НОВЫЙ БАКТЕРИОФАГ ШИГА-ТОКСИН ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ E. COLI ТИПА F18 ESC-COP-1 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ШИГА-ТОКСИН ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ E. COLI ТИПА F18 Российский патент 2018 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 A23K20/00 C02F3/34 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к бактериофагу, выделенному из природы, инфицирующему и уничтожающему Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, и способу предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием композиции, содержащей бактериофаг в качестве активного ингредиента. В частности, настоящее изобретение относится к миовирусному бактериофагу Esc-COP-1, выделенному из природы и способному специфически уничтожать штаммы Шига-токсин продуцирующей E. coli типа F18, имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: КСТС 12662 ВР), и способу предупреждения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, и их последующего лечения с использованием композиции, содержащей указанный бактериофаг в качестве активного ингредиента.

2. Описание уровня техники

Существует два вида Escherichia coli (Е. coli): непатогенная Е. coli и патогенная Е. coli. Непатогенная Е. coli является представителем нормальной флоры кишечника и полезна для достижения баланса с другими энтеробактериями, помощи пищеварению и так далее. Патогенная Е. coli прикрепляется к стенке кишечника с помощью фимбрий для пролиферации и продуцирует энтеротоксины, вызывающие диарею.

Патогенная Е. coli поражает различные виды сельскохозяйственных животных, вне зависимости от возраста, и вызывает диарею - существенный симптом, способный повлечь высокую смертность вследствие обезвоживания. В Корее сообщалось о возникновении этой диареи практически на всех животноводческих фермах. Более того, в случае смешанных инфекций, вызываемых ротавирусом, коронавирусом, простейшими кокцидиями и тому подобными, эта вспышка усиливается в связи с повреждением слизистой кишечника и симптомы значительно усугубляются по сравнению со случаями единичных инфекций. Существует несколько патогенных штаммов Е. coli, вызывающих диарею. Прежде всего, часто сообщается, что Шига-токсин продуцирующая Escherichia coli типа F18 вызывает тяжелую диарею и отеки у свиней. Шига-токсин продуцирующая Е. coli типа F18 прикрепляется к эпителиальным клеткам кишечника с помощью фимбрий (F18) для выделения Шига-токсина. Выделяемый токсин абсорбируется кровеносными сосудами, что приводит к повышению кровяного давления и повреждению артериол, что вызывает опухоли во всех частях тела, сопровождаемые судорогами, параличом и тому подобным. Учитывая существенный вред, который Шига-токсин продуцирующая Е. coli типа F18 наносит животноводческой отрасли, возникла острая потребность в разработке эффективного способа предупреждения и лечения таких инфекций. Для предупреждения или лечения таких инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, использовали различные антибиотики. Тем не менее, в связи с возрастающим в последнее время числом бактерий, устойчивых к антибиотикам, возникла острая потребность в эффективной альтернативе.

В последнее время внимание авторов привлекло применение бактериофагов в качестве нового способа лечения бактериальных инфекций. В частности, причиной повышенного интереса авторов к бактериофагам является то, что лечение, основанное на применении бактериофагов, является способом, дружественным к окружающей среде. Бактериофаги представляют собой чрезвычайно маленькие инфицирующие бактерии микроорганизмы, сокращенно называемые фагами. Как только бактериофаг инфицирует бактерию, бактериофаг пролиферирует внутри бактериальной клетки. После полной пролиферации потомки разрушают бактериальную клеточную стенку, чтобы выйти из хозяина, что указывает на то, что бактериофаги обладают способностью уничтожать бактерии. Инфицирование бактериофагами характеризуется высокой специфичностью, так что конкретный бактериофаг инфицирует только определенную бактерию. То есть, число бактерий, которые могут быть инфицированы конкретным бактериофагом, ограничено, что указывает на то, что бактериофаг способен уничтожать только определенную бактерию, и не может нанести вред другим бактериям.

Бактериофаг был впервые обнаружен английским бактериологом Туортом в 1915 г., когда он заметил, что колонии Micrococcus под воздействием чего-то неизвестного стали плавиться и становиться прозрачными. В 1917 г. французский бактериолог Д'Эрелль обнаружил, что Shigella disentriae в фильтрате кала больного дизентерией расплавилась под воздействием чего-то, и впоследствии исследовал этот феномен. В результате он независимо обнаружил бактериофаг, и назвал его «бактериофагом», что означает «пожиратель бактерий». После этого были обнаружены бактериофаги, обладающие специфическим антибактериальным действием против таких патогенных бактерий, как Shigella, Salmonella Typhi и Vibrio cholerae.

По причине их уникальной способности уничтожать бактерии, бактериофаги исследовали и прогнозировали как более совершенный способ для лечения бактериальных инфекций. Однако после открытия пенициллина Флемингом исследования бактериофагов продолжились только в ряде западноевропейских стран и бывшем Советском Союзе по причине универсализации антибиотиков. После 2000 года достоинства общепринятых антибиотиков померкли по причине увеличения числа бактерий, устойчивых к антибиотикам. Таким образом, бактериофаги вновь оказались в центре внимания как новый антибактериальный агент, способный заменить общепринятые антибиотики.

Более того, недавнее регулирование использования антибиотиков поддерживается правительствами по всему миру. Интерес к бактериофагам все больше повышается, а также постоянно открываются их промышленные применения.

Таким образом, в настоящем изобретении реализована попытка разработать композицию, подходящую для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей E. coli типа F18, с помощью бактериофага, выделенного из природы и способного селективно уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, и дополнительно обеспечить способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием композиции. В результате, авторы выделили бактериофаги, подходящие для этой цели, и установили нуклеотидную последовательность генома, позволяющую отличить бактериофаг по настоящему изобретению от других бактериофагов. Затем авторы разработали композицию, содержащую выделенный бактериофаг в качестве активного ингредиента, и подтвердили, что эта композиция может эффективно применяться для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, что привело к созданию настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение миовирусного бактериофага Esc-COP-1, выделенного из природы и способного специфически уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, имеющего геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: КСТС 12662 ВР).

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, подходящей для предупреждения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, содержащей бактериофаг Esc-COP-1, способный инфицировать и уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, в качестве активного ингредиента, и способа предупреждения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, подходящей для лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, содержащей бактериофаг Esc-COP-1, способный инфицировать и уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, в качестве активного ингредиента, и способа лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение дезинфицирующего средства для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение добавки для питьевой воды для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин Продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение пищевой добавки, эффективной в сельском хозяйстве, для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием указанной композиции.

Для достижения вышеуказанных целей в настоящем изобретении обеспечен миовирусный бактериофаг ESC-COP-1, выделенный из природы и способный специфически уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, имеющий геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: КСТС 12662 ВР), и способ предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием композиции, содержащей бактериофаг в качестве активного ингредиента. Бактериофаг Esc-COP-1 был выделен авторами настоящего изобретения и затем депонирован в Корейской коллекции типовых культур Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии 21 августа 2014 г. (регистрационный №: КСТС 12662 ВР). В настоящем изобретении также предложены дезинфицирующее средство, добавка для питьевой воды и пищевая добавка, подходящие для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, содержащие бактериофаг Esc-COP-1 в качестве активного ингредиента.

Поскольку бактериофаг Esc-COP-1, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, эффективно уничтожает Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, его следует считать эффективным для предупреждения или лечения диареи (инфекций), вызываемой Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18. Следовательно, композиция по настоящему изобретению может применяться для предупреждения и лечения диареи Е. coli, вызываемой Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18. В настоящем описании диарея Е. coli включает симптомы, вызываемые инфекциями Е. coli, сопровождающиеся лихорадкой, диареей и тому подобными.

В настоящем описании термин «лечение» или «лечить» обозначает (i) подавление диареи, вызываемой Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18; и (ii) облегчение диареи, вызываемой Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18.

В настоящем описании термин «выделение» или «выделенный» обозначает все действия, необходимые для отделения бактериофага с помощью различных экспериментальных техник, и для определения характеристик, позволяющих отличить данный бактериофаг от других бактериофагов, и дополнительно включает действие пролиферации бактериофага посредством биоинженерных технологий с тем, чтобы сделать его полезным.

Фармацевтически приемлемый носитель, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, представляет собой носитель, обычно используемый для получения фармацевтического состава, примерами которого являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, вода, сироп, метилцеллюлоза, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не всегда ограничиваясь перечисленным. Композиция по настоящему изобретению помимо вышеуказанных ингредиентов может дополнительно включать смазывающие вещества, смачивающие агенты, подсластители, вкусовые добавки, эмульгаторы, суспендирующие агенты и консерванты.

Бактериофаг Esc-COP-1 включен в состав композиции согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. При этом бактериофаг Esc-COP-1 включен в концентрации от 1×10¹ БОЕ/мл до 1×10³⁰ БОЕ/мл, или от 1×10¹ БОЕ/г до 1×10³⁰ БОЕ/г, и предпочтительно в концентрации от 1×10⁴ БОЕ/мл до 1×10¹⁵ БОЕ/мл, или от 1×10⁴ БОЕ/г до 1×10¹⁵ БОЕ/г.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена способом, осуществляемым специалистами в данной области, с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента, в форме контейнера для однократной дозы или многократных доз. Состав может быть представлен в форме раствора, суспензии или эмульсии в масле или водорастворимой среде, экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы. При этом может быть дополнительно включен диспергирующий агент или стабилизатор.

Композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в виде дезинфицирующего средства, добавки для питьевой воды или пищевой добавки, в зависимости от цели использования, но не всегда ограничиваясь перечисленным.

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ ЭФФЕКТ

Способ предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием данной композиции, содержащей бактериофаг Esc-COP-1 в качестве активного ингредиента, обладает преимуществом высокой специфичности к Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 по сравнению с общепринятыми способами, основанными на химических веществах, включая общепринятые антибиотики. Это означает, что композиция по настоящему изобретению может специфически применяться для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, не оказывая воздействия на другие имеющиеся полезные бактерии, и, соответственно, имеет меньше побочных эффектов. В общем, при использовании химических веществ, таких как антибиотики, основные имеющиеся бактерии также уничтожаются, что приводит к ослаблению иммунитета у животных с различными сопутствующими побочными эффектами. В то же время, в композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента используется бактериофаг, выделенный из природы, что является очень дружественным к окружающей среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Применение предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения более понятно со ссылкой на прилагаемые фигуры, где:

Фиг. 1 представляет собой снимок, полученный при помощи электронного микроскопа, демонстрирующий морфологию бактериофага Esc-COP-1.

Фиг. 2 представляет собой фотографию, иллюстрирующую способность бактериофага Esc-COP-1 уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18. Прозрачный участок на чашке представляет собой бляшки, образованные в результате лизиса бактериальных клеток.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Практические и предпочтительные в настоящий момент варианты осуществления настоящего изобретения являются иллюстративными, как показано в следующих Примерах.

Тем не менее, следует понимать, что специалисты в данной области с учетом настоящего описания могут создавать модификации и улучшения, оставаясь в рамках сущности и объема настоящего изобретения.

Пример 1: Выделение бактериофага, способного уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18

Образцы отбирали из природы для отбора бактериофага, способного уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18. Шига-токсин продуцирующая Е. coli типа F18, использованная здесь для выделения бактериофага, представляла собой выделенную авторами настоящего изобретения и ранее идентифицированную как Шига-токсин продуцирующая Е. coli типа F18.

Процедура выделения бактериофага подробно описана далее. Собранный образец добавляли к TSB (триптиказо-соевый бульон) среде (панкреатический гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат соевых бобов, 3 г/л; декстроза, 2,5 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; дикалийфосфат, 2,5 г/л), инокулированной Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 в соотношении 1/1000, с последующим встряхиванием культуры при 37°С в течение от 3 до 4 часов. После завершения культивирования осуществляли центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут, и собирали супернатант. Собранный супернатант инокулировали Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 в соотношении 1/1000 с последующим встряхиванием культуры при 37°С в течение от 3 до 4 часов. Когда образец содержал бактериофаг, для увеличения титра бактериофага вышеуказанную процедуру повторяли в общей сложности 5 раз. После повторения процедуры 5 раз культуральный раствор подвергали центрифугированию при 8000 об/мин в течение 20 минут и собирали полученный супернатант. Собранный супернатант фильтровали с использованием 0,45 мкм фильтра. Полученный фильтрат использовали в капельном анализе для исследования способности бактериофага уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18.

Капельный анализ проводили следующим образом; среду TSB инокулировали Шига-токсин продуцирующей E. coli типа F18 в соотношении 1/1000 с последующим встряхиванием культуры при 37°С в течение ночи. 3 мл (с OD₆₀₀, равной 1,5) культурального бульона Шига-токсин продуцирующей E.coli типа F18, полученного как описано выше, распределяли по пластинке с TSA (триптиказо-соевый агар; панкреатический гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат соевых бобов, 3 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; агар, 15 г/л). Пластинка находилась в камере в течение приблизительно 30 минут для высыхания. После высыхания 10 мкл полученного фильтрата точечно наносили непосредственно на поверхность газонов Шига-токсин продуцирующей E. coli типа F18 и сушили в течение приблизительно 30 минут. После сушки планшет инкубировали при 37°С в течение суток, и затем исследовали образование прозрачных участков на поверхности газонов бактерий. Если прозрачный участок был образован в том месте, куда капали фильтрат, можно было сделать вывод, что в фильтрате содержался бактериофаг, способный уничтожать Шига-токсин продуцирующую E. coli типа F18. Фильтрат, содержащий бактериофаг, способный уничтожать Шига-токсин продуцирующую E. coli типа F18, можно получать посредством вышеуказанного способа.

После чего бактериофаг выделяли из фильтрата, для которого ранее было подтверждено, что он содержит бактериофаг, способный уничтожать Шига-токсин продуцирующую E.coli типа F18. Для выделения чистых бактериофагов использовали общепринятый анализ бляшкообразования. А именно, бляшки, образованные в ходе анализа бляшкообразования, собирали с использованием стерилизованного наконечника, и затем добавляли в культуральный раствор Шига-токсин продуцирующей E. coli типа F18, с последующим культивированием в течение от 4 до 5 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. Собранный супернатант инокулировали культурой Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 в соотношении 1/50, с последующим культивированием вновь в течение от 4 до 5 часов. Для увеличения титра бактериофага вышеуказанную процедуру повторяли по меньшей мере 5 раз. Затем проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. С полученным супернатантом проводили анализ бляшкообразования. В общем, выделение чистого бактериофага не завершается однократной процедурой, поэтому вышеуказанную процедуру повторяли с использованием бляшек, образованных ранее. После повторения процедуры по меньшей мере 5 раз получали раствор, содержащий чистый бактериофаг. Процедуру выделения чистого бактериофага обычно повторяли до тех пор, пока образуемые бляшки не обладали схожими размерами и морфологиями. И последнее выделение чистого бактериофага подтверждали путем наблюдения с помощью электронного микроскопа. Вышеуказанную процедуру выполняли до тех пор, пока выделение чистого бактериофага не подтверждалось при помощи электронного микроскопа. Наблюдение при помощи электронного микроскопа проводили общепринятым способом. Вкратце, раствор, содержащий чистый бактериофаг, наносили на медную сетку с последующим негативным окрашиванием 2% уранилацетатом. После его сушки исследовали морфологию с помощью электронного микроскопа. Полученный при помощи электронного микроскопа снимок бактериофага, выделенного в настоящем изобретении, представлен на Фиг. 1. В результате морфологического исследования выделенный выше бактериофаг идентифицировали как принадлежащий к семейству миовирусов.

Раствор, содержащий чистый бактериофаг, подтвержденный как описано выше, подвергали очистке. Культуральный бульон Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 добавляли к раствору, содержащему чистый бактериофаг, в объемном соотношении 1/50 от общего объема раствора бактериофага, затем вновь культивировали в течение от 4 до 5 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. Эту процедуру повторяли 5 раз до получения раствора, содержащего достаточное количество бактериофага. Супернатант, полученный после последнего центрифугирования, фильтровали через 0,45 мкм фильтр, с последующим общепринятым осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ). В частности, ПЭГ и NaCl добавляли к 100 мл фильтрата до достижения 10% ПЭГ 8000/0,5 М NaCl, который выдерживали при 4°С в течение от 2 до 3 часов. Затем проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 30 минут с получением преципитата бактериофага. Полученный преципитат бактериофага ресуспендировали в 5 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO₄, 0,1% желатина, рН 8,0). Этот раствор называли суспензией бактериофага или раствором бактериофага.

В результате чистый бактериофаг, очищенный как описано выше, собирали, называли бактериофагом Esc-COP-1 и затем депонировали в Корейской коллекции типовых культур Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии 21 августа 2014 г. (регистрационный №: КСТС 12662 ВР).

Пример 2: Выделение и секвенирование генома бактериофага Esc-COP-1

Геном бактериофага Esc-COP-1 выделяли следующим образом. Геном выделяли из суспензии бактериофага, полученной в Примере 1. Сначала для того, чтобы устранить ДНК и РНК Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, содержащихся в суспензии, добавляли ДНКазу I и РНКазу А по 200 Е каждая к 10 мл суспензии бактериофага, которую инкубировали при 37°С в течение 30 минут. 30 минут спустя для удаления активности ДНКазы I и РНКазы А к ней добавляли 500 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и затем ее инкубировали в течение 10 минут. Суспензию дополнительно инкубировали при 65°С в течение 10 минут, и затем к ней добавляли 100 мкл протеиназы К (20 мг/мл) для разрыва внешней стенки бактериофага, с последующим инкубированием при 37°С в течение 20 минут. Затем к ней добавляли 500 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия (SDS) с последующим инкубированием при 65°С в течение 1 часа. К ней добавляли 10 мл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, затем хорошо перемешивали. Смесь центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут для разделения всех слоев. Получали верхний слой, к которому добавляли изопропиловый спирт в 1,5-кратном объеме по отношению к объему верхнего слоя с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для осаждения генома бактериофага. После сбора преципитата к нему добавляли 70% этанол с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для промывки преципитата. Промытый преципитат собирали, сушили в вакууме и затем растворяли в 100 мкл воды. Эту процедуру повторяли с получением достаточного количества генома бактериофага Esc-COP-1.

Нуклеотидную последовательность генома бактериофага Esc-COP-1, полученного выше, анализировали по технологии Секвенирования нового поколения (NGS) с помощью устройства Mi-Seq от illumina в Национальном инструментальном центре Экологического управления Национального университета Сеула. В результате было предположено, что конечный геном бактериофага Esc-COP-1 имеет размер 169727 п. н., и нуклеотидная последовательность полного генома имеет SEQ ID NO: 1.

Схожесть геномной последовательности бактериофага Esc-COP-1, полученной выше, с ранее описанными геномными последовательностями бактериофагов была исследована с помощью BLAST, доступного из Интернет (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Результатами BLAST было подтверждено, что геномная последовательность бактериофага Esc-COP-1 имеет высокую гомологичность с последовательностями бактериофага Е. coli vB_EcoM_ACG-С40 (регистрационный № в Genbank: JN986846.1), бактериофага Е. coli RB14 (регистрационный № в Genbank: FH839692.1), бактериофага Е coli HY01 (регистрационный № в Genbank: KF925357.1), бактериофага Е. coli RB51 (регистрационный № в Genbank: FJ839693.1) и бактериофага Е. coli RB68 (регистрационный № в Genbank: КМ607004.1) (96%, 96%, 97%, 95% и 95%). Тем не менее, размеры их геномов отличались друг от друга. А именно, было определено, что полный геном бактериофага Esc-COP-1 имел размер 169727 п. н., тогда как, в отличие от него, размер полного генома бактериофага Е. coli vB_EcoM_ACG-C40 составлял 167396 п. н., для бактериофага Е. coli RB14 он составлял 165429 п. н., для бактериофага Е. coli HY01 - 166977 п. н., для бактериофага Е. coli RB51 - 168394 п. н. и для бактериофага Е. coli RB68 - 168401 п. н. Более того, установленное количество ORF (открытых рамок считывания) в геноме бактериофага Esc-COP-1 составило 275 ORF, тогда как, в отличие от него, число ORF в бактериофаге Е. coli vB_EcoM_ACG-C40 составило 273 ORF, для бактериофага Е. coli RB14 оно составило 274 ORF, для бактериофага Е. coli HY01 - 257 ORF и для бактериофага Е. coli RB68 - 276 ORF. Но число ORF в геноме бактериофага Е. coli RB51 составило 275 ORF, что совпало с бактериофагом Esc-COP-1. Тем не менее, расположение ORF в геноме бактериофага Е. coli RB51 очень отличалось от Esc-COP-1.

На основании этого результата заключили, что бактериофаг Esc-COP-1 должен быть новым бактериофагом, не описанным ранее.

Пример 3: Исследование способности бактериофага Esc-COP-1 уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18

Исследовали способность выделенного бактериофага Esc-COP-1 уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18. Для этого наблюдали за образованием прозрачного участка посредством капельного анализа, таким же образом, как описано в Примере 1. Шига-токсин продуцирующая Е. coli типа F18, использованная для этого исследования, составляла 10 штаммов, ранее выделенных и идентифицированных авторами настоящего изобретения как Шига-токсин продуцирующая Е. coli типа F18. Бактериофаг Esc-COP-1 демонстрировал способность уничтожать 9 штаммов Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, использованных в данном эксперименте. Показательный результат исследования способности к уничтожению представлен на Фиг. 2. В то же время, также исследовали активность бактериофага Esc-COP-1 в отношении уничтожения Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Streptococcus uberis и Pseudomonas aeruginosa. В результате было решено, что бактериофаг Esc-COP-1 не обладал активностью в отношении уничтожения этих микроорганизмов.

Следовательно, было подтверждено, что бактериофаг Esc-COP-1 обладает специфической способностью уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18 и широким антибактериальным спектром против Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, указывая на то, что бактериофаг Esc-COP-1 по настоящему изобретению мог бы применяться в качестве активного ингредиента композиции для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18.

Пример 4: Эффект бактериофага Esc-COP-1 в отношении предупреждения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18

100 мкл раствора бактериофага Esc-COP-1 в концентрации 1×10⁸ БОЕ/мл добавляли в пробирку, содержащую 9 мл TSB. В другую пробирку, содержащую 9 мл TSB, добавляли такой же объем только TSB. Затем в каждую пробирку добавляли культуру Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 с получением бактериальной суспензии с OD₆₀₀, равной 0,5. После чего пробирки переносили в инкубатор при 37°С с последующим встряхиванием культуры, во время которого наблюдали рост Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18. Как представлено в Таблице 1, рост Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 ингибировался в пробирке, в которую был добавлен раствор бактериофага Esc-COP-1, тогда как в пробирке, не содержащей раствор бактериофага Esc-COP-1, рост Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 не ингибировался.

Вышеприведенные результаты указывают на то, что бактериофаг Esc-COP-1 не только ингибировал рост Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, но также мог ее уничтожать. Следовательно, бактериофаг Esc-COP-1 может применяться в качестве активного ингредиента в композиции для предупреждения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18.

Пример 5: Терапевтический эффект бактериофага Esc-COP-1 в отношении инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18

Исследовали терапевтический эффект бактериофага Esc-COP-1 на животных, пораженных Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18. 4 поросенка-отъемыша в возрасте 25 дней группировали; всего 2 группы поросят выращивали в свинарнике (1,1 м × 1,0 м) в течение 14 дней. Была оборудована нагревательная система и проводился контроль за окружающей средой. Контролировали температуру и влажность в свинарнике и ежедневно производили уборку пола. На 7-й день эксперимента всем животным пероральнр вводили 1 мл суспензии Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 с помощью питательного зонда. Суспензию Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, вводимую как описано выше, получали следующим образом: Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18 культивировали в среде TSB (триптиказо-соевый бульон) при 37°С в течение 18 часов и собирали бактериальные клетки центрифугированием. К бактериальной клеточной массе добавляли физиологический раствор (рН 7,2) с получением суспензии клеток с концентрацией 10⁹ КОЕ/мл. Начиная со следующего дня после введения Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, экспериментальной группе (свиньи, подвергавшиеся обработке раствором бактериофага) перорально вводили бактериофаг Esc-COP-1 (10⁹ БОЕ/особь) тем же способом введения, как описано выше, дважды в сутки. Контрольную группу (свиньи, не подвергавшиеся обработке раствором бактериофага) не подвергали какой-либо обработке. Корма и питьевую воду одинаково предоставляли обеим группам. После введения Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18 за всеми животными наблюдали ежесуточно, вне зависимости от того, наблюдалась ли у них диарея. Наблюдение производили путем измерения показателя диареи. Были установлены следующие показатели диареи в соответствии со шкалой консистенции кала (FC) (нормальный: 0, жидкий стул: 1, умеренная диарея: 2, и тяжелая диарея: 3). Результаты представлены в Таблице 2.

Исходя из вышеприведенных результатов было подтверждено, что бактериофаг Esc-COP-1 по настоящему изобретению мог бы быть очень эффективным в лечении инфекционных заболеваний, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18.

Пример 6: Получение кормовых добавок и кормов

Кормовую добавку, содержащую бактериофаг Esc-COP-1 в концентрации 1×10⁸ БОЕ/г, получали, используя раствор бактериофага Esc-COP-1. Способ ее получения представлял собой следующий: мальтодекстрин (40%, w/v) добавляли к раствору бактериофага, и затем добавляли трегалозу до достижения конечной концентрации 10%. После хорошего перемешивания смесь лиофилизировали. Наконец, лиофилизированную смесь размалывали в мелкие порошки. Вышеуказанный процесс лиофилизации может быть заменен сушкой в вакууме, сушкой при повышенной температуре или сушкой при комнатной температуре. Для получения контрольной кормовой добавки для сравнения получали кормовую добавку, не содержавшую бактериофаг, а содержавшую только буфер (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO₄, 0,1% желатина, рН 8,0).

Два вышеуказанных типа кормовых добавок смешивали с 1000-кратным объемом корма для свиноводства, соответственно, с получением двух типов конечных кормов.

Пример 7: Получение добавок для питьевой воды и дезинфицирующих средств

Добавка для питьевой воды и дезинфицирующее средство различаются по своему назначению, однако имеют аналогичный состав, поэтому их получали аналогичным образом. Добавку для питьевой воды (или дезинфицирующее средство), содержащую бактериофаг Esc-COP-1 в концентрации 1×10⁸ БОЕ/мл, получали, используя раствор бактериофага Esc-COP-1. В частности, для получения добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), раствор бактериофага Esc-COP-1 добавляли к буферному раствору до достижения концентрации 1×10⁸ БОЕ/мл, который хорошо перемешивали. Для сравнения, вышеуказанный буферный раствор сам по себе использовали в качестве добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), не содержащей бактериофаг.

Полученные два типа добавок для питьевой воды (или дезинфицирующих средств) разбавляли водой в соотношении 1:1000, и затем использовали как питьевую воду или дезинфицирующее средство.

Пример 8: Эффект в свиноводстве

Исследовали эффект кормов, питьевой воды и дезинфицирующего средства, полученных в Примере 6 и Примере 7, в свиноводстве. В частности, исследование фокусировалось на состоянии диареи, оцененном с помощью шкалы консистенции кала, использованной в Примере 5. Всего 30 поросят делили на три группы, и в каждой группе было по 10 поросят (группа А: группа исследования корма, группа В: группа исследования питьевой воды; и группа С: группа исследование дезинфицирующего средства). Исследование проводили в течение 2 недель. Каждую группу делили на две подгруппы по 5 поросят в каждой. Подгруппы делили в соответствии с тем, проводили ли лечение бактериофагом Esc-COP-1, или нет (подгруппа-: подвергалась лечению бактериофагом Esc-COP-1; и подгруппа-: не подвергалась лечению бактериофагом Esc-COP-1). Поросята, использованные в данном эксперимента, представляли собой поросят-отъемышей в возрасте 20 дней, и их выращивали в отдельных комнатах, расположенных на достаточном расстоянии друг от друга. Каждую подгруппу делили и называли, как показано в Таблице 3.

Корма предоставляли в соответствии с общепринятым способом кормления, как представлено в Таблице 3, с кормами, полученными в Примере 6. Питьевую воду предоставляли в соответствии с традиционным способом снабжения водой, как представлено в Таблице 3, с питьевой водой, полученной в Примере 7. Обработку дезинфицирующим средством проводили трижды в неделю, по очереди с общепринятым дезинфицирующим средством. То есть, в день, когда распыляли дезинфицирующее средство по настоящему изобретению, не производили обработку общепринятым дезинфицирующим средством. Результаты представлены в Таблице 4.

Вышеприведенные результаты подтвердили, что корма, питьевая вода и дезинфицирующее средство, полученные согласно настоящему изобретению, были эффективны в снижении диареи у животных. Следовательно, можно сделать вывод, что композиция по настоящему изобретению может эффективно применяться для улучшения продуктивности животноводства.

Специалистам в данной области понятно, что концепции и конкретные варианты осуществления, раскрытые в вышеизложенном описании, могут быть без труда использованы в качестве основы для модификации или разработки других вариантов осуществления для достижения тех же целей, которые достигаются в настоящем изобретении. Специалистам в данной области также понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не отступают от сущности и объема настоящего изобретения, как представлено в прилагаемой формуле изобретения.

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Esc-СОР-1, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: КСТС 12662 ВР). Изобретения также относятся к способу предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, с использованием композиции, содержащей указанный бактериофаг в качестве активного ингредиента. Изобретения позволяют использовать заявленный бактериофаг, который способен специфически уничтожать штаммы Шига-токсин продуцирующей E. соli типа F18, и могут быть использованы в медицинской промышленности. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил.,4 табл., 8 пр.

1. Миовирусный бактериофаг Esc-COP-1 (регистрационный №: KCTC 12662 ВР), выделенный из природы и способный специфически уничтожать Шига-токсин продуцирующую Е. coli типа F18, имеющий геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

2. Композиция для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, содержащая от 1×10¹ БОЕ/мл до 1×10³⁰ БОЕ/мл или от 1×10¹ БОЕ/г до 1×10³⁰ БОЕ/г бактериофага Esc-COP-1 по п. 1 в качестве активного ингредиента.

3. Композиция для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, по п. 2, где указанную композицию используют для получения кормовой добавки, добавки для питьевой воды или дезинфицирующего средства.

4. Способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, включающий стадию введения субъекту композиции по п. 2 или 3, содержащей бактериофаг Esc-COP-1 в качестве активного ингредиента.

5. Способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Шига-токсин продуцирующей Е. coli типа F18, по п. 4, где указанную композицию вводят субъекту в форме кормовой добавки, добавки для питьевой воды или дезинфицирующего средства.