СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2012 года по МПК A61K36/28 A61P37/02 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1 - зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

В настоящее время в терапии заболеваний, обусловленных недостаточностью Th1 и имеющих своей мишенью макрофагальные клетки используются препараты на основе нуклеиновых кислот (натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеинат, оксиметилурацил), препараты, содержащие микроорганизмы или их производные (имудон, ИРС 19, рибомунил) [4]. Наиболее близким (базовым) препаратом является ликопид, поскольку в основе механизма его иммуномодулирующего действия лежит активация антиген-презентирующих клеток и фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы) [3]. Ликопид активирует клетки моноцитарно-макрофагального звена, стимулируя продукцию ими воспалительных цитокинов.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуно-модулирующих средств растительного происхождения, повышение их эффективности путем избирательной стимуляции продукции макрофагами ин-терлейкина-12 и фактора некроза опухоли-альфа.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, в качестве стимулятора продукции макрофагами ИЛ-12 и TNF-α, следствием чего является активация Th1 - зависимого типа иммунного ответа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых полиса-харидов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной.

Новое свойство водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, было обнаружено в результате экспериментальных исследований.

Доказано, что для эффективного противомикробного и противоопухолевого ответа необходимо, чтобы иммунная система находилась в определенном функциональном состоянии, описываемом термином «поляризация Th1 типа». Маркерной чертой данного типа поляризации является, во-первых, преобладание характерного набора цитокинов, прежде всего, интерферон-гамма, интерлейкин-2, а во-вторых, проявление типичных функций - участие в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, переключение продукции В-лимфоцитами антител класса IgG2a, защита от внутриклеточных патогенов, элиминация опухолевых клеток.

В настоящий момент установлено, что уникальным цитокином, вызывающим дифференцировку наивных Т-лимфоцитов в Т-хелперы 1 типа (Th1), является интерлейкин-12 (ИЛ-12). Он является ключевым в индукции образования цитотоксических Т-лимфоцитов, активации макрофагов, подавлении синтеза иммуноглобулинов G1 и Е, в развитии органоспецифического аутоиммунитета, резистентности к бактериальной и вирусной инфекции. Основными клетками-продуцентами ИЛ-12 являются дендритные клетки и макрофаги. Эти же клетки вырабатывают и противоположный по функциональным свойствам цитокин - интерлейкин-10, который подавляет Th1, подавляет воспаление и создает условия для развития толерантности на антиген. Баланс этих двух цитокинов (интерлейкина-12 и интерлейкина-10) является ключевым для направления поляризации по Th1 или Th2 типу.

Кроме ИЛ-12 фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) является важнейшим провоспалительным цитокином млекопитающих, который вырабатывают макрофаги в раннюю фазу противомикробного ответа. Таким образом, ИЛ-12 и TNF-α, которые вырабатываются макрофагами, являются необходимым условием эффективного противомикробного и противоопухолевого иммунитета [1].

Для стимулирования активности макрофагов мы предлагаем использовать водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, поскольку известно, что полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами антиген-презентирующих клеток [5]. Кроме того, в ряде работ показано, что полисахариды растительного или микробного происхождения могут оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток, при этом полисахариды могут способствовать как развитию Th1-, так и Th2 - зависимого иммунного ответа.

Новое свойство полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве иммуномодулирующего средства водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, можно использовать для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1 - зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания: водорастворимые полисахариды (ПС) были выделены из фармакопейного сырья календулы лекарственной (Calendula offficinalis L.). Полисахариды получены по стандартной методике следующим образом. Фармакопейное сырье измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96% этиловым спиртом и высушивали. Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов, белка и нуклеиновых кислот (табл.1).

Таблица 1 Характеристика исследуемых образцов полисахаридов {Х±m} Название образца Выход ПС (% от массы воздушно-сухого сырья) Содержание в образцах: углеводов (%) белка (%) нуклеиновых кислот (%) ПС календулы 1,48±0,19 97,8±1,06 1,68±0,26 0,165±0,024

Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение (ММР) исследуемых образцов определялись методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPXL 300×7.8 mm («Supelco»), подвижная фаза - вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса ПС, входящих в состав исследуемого образца, определялась по времени удерживания в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich»). На спекте ВЭЖХ исследуемого образца присутствовало 2 пика, соответствующих молекулярной массе 310 и 490 кДа. Таким образом, полученое вещество представляет собой смесь двух полисахаридов с разными молекулярными массами - 310 и 490 кДа.

Эксперименты проведены на линейных мышах BA1b/с и C57BL/6 в возрасте 6-12 недель. Животные были получены из отдела экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат качества №188-05). В предварительных экспериментах было выявлено, что оптимальной суточной дозой полисахаридов, полученных из фармакопейного календулы лекарственной, для иммуномодуляции является 10 мг/кг массы тела. Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных (от 18 марта 1986 г.; Страсбург; ETS №123).

Макрофаги получали из суспензии перитонеальных клеток, для чего животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим. Затем эти клетки помещали по 1,5-2,0×106/мл в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч при 37°С (в атмосфере 5% CO₂ и абсолютной влажности) в среде (среда следующего состава: RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина (РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Россия), 2 мМ L-глютамина («Sigma»), после чего собирали только прилипшие к пластику клетки. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Макрофаги (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл), полученные после прилипания, помещали в плоскодонные 96-луночные планшеты и культивировали в указанных выше условиях в присутствии полисахаридов (20 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111-B4, «Sigma»); 10 мкг/мл мура-милдипептида (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»). Через 48 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов.

Количественное определение ИЛ-12 и ИЛ-10 в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R@D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.

Количественное определение TNF-α, вырабатываемого мононуклеарами периферической крови здоровых доноров, взятой утром натощак из локтевой вены, осуществляли следующим образом. Жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь с добавлением гепарина (10 ЕД/мл) согласно прилагаемой к реактиву инструкции. После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо в растворе. Полученные клетки трижды отмывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность. Мононуклеары помещали в 96-луночный планшет (1×10⁶ клеток/мл), продукцию монокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл) и вносили изучаемые растительные полисахариды (10 мкг/мл). Через 24 ч собирали бесклеточный супернатант и определяли в нем количество TNF-α твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Вектор-Бэст») согласно прилагаемым протоколам.

Для индукции Th1 - зависимого типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, водорастворимые полисахариды вводили мышам по 10 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Через 5 дней от начала введения животных иммунизировали эритроцитами барана (по 5×10⁶ внутрибрюшинно при определении числа АОК и титра антител, по 1×10⁸ при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа).

В экспериментах in vivo использовали ликопид в рекомендованной терапевтической суточной дозе 2 мг/кг, в экспериментах in vitro использовали фармакологическую субстанцию препарата «ликопид» - мурамилдипептид (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem») в концентрации 10 мкг/мл. ПС вводили в оптимальной дозе 10 мг/кг, которую определили в предварительных экспериментах.

Влияние полисахаридов на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей [2]. Для этого животных забивали через 5 дней после иммунизации, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.

Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [2]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10⁸ эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной и контрольной лап.

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistics 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака Х и ошибку средней величины m. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Вычисленное значение t сравнивали с табличным при заданном уровне значимости p<0,05. Если расчетная t больше табличной, то гипотеза о равенстве средних отвергалась.

Пример 1.

Исследуемое вещество, представляющее собой смесь водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, при прямом действии на макрофаги вызывало резкую эскалацию продукции ключевого цитокина, ответственного за эффективный Т-клеточный иммунный ответ, - ИЛ-12 (табл.2). При культивировании макрофагов без добавления каких-либо стимуляторов (контроль 1) не удалось обнаружить сколько-нибудь значимых количеств данного цитокина в супернатантах. При добавлении стандартного активатора макрофагов - липополисахарида из E.coli (серотип O111:B4) макрофаги начинали вырабатывать небольшое количество ИЛ-12. Мурамилдипептид (МДП, фармакологическая субстанция препарата «Ликопид») вдвое повышал ЛПС-стимулированный уровень ИЛ-12, однако изучаемая смесь полисахаридов повышала продукцию ИЛ-12 почти в 12 раз сильнее, чем ЛПС, и в 6 раз сильнее, чем мурамилдипептид. В отсутствие каких-либо стимуляторов макрофаги продуцировали незначительное количество другого цитокина - ИЛ-10. ЛПС стимулировал выработку данного цитокина в 3,2 раза, полисахариды не вызывали увеличения этого ЛПС-стимулированного уровня, а МДП, напротив, еще больше стимулировал эту продукцию - в 3,9 раза.

Все исследуемые вещества стимулировали продукцию TNF-α (табл.3). ПС календулы и мурамилдипептид соизмеримо увеличили продукцию цитокина - в 1,6 раза ПС и в 2,4 раза МДП. В данных условиях эксперимента ЛПС незначительно стимулировал продукцию TNF-α (с 33,8±0,8 пг/мл до 47,3±4,1 пг/мл, p<0,05).

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, стимулируют выработку макрофагами ключевого цитокина, активирующего воспалительный ответ и развитие Th1 - зависимого иммунного ответа, - ИЛ-12, а также стимулируют продукцию макрофагами ведущего цитокина противомикробного и противоопухолевого ответа - фактора некроза опухоли-альфа. Следует отметить, что по своему ИЛ-12-стимулирующему действию изученные полисахариды значительно превосходят как ЛПС, так и мурамилдипептид (фармакологическая субстанция препарата «Ликопид»).

Таблица 2 Влияние полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, на продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мыши (Х±m) Исследуемое вещество Концентрация ИЛ-12 (пг/мл) Концентрация ИЛ-10 (мг/мл) - (контроль 1) - 0,72±0,07 - (контроль 2) 4,4±5,1 2,28±0,19* ПС календулы (10 мкг/мл) 52,1±9,0# 2,25±0,05* МДП (10 мкг/мл) 8,3±4,1 2,84±0,21* Примечания: * - достоверные различия с контролем 1 (уровень цитокинов, вырабатываемый макрофагами в отсутствии каких-либо веществ), p<0,05; # - достоверные различия с контролем 2 (уровень цитокинов, вырабатываемый макрофагами в присутствии ЛПС), p<0,05.

Таблица 3 Влияние полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, на ЛПС-стимулированную продукцию TNF-α мононуклеарами периферической крови здоровых доноров (Х±m) Исследуемое вещество Концентрация TNF-a (пг/мл) - (контроль 1) 33,8±0,8 -(контроль 2) 47,3±4,1 ПС календулы (10 мкг/мл) 76,8±9,4*# МДП мкг/мл) 115,5±6,9*# Примечания: * - достоверные различия с контролем 1 (уровень TNF-α, вырабатываемый макрофагами в отсутствии каких-либо веществ), p<0,05; # - достоверные различия с контролем 2 (уровень TNF-α, вырабатываемый макрофагами в присутствии ЛПС), p<0,05.

Пример 2.

Курсовое введение смеси водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, животным на фоне развития у них Th1 - зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, оказывало стимулирующее действие на гуморальный ответ, индуцированный эритроцитами барана (табл.4). Абсолютное количество АОК после курсового введения изучаемых веществ возрастало: в 2,9 раза (ПС календулы) и в 1,8 раза (ликопид).

Таблица 4 Влияние полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, на количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках иммунизированных мышей (Х±m) Исследуемое вещество Группа Число АОК (10³/селезенку) ПС календулы контроль 22,3±8,5 опыт 64,3±12,3* Ликопид контроль 36,7±6,0 опыт 66,9±9,3* Примечание: * - различия показателя с контролем достоверны, p<0,05.

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, стимулируют протекание иммунного ответа, вызванного эритроцитами барана, а следовательно, являются активаторами Th1 типа иммунного ответа.

Водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, являются активаторами воспалительных свойств макрофагов и Th1 - зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах и онкологической болезни.

Литература

1. Ма X. TNF-α and IL-12: a balancing act in macrophage functioning. // Microbes and Infection. 2001. Vol.3. P. 121-129.

2. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. №1. С.31-36.

3. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. №3. С.199.

4. Энциклопедия лекарств. 2004. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.1081-1082.

5. Schepetkin I.A., Quinn M.T. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol.6, №3. P.317-733.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Тh1 - зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания). Водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, являются активаторами воспалительных свойств макрофагов и Th1 - зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах и онкологической болезни. 4 табл., 2 пр.

Применение смеси водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1 - зависимый тип иммунного ответа.