ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ГРИППА НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 A61K39/295 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Данная заявка испрашивает приоритет в соответствии с 35 USC. §119 (e) по предварительной заявке на патент США № 62/644 623, поданной 19 марта 2018 г.; и предварительной заявке на патент США № 62/787980, поданной 3 января 2019 г., содержание каждой из которых полностью включено в данный документ посредством ссылки для всех целей.

[002] Заявка также включает в себя посредством ссылки содержание заявки США № 15/257436, поданной 6 сентября 2016 г.; и заявки США № 15/819962, поданной 21 ноября 2017 г., во всей их полноте для всех целей.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[003] Данное описание в целом относится к композициям вакцин против гриппа, применимым для стимуляции иммунных ответов против гриппа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Существенное глобальное бремя сезонного гриппа детально задокументировано. Только в США ежегодно от 140000 до 10000 госпитализаций и от 12000 до 56000 смертей связаны с гриппом ежегодно, причем на пожилых людей приходится непропорционально 62% госпитализаций и 72% смертности. Вакцинация против сезонного гриппа является основой усилий по профилактике и повсеместно рекомендована в США с 2010 года.

[005] Однако последние события, включая сезон тяжелого гриппа A (H3N2), преобладающий в США в 2017-2018 годах, свидетельствуют о низкой эффективности вакцин по меньшей мере в Австралии, Канаде и США. Другие проблемы, такие как антигенное несоответствие, связанное с вакцинами против гриппа на основе яиц, и постоянная проблема антигенного дрейфа, также представляют собой необходимость разработки более эффективных стратегий вакцинации.

[006] Следовательно, сохраняется интерес к производству вакцин против вирусов гриппа, и сохраняется постоянная потребность в производстве эффективных вакцин, особенно с использованием подходов без применения рекомбинантных яичных белков.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[007] В данном описании предложены поливалентные композиции против гриппа. Композиции стимулируют иммунные ответы против множества штаммов гриппа. Преимущественно иммунные ответы могут включать нейтрализующие антитела в широком смысле, направленные против вариантов штаммов, отличных от тех, которые используются для получения композиций. Мутации гриппа приводят к «дрейфующим штаммам», а описанные композиции обеспечивают защиту от «дрейфующих штаммов». Кроме того, композиции демонстрируют превосходную стабильность и могут храниться в течение продолжительных периодов времени и могут быть изготовлены в предварительно заполненных шприцах, готовых к введению. В некоторых аспектах предварительно заполненный шприц (ПЗШ) может уже содержать адъювант и антиген гриппа, и может храниться в течение продолжительных периодов. Композиции, описанные в данном документе, не нуждаются в охлаждении (2-8^oC), демонстрируя хорошую стабильность при более высоких температурах (например, при комнатной температуре, около 25^oC). Таким образом, описанные в данном документе композиции обеспечивают превосходное удобство, а также превосходные иммунные ответы.

[008] В конкретных аспектах наночастицы, содержащие антигены гриппа, вводят в состав композиций вакцин путем смешивания с адъювантом Матрица ИСКОМ (иммуностимулирующего комплекса) (также называемым в данном документе «Матрица») в течение некоторого времени с образованием HaSMaN (наночастицы на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином) перед введением субъекту. Композиции, содержащие HaSMaN, демонстрируют хорошую стабильность и иммуногенность и, таким образом, хорошо подходят для упаковки, например, в предварительно заполненных шприцах. Действительно, HaSMaN более стабильны, чем наночастицы с детергентным ядром. Термическая стабильность, измеренная с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, была лучше примерно на 1 градус для HaSMaN по сравнению с наночастицами с детергентным ядром. Ранее подходы к применению адъюванта Матрица ИСКОМ включали комбинирование композиции вакцины с адъювантом у постели больного непосредственно перед введением. В конкретных аспектах описанные в данном документе композиции исключают это требование, обеспечивая тем самым улучшенные способы индукции иммунных ответов. Неожиданно было обнаружено, что формирование HaSMaN варьируется в зависимости от типа гриппа. HaSMaN, как правило, образуются, когда композиции содержат белки гемагглютинина (HA) из штаммов гриппа типа A, но не образуются, когда белки HA получены из штаммов гриппа типа B.

[009] В некоторых вариантах осуществления адъювант Матрица ИСКОМ в поливалентной композиции против гриппа представляет собой Матрицу M, комбинацию двух типов Матриц, первого типа, Матрицы A, содержащей сапониновую фракцию A (также называемую в данном документе как Матрица с фракцией A), и второго типа, Матрицы C, содержащей сапониновую фракцию C (также называемую в данном документе как Матрица с фракцией C). В некоторых аспектах Матрица M может содержать по меньшей мере около 85% (мас./мас.) Матрицы с фракцией A, а остальная часть представляет собой Матрицу с фракцией C. Если не указано иное, Матрица M, используемая в данном документе, содержит Матрицу с фракцией A и Матрицу с фракцией C в соотношении 85:15 (мас./мас.), также называемую в данном документе как Матрица M1.

[010] В некоторых вариантах осуществления каждый белок НА гриппа в поливалентной композиции против гриппа на основе наночастиц может быть получен из другого штамма гриппа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один штамм может представлять собой штамм подтипа A или штамм подтипа B. В некоторых вариантах осуществления штамм подтипа A может образовывать комплекс с адъювантом Матрица M, но штаммы подтипа B - нет.

[011] Хотя в данном описании предусмотрены поливалентные композиции, особенно для применения в сезонных вакцинах, моновалентные композиции вакцин также могут быть получены с HaSMaN для применения, например, для вакцинации против штаммов пандемического гриппа, которые возникают время от времени.

[012] Стабильность, особенно стабильность при комнатной температуре, является ценным свойством, поскольку она снижает или устраняет необходимость в хранении в холодовой цепи, что делает распространение более дешевым и более простым. Преимущественно поливалентные композиции, описанные в данном документе, стабильны в течение продолжительных периодов времени, например, до 3 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, и при комнатной температуре (т.е. около 25°C) в течение этих периодов. Превосходная стабильность, особенно при объединении в процессе получения состава с адъювантом Матрица M, означает, что композиции вакцин подходят для доставки в клинические условия в формате, готовом к введению; например, составы в предварительно заполненных шприцах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[013] На Фиг. 1 показаны примеры изображений просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) одних наночастиц на основе детергентного ядра и HA гриппа (слева), одной Матрицы M (в центре) и комбинации наночастиц с HA и Матрицей M, которая образует наночастицы на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином (HaSMaN) (справа).

[014] На Фиг. 2 показаны изображения восстановленного ДСН-ПААГ геля для антигенов гриппа в высокодозных и низкодозных свежеприготовленных четырехвалентных составах во флаконах (240 мкг/мл/штамм и 60 мкг/мл/штамм); и составах в предварительно заполненных шприцах (ПЗШ) (120 мкг/мл/штамм и 30 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M при 4°C через T = 0, 6 месяцев и 12 месяцев. Сокращения на фигуре: ПЗШ: предварительно заполненные шприцы; M1: Матрица M.

[015] На Фиг. 3 показаны изображения невосстановленного и восстановленного ДСН-ПААГ геля для антигенов гриппа в высокодозных свежеприготовленных составах во флаконах (240 мкг/мл/штамм); и составах ПЗШ (120 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M при 4°C в момент времени = 0.

[016] На Фиг.4 показаны изображения невосстановленного ДСН-ПААГ геля для антигенов гриппа высокодозных и низкодозных свежеприготовленных составов во флаконах (240 мкг/мл/штамм и 60 мкг/мл/штамм); и составах ПЗШ (120 мкг/мл/штамм и 30 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M при 4°C и 25°C через 3 месяца.

[017] На Фиг. 5 показаны результаты реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) штаммов A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane, и B/Phuket для составов ПЗШ с дозой 120 мкг/мл/штамм с или без Матрицы M при 2-8°C через Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев. Сокращения на фигуре: MXM: Матрица M; HK: Hong Kong; MI: Michigan; Bris: Brisbane; Phu: Phuket.

[018] На Фиг. 6 показаны результаты ОРИД для штаммов A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane, и B/Phuket для составов ПЗШ с дозой 120 мкг/мл/штамм с или без Матрицы M при 25°C через Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, и 6 месяцев.

[019] На Фиг. 7 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа A/Hong Kong/4801/2014. Образование антител представлено в виде титров HAI. Сокращения на фигуре: HAI: ингибирование гемагглютинации; НА: гемагглютинин; Совм. сост.: совместные составы; Quad-NIV: четырехвалентная вакцина против гриппа на основе наночастиц; QIV: четырехвалентная вакцина против гриппа.

[020] На Фиг. 8 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против A/Michigan/45/2015 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа.

[021] На Фиг. 9 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против B/Brisbane/60/2008 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа.

[022] На Фиг. 10 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против B/Phuket/3073/2013 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы М, по сравнению с коммерческими вакцинами против гриппа.

[023] На Фиг. 11 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител у мышей, которым вводили составы предварительно приготовленных смесей Quad-NIV или свежеприготовленных смесей с Матрицей M против A/Hong Kong/4801/2014, A/Michigan/45/2015, B/Brisbane/60/2008, и B/Phuket/3073/2013. Составы ПЗШ хранили при 4°C в течение 3 месяцев. В случае свежеприготовленных вакцин вирусный антиген хранился при -60°C в течение 3 месяцев и смешивался с адъювантом Матрица M непосредственно перед введением. Ответ антител был представлен в виде СГТ титров HAI. Для результатов СГТ использовали 95% нижний контрольный предел и 95% верхний контрольный предел. Сокращения на фигуре: HAI: ингибирование гемагглютинации; НА: гемагглютинин; СГТ: среднее геометрическое титра; НКП: нижний контрольный предел; ВКП: верхний контрольный предел.

[024] На Фиг. 12 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[025] На Фиг. 13 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[026] На Фиг. 14 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong/4801/2014 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[027] На Фиг. 15 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[028] На Фиг. 16 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[029] На Фиг. 17 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[030] На Фиг. 18 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[031] На Фиг. 19 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при указанных температурах в течение 6 месяцев.

[032] На Фиг. 20 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong/4801/2014 у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[033] На Фиг. 21 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Hong Kong у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[034] На Фиг. 22 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[035] На Фиг. 23 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов A/Michigan у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[036] На Фиг. 24 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[037] На Фиг. 25 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Brisbane у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[038] На Фиг. 26 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 21-е сутки. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[039] На Фиг. 27 показано образование ингибирующих гемагглютинацию антител против штаммов B/Phuket у мышей, которым вводили совместные составы Quad-NIV; или составы свежеприготовленных смесей с или без Матрицы M (100 мкг/мл) на 35-е сутки. Образование антител представляли в виде титров HAI. Предварительно приготовленные совместные составы Quad-NIV хранили при 4°C в течение 12 месяцев.

[040] На Фиг. 28 показаны профили седиментации AUC составов ПЗШ Quad-NIV (120 мкг/мл) через Т = 0, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев или 12 месяцев при 4°C и составов Quad-NIV ПЗШ с 100 мкг/мл Матрицы M1 через T = 3 месяца, 6 месяцев 9 месяцев или 12 месяцев при 4°C.

[041] На Фиг. 29 показаны профили седиментации при аналитическом центрифугировании (AUC) составов Quad-NIV ПЗШ с или без Матрицы M1 (100 мкг/мл) в начале исследования (T0), через 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Составы инкубировали при 25°C.

[042] На Фиг. 30 показаны ПЭМ-изображения только высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм), только Матрицы M (100 мкг/мл), высокодозной Quad-NIV + Матрица M и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) без инкубации (T = 0).

[043] На Фиг. 31 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали 4 часа.

[044] На Фиг. 32 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали в течение 24 часов. Иллюстративные HaSMaN обведены кружком.

[045] На Фиг. 33 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали 48 часа. Иллюстративные HaSMaN обведены кружком.

[046] На Фиг. 34 показаны ПЭМ-изображения высокодозной Quad-NIV (120 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C и низкодозной Quad-NIV (30 мкг/мл/штамм) + Матрица M (100 мкг/мл) при 4°C или 25°C. Все образцы инкубировали в течение 7 суток. Иллюстративные HaSMaN обведены кружком.

[047] На Фиг. 35 показаны ПЭМ-изображения для групп ПЗШ с низкой дозой (30 мкг/мл/штамм) с или без Матрицы M (100 мкг/мл), инкубированных в течение 1 месяца при различных температурах (2-8°C, 25°C и 37°C).

[048] На Фиг. 36 показаны профили ДСК Quad-NIV в составах с дозой 120 мкг/мл/штамм с или без Матрицы M1 (100 мкг/мл). Показаны молярные теплоемкости (Cp: кДж/моль*K) антигенов четырехвалентной вакцины при 4°C, инкубированных в течение 3 месяцев, 6 месяцев и 12 месяцев и при 25°C в течение 3 месяцев и 6 месяцев.

[049] На Фиг. 37 показано образование HaSMaN, измеренное по уменьшению в nHA (т.е. наночастиц с детергентным ядром) с белками HA из штаммов A, штамма B и штамма A с модифицированным С-концом, слитым с фолдоном.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[050] Использование в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения форм единственного числа включает ссылку на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «белок» может относиться к одному белку или к смесям такого белка, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и/или способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее.

[051] В контексте данного документа термин «адъювант» относится к соединению, которое при использовании в комбинации с иммуногеном усиливает или иным образом изменяет или модифицирует иммунный ответ, индуцированный против иммуногена. Модификация иммунного ответа может включать усиление или увеличение специфичности антител и/или клеточного иммунного ответа.

[052] В контексте данного документа термин «около» или «приблизительно», предшествующие числовому значению, указывают на это значение плюс или минус диапазон в 10%. Например, «около 100» включает 90 и 110.

[053] В контексте данного документа термины «иммуноген», «антиген» и «эпитоп» относятся к таким веществам, как белки, включая гликопротеины, и пептиды, которые способны вызывать иммунный ответ.

[054] В контексте данного документа термин «иммуногенная композиция» представляет собой композицию, которая содержит антиген, причем введение композиции субъекту приводит к развитию у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на антиген.

[055] В контексте данного документа термины «Quad-NIV», «QuadNIV» или «четырехвалентная вакцина против гриппа на основе наночастиц» относятся к составам вакцин против гриппа, содержащим антигены из четырех штаммов вируса гриппа.

[056] В контексте данного документа термины «свежеприготовленная смесь», «свежеприготовленные составы», «свежеприготовленные композиции вакцины», «флаконы со свежеприготовленной смесью», «свежеприготовленные составы во флаконах» относятся к составам вакцины, которые готовятся непосредственно перед введением. Такие составы вакцин содержат вирусные антигены и адъюванты, которые хранятся отдельно в разных контейнерах и вводятся субъекту (например, или путем двух последовательных инъекций, или путем объединения антигенов и адъювантов в одну инъекцию перед введением).

[057] В контексте данного документа термины «смесь для совместного составления», «совместный состав», «композиции вакцин для совместного составления», «предварительно заполненные шприцы», «предварительно приготовленная смесь» относятся к составам вакцин, которые готовят для кратковременного или длительного хранения до момента введения субъекту. Такие композиции вакцин содержат комбинацию антигенов гриппа и адъювант Матрица ИСКОМ в одном и том же контейнере и приготовлены в условиях, достаточных для образования HaSMaN (наночастиц на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином).

[058] В контексте данного документа термины «лечить», «лечение» и «процесс лечения» относятся к подходу к получению полезных или желаемых результатов, например, клинических результатов. Для целей данного описания полезные или желаемые результаты могут включать ингибирование или подавление инициации или прогрессирования инфекции или заболевания; облегчение или уменьшение развития симптомов инфекции или заболевания; или их комбинацию.

[059] «Предотвращение» в данном контексте используется взаимозаменяемо с «профилактикой» и может означать полное предотвращение инфекции или заболевания, или предотвращение развития симптомов этой инфекции или заболевания; задержку начала инфекции или заболевания или их симптомов; или снижение тяжести впоследствии развившейся инфекции или заболевания или их симптомов.

[060] В контексте данного документа «эффективная доза» или «эффективное количество» относится к количеству иммуногена, достаточному для индукции иммунного ответа, который уменьшает по меньшей мере один симптом инфекции, вызванной патогеном. Эффективная доза или эффективное количество могут быть определены, например, при помощи измерения количества нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, посредством нейтрализации бляшек, фиксации комплемента, иммуноферментного анализа (ИФА), анализа микронейтрализации и титров HAI.

[061] В контексте данного документа термин «вакцина» относится к иммуногенной композиции, такой как иммуноген, полученный из патогена, который используется для индукции иммунного ответа против патогена, который обеспечивает защитный иммунитет (например, иммунитет, который защищает субъекта от инфекции, вызванной возбудителем, и/или снижает тяжесть заболевания или патологического состояния, вызванного инфицированием патогеном). Защитный иммунный ответ может включать образование антител и/или опосредованный клетками ответ. В зависимости от контекста термин «вакцина» может также относиться к суспензии или раствору иммуногена, которые вводят субъекту для выработки защитного иммунитета.

[062] В контексте данного документа термин «субъект» включает людей и других животных. Как правило, субъект представляет собой человека. Например, субъектом может быть взрослый, подросток, ребенок (от 2 лет до 14 лет), младенец (от 1 месяца до 24 месяцев) или новорожденный (до 1 месяца). В некоторых аспектах взрослыми являются пожилые люди около 65 лет и старше или около 60 лет и старше. В типичных аспектах возраст взрослых составляет от около 60 до около 75 лет или по меньшей мере около 75 лет. В некоторых аспектах субъект представляет собой беременную женщину или женщину, намеревающуюся забеременеть. В других аспектах субъект не представляет собой человека, например, представляет собой примата, не являющегося человеком; например, павиана, шимпанзе, гориллу или макака. В определенных аспектах субъект может представлять собой домашнее животное, такое как собака или кошка.

[063] В контексте данного документе термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобренный регуляторным ведомством Федерального правительства или правительства штата США, или другой общепризнанный Фармакопеей США, Европейской фармакопеей или другой общепризнанный фармакопеей для применения у млекопитающих и, в частности, у людей. Эти композиции могут быть использованы в качестве вакцин и/или антигенных композиций для индукции защитного иммунного ответа у позвоночных.

Наночастицы: структура и морфология

[064] Описанные в данном документе композиции содержат два типа наночастиц. Первый тип, называемый наночастицами с детергентным ядром, в основном соответствует описанному ранее. См. регистрационный номер США 15/257436, который для всех целей включен в данный документ посредством ссылки. Вкратце, эти наночастицы продуцируются в клетках насекомых путем экспрессии белков НА с использованием систем экспрессии бакуловирусов и затем экстракции белков НА с помощью детергента. Во время очистки первый детергент заменяется вторым детергентом, как правило, неионным детергентом, что приводит к образованию наночастиц, имеющих ядро из неионогенного детергента, в которое заключена концевая часть белка НА, в форме тримеров. На Фиг. 1 (левая панель) показаны эти структуры, наблюдаемые при помощи электронного микроскопа.

[065] Второй тип наночастиц упоминается в данном документе как HaSMaN (наночастица на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином). На Фиг. 1 (правая панель) показаны эти структуры, наблюдаемые при помощи электронного микроскопа. Гликопротеины HA декорируют структуры, похожие на клетки матрицы. Структуры HaSMaN формируются путем приготовления наночастиц HA и затем их инкубирования с частицами адъюванта Матрица ИСКОМ в течение определенного периода времени. Частицы Матрицы ИСКОМ показаны на центральной панели Фиг.1. Примечательно, что HaSMaN легко образуются с белками HA вируса гриппа типа A, но не с белками HA вируса гриппа типа B. Соответственно, в конкретных аспектах композиции, содержащие наночастицы, содержащие белки HA из вируса типа A и типа B, будут содержать оба типа наночастиц (т.е. наночастицы с детергентным ядром и HaSMaN). В некоторых аспектах наночастицы будут переходить между двумя состояниями, и, таким образом, композиции могут содержать переходные наночастицы.

[066] В конкретных вариантах осуществления наночастицы с детергентным ядром состоят из множества тримеров белка, окружающих ядро из неионного детергента. Например, каждая наночастица может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 15 тримеров. В некоторых вариантах осуществления каждая наночастица содержит от 2 до 6 тримеров. В конкретных вариантах осуществления каждая наночастица содержит от 2 до 9 тримеров.

[067] Белки НА связаны с ядром наночастицы, содержащим неионные детергенты. Как правило, детергент выбран из полисорбата-20 (PS20), полисорбата-40 (PS40), полисорбата-60 (PS60), полисорбата-65 (PS65) и полисорбата-80 (PS80). Присутствие детергента облегчает образование наночастиц за счет формирования ядра, которое организует и презентует антигены. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления наночастицы содержат антигены, собранные в мультиолигомерные наночастицы гликопротеин-PS80-белок-детергент с выступающими наружу областями головок и гидрофобными областями, и детергент PS80, образующий центральное ядро, окруженное антигенами. В конкретных вариантах осуществления неионный детергент в композициях вакцин против гриппа представляет собой PS80. Z-средний размер наночастиц с детергентным ядром составляет от около 25 нм до около 30 нм. Однако после того как наночастицы с детергентным ядром объединяются с Матрицей M в течение некоторого времени, образуются HaSMaN, и они с размером от около 50 до 60 нм немного больше, чем наночастицы с детергентным ядром. Размер частиц (Z-средний размер) измеряют методом динамического рассеяния света (DLS) с использованием Malvern Zetasizer, если не указано иное.

Наночастицы: Получение

[068] Наночастицы с детергентным ядром и HaSMaN согласно данному изобретению представляют собой продукты неприродного происхождения, компоненты которых не встречаются вместе в природе. Как правило, в описанных в данном документе способах используется подход с заменой детергента, при котором первый детергент используется для выделения белка, а затем этот первый детергент заменяется вторым детергентом с образованием наночастиц.

[069] Гликопротеиновые антигены, как правило, НА, в наночастицах, как правило, продуцируются при помощи рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах. Как правило, гликопротеины экспрессируются в клетках-хозяевах насекомых с использованием бакуловирусной системы. В предпочтительных вариантах осуществления бакуловирус представляет собой бакуловирус с нокаутом по катепсину-L. В других предпочтительных вариантах осуществления бакуловирус представляет собой бакуловирус с нокаутом по хитиназе. В еще других предпочтительных вариантах осуществления бакуловирус представляет собой бакуловирус с двойным нокаутом как по катепсину-L, так и по хитиназе. Высокий уровень экспрессии может быть получен в системах экспрессии клеток насекомых. Неограничивающими примерами клеток насекомых являются клетки Spodoptera frugiperda (Sf), например, Sf9, Sf21, клетки Trichoplusia ni , например, клетки «High Five», и клетки Drosophila S2. Предпочтительно клетки представляют собой клетки Sf9 или их производные.

[070] Для культивирования клеток можно использовать типичные методы трансфекции и роста клеток. Векторы, например, векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие слитые белки, можно трансфицировать в клетки-хозяева в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Например, введение нуклеиновых кислот в эукариотические клетки может быть достигнуто путем совместного осаждения фосфатом кальция, электропорации, микроинъекции, липофекции и трансфекции с использованием реагентов на основе полиаминов для трансфекции.

[071] Способы выращивания клеток-хозяев включают, но не ограничиваются ими, способы периодического, периодического с подпиткой, непрерывного и перфузионного культивирования клеток. Под культивированием клеток подразумевают рост и размножение клеток в биореакторе (камере ферментации), где клетки размножаются и экспрессируют белок (например, рекомбинантные белки) для очистки и выделения. Как правило, культивирование клеток проводят в стерильных, контролируемых температурных и атмосферных условиях в биореакторе. Биореактор представляет собой камеру, используемую для культивирования клеток, в которой можно контролировать такие условия окружающей среды, как температура, атмосфера, перемешивание и/или pH. В одном варианте осуществления биореактор представляет собой камеру из нержавеющей стали. В другом варианте осуществления биореактор представляет собой предварительно стерилизованный пластиковый мешок (например, Cellbag®, Wave Biotech, Бриджуотер, штат Нью-Джерси). В другом варианте осуществления предварительно стерилизованные пластиковые пакеты представляют собой пакеты от около 50 л до 3500 л.

Экстракция детергентами и очистка наночастиц

[072] После роста клеток-хозяев белок может быть выделен из клеток-хозяев с использованием детергентов и протоколов очистки. После того как клетки-хозяева выросли в течение 48-96 часов, клетки выделяют из среды и добавляют раствор, содержащий детергент, для растворения клеточной мембраны, высвобождая белок в детергентный экстракт. Тритон X-100 и тергитол, также известный как NP-9, представляют собой предпочтительные детергенты для экстракции. Детергент можно добавлять до конечной концентрации от около 0,1% до около 1,0%. Например, концентрация может составлять около 0,1%, около 0,2%, около 0,3%, около 0,5%, около 0,7%, около 0,8% или около 1,0%. В некоторых вариантах осуществления диапазон может составлять от около 0,1% до около 0,3%. Предпочтительно концентрация составляет около 0,5%.

[073] В других аспектах для выделения белка из клетки-хозяина можно использовать разные первые детергенты. Например, первым детергентом может быть бис(полиэтиленгликоль бис[имидазоилкарбонил]), ноноксинол-9, бис(полиэтиленгликоль бис[имидазоилкарбонил]), Brij® 35, Brij®56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij ® 58P, Cremophor® EL, монододециловый эфир декаэтиленгликоля, N-деканоил-N-метилглюкамин, н-децил-альфа-D-глюкопиранозид, децил-бета-D-мальтопиранозид, н-додеканоил-N-метилглюкамид, н-додецил-альфа-D-мальтозид, н-додецил-бета-D-мальтозид, н-додецил бета-D-мальтозид, монодециловый эфир гептаэтиленгликоля, монододециловый эфир гептаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гептаэтиленгликоля, н-гексадецил бета-D-мальтозид, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир гексаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гексаэтиленгликоля, Igepal CA-630, Igepal CA-630, метил-6-0-(N-гептилкарбамоил) -альфа-D-глюкопиранозид, монододециловый эфир нонаэтиленгликоля, N-нонаноил-N-метилглюкамин, N-нонаноил-N-метилглюкамин, монодециловый эфир октаэтиленгликоля, монододециловый эфир октаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир октаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир октаэтиленгликоля-бета-монооктадецилгликоля, монооктадециловый эфир октаэтиленгликоля, монодециловый эфир пентаэтиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексиловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктиловый эфир пентаэтиленгликоля, диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля, простой эфир полиэтиленгликоля W-1, тридециловый эфир полиоксиэтилена 10, полиоксиэтилен стеарат 100, изогексадециловый эфир полиоксиэтилена 20, олеиловый эфир полиоксиэтилена 20, полиоксиэтилен 40 стеарат, полиоксиэтилен 50 стеарат, полиоксиэтилен 8 стеарат, полиоксиэтилен бис(имидазолилкарбонил), полиоксиэтилен 25 пропиленгликоль стеарат, сапонин из коры Quillaja, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, тергитол типа 15-S-12, тергитол типа 15-S-30 , тергитол типа 15-S-5, тергитол типа 15-S-7, тергитол типа 15-S-9, тергитол типа NP-10, тергитол типа NP-4, тергитол типа NP-40, тергитол типа NP-7, тергитол типа NP-9, тергитол типа TMN-10, тергитол типа TMN-6, Тритон X-100 или их комбинации.

[074] Затем наночастицы можно выделить из клеточного дебриса с помощью центрифугирования. В некоторых вариантах осуществления можно использовать градиентное центрифугирование, например, с использованием хлорида цезия, сахарозы и йодиксанола. В качестве альтернативы или в дополнение могут использоваться другие методы, такие как стандартные методы очистки, включая, например, ионообменную, аффинную и гель-фильтрационную хроматографию.

[075] Например, первая колонка может быть смолой для ионообменной хроматографии, такой как Fractogel® EMD TMAE (EMD Millipore), вторая колонка может быть чечевичной (Lens culinaris) лектиновой аффинной смолой, а третья колонка может быть катионообменной колонкой, например, смолой Fractogel® EMD SO3 (EMD Millipore). В других аспектах катионообменная колонка может быть колонкой MMC или колонкой Nuvia C Prime (Bio-Rad Laboratories, Inc.). В описанных в данном документе способах предпочтительно не использовать колонку экстракции детергентом; например, колонку гидрофобного взаимодействия. Такая колонка часто используется для удаления детергентов во время очистки, но может отрицательно повлиять на описанные в данном документе способы.

Замена детергентов

[076] Для образования наночастиц с детергентным ядром, первый детергент, используемый для экстракции белка из клетки-хозяина, по существу заменяется вторым детергентом для получения структуры наночастиц. NP-9 представляет собой предпочтительный детергент для экстракции. Как правило, наночастицы не содержат детектируемого NP-9 при измерении с помощью ВЭЖХ. Второй детергент, как правило, выбран из группы, состоящей из PS20, PS40, PS60, PS65 и PS80. Предпочтительно второй детергент представляет собой PS80.

[077] В конкретных аспектах замену детергента проводят с использованием аффинной хроматографии для связывания гликопротеинов через их углеводный фрагмент. Например, для аффинной хроматографии можно использовать колонку с лектинами бобовых. Лектины бобовых представляют собой белки, изначально идентифицированные в растениях и, как было обнаружено, специфично и обратимо взаимодействуют с углеводными остатками. См., например, Sharon and Lis, «Legume lectins--a large family of homologous proteins», FASEB J. 1990 Nov;4(14):3198-208; Liener, «The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine», Elsevier, 2012. Подходящие лектины включают конканавалин A (con A), лектин гороха, лектин эспарцета и лектин чечевицы. Лектин чечевицы представляет собой предпочтительную колонку для замены детергентов из-за его связывающих свойств. Колонки с лектином коммерчески доступны; например, Capto Lentil Lectin доступен от GE Healthcare. В некоторых аспектах в колонке с лектином чечевицы может использоваться рекомбинантный лектин. На молекулярном уровне считается, что углеводные фрагменты связываются с лектином чечевицы, освобождая аминокислоты белка для слияния вокруг детергента, что приводит к образованию детергентного ядра, обеспечивающего наночастицы, имеющие множественные копии антигена, например, олигомеры гликопротеина, которые могут представлять собой димеры, тримеры или тетрамеры, закрепленные в детергенте.

[078] Детергент, инкубируемый с белком для образования наночастиц во время замены детергента, может присутствовать в количестве до около 0,1% (мас./об.) на ранних стадиях очистки.

[079] Как правило, наночастицы с детергентным ядром против гриппа готовят индивидуально в виде одновалентного продукта одного штамма. Например, неионный детергент (например, PS80) может составлять от около 0,03% до около 0,5%. В конкретном аспекте одновалентная лекарственная субстанция может содержать около 1,5 мг/мл белка, измеренного с помощью A280, и около 0,12% PS80, обеспечивая молярное соотношение около 40:1. В конкретных четырехвалентных композициях концентрация белка может составлять около 0,48 мг/мл, как измерено с помощью реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), а расчетное количество PS80 составляет около 0,04%.

[080] Замена детергента может выполняться с белками, очищенными, как описано выше, и очищенными, замороженными для хранения, а затем размороженными для замены детергента.

Образование HaSMaN

[081] Описанные в данном документе HaSMaN получают путем инкубации наночастиц с детергентным ядром и адъюванта Матрица ИСКОМ, содержащим сапониновую фракцию, холестерин и фосфолипид.

[082] Как правило, для образования требуется от 24 до 48 часов инкубации при 4^oC или 25^oC. Образованию HaSMaN способствует более высокие температуры. См., например, Фиг. 33 и 35. Таким образом, в конкретных аспектах, образование HaSMaN происходит при инкубации в течение по меньшей мере 24 часов при температуре около 25^oC. Смешивание наночастиц с детергентным ядром и адъюванта Матрица ИСКОМ незадолго до введения субъекту, т.е. смешивание у постели больного, не приводит к образованию HaSMaN. Более длительные периоды инкубации не оказывают отрицательного воздействия на образование HaSMaN.

Белки HA гриппа для наночастиц

[083] Гликопротеины НА, используемые в качестве антигенов гриппа, могут происходить из любого штамма вируса гриппа. Вирусы человеческого гриппа типа A и типа B вызывают сезонные эпидемии болезней почти каждую зиму в Соединенных Штатах. Вирусы гриппа типа A делятся на подтипы на основе двух белков на поверхности вируса: гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA).

[084] Белок HA может быть выбран из подтипов H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 и H18. Филогенетически грипп делится на группы. Для HA группа 1 содержит H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 и H18, а группа 2 содержит H3, H4, H7, H10, H14 и H15.

[085] В некоторых аспектах наночастицы на основе вируса гриппа представляют собой устойчивые к трипсину наночастицы, полученные с использованием очистки при нейтральном pH. Устойчивость к трипсину достигается за счет диапазона нейтрального pH от 6,9 до 8,5 во время очистки и получения наночастиц на основе HA. Устойчивые к трипсину гликопротеины гриппа, и наночастицы на основе вируса гриппа, устойчивые к трипсину; и способы их изготовления подробно описаны в заявке США № 15/819962, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Модифицированные антигены

[086] Как правило, антиген представляет собой полноразмерную последовательность дикого типа, однако антиген может быть вариацией или мутантом антигена дикого типа. В некоторых аспектах антиген может быть идентичен описанному антигену; например, процентная идентичность может составлять по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98%. Идентичность в процентах можно рассчитать с помощью программы выравнивания ClustalW2, доступной на www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. Для попарного выравнивания могут использоваться следующие параметры по умолчанию: матрица сравнения аминокислот = Gonnet; Открытие гэпа= 10; Продление гэпа = 0,1.

[087] Могут использоваться другие варианты. НА представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из ~550 аминокислотных остатков. Каждый мономер HA согласно принятому представлению разделен на три домена: эктодомен из ~515 остатков составляет экстравирусную часть молекулы; единственный участок из 27 остатков определяет трансмембранный (TM) домен; и ~10 остатков составляют цитоплазматический хвост (CT). Хотя некоторые изменения могут быть внесены в антигены, для образования как наночастиц с детергентным ядром, так и HaSMaN требуется интактный трансмембранный домен (TM). Таким образом, в конкретных примерах, модифицированная последовательность белка НА имеет 100% идентичность (т.е. является диким типом) по отношению к доменам TM и CT с некоторой вариативностью в оставшейся части эктодомена, где идентичность может составлять по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. Домены могут быть идентифицированы по гомологии с аминокислотными последовательностями доменов TM и CT HA Japan/305/57, приведенными на Фиг. 1 Melikyan et al. (Mol Biol Cell. 1999 Jun; 10(6): 1821–1836), хотя следует отметить, что границы между эктодоменом, доменами TM и CT могут варьироваться от белка HA к белку HA максимум на три аминокислоты.

Стабильность вакцины

[088] Преимущественно, описанные составы вакцины на основе наночастиц против гриппа являются стабильными и пригодными для длительного хранения. Составы, предложенные в данном документе, могут быть особенно подходящими для стратегий совместного приготовления (то есть когда антигены и адъювант Матрица комбинируются задолго до введения; например, в предварительно заполненном шприце). Как описано в данном документе, стратегии совместного составления вакцин против гриппа могут обеспечить преимущества для клинической практики и могут быть экономически эффективной альтернативой используемым в настоящее время свежеприготовленным составам.

[089] В некоторых вариантах осуществления антигены гриппа в комбинированных композициях вакцин стабильны, когда композиции хранятся до 12 месяцев. Хотя композиции вакцин можно хранить при 2-8°C, они демонстрируют отличную стабильность при 25°C.

[090] Стабильность предварительно приготовленных (совместно составленных) составов можно оценить способами и протоколами, известными в данной области техники. Стабильность можно измерить по уровням деградации антигенов вакцины и по иммуногенности вакцин. Стабильность можно исследовать путем оценки термостабильности вирусных антигенов в вакцинах.

[091] Стабильность составов вакцин при комнатной температуре (25°C) в течение длительного периода времени является преимуществом для эффективных с точки зрения затрат стратегий вакцинации, особенно в регионах, где распространение и хранение в холодовой цепи может быть ограничено. Как указано в рекомендациях ВОЗ по оценке стабильности вакцин, контролируемая температурная цепочка во время производства, распространения и хранения важна для обеспечения эффективности вакцин («Руководство по оценке стабильности вакцин для использования в цепочке поставок с контролируемой температурой; доступно по адресу www.who.int/biologicals/WHO_CTC_first_draft_22_Dec_2014_amended.pdf).

[092] Не ограничиваясь теорией, считается, что структура HaSMaN может способствовать стабильности совместно составленных составов вакцин. (См. Фиг. 36, демонстрирующую более высокую термическую стабильность в присутствии адъюванта Матрица, т.е. демонстрирующую, что частицы HaSMaN обладают большей стабильностью, чем составы, содержащие только детергентное ядро). Смешивание наночастиц с детергентным ядром с Матрицей M для получения HaSMaN обеспечивает композиции вакцины с повышением температуры от около 0,5°C до около 1,0°C (по данным дифференциальной сканирующей калориметрии) по сравнению с композициями вакцины, содержащими только наночастицы с детергентным ядром.

[093] Эта улучшенная термостабильность способствует увеличению срока хранения вакцины. В конкретных аспектах составы вакцины могут быть стабильными до 6 месяцев или до 12 месяцев. Тестируемый образец считается «стабильным» в контексте данного описания, если титр HAI против тестируемого образца после 12 месяцев хранения при 2-8°C статистически не отличается от свежеприготовленного образца; и если реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД) дают значение не менее около 70% после 12 месяцев хранения при 2-8^oC. Анализ статистической значимости измерений титра HAI выполняли следующим образом. Среднее геометрическое титра (СГТ) и связанные 95% доверительные интервалы (ДИ) рассчитывали по группам. Среднее значение log10 трансформированных измерений титра с помощью HAI сравнивали между группами с использованием критерия подлинной значимости Тьюки с программным обеспечением JMP13. Значение p <0,05 указывает на статистически значимую разницу между двумя сравниваемыми группами.

Композиции вакцин

[094] Описанные в данном документе композиции можно использовать как профилактически, так и терапевтически. Изобретение включает способы предотвращения заражения вирусом гриппа. Способы включают введение субъекту терапевтического или профилактического количества иммуногенных композиций согласно описанию. Предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой композицию вакцины, которая обеспечивает защитный эффект. В аспектах защитный эффект может включать ослабление симптома, связанного с инфекцией, в процентном отношении к популяции, подвергшейся воздействию. Например, композиция может предотвращать или уменьшать один или более симптомов гриппа, выбранных из: лихорадочной усталости, мышечной боли, головной боли и боли в горле, по сравнению с неполучавшим лечение субъектом.

[095] Композиции вакцин могут содержать различные вспомогательные вещества, фармацевтически приемлемые буферы и тому подобное. Например, фармацевтически приемлемые буферы в композициях вакцины могут содержать одно или более из следующего: фосфата натрия, хлорида натрия, гистидина, аргинин гидрохлорида и трегалозы. Фосфат натрия может присутствовать в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ, от около 15 мМ до около 30 мМ. В конкретных случаях присутствует около 25 мМ фосфата натрия. Гистидин может присутствовать в диапазоне от около 0,1% (мас./об.) до около 2,5% (мас./об.); например, гистидин может присутствовать в количестве около 0,1% (мас./об.), около 0,5% (мас./об.), около 0,7% (мас./об.), около 1% (мас./об.), около 1,5% (мас./об.), около 2% (мас./об.) или около 2,5% (мас./об.).

[096] Хлорид натрия может находиться в диапазоне от около 50 мМ до около 300 мМ. Как правило, хлорид натрия, когда он содержится в композиции, присутствует в концентрации около 150 мМ.

[097] Аргинин гидрохлорид может присутствовать в концентрации от около 50 мМ до около 200 мМ, от около 80 мМ до около 150 мМ или от около 100 мМ до около 180 мМ. В конкретных случаях присутствует около 100 мМ аргинин гидрохлорида.

[098] Трегалоза может присутствовать в диапазоне от около 1% до около 10%; например, около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9% или около 10%.

[099] Диапазон pH для композиции вакцины против гриппа, как правило, близок к нейтральному и поддерживается на уровне выше 6,9 во время очистки и в композициях. Например, pH буферов и композиций может составлять от около 7,2 до около 7,8, более предпочтительно от около 7,2 до около 7,5. В конкретных аспектах pH составляет около 7,5. Уровни pH ниже 6,9 следует избегать, поскольку они отрицательно влияют на стабильность структуры HA.

Адъюванты

[0100] В определенных вариантах осуществления описанные в данном документе композиции могут быть объединены с одним или более адъювантами для усиления иммунного ответа. В других вариантах осуществления композиции готовят без адъювантов и, таким образом, доступны для введения в виде композиций без адъювантов.

[0101] Иммуногенность конкретной композиции может быть увеличена за счет использования неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Эффективные количества адъювантов давно используются для обеспечения общего повышения иммунитета против антигенов (например, патент США № 4877611). В протоколах иммунизации адъюванты используются для стимулирования ответов в течение многих лет, и поэтому адъюванты хорошо известны специалисту в данной области техники. Некоторые адъюванты влияют на способ презентации антигенов. Например, иммунный ответ усиливается, когда белковые антигены осаждаются квасцами. Эмульгирование антигенов также продлевает продолжительность презентации антигена. Включение любого адъюванта, описанного в Vogel et al., «A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2-е издание)», включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте для всех целей, входит в объем данного описания.

[0102] Хотя могут быть включены различные адъюванты, HaSMaN получают с использованием адъюванта Матрица ИСКОМ, который сохраняет свою эффективную адъювантную активность после введения субъекту. Соответственно, в некоторых аспектах в состав нельзя добавлять дополнительный адъювант. Как отмечалось выше, такой подход к составлению позволяет изготавливать предварительно заполненные шприцы, содержащие вакцину, без необходимости смешивания антигена с адъювантом у постели больного.

Сапониновые адъюванты для матрицы

[0103] Матрицу ИСКОМ готовят с использованием сапониновых фракций. Сапонины представляет собой гликозиды, полученные из коры дерева Quillaja saponaria Molina. Как правило, сапонин получают с использованием многостадийного процесса очистки, в результате которого образуются несколько фракций. В контексте данного документа термин «сапониновая фракция из Quillaja saponaria Molina» в общем используется для описания полуочищенной или определенной сапониновой фракции Quillaja saponaria или ее по существу чистой фракции.

Сапониновые фракции

[0104] Существует несколько подходов к получению сапониновых фракций. Фракции A, B и C описаны в патенте США № 6352697 и может быть получен следующим образом. Липофильная фракция из Quil A, неочищенного водного экстракта Quillaja saponaria Molina, разделяется хроматографией и элюируется 70% ацетонитрилом в воде для извлечения липофильной фракции. Затем эту липофильную фракцию разделяют полупрепаративной ВЭЖХ с элюированием, используя градиент от 25% до 60% ацетонитрила в кислой воде. Фракция, называемая в данном документе «фракцией A» или «QH-A», представляет собой или соответствует фракции, которая элюируется приблизительно при 39% ацетонитрила. Фракция, называемая в данном документе «фракцией B» или «QH-B», представляет собой или соответствует фракции, которая элюируется приблизительно при 47% ацетонитрила. Фракция, называемая в данном документе «фракцией C» или «QH-C», представляет собой или соответствует фракции, которая элюируется приблизительно при 49% ацетонитрила. Дополнительную информацию относительно очистки фракций можно найти в патенте США № 5057540. При получении, как описано в данном документе, каждая фракция A, B и C Quillaja saponaria Molina представляет собой группы или семейства химически близких молекул с определенными свойствами. Хроматографические условия, при которых они получены, таковы, что воспроизводимость от партии к партии с точки зрения профиля элюирования и биологической активности очень стабильна.

[0105] Были описаны другие сапониновые фракции. Фракции B3, B4 и B4b описаны в EP 0436620. Фракции QA1-QA22 описаны в EP03632279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Denmark), спикозид из Quillaja saponaria Molina (lsconova AB, Ultunaallén 2B, 756 51 Упсала, Швеция). Могут использоваться фракции QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21, и QA-22 из EP 0 3632 279 B2, особенно QA-7, QA-17, QA-18, и QA-21. Их получают, как описано в EP 03632279 B2, особенно на странице 6 и в Примере 1 на страницах 8 и 9.

[0106] Сапониновые фракции, описанные в данном документе и используемые для образования адъювантов, часто представляют собой по существу чистые фракции; то есть фракции по существу не содержат примесей других материалов. В конкретных аспектах по существу чистая сапониновая фракция может содержать до 40% по массе, до 30% по массе, до 25% по массе, до 20% по массе, до 15% по массе, до 10% по массе, до 7% по массе, до 5% по массе, до 2% по массе, до 1% по массе, до 0,5% по массе или до 0,1% по массе других соединений, таких как другие сапонины или другие адъювантные вещества.

[0107] Другие сапониновые фракции, такие как фракции QS-7 и QS-21, их получение и применение описаны в патентах США №№ 5057540; 6231859; 6352697; 6524584; 6846489; 7776343 и 8173141. Эти фракции можно использовать в описанных в данном документе способах и композициях.

Частицы матрицы

[0108] Адъюванты на основе частиц Матрицы, описанные в данном документе, можно использовать для получения HaSMaN или использовать в качестве дискретных частиц из-за их адъювантных свойств. Матрица ИСКОМ содержит по меньшей мере одну сапониновую фракцию и липид. Липид представляет собой по меньшей мере стерол, такой как холестерин. В конкретных аспектах липид представляет собой фосфолипид. Комплексы Матриц ИСКОМ могут также содержать одно или более других иммуномодулирующих (адъювантно-активных) веществ, не обязательно гликозид, и могут быть получены, как описано в EP0436620B1.

[0109] Сапониновая фракция может представлять собой фракцию A, фракцию B или фракцию C Quillaja saponaria, полуочищенный препарат Quillaja saponaria, очищенный препарат Quillaja saponaria или любую очищенную субфракцию, например, QA 1-21.

[0110] Матричные частицы могут содержать смеси сапониновых фракций, или частица может быть образована с использованием только одной сапониновой фракции. Композиции, описанные в данном документе, могут содержать несколько частиц, при этом каждая частица содержит только одну сапониновую фракцию. То есть определенные композиции могут содержать один или более различных типов Матриц ИСКОМ, где каждая отдельная частица содержит одну сапониновую фракцию из Quillaja saponaria Molina, причем сапониновая фракция в одной частице отличается от сапониновой фракции в других частицах комплекса.

[0111] В конкретных аспектах, один тип сапониновой фракции или неочищенная сапониновая фракция могут быть интегрированы в одну частицу Матрицы ИСКОМ, а другой тип по существу чистой сапониновой фракции или неочищенной сапониновой фракции может быть интегрирован в другую частицу Матрицы ИСКОМ. Композиция или вакцина могут содержать по меньшей мере два типа комплексов или частиц, каждый из которых имеет один тип сапонинов, интегрированных в физически разные частицы.

[0112] В композициях могут использоваться смеси частиц Матрицы ИСКОМ, в которых одна сапониновая фракция Quillaja saponaria Molina и другая сапониновая фракция Quillaja saponaria Molina по отдельности включены в различные частицы комплекса Матрицы ИСКОМ и/или частицы комплекса ИСКОМ.

[0113] Матрица ИСКОМ, каждая из которых имеет одну сапониновую фракцию, может присутствовать в композиции в любой комбинации % по массе. В конкретных аспектах композиция может содержать от 0,1% до 99,9% по массе, от 5% до 95% по массе, от 10% до 90% по массе, от 15% до 85% по массе, от 20% до 80% по массе, 25%. до 75% по массе, от 30% до 70% по массе, от 35% до 65% по массе, от 40% до 60% по массе, от 45% до 55% по массе, от 40% до 60% по массе или 50% по массе Матрицы ИСКОМ, содержащей первую сапониновую фракцию, а оставшаяся часть состоит из Матрицы ИСКОМ, содержащей другую сапониновую фракцию. В некоторых аспектах оставшаяся часть представляет собой одну или более частиц Матрицы ИСКОМ, содержащих только одну сапониновую фракцию. В других аспектах частица Матрицы ИСКОМ может содержать более одной сапониновой фракции.

[0114] В предпочтительных композициях сапониновая фракция в первой Матрице ИСКОМ представляет собой фракцию A («Матрица c фракцией A»), а сапониновая фракция во второй Матрице ИСКОМ или частице комплекса ИСКОМ представляет собой фракцию C («Матрица с фракцией C»). Таким образом, предпочтительные композиции содержат в качестве адъюванта: адъювант Матрица с фракцией А и адъювант «Матрица с фракцией С». Количество каждой Матрицы в составе может варьироваться. Например, количество Матрицы с фракцией А может составлять около 80% (мас./мас.), около 85% (мас./мас.), около 90% (мас./мас.), около 92% (мас./мас.) или около 95% (мас./мас.), а остальная часть представляет собой Матрицу с фракцией С. Пример подходящей комбинации Матрицы с фракцией A и Матрицы с фракцией C 85:15 (называемой в данном документе Матрицей M или Матрицей M1) может быть получен от Novavax AB, Упсала, Швеция, как Matrix-M™.

[0115] В некоторых аспектах Матрица-M может использоваться в качестве адъюванта в композициях, представленных в данном документе. В некоторых аспектах Матрица-M может использоваться в качестве единственного адъюванта в композиции вакцины против гриппа на основе наночастиц, представленной в данном документе.

[0116] В некоторых вариантах осуществления количество Матрицы-M на вводимую дозу может находиться в диапазоне от около 20 мкг до около 140 мкг; например, около 20 мкг, около 30 мкг, около 40 мкг, около 50 мкг, около 60 мкг, около 70 мкг, около 75 мкг, около 80 мкг, около 90 мкг, около 100 мкг, около 110 мкг, около 120 мкг, около 130 мкг или около 140 мкг. В конкретных аспектах адъювант может присутствовать в количестве от около 50 мкг до около 75 мкг.

Другие адъюванты

[0117] Иллюстративные адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитые Mycobacterium tuberculosis), неполные адъюванты Фрейнда и адъювант алюминия гидроксид. Другие адъюванты включают GMCSP, BCG, соединения MDP, такие как thur-MDP и nor-MDP, CGP (MTP-PE), липид A и монофосфориллипид A (MPL), MF-59, RIBI, который содержит три компонента, экстрагированных из бактерии, MPL, димиколат трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS) в 2% эмульсии сквален/Tween® 80. В других предпочтительных аспектах используются квасцы, такие как 2% альгидрогель (Al(OH)₃). В некоторых аспектах адъювант может представлять собой олиголамеллярную липидную везикулу; например, Novasomes®. Novasomes® представляют собой олиголамеллярные нефосфолипидные везикулы в диапазоне от около 100 нм до около 500 нм. Они содержат Brij 72, холестерин, олеиновую кислоту и сквален. Было показано, что Novasomes представляют собой эффективный адъювант (см. патенты США №№ 5629021, 6387373 и 4911928.

Введение и дозировка композиций вакцин на основе наночастиц

[0118] Описанные в данном документе композиции можно вводить системным путем, через слизистую оболочку, трансдермальным путем или непосредственно в конкретную ткань. В контексте данного документа термин «системное введение» включает парентеральные пути введения. В частности, парентеральное введение включает подкожную, внутрибрюшинную, внутривенную, внутримышечную или внутригрудинную инъекцию. Как правило, композиции вводят при помощи внутримышечной инъекции. В конкретных аспектах композиции можно вводить через слизистую оболочку. В контексте данного документа термин «введение через слизистую оболочку» включает пероральное, интраназальное, интравагинальное, интраректальное и интратрахеальное введение.

[0119] Композиции можно вводить нуждающемуся в этом субъекту, как правило, человеку.

[0120] Композиции можно вводить по схеме введения однократной дозы или схеме введения многократных доз. Многократные дозы можно использовать в схеме первичной иммунизации или в схеме бустер-иммунизации. В схеме введения многократных доз различные дозы можно вводить одним и тем же или разными путями, например, парентеральный прайм и мукозальный буст, мукозальный буст и парентеральный буст и т.д. В некоторых аспектах последующая бустерная доза вводится через около 2 недели, около 3 недели, около 4 недели, около 5 недель или около 6 недель после предыдущей дозы.

[0121] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один штамм из четырех штаммов в композициях четырехвалентных вакцин против гриппа является штаммом типа А. Например, четырехвалентная вакцина против гриппа может содержать три штамма типа A и один штамм типа B.

[0122] Общее количество НА гриппа в композициях вакцин может находиться в диапазоне от около 25 мкг до около 200 мкг, от около 30 мкг до около 150 мкг, от около 50 мкг до около 100 мкг, от около 45 мкг до около 180 мкг, от около 60 мкг до около 190 мкг или от около 100 мкг до около 200 мкг. В определенных вариантах осуществления количество белка НА гриппа в композиции вакцины может находиться в диапазоне от около 5 мкг на штамм до около 80 мкг на штамм, от около 10 мкг на штамм до около 75 мкг на штамм, от около 15 мкг на штамм до около 70 мкг на штамм, от около 20 мкг на штамм до около 65 мкг на штамм, от около 25 мкг на штамм до около 60 мкг на штамм, от около 30 мкг на штамм до около 55 мкг на штамм, от около 35 мкг на штамм до около 50 мкг на штамм, от около 15 мкг на штамм до около 60 мкг на штамм. Преимущественно композиции демонстрируют стабильность до 9-12 месяцев, так что оставшееся количество, измеренное с помощью ОРИД, составляет значительный процент от начального количества; например, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75% или по меньшей мере около 80% от начального количества.

[0123] В некоторых вариантах осуществления в описании предложены стратегии совместного составления (т.е. предварительно заполненные шприцы или предварительно приготовленная смесь) композиций вакцин против гриппа на основе наночастиц. Типичные стратегии введения вакцины против гриппа, используемыми в данном документе время, относятся к составам свежеприготовленных смесей. То есть композиции вакцин и адъюванты хранятся отдельно и смешиваются перед введением. Стратегии предварительного смешивания, совместного приготовления или предварительно заполнения шприцев для вакцины против гриппа менее распространены из-за опасений по поводу стабильности антигенов гриппа и их последующих иммуногенных свойств. В данном описании предложены композиции вакцин против гриппа на основе наночастиц, которые можно предварительно смешивать и хранить. Описанные стратегии вакцинации и получения составов могут повысить эффективность вакцинации и могут снизить риски ошибок при смешивании у постели больного, сохраняя при этом общую безопасность и иммуногенность.

Иммуногенность вакцины против гриппа на основе наночастиц

[0124] В данном описании предложены способы предотвращения инфекции гриппа. Иммуногенность вакцин против гриппа на основе наночастиц, описанных в данном документе, может быть определена с использованием подходящих подходов, включая выполнение анализов HAI или путем измерения нейтрализующих антител. В некоторых вариантах осуществления иммуногенность вакцин против гриппа на основе наночастиц можно сравнить с коммерчески доступной композицией вакцины против гриппа. В контексте данного документа термин «коммерчески доступная композиция вакцины против гриппа» может представлять собой любые композиции вакцин против гриппа, которые доступны для применения в медицинских целях. Например, коммерчески доступная композиция вакцины против гриппа может быть составлена для инъекции трехвалентной или четырехвалентной композиции. В некоторых аспектах состав для инъекции может содержать инактивированную форму вируса. В другом примере коммерчески доступная композиция вакцины против гриппа может быть составлена для назального спрея. В некоторых аспектах состав для назального спрея может содержать аттенуированные или ослабленные формы вируса.

[0125] Композиция, описанная в данном документе, обеспечивает не худший иммунный ответ по сравнению с другими вакцинами, в частности, коммерчески доступными вакцинами, включая четырехвалентную Афлюрию, четырехвалентную Флюарикс, четырехвалентную вакцину ФлюЛавал, четырехвалентную Флюзон, четырехвалентную Флюцельвакс, интрадермальную четырехвалентную Флюзон, Афлюрию, Флювирин, Флюад, Флюзон с высокой дозой, четырехвалентую Флюблок, Флюблок и четырехвалентную ФлюМист.

[0126] Преимущественно композиции, описанные в данном документе, индуцируют нейтрализующие антитела, которые связываются со штаммом, который дрейфовал (т.е. претерпел небольшую мутацию) относительно последовательности, используемой в вирусе в пределах того же подтипа гриппа. В конкретных аспектах один, два, три, четыре или все штаммы, используемые в композициях, индуцируют нейтрализующие антитела против одного дрейфующего штамма, против двух дрейфующих штаммов, против трех дрейфующих штаммов, против четырех дрейфующих штаммов или против пяти дрейфующих штаммов. Не ограничиваясь теорией, считается, что присутствие адъюванта Матрица в композициях способствует экспозиции дополнительных антигенов, обеспечивая расширенную защиту от дрейфующего штамма. Аналогичным образом, образование HaSMaN после инкубации с адъювантом Матрица с белками НА подтипа A, как полагают, вносит вклад в этот процесс.

[0127] Важно отметить, что HaSMaN по меньшей мере так же иммуногенны, как и наночастицы с детергентным ядром. Например, как показано в Таблице 6 ниже, титр HAI против A/Michigan на 35-е сутки для 1,5 мкг составов предварительно приготовленных смесей составлял около 538 при 25°C, тогда как титр HAI против A/Michigan для 1,5 мкг составов свежеприготовленных смесей составлял около 453 при 25°C. В другом примере, приведенном в Таблице 8, титр HAI против A/Hong Kong на 35-е сутки для 1,5 мкг составов предварительно приготовленных смесей составлял около 538 при 25°C, тогда как титр HAI против A/Michigan для 1,5 мкг составов свежеприготовленных смесей составлял около 494 при -60°C. Сходная иммуногенность среди составов предварительно приготовленных смесей и составов свежеприготовленных смесей также предполагает, что составы предварительно приготовленных смесей стабильны при комнатной температуре. Кроме того, данные составы предварительно приготовленных смесей, хранящиеся при комнатной температуре, неожиданно могут иметь аналогичную иммуногенность по сравнению с составами свежеприготовленных смесей, которые инкубируются при -60°C.

Контейнеры

[0128] Для хранения и транспортировки составов предварительно приготовленных смесей можно использовать различные контейнеры, включая шприцы для одноразового введения и пластиковые ампулы. В некоторых случаях пластиковые ампулы могут быть изготовлены с использованием технологии или способа изготовления раздув-заполнение-уплотнение. В общем, способ изготовления раздув-заполнение-уплотнение (BFS) включает экструзию пластикового материала (например, смолы) с образованием заготовки, которую затем помещают в форму и разрезают по размеру. Затем используют заполняющую иглу или оправку для надувания пластика, что, в свою очередь, приводит к получению полой ампулы, которая по существу соответствует форме формованного изделия. После надувания в ампулу можно ввести желаемый объем жидкости, можно удалить иглу для наполнения или оправку и запечатать ампулу. Соответственно, BFS может быть автоматизированным процессом, который может выполняться в стерильной среде без прямого вмешательства человека.

[0129] В некоторых случаях способность производить стерильные ампулы, содержащие желаемую жидкость, в асептических условиях, может сделать ампулы, изготовленные при помощи BFS, особенно подходящими для фармацевтической промышленности. Однако технология BFS не совместима со всеми фармацевтическими жидкостями, продуктами и т. д. Например, некоторые известные методы изготовления BFS включают доставку жидкости или продукта в ампулу, пока пластик еще относительно горячий, что может привести к неблагоприятным последствиям для чувствительных к температуре жидкости и/или продуктам, таким как вакцины, биопрепараты и т. д. Однако достижения в технологии охлаждения BFS увеличили разнообразие подходящих продуктов, жидкостей и т.д., позволяя хранить некоторые вакцины, биопрепараты и/или другие чувствительные к температуре фармацевтические препараты в ампулах BFS.

[0130] В некоторых случаях ампула BFS может иметь размер, форму и/или конфигурацию, которая по меньшей мере частично зависит от желаемого применения и/или желаемой фармацевтической жидкости или дозировки, для содержания которых сконфигурирована ампула. Например, некоторые известные ампулы BFS могут включать прокалываемый верх, откручивающийся верх, верхнюю часть, включающую конус или канюлю Люэра, и/или тому подобное. Некоторые известные ампулы BFS могут иметь размер и/или форму в зависимости от объема жидкости или дозировки, предназначенной для размещения в них. Кроме того, некоторые известные ампулы BFS могут быть изготовлены в виде стрипа из нескольких временно соединенных ампул, что может повысить эффективность производства, упаковки и/или хранения, и/или т.п.

[0131] Все патенты, заявки на патенты, ссылки и журнальные статьи, цитируемые в этом описании, явным образом включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Очистка наночастиц с HA

[0132] Белки НА из одного штамма экспрессировались в клетках Sf9 с помощью бакуловирусной инфекции и позволяли расти в течение 48-96 часов перед сбором. Затем белки НА были собраны путем экстракции детергентом и во время очистки превращены в наночастицы с детергентным ядром. Вкратце, колонку TMAE предварительно уравновешивали буфером, состоящим из 25 мМ Трис, pH 8,0, 1,5 М хлорида натрия, 0,02% NP9. Образец загружали со скоростью ≤ 90 см/час (время пребывания 24 мин), а затем промывали буфером EQ (25 мМ Трис, pH 8,0, 50 мМ хлорид натрия или 81 мМ хлорид натрия (штаммы A, B, соответственно), 0,02% NP-9). Затем очищенный образец элюировали 1,5 CV буфера EQ .

[0133] Для штаммов A проводили нанофильтрацию продукта из колонки TMAE с последующим нанесением на колонку с лектином чечевицы для аффинной хроматографии, предварительно уравновешенную буфером, состоящим из 25 мМ Трис, 50 мМ и 107 мМ хлорида натрия (для штаммов A и B, соответственно). 0,02% (мас./об.) NP-9, pH 8,0 для 3CV (скорость потока: 150 см/ч). Образец загружали с временем удерживания 4 мин. После загрузки выполняли промывку 3CV уравновешивающего буфера лектина чечевицы. Продукт элюировали 25 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия, 500 мМ метил-α-D-маннопиранозида, 0,01% (мас./об.) PS80, pH 7,5, собирая 2CV при 75 см/час и 8-минутном временем удерживания.

[0134] Для штаммов B продукт колонки TMAE дополнительно очищали с использованием колонки Capto Blue. Колонку уравновешивали 25 мМ Трис, pH 8,0, 107 мМ хлорида натрия, 0,02% (мас./об.) NP-9 с последующей загрузкой продукта TMAE со скоростью потока 225 см/час при времени удерживания 4 минуты и сбором 2CV уравновешивающего буфера. Нанофильтрацию продукта из колонки Capto Blue проводили с последующим нанесением на колонку для аффинной хроматографии на лектине чечевицы, предварительно уравновешенную буфером, состоящим из 25 мМ Трис, 50 мМ и 107 мМ хлорида натрия (для штаммов A и B, соответственно), 0,02% (мас./об.) NP-9, pH 8,0 для 3CV (скорость потока: 150 см/ч). Образец загружали с временем удерживания 4 мин. После загрузки выполняли промывку 3CV уравновешивающего буфера лектина чечевицы. Продукт элюировали 25 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия, 500 мМ метил-α-D-маннопиранозида, 0,01% (мас./об.) PS80, pH 7,5, собирая 2CV при 75 см/час и 8-минутном временем удерживания.

[0135] Продукты лектина чечевицы как для штаммов A, так и для штаммов B концентрировали до целевой концентрации НА, а затем заменяли буфер на буфер для конечной композиции лекарственного вещества. Концентрирование и замену буфера выполняли при помощи ультрафильтрации и диафильтрации.

Пример 2 – Анализ методом ДСН-ПААГ-электрофореза

[0136] Для оценки стабильности совместного составления Quad-NIV и адъюванта Матрица ИСКОМ (Матрица M) в предварительно заполненных шприцах и для понимания физических, химических и биологических свойств такой вакцины были приготовлены составы, как показано в Таблице 1 ниже. Тестируемые композиции вакцин были разделены на три группы: (1) стеклянные флаконы со свежеприготовленной смесью, содержащие только антигены HA, (2) предварительно заполненные шприцы (ПЗШ), содержащие антигены HA вакцины, составленные вместе с Матрицей M1, и (3) ПЗШ, содержащие антигены HA вакцины. Стеклянные флаконы для свежеприготовленной смеси и ПЗШ были приобретены коммерческим путем (Schott).

Таблица 1. Сравнительное исследование свежеприготовленных составов флаконов и составов ПЗШ

[0137] На Фиг. 2 показаны уменьшенные изображения ДСН-ПААГ геля, демонстрирующие полосы белков или из флаконов со свежеприготовленной смесью, хранящихся при 4°C; или из предварительно заполненных шприцев (ПЗШ), с Матрицей M1 или без нее, хранящиеся при 4°C. Во все тестируемые моменты времени электрофореграмма белков из ПЗШ была подобна электрофореграмме белков из флаконов со свежеприготовленной смесью, что указывает на то, что белки в ПЗШ были по меньшей мере такими же стабильными, как белки в флаконах со свежеприготовленной смесью. Присутствие или отсутствие Матрицы M не изменило электрофореграммы среди групп ПЗШ, равно как и хранение в течение 6 или даже 12 месяцев. Группы флаконов со свежеприготовленной смесью с LD и группы ПЗШ с LD также имели неизменно похожие электрофореграммы при 4°C, хотя в группах LD были более слабые электрофореграммы по сравнению с их когортами HD в тот же момент времени.

[0138] На Фиг. 3 показаны электрофореграммы белков из ПЗШ или флаконов со свежеприготовленной смесью, хранящихся при 4°C, исследованных на невосстановленном ДСН-ПААГ геле и восстановленном ДСН-ПААГ геле. Результаты демонстрируют, что электрофореграмма белка была одинаковой для всех групп даже в невосстановленном геле, что дополнительно демонстрирует, что белки в ПЗШ были аналогичны белкам в флаконах со свежеприготовленной смесью в нулевой момент времени.

[0139] Кроме того, стабильность белка для групп флаконов со свежеприготовленной смесью; и группы ПЗШ с или без Матрицы M, хранящиеся при 4°C или 25°C в течение 3 месяцев, были исследованы с использованием анализов методом ДСН-ПААГ-электрофореза в невосстанавливающих условиях (Фиг. 4). Полосы с более высокой молекулярной массой, как правило, появлялись в некоторых группах, которые хранили при более высокой температуре (25°C), по сравнению с группами, которые хранили при более низкой температуре (например, 4°C). Более сильную экспрессию белков наблюдали также в группах, хранящихся при более низких температурах. Результаты демонстрируют, что белки в ПЗШ были по меньшей мере такими же стабильными, как белки во флаконах со свежеприготовленной смесью, даже после длительного периода хранения, такого как хранение в течение 3 месяцев.

[0140] Эти данные демонстрируют, что стратегии совместного составления вакцин в ПЗШ могут быть осуществимы в отношении стабильности. Допустимо хранение совместно составленных в ПЗШ вакцин как при 4°C, так и при 25°C. Присутствие Матрицы M1 и продолжительность хранения (например, 3 месяца) не повлияли отрицательно на стабильность составов вакцин, подтверждая, что образование HaSMaN не влияет на стабильность белка в течение продолжительных периодов времени.

Пример 3 – анализ методом ОРИД

[0141] Стабильность белка тестировали путем проведения анализа методом ОРИД для различных штаммов гриппа A и штаммов B, составленных в группах ПЗШ. Анализ методом ОРИД выполняли при 2-8°C (например, 4°C) при Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев; и при 25°C при Т = 0, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. На Фиг. 5 и 6 представлены данные ОРИД для 120 мкг/мл составов ПЗШ, содержащих A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane или B/Phuket, с или без 100 мкг/мл Матрицы M при 2-8°C (Фиг. 5) и 25°C (Фиг. 6).

[0142] Результаты иммунореактивности ОРИД ПЗШ с Матрицей M были подобны или лучше результатов иммунореактивности ОРИД ПЗШ без Матрицы M. Данные демонстрируют, что общая тенденция иммунореактивности во времени при хранении при 25°C заметно не отличается от результатов, наблюдаемых при 4°C. Отсутствие заметных изменений в иммунореактивности вакцины указывает на то, что составы Quad-NIV ПЗШ стабильны при различных температурах в течение по меньшей мере до 6 месяцев. Стабильность составов Quad-NIV ПЗШ при комнатной температуре (25°C) обеспечивает преимущественно экономически эффективные стратегии вакцинации, поскольку составы ПЗШ не нуждаются в длительном охлаждении или ограничиваются транспортировкой при низких температурах. Эти данные также демонстрируют, что массовое производство стабильных предварительно приготовленных вакцин (содержащих антигены гриппа и Матрицу M) задолго до вакцинации в клиниках является целесообразным подходом.

[0143] Пример 4 - Сравнительное исследование иммуногенности вакцины против гриппа Quad-NIV и коммерческой вакцины против гриппа у хорьков

[0144] Были проведены исследования на хорьках для сравнения иммуногенности при различных стратегиях получения тестируемых вакцин (свежеприготовленных и совместно составленных) с коммерчески доступными вакцинами против гриппа.

Таблица 2. Сравнительное исследование иммуногенности вакцины Quad-NIV и коммерческой вакцины на хорьках

^*- Доза каждого штамма B составляла 90 мкг; и доза каждого штамма A составляла 60 мкг.

^№- Результаты, представленные на Фиг. 7-10, соответствуют 42 суткам.

[0145] Для составов Quad-NIV использовали штаммы A/Michigan/45/2015-H1N1, штаммы A/Hong Kong/4801/2014-H3N2, штаммы B/Brisbane/60/2008, штаммы B/Phuket/3073/2013. Для Флюзон с HD (TIV; Sanofi Pasteur) использовали A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2 и B/Brisbane/60/2008. Для Флюзон с HD (QIV; Sanofi Pasteur) использовали A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, B/Brisbane/60/2008 и B/Phuket/3073/2013. Для Флюад (TIV; Seqirus) использовали A/Singapore/GP1908/2015 (подобный A/Michigan/45/2015-H1N1), A/HongKong/4801/2014-H3N2 и B/Brisbane/60/2008. Для Флюблок (QIV; Protein Sciences) использовали A/Michigan/45/2015-H1N1, A/HongKong/4801/2014-H3N2, B/Brisbane/60/2008 и B/Phuket/3073/2013. Для Флюцельвакс (QIV; Seqirus) использовались A/Singapore/GP1908/2015 (подобный A/Michigan/45/2015-H1N1), A/Singapore/GP2050/2015 (подобный A/Hong Kong/4801/2014 - H3N2), B/Hong Kong/259/2010 (подобный B/Brisbane/60/08) и B/Utah/9/2014 (подобный B/Phuket/3073/2013).

[0146] Хорьков иммунизировали на 0-е сутки и на 21-е сутки исследования. Кровь отбирали за сутки до начала исследования, на 21-е и 42-е сутки исследования. Анализ HAI проводили с использованием красных кровяных телец человека для оценки иммуногенности тестируемых составов у хорьков. Протоколы экспериментов известны в данной области техники и обсуждаются выше. Следующие реагенты HAI были использованы в анализе в качестве эталонных антигенов гриппа в формах VLP: (1) A/Michigan 45/15 (BV № 001), (2) A/HongKong/4801/14 (BV № 1808), (3) B/Bris/60/08 (BV № 714), (4) B/Phuket/3073/13 (BV № 1659), (5) A/Switzerland/9715293/13 (BV № 1660), (6 ) A/Singapore/2016 (BV № 2165), (7) A/Texas/50/2012 (BV № 1324), (8) A/Victoria/36/11 (BV № 1577) и (9) A/Perth/16/09. Способы создания VLP антигена гриппа описаны, например, в заявке на патент США № 15/901000, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[0147] Все коммерчески доступные вакцины против гриппа имели более низкие титры HAI по сравнению со всеми составами Quad-NIV в присутствии Матрицы M, независимо от схем применения, типов составов (т.е. свежеприготовленных и совместных составов). См. Фиг. 7 (A/Hong Kong/4801-2014), Фиг. 8 (A/Michigan/45/2015), Фиг. 9 (B/Brisbane/60/2008) и Фиг. 10 (B/Phuket/3073/2013).

[0148] Таким образом, составы Quad-NIV могут вызывать более устойчивые иммуногенные эффекты у хорьков для всех тестируемых штаммов гриппа, описанных в данном документе, по сравнению с коммерческими вакцинами, в то время как различия более значительны при наличии Матрицы M в составах. Совместные составы Quad-NIV (предварительно приготовленные), содержащие HaSMaN, обладали сходной иммуногенностью по сравнению с составами Quad-NIV у постели больного. Среди групп совместных составов, составы, хранящиеся при 4°C и 25°C, как правило, имели очень похожую иммуногенность.

Пример 5 - Оценка иммуногенности четырехвалентных вакцин против гриппа на основе наночастиц, хранящихся при 4°C

[0149] В таблице 3 приведен дизайн исследования на мышах для изучения иммуногенности и стабильности предварительно приготовленных в ПЗШ составов вакцин и свежеприготовленных вакцин. Составы ПЗШ хранили при 4°C в течение 3 месяцев. Для предварительно приготовленных вакцин вирусные антигены хранили при -60°C в течение 3 месяцев и смешивали с адъювантом Матрица M непосредственно перед введением.

[0150] Таблица 3. Составы Quad-NIV для оценки иммуногенности

[0151] Иммунизации проводили внутримышечно на 0-е сутки и 21-е сутки. Образцы крови отбирали за сутки до начала исследования и повторно на 42-е сутки исследования (или 21-е сутки после второй иммунизации) для анализа иммуногенности. Иммуногенность определяли на основании ответов ингибирования гемагглютинации (HAI) на следующие штаммы гриппа A и B: (1) A /Hong Kong/4801/2014; (2) A/Michigan/45/2015; (3) B/Brisbane/60/2008; и (4) B/Phuket/3073/2013. HAI измеряли, как описано в Руководстве по лабораторной диагностике и вирусологическому надзору за гриппом (Всемирная организация здравоохранения 2011 г., дата обращения 15.02.2018 г., по адресу: www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/manual_diagnosis_surveillance_influenza/en/, которое включено в это описание посредством ссылки.

[0152] На Фиг. 11 показаны титры HAI против четырех штаммов гриппа для всех групп HD через 3 месяца для составов, перечисленных в таблице 3. Результаты демонстрируют, что предварительно приготовленные составы, хранящиеся при 4°C в течение 3 месяцев, обладали аналогичными иммуногенными свойствами по сравнению с составами свежеприготовленных смесей, хранящихся при -60°C. Результаты также демонстрируют, что Матрица M не изменяет иммуногенность тестируемых составов Quad-NIV, даже когда состав предварительно приготовленной смеси хранится в течение длительного периода, например, 3 месяцев.

[0153] Пример 6 - Иммуногенность и долговременная стабильность наночастиц с HA на основе предварительно приготовленной смеси и свежеприготовленной смеси с Матрицей M при 25°C

[0154] Группы с 1 по 14 были получены, как показано в таблице 4 ниже. Для групп предварительно приготовленной смеси наночастицы с НА и Матрицу M (85:15 мас./мас. Матрицы с фракцией A и Матрицы с фракцией C) объединяли и хранили при 4°C в течение 6 месяцев или 12 месяцев или при 25°C в течение 6 месяцев перед введением. В группах свежеприготовленных смесей HA хранили при 25°C, или замораживали при -60°C в течение 6 месяцев, или замораживали при -60°C в течение 12 месяцев, а затем объединяли с Матрицей M непосредственно перед введением мышам. Наночастицы с белком НА содержали НА из следующих штаммов A/Michigan H1N1, A/Hong Kong-H3N2 B/Brisbane и B/Phuket.

[0155] Таблица 4. Составы для анализа стабильности в течение 6 и 12 месяцев³

¹ Высокая доза: 120 мкг/мл/штамм (всего 480 мкг HA) + 100 мкг/мл Матрицы.

² Низкая доза: 30 мкг/мл/штамм HA (всего 120 мкг HA) + 100 мкг/мл Матрицы.

³ 12-месячное исследование стабильности не включало образцы, хранящиеся при 25°C.

[0156] Мы измеряли титры HAI против каждого из четырех штаммов. На Фиг. 12-19 и в таблицах 5-12 приведены титры HAI против штаммов A/Hong Kong, A/Michigan, B/Brisbane и B/Phuket для групп HD и LD через 6 месяцев.

[0157] Таблица 5. Титры A/Michigan H1N1-HAI на 21-е сутки

[0158] Таблица 6. Титры A/Michigan H1N1-HAI на 35-е сутки

[0159] Таблица 7. Титры HAI A/Hong Kong-H3N2 на 21-е сутки

[0160] Таблица 8. Титры HAI A/Hong Kong-H3N2 на 35-е сутки

[0161] Таблица 9. Титры HAI B/Brisbane на 21-е сутки

[0162] Таблица 10. Титры HAI B/Brisbane на 35-е сутки

[0163] Таблица 11. Титры HAI B/Phuket на 21-е сутки

[0164] Таблица 12. Титры HAI B/Phuket на 35-е сутки

[0165] На Фиг. 20-27 показаны титры HAI против штаммов A/Hong Kong, штаммов A/Michigan, штаммов B/Brisbane и штаммов B/Phuket для групп с высокими дозами (HD) и низкими дозами (LD) через 12 месяцев.

[0166] Данные демонстрируют, что вакцины на основе свежеприготовленной смеси и вакцины на основе предварительно приготовленной смеси вызывают аналогичную иммуногенность у мышей даже после 6 или 12 месяцев хранения по измерениям титров HAI. Исследование также подтвердило, что присутствие Матрицы M было полезно для генерации более сильных иммунных ответов. Матрица M, даже при хранении в течение продолжительных периодов времени, не изменяет иммуногенность тестируемых составов Quad-NIV.

[0167] Предварительно приготовленные составы при 25°C обладали аналогичными иммуногенными свойствами по сравнению со составами свежеприготовленных смесей при 25°C. Например, группы 1,5 мкг предварительно приготовленной смеси, хранящихся при 4°C или 25°C, вызвали аналогичный ответ с титром HAI против штамма A/Michigan на 21-е сутки день (таблица 5; СГТ (среднее геометрическое значение титра): 57 против 67, соответственно). В сочетании со стабильностью составов предварительно приготовленных смесей, хранящихся при 25°C в течение длительных периодов времени, вакцины, таким образом, особенно полезны в условиях, когда хранение в холодовой цепи может быть ограничено или может отсутствовать.

[0168] Данные, приведенные на Фиг. 12-27, демонстрируют, что группы с высокими дозами, в частности составы предварительно приготовленных смесей, имели более высокие ответы титра HAI по сравнению с группами с низкими дозами для всех штаммов на 21-е сутки. Ответы с титрами HAI на 35-е сутки были выше во всех группах для всех штаммов по сравнению с ответами с титрами HAI, наблюдавшимися на 21-е сутки, (например, титры HAI A/Hong Kong для 1,5 мкг составов предварительно приготовленных смесей при 25°C на 21-е сутки и 35-е сутки: 22 и 538), в то время как минимальные различия наблюдались между группами с высокой дозой и группами с низкой дозой на 35-е сутки.

[0169] Данные подтверждают, что частицы HaSMaN, образованные с белками НА типа A, по меньшей мере так же эффективны в индукции иммунных ответов, как наночастицы с HA с детергентным ядром не в форме HaSMaN. Данные демонстрируют, что взаимодействие наночастиц с HA с Матрицей с образованием HaSMaN не оказывает отрицательного воздействия ни на адъювантный эффект Матрицы, ни на иммуногенность самого белка HA. Хотя наночастицы с HA, по-видимому, сохраняют стабильность белка HA путем вставки в детергентное ядро, данные, таким образом, предполагают, что частицы HaSMaN могут обеспечивать некоторую защиту структуры белка HA, а также могут положительно влиять на представление в иммунной системе, не требуя белок, встроенный в детергентное ядро.

Пример 7 – Анализ коэффициентов седиментации

[0170] Четырехвалентные композиции, которые ранее были протестированы на стабильность на мышах в примере 6, были проанализированы при помощи аналитического ультрацентрифугирования (AUC) для измерения скорости седиментации (SV) для определения размера частиц.На Фиг. 28 показаны результаты только с 120 мкг/мл/штамм Quad-NIV (только QIV) через 0, 3, 6, 9 и 12 месяцев при 4°C; или QIV + 100 мкг/мл M1 через 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев при 4°C. Данные демонстрируют, что с течением времени количество быстро оседающих частиц увеличивалось, т.е. структур, появляющихся при более высоких значениях, демонстрируя, что частицы HA с увеличением времени превращаются в HaSMaN.На Фиг. 29 показаны результаты с Quad-NIV, отдельно или с 100 мкг/мл M1 через 0, 3 или 6 месяцев при 25°C, и подтверждает, что образование HaSMaN происходит быстрее при более высокой температуре.

Пример 8 - Анализ образования HaSMaN с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

[0171] Как описано ранее, на Фиг. 1 показаны различные структуры наночастиц с HA (Flu), матрицы M и HaSMaN (взаимодействие Flu-матрицей), как показано с помощью ПЭМ. Как и ожидалось, наночастицы с HA не образовывали HaSMaN. Скорее, наночастицы с НА демонстрируют структуру детергентного ядра с белками НА, окружающими ядро. Матрица M имеет клеточные структуры, которые содержат сапониновую фракцию (фракцию A или фракцию C, но не обе), фосфолипид и холестерин. В структурах HaSMaN гликопротеин HA прикреплен к клеточным частицам Матрицы, при этом головная часть HA выходит наружу.

[0172] Затем мы просмотрели динамику различных образцов, описанных ниже под ТЕМ, чтобы визуально оценить образование HaSMaN в различных условиях. В таблице 13 ниже показаны условия образцов и моменты времени для тестирования структур наночастиц составов предварительно приготовленных смесей Quad-NIV (высокая доза, HD и низкая доза, LD) с использованием ТЕМ. Обозначение «X» указывает на условия образцов, доступные для каждого момента времени. Кроме того, составы LD были испытаны при различных температурах через 1 месяц (Фиг. 35).

[0173] На Фиг. 30 – Фиг. 34 показаны репрезентативные изображения со структурами HaSMaN. Данные демонстрируют, что образование HaSMaN видно через около 4 часа инкубации; и что нет никаких доказательств образования HaSMaN до 4 часов (Фиг. 30 и Фиг. 31). К 24 часам HaSMaN образовывались как при низких (4°C), так и при высоких (25°C) температурах; однако образование HaSMaN не наблюдалось при высокодозной Quad-NIV при 4°C. При высокодозной Quad-NIV показано образование HaSMaN при 4°C через 48 часов (Фиг. 33) и через 7 суток (Фиг. 34). Данные также показывают, что к 1 месяцу структуры HaSMaN оставались в группе LD и были более заметными при более высоких температурах, особенно при 37^oC (Фиг. 35).

Таблица 13. Получение ПЭМ-изображений: дизайн исследования

Концентрация Матрицы M: 100 мкг/мл во всех образцах

[0174] Эти данные демонстрируют, что для образования HaSMaN требуется около 4 часов совместной инкубации наночастиц с HA с Матрицей M1. При всех условиях показано образование HaSMaN в течение 48 часов. Образующиеся частицы HaSMaN стабильны в течение продолжительных периодов времени. HaSMaN образуются раньше при более высокой температуре и меньших дозах Quad-NIV.

[0175] Это говорит о том, что составы предварительно заполненных шприцев, содержащие HaSMaN, можно хранить при комнатной температуре или выше (например, 37°C), что позволит избежать затрат на хранение и транспортировку при низкой температуре и предотвратит потенциальные несоответствия при смешивании и приготовлении вакцин непосредственно перед вакцинацией в клинике.

Пример 9

Профили дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) Quad-NIV

[0176] Стабильность составов Quad-NIV, описанных в примерах 6 и 7, исследовали с помощью анализа методом ДСК. 120 мкг/мл/штамм Quad-NIV со 100 мкг/мл Матрицы M1 получали в буферах, содержащих 25 мМ NaPi, 150 мМ NaCl, 100 мМ аргинина, 5% трегалозу, 0,03% PS80 при pH 7,5. Все образцы Quad-NIV инкубировали при 4°C в течение 3 месяцев, 6 месяцев или 12 месяцев; или 25°C в течение 3 месяцев или 6 месяцев. Сканирование при помощи ДСК проводили при температуре от 4°C до 120°C при скорости 1°C в минуту и измеряли молярную теплоемкость (Cp: кДж/моль*К) Quad-NIV.

[0177] На Фиг. 36 показано, что составы, инкубированные при 25°C, имели меньший сдвиг температуры плавления (T_пл) и имели более широкую ширину пика, чем те же группы, инкубированные при 4°C.В таблице 14 показано, что составы 120 мкг/мл/штамм Quad-NIV + Матрица M1, инкубированные при 25°C, имели более низкую T_пл, чем 4°C, как через 3 месяца (59,6°C против 60,4°C), так и через 6 месяцев (59,0°C против 60,4°С). В таблице 14 также показано, что составы при 25°C требовали меньших изменений Hcal для достижения пиковых температур, чем 4°C, что дополнительно предполагает, что этот состав содержит относительно меньше комплексов HaSMaN.

[0178] Профили ДСК и T_пл являются мерой термостабильности белка. Результаты демонстрируют, что образование HaSMaN увеличивает T_пл белка HA от около 0,5°C до около 1°C, тем самым улучшая термостабильность белка HA в HaSMaN по сравнению с наночастицей с детергентным ядром.

Таблица 14. Профили ДСК для высокодозных и низкодозных составов Quad-NIV

[0179] Пример 10 - Штаммы типа A, но не штамм типа B для HaSMaN

[0180] Мы исследовали способность гликопротеинов НА из разных штаммов гриппа образовывать HaSMaN. Наночастицы с детергентным ядром были приготовлены и очищены, как описано в примере 1, для следующих штаммов: Тип A: A/Hunan, A/Guangdong (оба подтипа H7N9) и A/Panama и A/Hong Kong/4801/2014 (оба относятся к подтипу H3N2) и для типа B: B/Brisbane/60/2008.

[0181] Наночастицы смешивали с Матрицей M (85:15 по массе Матрицы с фракцией A и Матрицы с фракцией C) в течение до 4 недель. Конечная концентрация HA составляла 120 мкг/мл (60 мкг каждого штамма A + 60 мкг каждого штамма B в 0,5 мл). Были измерены свободные nHA. Результаты показаны на Фиг. 37. Уменьшение количества свободных частиц nHA соответствует образованию HaSMaN.

[0182] Эти данные позволяют предположить, что гликопротеины НА штамма А образуют HaSMaN, а гликопротеины НА штамма В - нет. Мы также протестировали слитый белок гликопротеина НА, имеющий фолдон на С-конце. Присутствие фолдона блокирует образование HaSMaN, что указывает на то, что С-конец должен быть свободным, чтобы гликопротеин НА мог образовывать HaSMaN.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и медицине. Предложена поливалентная иммуногенная композиция против гриппа. Композиция содержит (a) наночастицу с детергентным ядром, причем наночастица с детергентным ядром содержит рекомбинантный гликопротеин гемагглютинина (НА) гриппа из штамма вируса гриппа типа В; (b) наночастицу на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином (HaSMaN), причем HaSMaN содержит рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А и адъювант Матрица ИСКОМ; и (c) фармацевтически приемлемый буфер. Предложен способ стимуляции иммунного ответа против гриппа, включающий введение поливалентной композиции против гриппа, а также предварительно заполненный шприц, содержащий композицию, и полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер, содержащий композицию. Изобретение позволяет получить эффективную поливалентную иммуногенную композицию против гриппа. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 14 табл., 37 ил., 10 пр.

1. Поливалентная иммуногенная композиция против гриппа, содержащая

(a) наночастицу с детергентным ядром, причем наночастица с детергентным ядром содержит рекомбинантный гликопротеин гемагглютинина (НА) гриппа из штамма вируса гриппа типа В; и

(b) наночастицу на основе сапониновой матрицы с гемагглютинином (HaSMaN), причем HaSMaN содержит рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А и адъювант Матрица ИСКОМ; и

(c) фармацевтически приемлемый буфер.

2. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая одну или более наночастиц с детергентным ядром и/или одну или более HaSMaN.

3. Композиция по п. 1, в которой каждая из наночастиц представляет собой устойчивую к трипсину наночастицу.

4. Композиция по п. 1, в которой адъювант Матрица ИСКОМ представляет собой Матрицу М.

5. Композиция по п. 4, в которой Матрица М содержит 85% Матрицы с фракцией А и 15% Матрицы с фракцией С по массе.

6. Композиция по п. 1, в которой детергент представляет собой PS-80.

7. Композиция по п. 6, в которой детергент PS-80 присутствует в количестве от около 0,03% до около 0,5%.

8. Композиция по п. 6, в которой детергент PS-80 присутствует в количестве около 0,04%.

9. Композиция по п. 1, в которой штамм вируса гриппа относится к подтипу, выбранному из группы, состоящей из H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16, Н17 и Н18.

10. Композиция по п. 1, в которой фармацевтически приемлемый буфер содержит (i) фосфат натрия в концентрации около 25 мМ; (ii) хлорид натрия в концентрации около 150 мМ; (iii) гидрохлорид аргинина в концентрации около 100 мМ; (iv) трегалозу в концентрации около 5%; при этом рН композиции составляет около 7,5.

11. Композиция по п. 1, в которой адъювант присутствует в количестве от около 50 мкг до около 75 мкг на дозу.

12. Композиция по п. 1, в которой как рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В, так и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А присутствуют в количестве около 60 мкг.

13. Композиция по п. 1, в которой как рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В, так и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А представляют собой гликопротеины НА вируса гриппа дикого типа.

14. Композиция по п. 1, в которой рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А экспрессируются в клетке-хозяине.

15. Композиция по п. 14, в которой клетка-хозяин представляет собой клетку Sf9 насекомого.

16. Композиция по п. 14, в которой рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа В и рекомбинантный гликопротеин НА гриппа из штамма вируса гриппа типа А экспрессируются с использованием бакуловируса.

17. Предварительно заполненный шприц, содержащий композицию по п. 1.

18. Предварительно заполненный шприц по п. 17, в котором композиция стабильна в течение по меньшей мере 12 месяцев.

19. Предварительно заполненный шприц по п. 17, в котором композиция стабильна при 25°С.

20. Способ стимуляции иммунного ответа против гриппа, включающий введение поливалентной композиции против гриппа по любому из пп. 1-16.

21. Способ по п. 20, в котором композицию вводят внутримышечно.

22. Полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер, содержащий композицию по п. 1.

23. Полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер по п. 22, в котором композиция стабильна в течение по меньшей мере 12 месяцев.

24. Полученный выдуванием/фасовкой/запаиванием контейнер по п. 22, в котором композиция стабильна при 25°С.