Способ получения органной культуры трабекулярной сети из кадаверного глаза человека Российский патент 2018 года по МПК A61F9/07 C12N5/00 C12N5/07 C12N5/71 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и трансплантологии, а также к области биологии, а именно клеточной биологии, и может быть использовано для получения органной культуры трабекулярной сети (ОКТС), как экспериментальной модели для исследований in vitro.

Трабекулярная сеть располагается в углу передней камеры, входя в состав его передней стенки. Морфологически в трабекулярной сети выделяют 3 основных слоя. Внутренний слой - увеальный - тонкая сеть образованная перекрещивающимися тяжами ткани, с межтрабекулярным пространством размером 25-75 мкм. Средний слой - корнеосклеральный. Его составляют соединительнотканные пластины, покрытые эпителиальными клетками, расстояние между пластинами составляет 5-50 мкм. Каждая пластина этого слоя состоит из коллагеновых и эластических волокон, покрытых базальной мембраной. Наружный слой - юкстаканаликулярный - слой пористой ткани толщиной до 20 мкм.

Трабекулярная сеть является динамической структурой, выполняющей функцию фильтра, и играет основную роль в регуляции оттока внутриглазной влаги из передней камеры глаза в Шлеммов канал. При первичной открытоугольной глаукоме происходит отложение гранул пигмента и псевдоэксфолиативного материала в пространствах между трабекулами, что приводит к нарушению фильтрующей функции трабекулярной сети и повышению внутриглазного давления. При экспериментальной разработке лазерных способов очищения трабекулы от наложений невозможно использование экспериментальных животных ввиду разности строения трабекулярного аппарата животных и человека. Но не исключено использование метода органной культуры, при помощи которой можно получить жизнеспособный фрагмент трабекулярной ткани от трупного донора и поддерживать его жизнеспособность в течение некоторого срока. Так в эксперименте in vitro для изучения влияния лазерного воздействия на трабекулярную ткань глаза человека можно использовать органную культуру трабекулярной сети (ОКТС).

Ближайшим аналогом является способ получения органной культуры трабекулярной сети, описанный в научной статье: Туманян Э.Р., Иванова Е.С., Любимова Т.С., Субхангулова Э.А. Т.Г. Боровая, Л.В. Диденко, Н.В. Шевлягина Морфологическая оценка изменений трабекулярной сети угла передней камеры глаза после селективной лазерной трабекулопластики по М. Latina и селективной лазерной активации трабекулы // Офтальмохирургия. - 2010. - №3. - С. 39-42. Согласно статье, органную культуру получают следующим способом: в 5 мм от лимба выполняли круговой разрез склеры и сосудистой оболочки, после чего отделяли передний полюс глаза. Затем удаляли хрусталик. Далее каждый образец делили на 3 части согласно секторам, где проводилось лазерное воздействие, и контроль (180°, 90° и 90° соответственно). Радужку фиксировали хирургическими иглами так, чтобы открывался угол передней камеры.

Данный способ имеет ряд недостатков. При обработке донорского глаза таким образом в образцах содержится не только трабекулярная ткань, но большая часть роговицы и радужки. Наличие дополнительных тканей может повлиять на результаты эксперимента, исказив истинную картину ответа трабекулы на какое-либо воздействие.

Задачей изобретения является выделение и последующее культивирование ткани трабекулярной сети из кадаверного глаза человека с наименьшим количеством окружающих тканей.

Техническим результатом изобретения является получение ОКТС из кадаверного глаза человека, содержащей неповрежденную, жизнеспособную ткань трабекулы с сохранением прижизненных функций и с наименьшим количеством окружающих тканей, что позволит повысить достоверность результатов при моделировании состояния in vivo с целью изучения воздействий в эксперименте.

Технический результат достигается тем, что в способе получения ОКТС из кадаверного глаза человека, включающем выполнение кругового разреза склеры и сосудистой оболочки, отделение переднего полюса глаза (ПСГ), удаление хрусталика, и разделение ПСГ на части, согласно изобретению, донорский кадаверный глаз фиксируют в держателе глазного яблока до достижения тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека, производят скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекают ткань конъюнктивы, перед выполнением кругового разреза склеры и сосудистой оболочки осуществляют надрез склеры на расстоянии 2 мм от лимба глубиной не более 0,1 мм, круговым трепаном диаметром 8 мм производят иссечение и удаление оставшихся слоев роговицы, исключая ее переходную часть в склеру, затем ножницами производят иссечение склеры и подлежащих тканей по намеченному ранее надрезу, получая в итоге образец трабекулярной сети, включающий ткань трабекулы, радужку и переходную часть роговицы в склеру, укладывают образец на дно стерильной чашки Петри роговичной стороной вниз и рассекают его меридионально на 4 части, далее под увеличением микроскопа 20Х производят иссечение радужки в каждой части, оставляя 2 мм ткани у ее корня, затем полученные части трабекулярной сети помещают в раствор культуральной среды следующего состава на 10 мл среды: 8900 мкл DMEM/F12, 1000 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мкл 2 мМ L-глутамина, 100 мкл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивируют при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100%, смену среды производят каждые 3 дня.

Иссечение роговицы круговым трепаном диаметром 8 мм, отсечение склеры в 2 мм от лимба и отсечение радужки в 2 мм от корня позволяет максимально удалить окололежащие ткани, оставив ткань трабекулы неповрежденной, с сохранением прижизненных функций. Рассечение полученного образца на 4 части позволяет увеличить количество исследуемых единиц в эксперименте, что повысит достоверность результатов.

На рис. 1 изображена схема получения ОКТС. Позицией 1 обозначена переходная часть роговицы в склеру, 2 - ткань трабекулы, 3 - радужка, 4 - линия иссечения роговицы, 5 - линия иссечения склеры и подлежащих тканей.

Способ осуществляется следующим образом: донорский кадаверный глаз фиксируют в специальном держателе глазного яблока с достижением достаточного тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека. Производят скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекают ткань конъюнктивы. Далее на расстоянии 2 мм от зоны лимба офтальмохирургическим лезвием осуществляют надрез склеры глубиной не более 0,1 мм. Хирургическим роговичным трепаном диаметром 8 мм производят иссечение и удаление оставшихся слоев роговицы, исключая ее переходную часть в склеру. Затем универсальными офтальмохирургическими ножницами производят иссечение склеры и подлежащих тканей по намеченному надрезу. Полученный образец, включающий в себя ткань трабекулы, радужку и переходную часть роговицы в склеру (рис 1), укладывают на дно стерильной чашки Петри роговичной стороной вниз и рассекают меридионально на 4 части. Далее под увеличением микроскопа 20Х производят иссечение радужки в каждой части, оставляя 2 мм ткани у ее корня. Затем образцы трабекулярной сети помещают в раствор культуральной среды следующего состава: на 10 мл среды 8900 мкл DMEM/F12, 1000 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мкл 2 мМ L-глутамина, 100 мкл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина и культивируют при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100%, смену среды производят каждые 3 дня.

Такая модель ОКТС может быть использована для проведения исследований in vitro.

Способ поясняется примером:

Пример. Глазное яблоко донора-трупа мужчины, 62 года фиксировали в специальном держателе глазного яблока с достижением достаточного тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека. Производили скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекали ткань конъюнктивы. Далее на расстоянии 2 мм от зоны лимба офтальмохирургическим лезвием осуществляли надрез склеры глубиной не более 0,1 мм. Хирургическим роговичным трепаном диаметром 8 мм производили иссечение и удаление оставшихся слоев роговицы, исключая ее переходную часть в склеру. Затем универсальными офтальмохирургическими ножницами производили иссечение склеры и подлежащих тканей по намеченному надрезу. Полученный образец, включающий в себя ткань трабекулы, радужку и переходную часть роговицы в склеру (рис 1), укладывали на дно стерильной чашки Петри роговичной стороной вниз и рассекали меридионально на 4 части. Далее под увеличением микроскопа 20Х производили иссечение радужки в каждой части, оставляя 2 мм ткани у ее корня. Затем образцы трабекулярной сети помещали в раствор культуральной среды следующего состава: на 10 мл среды 8900 мкл DMEM/F12, 1000 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мкл 2 мМ L-глутамина, 100 мкл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина и культивируют при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100%, смену среды производят каждые 3 дня.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии и трансплантологии. Для получения органной культуры трабекулярной сети из кадаверного глаза человека проводят выполнение кругового разреза склеры и сосудистой оболочки, отделение переднего полюса глаза (ПСГ), удаление хрусталика, и разделение ПСГ на части. Донорский кадаверный глаз фиксируют в держателе глазного яблока до достижения тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека. Производят скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекают ткань конъюнктивы. Перед выполнением кругового разреза склеры и сосудистой оболочки осуществляют надрез склеры на расстоянии 2 мм от лимба глубиной не более 0,1 мм. Круговым трепаном диаметром 8 мм производят иссечение и удаление оставшихся слоев роговицы, исключая ее переходную часть в склеру. Затем ножницами производят иссечение склеры и подлежащих тканей по намеченному ранее надрезу, получая в итоге образец трабекулярной сети, включающий ткань трабекулы, радужку и переходную часть роговицы в склеру. Укладывают образец на дно стерильной чашки Петри роговичной стороной вниз и рассекают его меридионально на 4 части. Далее под увеличением микроскопа 20Х производят иссечение радужки в каждой части, оставляя 2 мм ткани у ее корня. Затем полученные части трабекулярной сети помещают в раствор культуральной среды следующего состава: на 10 мл среды 8900 мкл DMEM/F12, 1000 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мкл 2 мМ L-глутамина, 100 мкл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина и культивируют при температуре 37°С, 5% содержании CO₂ и влажности 100%. Смену среды производят каждые 3 дня. Способ позволяет повысить достоверность результатов при моделировании состояния in vivo с целью изучения в эксперименте, за счет получения неповрежденной, жизнеспособной ткани трабекулы с сохранением прижизненных функций и с наименьшим количеством окружающих тканей. 1 пр., 1 ил.

Способ получения органной культуры трабекулярной сети из кадаверного глаза человека, включающий выполнение кругового разреза склеры и сосудистой оболочки, отделение переднего полюса глаза (ПСГ), удаление хрусталика, и разделение ПСГ на части, отличающийся тем, что донорский кадаверный глаз фиксируют в держателе глазного яблока до достижения тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека, производят скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекают ткань конъюнктивы, перед выполнением кругового разреза склеры и сосудистой оболочки осуществляют надрез склеры на расстоянии 2 мм от лимба глубиной не более 0,1 мм, круговым трепаном диаметром 8 мм производят иссечение и удаление оставшихся слоев роговицы, исключая ее переходную часть в склеру, затем ножницами производят иссечение склеры и подлежащих тканей по намеченному ранее надрезу, получая в итоге образец трабекулярной сети, включающий ткань трабекулы, радужку и переходную часть роговицы в склеру, укладывают образец на дно стерильной чашки Петри роговичной стороной вниз и рассекают его меридионально на 4 части, далее под увеличением микроскопа 20Х производят иссечение радужки в каждой части, оставляя 2 мм ткани у ее корня, затем полученные части трабекулярной сети помещают в раствор культуральной среды следующего состава: на 10 мл среды 8900 мкл DMEM/F12, 1000 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мкл 2 мМ L-глутамина, 100 мкл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивируют при температуре 37°С, 5% содержании CO₂ и влажности 100%, смену среды производят каждые 3 дня.