Средство гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью Российский патент 2018 года по МПК A61K35/10 A61P37/02 

Описание патента на изобретение RU2662094C1

Изобретение, относящееся к медицине, конкретно к фармакологии, результаты которого могут быть использованы для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Гуминовые вещества - основная органическая составляющая почвы, воды, твердых полезных ископаемых, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов окружающей среды. Запасы гуминовых веществ планеты можно считать неограниченными, поскольку гумификация - это «всеобщий процесс постмортального превращения органических остатков, он может протекать в почвах, природных водах, илах, торфах, при углеобразовании и образовании горючих сланцев, любых каустобиолитов… его нельзя ограничивать только почвенной средой» [13]. Гумификация является глобальным явлением, свойственным любой почве, начиная от старых почв арктических пустынь, черноземов и тропиков до довольно молодых на техногенных отвалах или вулканических пеплах. В процессе гумификации образуется особый класс высокомолекулярных органических азотсодержащих природных соединений, не существующих в живых организмах - гумусовых кислот (гидрокси-, оксокарбоновых кислот с ароматическим ядром), делящихся, в свою очередь, на темноокрашенные гуминовые кислоты (ГК), растворимые в щелочах и нерастворимые в кислотах, гиматомелановые кислоты, растворимые в этаноле и фульвовые кислоты, растворимые в водных растворах кислот [3].

Состав гумусовых веществ торфяников, содержание функциональных групп и молекулярных фрагментов (по данным 13С-ЯМР) зависит от ботанического вида исходных растительных остатков, степени гумификации (разложения) растительного опада, а также климатических условий периода формирования почвенного органического вещества [4, 6, 12, 15, 29].

Гуминовые кислоты торфа - высокомолекулярные азотсодержащие соединения циклического строения, представляющие собой смесь темноокрашенных органических, высокомолекулярных, в основном ароматических, метоксисодержащих, гидрокси- и оксокарбоновых кислот, объединенных общим типом строения, но имеющих некоторые различия, определяемые их происхождением [11].

Несмотря на недостаточную изученность, вещества гуминовой природы давно и широко применяются во многих отраслях деятельности человека: в промышленности при нефте- и газодобыче, для ремедиации территорий, загрязненных отходами производства, в сельском хозяйстве в качестве ветеринарных препаратов [24] и компонентов органоминеральных удобрений [16].

В последние годы и в экспериментальной медицине наблюдается повышение интереса к использованию ГК. Получены весомые результаты, как подтверждающие их фармакологические противоопухолевые, гепатопротекторные, ранозаживляющие свойства, так и предполагаемые механизмы действия [2, 9, 27, 28]. Показано, что ГК различной этиологии и разных физико-химических характеристик обладают широким спектром плейотропных иммунологических эффектов - оказывают влияние на поляризацию иммунокомпетентных клеток по классическому или альтернативному пути за счет селективной секреции про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-α и ИНФ-γ) [18, 25], обладают противовирусной активностью против вирусов герпеса 1 и 2 типов (HSV1, HSV2), респираторного и цитомегаловируса человека (HCMV, RSV) in vitro [17] и иммунокоррегирующими свойствами на фоне антибактериальной терапии рядом антибиотиков (ампициллин, амикацин, доксициклин, рифампицин, рифамицин), а также способствует значительной локализации воспаления и усилению сосудообразования при ксенотрансплантации [22]. Также ГК способны действовать как мощные антиприонные агенты при лечении нейродегенеративных расстройств у животных [21] и проявлять синергический цитотоксический эффект на β-амилоидный белок на модели SK-N-MC нервных клеток человека [19]. Кроме того, ГК не проявляют токсических эффектов в широкой линейке доз у экспериментальных животных при пероральном или накожном применении [8, 26].

Известно, что эффективный иммунный ответ зависит от поляризации антигенпрезентирующих клеток, прежде всего макрофагов. Функциональное состояние МФ определяется способом утилизации L-аргинина и изменением цитокинового профиля: Th1-цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИНФ-γ и ФНО-α), стимулируя цитотоксические лимфоциты и натуральные киллеры, являются основными индукторами клеточно-опосредованного иммунного ответа и ассоциированных с ним воспалительных реакций; Тh2-цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13, ТФР-β активируют В-лимфоциты и определяют таким образом гуморальный иммунный ответ. Классически активированные МФ преобразуют L-аргинин с помощью индуцибельной NO-синтазы в оксид азота и цитруллин, а альтернативно активированные - с помощью аргиназы в мочевину и орнитин, приводя, соответственно, к развитию Th1 или Th2 типа иммунного ответа [20, 23].

Однако применение гуминовых веществ в медицине на текущий момент является сложной задачей. Это связано с тем, что ГК не имеют привычного стехиометрического состава и регулярного строения, обладают полидисперсностью и широкой гетерогенностью структурных элементов, а также могут значительно отличаться между собой по свойствам в зависимости не только от вида исходного сырья, но и от способа их извлечения - выщелачивающего реагента [1, 7]. Так, извлечение ГК из торфа водными растворами гидроксидов щелочных металлов представляет собой процесс образования солей, имеющих большую степень ионизации в водных растворах, чем сами ГК. Гидроокись натрия среди всех известных экстрагентов ГК имеет самую наибольшую степень диссоциации в водных растворах, поэтому данный экстрагент обладает высокой извлекающей способностью, т.к. растворимость ГК усиливается повышением содержания гидроксильных ионов. При использовании другого щелочного экстрагента - децимолярного раствора пирофосфата натрия происходит внутрисферное замещение лигандов в металло-гуминовых комплексах, поэтому вся специфичность действия пирофосфата натрия сводится к образованию нерастворимых осадков с кальцием и другими многовалентными катионами. Пирофосфат натрия, за счет своих комплексоообразующих свойств, способен разрушать комплексы ковалентного и ионного типов. Пирофосфаты кальция, железа и алюминия труднорастворимы, поэтому параллельно протекает процесс декальцинирования, что способствует более полной экстракции именно свободных (истинных) ГК [10]. Полученные таким образом ГК торфа представляют собой водорастворимый аморфный порошок темно-коричневого цвета, без запаха.

В предыдущих исследованиях нами показано, что ГК, как базовый компонент гуминовых веществ, способны дозозависимо усиливать продукцию оксида азота, не влияя на активность аргиназы, перитонеальными макрофагами (МФ), что предполагает наличие у них потенциальной иммуномодулирующей активности [5].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств природного происхождения, обладающих способностью избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых гуминовых кислот, выделенных экстракцией пирофосфатом натрия из верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа, отобранного с глубины 10-50 см на торфяном месторождении «Васюганское» (участок Высокий рям) Бакчарского района Томской области, обладающие способностью к избирательной стимуляции продукции ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ, для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых ГК, выделенных из верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа экстракцией пирофосфатом натрия. Новое свойство водорастворимых ГК, выделенных при экстракции пирофосфатом натрия из верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, и описание этого свойства не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных фигур 1 и 2. На фиг. 1 представлен абсорбционный спектр гуминовых кислот, выделенных из верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа. На фиг. 2 представлен молекулярный спектр гуминовых кислот верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа.

С целью получения представительного среднего образца торфа, в котором наиболее полно отражена неоднородность химического состава всей партии анализируемого материала, отбор пробы торфа проводили буром ТБГ-1 в генетическом центре торфяного месторождения «Васюганское» (участок Высокий рям) Бакчарского района Томской области, из середины однородного по ботаническому составу горизонта с глубины 10-50 см, в летний период (июнь-август) согласно ГОСТ 17644-83 «Торф. Методы отбора проб из залежи и обработки их для лабораторных испытаний». В скважине с каждой глубины отбирали только один раз, масса одной пробы составляла не менее 600 г, количество скважин - не менее 50, средняя масса пробы торфа составляла более 30 кг. Согласно проведенному ботаническому и гравиметрическому анализу, а также общетехнической характеристики, отобранный торф охарактеризован как верховой тип, сосново-сфагново-пушицевый вид, степень разложения растительных остатков 30-35%, содержание минеральной примеси (общей золы) - не более 7,2%, содержание биологически активных гуминовых кислот 13,2 масс. %.

Партию торфа высушивали при комнатной температуре на воздухе в хорошо проветриваемом помещении, периодически перемешивая, до воздушно-сухого состояния, измельчали в роторно-ножевой мельнице и просеивали через сито с диаметром отверстий 3 мм, обрабатывали 0,1 моль/л раствором пирофосфата натрия (Na4P2O7) в массовом соотношении 1:50-1:100 в течение 8 часов при постоянном перемешивании в реакторе Р-100 при температуре 25-27°C, отделяли жидкую фазу (экстракт ГК) от осадка (остатка торфа) фильтрованием при помощи системы вакуумной фильтрации (нутч-фильтр), для осаждения ГК из экстракта жидкую фазу обрабатывали хлороводородной кислотой до pH 1-2, выделившиеся ГК разделяли в поле центробежных сил (центрифугированием), отмывали водой очищенной до pH 7 и высушивали при комнатной температуре.

Полученные вышеописанным способом гуминовые кислоты из верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа были охарактеризованы по физико-химическим параметрам: элементному составу, электронным и молекулярным спектральным свойствам, молекулярному весу.

1. Элементный состав ГК определяли методом сожжения на C,H,N - анализаторе «Carlo Erba Strumentazione» модель 1106, содержание кислорода определяли по разности.

Элементный состав ГК верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа, представленный в таблице 1, показывает распределение основных конституционных элементов молекулярной структуры вещества и является диагностическим показателем для характеристики субстанции. Атомное отношение элементов углерода и водорода (Н/С=1,11) указывает на ароматический характер молекулы ГК, т.к. содержание водорода всего на 11% выше углерода, следовательно, алифатическая часть молекулы выражена незначительно и/или является полизамещенной различными кислород и азотсодержащими функциональными группами. Соотношение содержания кислорода в ГК относительно углерода порядка 45% свидетельствуют о большом количестве кислородсодержащих функциональных групп, в основном фенольных, карбонильных и карбоксильных групп. Содержание азота в молекуле ГК относительно количества углерода незначительно (около 4%).

2. Регистрацию электронных спектров поглощения 0,001% водных растворов ГК проводили на спектрофотометре Unico 2800 (производство США) в диапазоне длин волн 190-800 нм в кварцевой кювете толщиной 1 см. Из полученных спектров определяли коэффициенты экстинкции, которые характеризуют оптические плотности раствора ГК для слоя 1 см, при концентрации ГК 0,001% при длине волны 465 нм (А465) и 650 нм (A650) и вычисляли коэффициент цветности Q4/6 по Е. Вельте [30] как отношение оптических плотностей при длинах волн 465 и 650 нм (А465665).

Электронный спектр ГК верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа представлен на фиг. 1, согласно которой в видимой области (400-800 нм) спектр не имеет четко выраженных максимумов поглощения, и выглядит как пологая кривая, характеризующая сплошное поглощение с постепенным уменьшением оптической плотности по мере увеличения длины волны. В ультрафиолетовой области спектра (200-400 нм) поглощение света резко возрастает в коротковолновую сторону. При этом в области 275 нм выделяется плечо, характерное для фенольных, карбонильных, карбоксильных групп и полиеновых цепей, что, вероятнее всего, соответствуют n→π*-переходам, присущим для ароматических альдегидов, кетонов, карбоновых кислот и их функциональных и гетерофункциональных производных. Кроме того, в этой же области расположены: полосы поглощения 1) n→π*-переходов вызванные ауксохромными группами, такими как -O-R, -NHR, -NR2 и др., находящимися в p-π- и π-p-π-сопряжениях с бензольными кольцами; 2). π→π*- и n→π*-переходами в виду наличия в структуре ГК фрагментов с цепью π-π-сопряжений ароматического кольца и карбонильных групп с кратными C=C-связями (структурные фрагменты стильбенового типа, коричных кислот и т.п.), ката-конденсированных и периконденсированных ароматических систем типа «аценов», «фенов», пиренов, периленов и др. Характер n→π*-перехода в ГК подтверждается также смещением полосы (275 нм) в коротковолновую область спектра при протонировании молекулы ГК.

Важным диагностическим параметром ГК, как темноокрашенных соединений [13], является интенсивность поглощения света. Полученные гуминовые кислоты характеризовались невысокими коэффициентами цветности (Q4/6) и экстинкции (ЕA465, ЕA650), обуславливающими высокую поляризованность молекулы ГК (Таблица 2).

3. Исследование молекулярных параметров структуры ГК проводили методом инфракрасной (ИК) спектроскопии на ИК - Фурье - спектрометре ФСМ 1201 (ООО «Инфраспек») в таблетках с KBr (в соотношении 1:100 соответственно), в интервале значений частоты от 500 до 4000 см-1. Для количественной оценки интенсивности полос поглощения и относительных концентраций функциональных групп использован метод относительных оптических плотностей полос поглощения (ОППП).

Молекулярный спектр ГК верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа (фиг. 2), выявил широкую интенсивную полосу поглощения с максимумом при 3500-3300 см-1, обусловленную переменными валентными колебаниями гидроксильных групп (ион) алифатического и ароматического характера, связанных преимущественно водородными связями, наличие которых проявляется максимумом поглощения в интервале 1270-1220 и 1170-1040 см-1. В длинноволновом крыле главной полосы при 3250-3200 см-1 обнаруживается поглощение средней интенсивности, имеющее вид уступа (перегиба) и отвечающее колебаниям N-H (υNH) в структуре амида, аминов, связанных водородными связями. Полосы средней интенсивности хорошо видны при 2928-2921 см-1 и 2855-2842 см-1 за счет переменных валентных колебаний -CH3 и -CH2 групп боковых цепей в молекулах ГК, в том числе связанных с ароматическими фрагментами, судя по наличию полосы поглощения в области 1385 см-1. Отмечается слабое поглощение при 2700-2400 см-1 присущее димерам карбоновых кислот. Отчетливый максимум сильной интенсивности обнаруживается в интервале 1725 см-1-1710 см-1, свойственном для валентных колебаний карбонильных групп (υС=О), которые могут быть представлены кетонами, альдегидами, карбоновыми кислотами и их функциональными производными. В ИК-спектре ГК обнаруживается сильная полоса в области 1650-1600 см-1, обусловленная плоскостными валентными колебаниями сопряженных углерод-углеродных (ароматические, υС=С) и углерод-кислородных связей (карбонилы, связанные водородными связями, карбоксилат-ионы, υC=O) в ароматическом скелете и хинонах. Полоса поглощения около 1513 см-1С-С) указывает на наличие неконденсированных моноароматических структур. В данной области наблюдаются также колебания связей полипептидов в составе ГК, связанных с атомами азота и кислорода (N-H, N-C=O): первичной (1580-1632 см-1) и вторичной (1512-1560 см-1) аминогрупп. Колебания в области 1264-1225 см-1 определяются в основном валентными (υС-О) и деформационными колебаниями (δО-Н) связей недиссоциированных карбоновых кислот и их функциональных производных (в основном сложных эфиров как арильного, так и алкильного типов). За поглощение излучения в коротковолновой части спектра в области 1175-1000 см-1 ответственны валентные колебания гидроксильных групп (ион) спиртов и углеводов. В интервале около 1075-1013 см-1С-О) поглощают излучение первичные спирты, при 1125-1100 см-1С-О) - вторичные спирты и при 1175-1150 см-1С-О) - третичные спирты. Поглощение в данной области (1175-1000 см-1) может быть также обусловлено валентными колебаниями (υC-O-C) гликозидных связей углеводов, лактонов, С-О-С-связями циклических и алифатических простых эфиров, при этом присутствие С-O связей полисахаридов также подтверждается колебаниями в области 830-1100 см-1. В области волновых чисел от 800 до 600 см-1 наблюдаются слабые полосы поглощения, возможно обусловленные внеплоскостными деформационными колебаниями (бон) в ароматических кольцах, имеющих два и более незамещенных атомов водорода, и в том числе присутствием конденсированных многоядерных аренов (755-760 см-1).

Спектральные коэффициенты являются характерным диагностическим показателем структуры ГК. Высокая интенсивность полос поглощения говорит о большей обогащенности функциональными группами, т.е. чем выше интенсивность поглощения, тем больше содержание этой группы или фрагмента. Относительная количественная оценка содержания функциональных групп в молекулах ГК по данным ИК-спектроскопии дана на основании отношений оптических плотностей полос поглощения (ОППП) кислородсодержащих функциональных групп (υОН3400 см-1, υС=О 1720 см-1, υC-O, С-О-С 1225 см-1, υC-O 1035 см-1,) к оптическим плотностям полос поглощения, соответствующим ароматическим (υС=С1610 см-1) и алифатическим (υAlif2920 см-1) фрагментам структуры, и представлена в таблице 3.

Одними из основных кислородсодержащих функциональных групп в молекуле ГК верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа являются: гидроксильные (υOH3400-3300 см-1, υС-О 1150-1000 см-1) группы, карбоксильные группы и их функциональные производные (υС=О 1725-1700 см-1, υС-О 1260-1225 см-1), а также простые эфирные группы (υC-O-C 1050-1035 см-1). Рассматривая отношения ОППП алифатических фрагментов структуры к ароматическим (AAlif2920/AC=C 1610) можно отметить, что наблюдается преобладание ароматических структур над алкильными и над кислородсодержащими функциональными группами. Также наблюдается обратная зависимость в отношениях ОППП кислородсодержащих функциональных групп к алифатическим фрагментам структуры, где в основном преобладают группы карбоновых кислот и сложных эфиров.

4. Молекулярную массу определяли методом гель-проникающей хроматографии на приборе Ultimate 3000 (Thermo Scientific, США) с использованием колонки Ultrahydrogel 250, 300×7,8 мм, подвижная фаза - 0,1 М NaNO3, 0,01% NaN3 в воде, скорость потока 1 мл/мин. Детектирование спектрофотометрическое при длине волны 200 нм. Расчет молекулярной массы проводили по калибровочному графику log Mw=f(tR) построенному по стандартам PSS (polystyrene sulfonate) 891 - 976000 Da (Polymer Standarts Service Service GmbH, Германия). Среднечисленная молекулярная масса ГК составила 6110,2 Да; среднемассовая молекулярная масса составила 22783,9; полидисперсность - 3,7; медиана - 11798,9 Да.

Биологическую активность ГК оценивали на линейных мышах C57BL/6 [14]. Животные в возрасте 8-10 недель были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ РАН (ветеринарное свидетельство 270 №0008633 15 июля 2015 г.). Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране животных используемых в научных целях, ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». В качестве контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид и пирогенал, in vitro - мурамилдипептид.

Макрофаги получали из суспензии перитонеальных клеток, для чего животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Далее клетки (1,5-2,0×106/мл) помещали в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч при 37°C (в атмосфере 5% СО2 и абсолютной влажности) в среде RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицин («Sigma»), 2 мМ L-глютамин («Sigma»)). Полученные после прилипания макрофаги переносили в плоскодонные 96-луночные планшеты (2,5-3,0×106 клеток/мл) и культивировали в указанных выше условиях в присутствии ГК (100 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111:В4, «Sigma»); 10 мкг/мл мурамилдипептида (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»). Продукцию монокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл), лимфокинов - конканавалином А (4 мкг/мл) или митогеном лаконоса (5 мкг/мл). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам: ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12 и ИФН-γ («eBioscience»).

Количество цитокинов, вырабатываемых мононуклеарами периферической крови человека (Мн), определяли в супернатантах клеток, получаемых следующим образом. Жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь здоровых доноров с добавлением гепарина (10 ЕД/мл). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности, трижды отмывали их холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде, оценивали жизнеспособность. Далее Мн (2,5-3,0×106 клеток/мл) помещали в 96-луночный планшет и вносили ГК (100 мкг/мл), продукцию цитокинов стимулировали добавлением митогенов, как указано выше. Через 24 ч инкубации собирали бесклеточный супернатант, в котором иммуноферментным методом при помощи тест-систем определяли количество цитокинов согласно прилагаемым протоколам: ИЛ-10 и ИФН-γ («R@D Systems»), ФНО-α - («Вектор-Бэст»).

ГК вводили мышам ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. В предварительных экспериментах in vivo было выявлено, что для проявления иммуномодулирующего эффекта оптимальной суточной дозой ГК является концентрация 1 мг/кг массы тела, пирогенала (Филиал «Медгамал» ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) - 5 мкг/кг и ликопида (ЗАО «Пептек», Россия) - 2 мг/кг. Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа через 5 дней от начала введения ПС животных иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией эритроцитов барана (5×107).

Для оценки действия ГК на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 эритроцитов барана в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап.

Влияние ГК на гуморальное звено иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, для чего животных, получавших курс ПС, забивали на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (на пике IgM-AOK и IgG-АОК, соответственно).

Полученные в ходе исследования данные будут обрабатываться с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0. Для каждой выборки будет вычисляться среднее арифметическое (X), ошибка среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Проверка на нормальность распределения будет проводиться с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборочных средних будет осуществляться по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной в случае нормального распределения или по критерию Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) и критерия Данна в случае распределения, отличающегося от нормального.

Пример 1.

ГК, выделенные из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа с глубины 10-50 см торфяного месторождения «Васюганское» (участок Высокий рям) Бакчарского района Томской области, при культивировании с интактными МФ значительно, в 28 раз, увеличивали концентрацию ИЛ-12 - ключевого цитокина, ответственного за эффективность Т-клеточного иммунного ответа (Таблица 4) - с 0,166±0,018 пг/мл в контроле до 4,480±0,702 пг/мл. При культивировании макрофагов без добавления каких-либо стимуляторов (среда) сколько-нибудь значимых количеств данного цитокина в супернатанте обнаружено не было, а ЛПС даже снижал показатель в 2,1 раза. Активирующее действие мурамилдипептид (МДП) также было значительным относительно контроля и существенно не отличалось от ГК.

Примечания:* - достоверные различия с контролем; • - достоверные различия с митогеном; n=6.

ГК значительно, в 2,5 раза, усиливали секрецию другого провоспалительного цитокина ИЛ-2 митогенстимулированными спленоцитами мышей с 105,453±16,797 пг/мл при стимуляции Кон А до 268,310±3,170 пг/мл при добавлении ГК (Таблица 5). Кроме того, под влиянием ГК концентрация ИФН-γ увеличивалась в 5,9 раза с 2,901±0,543 в контроле до 17,101±2,521 пг/мл в опыте.

Примечания:* - достоверные различия с контролем; • - достоверные различия с митогеном. n=6.

В отсутствии каких-либо стимуляторов макрофаги продуцировали 20,048±5,036 пг/мл ИЛ-10. При добавлении стандартного активатора макрофагов ЛПС концентрация цитокина в супернатанте увеличилась в 6,9 раза до 138,770±7,635 пг/мл и в 4,6 (до 91,805±12,882 пг/мл) и 5 (до 100,567±5,485 пг/мл) раз в присутствии МДП и ГК, соответственно. Однако в условиях экспериментального воспаления (ЛПС стимуляция) ГК резко, в 1,5 раза, снижали митогенстимулированную продукцию ИЛ-10, в отличие от МДП, сохранявшего свои активирующие свойства (Таблица 6).

ГК не влияли на продукцию ИЛ-4 спленоцитами мышей, стимулированную митогеном лаконоса (Таблица 7).

Примечания:* - достоверные различия с контролем; • - достоверные различия с митогеном. n=6.

Примечания: * - достоверные различия с контролем. n=6.

На модели моноцитов периферической крови человека показано (Таблица 8), что при добавлении водорастворимых гуминовых кислот верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа концентрация ФНО-α резко увеличивалась с 1,486±0,92 пг/мл в контроле до 92,176±3,354 пг/мл как при культивировании с ГК, так и с МДП до 151,070±11,263 пг/мл. Активирующее действие ГК сохранялось и при оценке их влияния на продукцию ИФН-γ лимфоцитами: концентрация цитокина увеличивалась в 66,9 раза с 0,042±0,007 до 2,809±2,144 пг/мл.

Примечание: * - различия с контролем достоверны. n=6.

Оценка влияния исследуемых веществ на секрецию ИЛ-10 показала, что ГК не влияют на спонтанную продукцию цитокина в отличие от МДП, который ее значительно, в 7,1 раза, усиливал. Более того, инкубация мононуклеаров с ГК в условиях ЛПС-моделированного воспаления приводила к существенному снижению в 3,8 раза концентрации цитокина (Таблица 9). ГК не усиливали митогенстимулированную продукцию ИЛ-4 (Таблица 10).

Примечания: * - достоверные различия с контролем; • - достоверные различия с митогеном. n=6.

Примечания:* - достоверные различия с контролем. n=6.

Таким образом, экспериментально установлено, что ГК, выделенные из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа, снижают продукцию ИЛ-10 на фоне стимуляции выработки антигенпрезентирующими клетками ключевых провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ лимфоцитами. Следует отметить, что по своему цитокин-стимулирующему действию ГК значительно превосходят препарат сравнения МДП.

Пример. 2.

Курсовое введение ГК верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа животным на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, привело к подавлению реакции ГЗТ - маркерной реакции клеточного Тh1 иммунного ответа (Таблица 11). Курсовое введение препарата сравнения - ликопида - усиливало показатель в 1,3 раза. Величина отека при применении ГК и пирогенала снижалась в 1,6 по сравнению с контролем и в 2-2,2 раза относительно ликопида.

Примечание: * - различия с контролем достоверны. n=8.

Пример 3.

Влияние исследуемых гуминовых кислот на гуморальное звено Th1-зависимого иммунного ответа оценивали по количеству АОК. Показано, что курсовое введение ГК, выделенных при экстракции пирофосфатом натрия из верхового сосново-сфагново-пушицевого торфа, животным на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, приводило к достоверному повышению числа АОК (Таблица 12). Показатель увеличивался как у мышей, получавших ликопид, так и ГК в 1,2 и 1,7 раза, соответственно. Пирогенал, напротив, значительно, в 3,5 раза, снижал интенсивность антителообразования. При этом титр гемаагглютининов неизменно увеличивался при курсовом введении всех исследуемых веществ в 1,8 (ликопид), 1,7 (пирогенал) и в 2,8 (ГК) раза. Более того, ГК в среднем в 1,5 раза усиливали РГА по сравнению с ликопидом и пирогеналом.

Примечание: * - различия показателя с контролем достоверны; • - различия показателя со ликопидом достоверны; ■ - различия показателя с пирогеналом достоверны. n=6.

Таким образом, экспериментально установлено, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа, снижают продукцию ИЛ-10 на фоне стимуляции выработки ключевых провоспалительных цитокинов антигенпрезентирующими клетками - ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-α и лимфоцитами - ИФН-γ. Курсовое введение гуминовых кислот снижает интенсивность реакции клеточного иммунитета и усиливает показатели гуморального иммунитета. Гуминовые кислоты, выделенные из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа, являются активаторами воспалительных свойств макрофагов по Th1-зависимому типу иммунного ответа и могут расширить арсенал малотоксичных средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах, хронических и онкологических заболеваниях.

Список литературы

1. Бакина, Л.Г. Особенности извлечения гумусовых кислот из почв растворами пирофосфата натрия различной щелочности / Л.Г. Бакина, Н.Е. Орлова // Почвоведение. - 2012. - №4. - С. 445-452.

2. Бузлама, А.В. Анализ фармакологических свойств, механизмов действия и перспектив применения гуминовых веществ в медицине / А.В. Бузлама, Ю.Н. Чернов // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - Т. 73, - №9. - С. 43-48.

3. Ваксман, С.А. Гумус, происхождение, химический состав и значение в природе / С.А. Ваксман // М.: Сельхозгиз. - 1937. - 437 с.

4. Василевич, Р.С. Строение высокомолекулярных органических веществ тундровых бугристых торфяников / Р.С. Василевич, В.А. Безносиков, Е.Д. Лодыгин // Материалы VI Всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере». - Сыктывкар. - 2014. - c. 49-52.

5. Влияние гуминовых кислот торфа различного генеза на продукцию оксида азота in vitro (скрининговое исследование) / Е.С. Трофимова [и др.] // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2016. - №5. - С. 626-636.

6. Гостищева, М.В. Характеристика органического вещества торфяных почв эвтрофного болота Таган Томской области / М.В. Гостищева, Л.И. Инишева, А.И. Щеголихина // Вестник ТГПУ. - 2010. - №3. - С. 114-119.

7. Гуминовые кислоты торфа и препараты на их основе / И.И. Лиштван [и др.] // Природопользование. - 2004. - Вып. 10. - С. 114-119.

8. Исматова, Р.Р. Низкая токсичность и противовоспалительная активность гуматов, выделенных из торфа и сапропеля Томской области / Р.Р. Исматова, А.У. Зиганшин, С.Е. Дмитрук, И.В. Федько // Казанский медицинский журнал. - 2006. - Т. 87. - №6. - С. 454-455.

9. Исследование гепатозащитных свойств нативных гуминовых кислот низинного торфа Томской области / М.В. Белоусов [и др.] // Хим.-фарм. журн. - 2014. Т. 48, №4. С. 28-31.

10. Комиссаров, И.Д. Влияние способа извлечения гуминовых кислот из сырья на химический состав полученных препаратов / И.Д. Комиссаров, И.Н. Стрельцова // Гуминовые препараты: Научный трактат. Т. XIV. Тюмень. - 1974. - С. 48-62.

11. Кухаренко, Т.А. Об определении понятия и классификации гуминовых кислот / Т.А. Кухаренко // Химия твердого топлива. - 1979. - №5. - С. 3-11.

12. Левашенко, Д.В. Климатический оптимум голоцена в дельте Печоры / Д.В. Левашенко, Е.С. Малясова // Известия РАН. Сер. географическая. - 2007. - №4. - С. 125-132.

13. Орлов, Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. - М.: МГУ, 1990. - 325 с.

14. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 4.1. - М.: Гриф и К. 2013. - С. 64-79.

15. Сартаков, М.П. Графостатистический анализ и спектроскопия 13С-ЯМР молекул гуминовых кислот торфов Среднего Приобья / М.П. Сартаков, В.Д. Тихова // Вестник КрасГАУ. - 2009. - №6. - С. 76-80.

16. Хричтева, Л.А. Роль гуминовой кислоты в питании высших растений и гуминовые удобрения / Л.А. Хричтева // Труды почвенного института им. В.В. Докучаева, М.: 1951. - Т. 38. - 314 с.

17. In vitro evaluation of the antiviral properties of Shilajit and investigation of its mechanisms of action / V. Cagno [et al.] // Journal of Ethnopharmacology. - 2015. -, V. 166. P. - 129-134.

18. Inglot, A.D. A. A method to assess the immunomodulating effects of the Tolpa Torf Preparation (TTP) by measuring the hyporeactivity to interferon induction and tumor necrosis factor response / A.D. Inglot, A.Sypula // Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. - 1993. - V. 41. - Is. 1. - P. - 87-93.

19. Li, H.H. Humic Acid Increases Amyloid β-Induced Cytotoxicity by Induction of ER Stress in Human SK-N-MC Neuronal Cells / H.H. Li [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2015. -V. 16. - Is. 5. - P. - 10426-10442.

20. Mosmann, T.R. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymfokine secrecion lead to different functional properties / T.R. Mosmann, R.L. Coffman // Ann. Rev. Immunol. - 1989. - V. 7. - P. 145-173.

21. Prion protein interaction with soil humic substances: environmental implications / G. Giachin [et al.] // PloS one. - 2014. - V. 9. - Is. 6. - P. - e100016. (DOI: 10.1371/journal.pone.0100016).

22. D.M. Angiomodulatory properties of some antibiotics and Tolpa Peat Preparation / D.M. [et al.] // Central-European Journal of Immunology. - 2016. -V. 41. - Is. 1. - P. - 19-24.

23. Rivera, A. Innate cell communication kick-starts pathogen-specific immunity / A. Rivera, [et al.] // Nature Immunology. - 2016. - V. 17. - Is.4. - P. - 356-363.

24. Van Rensburg, C. J.In vitro and in vivo assessment of humic acid as an aflatoxin binder in broiler chickens / C. J. van Rensburg [et al.] // Poultry Science - 2006. - V. 85. - Is.9. - P. - 1576-1583.

25. Van Rensburg, C.E. Potassium humate inhibits complement activation and the production of inflammatory cytokines in vitro / C.E. Van Rensburg, P.J. Naude // Inflammation - 2009. - V. 32. - Is. 4. - P. - 270-276.

26. Van Rensburg, С.E. Topical application of oxifulvic acid suppresses the cutaneous immune response in mice / С. E. J. Van Rensburg, S. С. K. Malfeld, J. Dekker // Chemotherapy. - 2002. - V. 48. - P. - 138-143.

27. Vetvicka, V. Prophylactic effects of humic acid-glucan combination against experimental liver injury / V. Vetvicka, J.M. Garcia-Mina, J.C. Yvin // Journal of Intercultural Ethnopharmacology. - 2015. - V. 4. - Is. 3. - P. - 249-255.

28. Vetvicka, V. The relative abundance of oxygen alkyl-related groups in aliphatic domains is involved in the main pharmacological-pleiotropic effects of humic acids / V. Vetvicka [et al.] // Journal of Medicinal Food. - 2013. - V. 16. - Is. 7. - P. - 625-632.

29. Worall, F. Can climate change explain increases in DOC flux from upland peat catchments? / F. Worall, T. Burt, J. Adamson // Science of the Total Enviroment. - 2004. - N. 326. - P. - 95-112.

30. Welte, E. Zur Konzentrationsmessung von Huminsauren / E. Welte // Z. Pflanzenernahr., Dung., Bodenkunde. - 1956. - V. 74. - №3.

Похожие патенты RU2662094C1

название год авторы номер документа
Средство гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующим действием 2022
  • Шерстобоев Евгений Юрьевич
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Лигачева Анастасия Александровна
  • Зыкова Мария Владимировна
  • Белоусов Михаил Валерьевич
RU2783772C1
Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью 2019
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Зыкова Мария Владимировна
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Лигачева Анастасия Александровна
  • Шерстобоев Евгений Юрьевич
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Юсубов Мехман Сулейманович
  • Жукова Ксения Михайловна
  • Кривощеков Сергей Владимирович
  • Логвинова Людмила Анатольевна
  • Братишко Кристина Александровна
RU2716504C1
Средство гуминовой природы, обладающее противоаллергической активностью 2020
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Зыкова Мария Владимировна
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Лигачёва Анастасия Александровна
  • Шерстобоев Евгений Юрьевич
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Жукова Ксения Михайловна
  • Скогорева Любовь Степановна
  • Кривощеков Сергей Владимирович
  • Логвинова Людмила Анатольевна
  • Братишко Кристина Александровна
  • Цупко Андрей Владиславович
  • Михалев Дмитрий Александрович
RU2750098C1
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ГУМИНОВОЕ СРЕДСТВО 2020
  • Милов Николай Иванович
RU2756353C1
Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью 2018
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Гурьев Артем Михайлович
  • Лигачева Анастасия Александровна
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Шерстобоев Евгений Юрьевич
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Юсубов Мехман Сулейманович
  • Ровкина Ксения Игоревна
  • Данилец Андрей Викторович
  • Кривощеков Сергей Владимирович
RU2697526C1
СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ ПРОДУКЦИЮ ОКСИДА АЗОТА МАКРОФАГАМИ in vitro, НА ОСНОВЕ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ТОРФА БОЛОТ ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2015
  • Зыкова Мария Владимировна
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Кривощеков Сергей Владимирович
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Лигачёва Анастасия Александровна
  • Шерстобоев Евгений Юрьевич
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Юсубов Мехман Сулейманович
RU2610446C2
Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью 2017
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Гурьев Артем Михайлович
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Лигачева Анастасия Александровна
  • Шерстобоев Евгений Юрьевич
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Юсубов Мехман Сулейманович
  • Тобольжина Светлана Александровна
  • Ровкина Ксения Игоревна
  • Кривощеков Сергей Владимирович
RU2657819C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ 2011
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Лигачева Анастасия Александровна
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Бельская Наталия Витальевна
  • Бельский Юрий Павлович
  • Учасова Евгения Геннадьевна
  • Иванова Алена Николаевна
  • Агафонов Владимир Иванович
  • Чурин Алексей Александрович
  • Гурьев Артем Михайлович
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Юсубов Мехман Сулейманович
RU2470656C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ 2010
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Гурьев Артем Михайлович
  • Бельская Наталия Витальевна
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Бельский Юрий Павлович
  • Юсубов Мехман Сулейманович
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Агафонов Владимир Иванович
  • Учасова Евгения Геннадьевна
  • Лигачева Анастасия Александровна
RU2423141C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ 2010
  • Данилец Марина Григорьевна
  • Гурьев Артем Михайлович
  • Бельская Наталия Витальевна
  • Белоусов Михаил Валерьевич
  • Бельский Юрий Павлович
  • Юсубов Мехман Сулейманович
  • Трофимова Евгения Сергеевна
  • Агафонов Владимир Иванович
  • Учасова Евгения Геннадьевна
  • Лигачева Анастасия Александровна
RU2421232C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 662 094 C1

Реферат патента 2018 года Средство гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа. Изобретение обеспечивает расширение арсенала таргетных нетоксичных иммуномодулирующих средств растительного происхождения за счет селективного повышения продукции провоспалительных цитокинов интерлейкина-2, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа макрофагами и интерферона-гамма лимфоцитами, сопровождающееся отсутствием влияния на продукцию интерлейкина-4 и интерлейкина-10. 2 ил., 12 табл., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 662 094 C1

Применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа экстракцией пирофосфатом натрия, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью и стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2662094C1

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ 2007
  • Удинцев Сергей Николаевич
  • Касимова Любовь Владимировна
  • Жилякова Татьяна Петровна
RU2357741C1
И.И
ЛИШТВАН и др
Гуминовые кислоты торфа и препараты на их основе // Природопользование
Способ приготовления мыла 1923
  • Петров Г.С.
  • Таланцев З.М.
SU2004A1
- Вып
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами 1921
  • Богач В.И.
SU10A1
- С
Способ получения борнеола из пихтового или т.п. масел 1921
  • Филипович Л.В.
SU114A1
JUNEK R., et al
Индукционный выпрямитель переменного тока в постоянный 1924
  • Дитрих Ф.Р.
SU937A1
Колосоуборка 1923
  • Беляков И.Д.
SU2009A1
- Vol
Устройство для электрической сигнализации 1918
  • Бенаурм В.И.
SU16A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
- P
РУЧНОЙ СТАНОК ДЛЯ ФОРМОВКИ ПУСТОТЕЛЫХ КАМНЕЙ РАЗЛИЧНОЙ ФОРМЫ 1922
  • Смирнов М.Н.
SU470A1

RU 2 662 094 C1

Авторы

Данилец Марина Григорьевна

Зыкова Мария Владимировна

Трофимова Евгения Сергеевна

Лигачева Анастасия Александровна

Шерстобоев Евгений Юрьевич

Данилец Андрей Викторович

Белоусов Михаил Валерьевич

Юсубов Мехман Сулейманович

Жукова Ксения Михайловна

Кривощеков Сергей Владимирович

Логвинова Людмила Анатольевна

Даты

2018-07-23Публикация

2017-08-14Подача