве, эффективном для профилактики или контроля вспышки инфекции, вызываемой вирусом гриппа, у представителя популяции.

15. Способ индукции защитной иммунной реакции против вируса гриппа у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему композиции, которая содержит пептид по п.1 в количестве, эффективном для индукции защитной иммунной реакции против вируса гриппа у млекопитающего.