Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью Российский патент 2018 года по МПК A61K31/715 A61K36/888 A61P37/02 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Известно, что для развития адекватного противомикробного и противоопухолевого ответа необходима активация системы иммунитета по типу Th1 поляризации, основными характеристиками которой являются: с одной стороны, синтез характерного набора цитокинов (ИЛ-12 и ИФН-γ), а с другой, формирование характерных признаков - активация NK-клеток, продукция В-лимфоцитами антител класса IgG2a, усиление реакции гиперчувствительности замедленного типа, элиминация опухолевых клеток и защита от внутриклеточных патогенов. Основным цитокином, ответственным за формирование реакции организма в ответ на интервенцию инфекционного агента является ИЛ-12, экспрессия которого регулирует цепь врожденных реакций и определяет тип адаптивных иммунных реакций. ИЛ-12 индуцирует продукцию ИФН-γ, дифференцировку CD4+ Т-клеток в Т-хелперов 1 типа (Th1) [7]. Основными клетками-продуцентами ИЛ-12 являются дендритные клетки и макрофаги, которые также способны синтезировать и ИЛ-10 - альтернативный по функциональным свойствам цитокин, подавляющий Th1 иммунного ответа, способный угнетать воспаление и создавать условия для развития толерантности на антиген. Баланс этих двух цитокинов (ИЛ-12 и ИЛ-10) является определяющим для направления поляризации по Th1 или Th2 типу. Кроме ИЛ-12 в раннюю фазу противомикробного ответа макрофаги вырабатывают важнейший провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α). Таким образом, ИЛ-12 и ФНО-α, которые вырабатываются антигенпрезентирующими клетками, являются необходимым условием эффективного противомикробного и противоопухолевого иммунитета [9].

Одним из бурно развивающихся в последние годы направлений фармакологии является разработка таргетных фармпрепаратов, целенаправленно влияющих на те или иные звенья иммунной системы [5], что обусловило разработку большого количества препаратов. Для терапии заболеваний, обусловленных недостаточностью Th1 типа иммунного ответа, уже используются препараты, имеющие своей мишенью макрофагальные клетки. Как правило, это препараты микробного происхождения - лизаты (Бронхо-мунал, Имудон, ИРС-19) или отдельные компоненты микроорганизмов (Рибомунил, Продигиозан, Пирогенал, Нуклеинат натрия); биологически активные фрагменты клеточной стенки бактерий (Ликопид), которые могут обладать рядом нежелательных побочных эффектов [3, 6]. Поэтому создание новых совершенных препаратов, которые будут более эффективными и безопасными, чем имеющиеся средства, является важной задачей. Иммуномодуляторы растительного происхождения обладают рядом преимуществ, как то: минимальное количество побочных эффектов и противопоказаний, возможность применения в педиатрии, а также у пожилых лиц со сниженной реактивностью иммунной системы, при хронических воспалительных заболеваниях [1].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств растительного происхождения, повышение их эффективности путем избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых полисахаридов (ПС) с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, полученных из травы водного растения ряски малой (Lemna minor, L.), в качестве стимулятора продукции макрофагами ИЛ-12 и ФНО-α, следствием чего является активация Th1 - зависимого типа иммунного ответа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых ПС с молекулярными массами 1151, 615 и 41 кДа с относительным содержанием 44,11; 11,37 и 44,52% соответственно, выделенных из травы водного растения ряски малой.

Новое свойство водорастворимых ПС с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, полученных из травы водного растения ряски малой, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники и описание этих свойств не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе.

Поскольку известно, что полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами антиген-презентирующих клеток [10], в качестве иммуномодулирующего средства мы предлагаем использовать водорастворимые ПС с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенные из травы водного растения ряски малой, обладающие способностью избирательной стимуляции продукции ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания). Кроме того, в ряде работ показано, что полисахариды растительного или микробного происхождения могут оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток, при этом полисахариды могут способствовать как развитию Th1, так и Th2 - зависимого иммунного ответа.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания. Траву водного растения ряски малой заготавливали в местах естественного произрастания в середине вегетационного сезона (июнь-июль). Стандартизацию сырья проводили по общетехническим характеристикам: зольность и содержание экстрактивных веществ. Водорастворимые полисахариды выделяли из травы водного растения ряски малой по следующей методике: 20,0 г травы экстрагировали раствором 400 мл очищенной воды и 2 мл концентрированной HCl (pH4,0) при соотношении сырье : экстрагент - 1:20, при нагревании на кипящей водяной бане и периодическом перемешивании в течение 3-4 ч. После отделения частиц сырья путем фильтрования через многослойный тканевый фильтр фильтрат упаривали на роторном испарителе при температуре не более 50°C до 1/5 от исходного объема. К полученному раствору добавляли трехкратный объем 96% этанола и отстаивали 24 ч при температуре 2-4°C, затем осадок отфильтровывали через бумажный фильтр и растворяли в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Не растворившийся остаток, представляющий собой мельчайшие частицы сырья и денатурированный белок, отделяли центрифугированием (4000 об/мин, в течение 30 мин). Надосадок диализировали через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа в течение 48 ч в 50-кратном объеме очищенной воды при комнатной температуре и перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч. После диализа раствор замораживали и лиофильно высушивали. Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов, белка и нуклеиновых кислот (Таблица 1).

Хроматограмма силилированного образца гидролизата, полученного из травы водного растения ряски малой, показала, что полисахаридный комплекс является глюкоуронаном, состоящим из глюкозы - 35,07%, галактозы - 10,56%, ксилозы - 12,60%, глюкуроновой кислоты - 41,77%. Разделение проводили на газовом хроматографе Agilent 7890А (США): колонка 1 MS 30 м, внутренний диаметр капилляра 0,25 мкм, скорость потока газа-носителя (Не) 1 мл/мин, в градиенте температур: 70°C - 2 минуты, далее 10°C в минуту (до 300°C), температура инжектора 280°C. Дальнейшее детектирование осуществляли на масс-спектрометре Agilent 5975S (США): ионизация электронным ударом, сканирование m/z 33-600, температура ионного источника 120°C.

Анализ молекулярно-массового распределения проводили на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Германия, «Dionex»), используя калибровочную прямую по растворам декстранов молекулярной массой 1000, 17000, 40000, 250000, 500000, 1200000 Да, построенную на колонке TSK GMPWXL, 300×78 мм, 13 μm, подвижная фаза - вода, скорость потока 1 мл/мин, рефрактометрическое детектирование, температура ячейки детектора 40°C. Спектр исследуемого образца водного растения ряски малой показал, что полученное вещество представляет собой смесь трех полисахаридов разных молекулярных масс - 1151, 615 и 41 кДа с относительным содержанием 44,11; 11,37 и 44,52% соответственно.

Биологическую активность ПС оценивали на линейных мышах C57BL/6 [4]. Животные в возрасте 8-10 недель были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга, Томский НИМЦ РАН (ветеринарное свидетельство 270 №0008633 15 июля 2015 г.). Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране животных используемых в научных целях. В качестве контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид, in vitro - мурамилдипептид.

Макрофаги получали из суспензии перитонеальных клеток, для чего животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Далее клетки (1,5-2,0×10⁶/мл) помещали в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч при 37°C (в атмосфере 5% CO₂ и абсолютной влажности) в среде (RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицин («Sigma»), 2 мМ L-глютамин («Sigma»)). Полученные после прилипания макрофаги, переносили в плоскодонные 96-луночные планшеты (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл) и культивировали в указанных выше условиях в присутствии полисахарида ряски малой (20 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111:В4, «Sigma»); 10 мкг/мл мурамилдипептида (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам: ИЛ-12 и ИЛ-10 («eBioscience»).

Количество цитокинов, вырабатываемых мононуклеарами периферической крови человека, определяли в супернатантах клеток, получаемых следующим образом. Жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь здоровых доноров с добавлением гепарина (10 ЕД/мл). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности, трижды отмывали их холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде, оценивали жизнеспособность и, далее, проводили фракционирование клеточной взвеси адгезией (см. получение макрофагов) для получения моноцитов - прилипающая и лимфоцитов - не прилипающая фракция. Моноциты (1×10⁶ клеток/мл) или лимфоциты (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл) помещали в 96-луночный планшет и вносили изучаемые растительные полисахариды (10 мкг/мл), продукцию монокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл). Через 24 ч инкубации собирали бесклеточный супернатант, в котором иммуноферментным методом при помощи тест-систем определяли количество цитокинов согласно прилагаемым протоколам: ИЛ-12, ИЛ-10 и ИФН-γ («R@D Systems»); ФНО-α - («Вектор-Бэст»).

Водорастворимые полисахариды вводили мышам ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. В предварительных экспериментах in vivo было выявлено, что для проявления иммуномодулирующего эффекта оптимальной суточной дозой ПС, полученных из травы ряски малой, является концентрация 10 мг/кг массы тела и ликопида - 2 мг/кг (рекомендованная терапевтическая суточная доза). Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа через 5 дней от начала введения ПС животных иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией эритроцитов барана (1×10⁸).

Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [4]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10⁸ эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап.

Влияние ПС на гуморальное звено иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, для чего животных, получавших курс ПС, забивали на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (на пике IgM-AOК и IgG-АОК, соответственно) [4, 8].

Количество цитокинов в бесклеточных супернатантах клеток мышей определяли иммуноферментным методом после 24 часовой инкубации при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам - ИЛ-10 и ИЛ-12 («eBioscience»).

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistics 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [2]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и стандартную ошибку средней m. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Даннета. Допустимым уровнем значимости принималось p<0,05.

Пример 1

ПС водного растения ряски малой, представляющие собой смесь водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, при прямом действии на макрофаги вызывали резкое усиление продукции ИЛ-12 - ключевого цитокина, ответственного за эффективность Т-клеточного иммунного ответа (Таблица 2). При культивировании макрофагов без добавления каких-либо стимуляторов (среда) сколько-нибудь значимых количеств данного цитокина в супернатанте обнаружено не было. Мурамилдипептид (МДП) также существенно не изменял уровень ИЛ-12, при этом изучаемая сумма полисахаридов повышала продукцию ИЛ-12 в 4,7 раза с 0,581±0,581 в контроле до 2,710±0,138 пг/мл в опыте.

В отсутствие каких-либо стимуляторов макрофаги продуцировали ИЛ-10 - 17,562±2,234 мг/мл. При добавлении стандартного активатора макрофагов ЛПС концентрация ИЛ-10 в супернатанте увеличилась в 7,4 раза до 130,270±1,758 пг/мл. ПС ряски малой не влияли на ЛПС-стимулированный уровень цитокина, а МДП, при этом, в 1,5 раза усиливал его продукцию как относительно инкубации с ЛПС, так и в 1,3 раза относительно ПС ряски малой (Таблица 3).

На модели моноцитов периферической крови человека показано (Таблица 4), что водорастворимые полисахариды травы водного растения ряски малой с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа усиливали продукцию ИЛ-12 в 6,6 раза с 0,297±0,043 до 1,950±0,340 пг/мл, а МДП в 3,3 раза до 0,975±0,042 пг/мл. Концентрация ФНО-α увеличивалась, практически, на два порядка с 1,49±0,92 пг/мл в контроле до 146,15±6,81 пг/мл как при культивировании с ПС, так и при активации МДП до 151,07±11,26 пг/мл. Данное активирующее действие сохранялось и при оценке влияния изучаемых ПС на продукцию ИФН-γ лимфоцитами: его концентрация увеличивалась в 64,6 раза с 0,042±0,007 до 2,712±0,596 пг/мл.

Оценка влияния исследуемых ПС на секрецию ИЛ-10 на модели воспаления (ЛПС-стимуляция) выявила, что МДП и ПС ряски малой не оказывают влияния продукцию цитокина (Таблица 5).

Таким образом, экспериментально установлено, что ПС с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенные из травы водного растения ряски малой, стимулируют выработку антигенпрезентирующими клетками ключевых цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ лимфоцитами. Следует отметить, что по своему ИЛ-12-стимулирующему действию изученные полисахариды значительно превосходят препарат сравнения МДП.

Пример 2

Курсовое введение суммы водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенных из травы водного растения ряски малой, животным на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, привело к усилению маркерной реакции клеточного Th1 иммунного ответа (Таблица 6). ПС ряски малой и ликопид соизмеримо в 2,6 раза усиливали величину реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Пример 3

Влияние исследуемых веществ на гуморальное звено Th1-зависимого иммунного ответа оценивали по количеству АОК. Показано, что курсовое введение водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенных из травы водного растения ряски малой, животным на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, приводило к достоверному увеличению числа АОК (Таблица 7). Показатель увеличивался как у мышей, получавших ПС ряски малой в 2,3 раза, так и ликопид в 2,8 раза.

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенные из травы водного растения ряски малой, усиливают протекание иммунного ответа, стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и IFN-γ и, следовательно, являются активаторами Th1-зависимого типа иммунного ответа, а также воспалительных свойств макрофагов, и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах и онкологической болезни.

Литература

1. Горностаева Ю.А. Профилактика ОРВИ у пациентов с неспецифическими заболеваниями легких. Медицинский совет. 2014. №7. С. 8-11.

2. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика // Учебн. пособие для вузов. Изд. 7-е, стер. М.: Высш. шк., 2001. 479 с.

3. Мирошник О.А., Редькин Ю.В. Иммуномодуляторы в России: Справочник. 2-е издание исправленное и дополненное. Омск: Изд-во ГП «Омская областная типография». 2006. 432 с.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч.1. М.: Гриф и К. 2013. С. 64-79.

5. Сепиашвили Р.И. От иммунотерапии к персонализированной таргетной иммуномодулирующей терапии и иммунореабилитации // Аллергология и иммунология. 2015. Том 16. №4. С. 323-327.

6. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы. Классификация, механизм действия. Рос. аллергол. журн. 2005; 4: 30-43. или Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. №3. С. 199.

7. Hamza Т., Barnett J.B., Li В. Interleukin 12 a key immunoregulatory cytokine in infection applications. // International Journal of Molecular Sciences. 2010. Т. 11. Is. 3. P. 789-806

8. Ierne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody production cells // Science. 1963. Vol. 140. №3565. P. 405-408.

9. Ma X. TNF-α and IL-12: a balancing act in macrophage functioning. // Microbes and Infection. 2001. Vol. 3. P. 121-129.].

10. Schepetkin I.A., Quinn M.T. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol. 6, №3. P. 317-733.]

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению комплекса водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенных из травы водного растения ряски малой, в качестве средства для избирательной активации иммунологических реакций Th1-типа, стимуляции продукции Th1 специфических цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ. Применение комплекса водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенных из травы водного растения ряски малой, в качестве средства для избирательной активации иммунологических реакций Th1-типа, стимуляции продукции Th1 специфических цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ, полученного путем экстракции травы раствором очищенной воды и концентрированной HCl pH 4,0 при нагревании на кипящей водяной бане и периодическом перемешивании, фильтровании и упаривании на роторном испарителе до 1/5 от исходного объема, при добавлении трехкратного объема 96% этанола и отстаивании с последующей фильтрацией осадка через бумажный фильтр и растворении в очищенной воде, при перемешивании на магнитной мешалке, отделении нерастворившегося остатка центрифугированием, диализировании надосадка через полупроницаемую мембрану и перемешивании на магнитной мешалке с дальнейшим замораживанием получившегося раствора и лиофильным его высушиванием при определенных условиях. Вышеописанный комплекс водорастворимых полисахаридов является эффективным в качестве средства для избирательной активации иммунологических реакций Th1-типа, стимуляции продукции Th1 специфических цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ. 7 табл., 3 пр.

Применение комплекса водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1151, 615 и 41 кДа, выделенных из травы водного растения ряски малой, в качестве средства для избирательной активации иммунологических реакций Th1-типа, стимуляции продукции Th1 специфических цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ, полученного путем экстракции 20,0 г травы раствором 400 мл очищенной воды и 2 мл концентрированной HCl pH 4,0 в соотношении сырье : экстрагент - 1:20, при нагревании на кипящей водяной бане и периодическом перемешивании в течение 3-4 ч, фильтровании и упаривании при температуре 50°C на роторном испарителе до 1/5 от исходного объема, при добавлении трехкратного объема 96% этанола и отстаивании 24 ч при температуре 2-4°C с последующей фильтрацией осадка через бумажный фильтр и растворении в 100 мл очищенной воды, при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре, отделении нерастворившегося остатка центрифугированием при 4000 об/мин в течение 30 минут, диализировании надосадка через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа и перемешивании на магнитной мешалке в течение 48 ч в 50-кратном объеме очищенной воды при комнатной температуре со сменой воды через 24 ч, с дальнейшим замораживанием получившегося раствора и лиофильным его высушиванием.