НОВЫЙ БАКТЕРИОФАГ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CLO-PEP-1 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Российский патент 2018 года по МПК C12N7/01 A61K35/76 A23K20/00 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к бактериофагу, выделенному из природы, инфицирующему и уничтожающему клетки Clostridium perfringens, и способу предупреждения и лечения инфекций, вызываемых клетками Clostridium perfringens, с использованием композиции, содержащей бактериофаг в качестве активного ингредиента. В частности, настоящее изобретение относится к миовирусному бактериофагу Clo-PEP-1, выделенному из природы и способному специфически уничтожать клетки Clostridium perfringens, имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KCTC 12664 BP), и способу предупреждения инфекций, вызываемых клетками Clostridium perfringens, и их последующего лечения с использованием композиции, содержащей указанный бактериофаг в качестве активного ингредиента.

2. Описание уровня техники

Clostridium perfringens представляет собой облигатный анаэроб (редко выживающий в присутствии кислорода) и патогенную бактерию, вызывающую тяжелые заболевания, включающие некротический энтерит и пищевое отравление у людей и животных, таких как корова, свинья и коза, и т.д. Энтеротоксины, продуцируемые Clostridium perfringens, обычно представляют собой гемолитические токсины и некротические токсины, которые включают четыре вида основных токсинов, α, β, ε и ι. В зависимости от их присутствия, Clostridium perfringens классифицируют на шесть токсигенных типов от A до F. Clostridium perfringens типа A представляет собой основной возбудитель пищевого отравления, a Clostridium perfringens типа С представляет собой основной возбудитель некротического энтерита.

В последнее время инфекции, вызываемые Clostridium perfringens, все чаще встречаются в птицеводческой отрасли. Птицефермы страдают от таких случаев, поскольку они распространяются среди большой популяции цыплят, а также являются латентными, не проявляя симптомов в течение длительного времени. В особенности у бройлерных цыплят инфекции, вызываемые Clostridium perfringens, имеют тенденцию частого возникновения по всему миру, в связи с чем в настоящее время эта бактерия считается главным патогеном. Более того, сообщается о том, что в свиноводческой отрасли частота случаев инфицирования Clostridium perfringens возрастает. Учитывая существенный вред, который Clostridium perfringens наносит животноводческой отрасли, возникла острая потребность в разработке способа предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens. Для предупреждения или лечения таких инфекций, вызываемых клетками Clostridium perfringens, использовали различные антибиотики. Тем не менее, в связи с возрастающим в последнее время числом бактерий, устойчивых к антибиотикам, возникла острая потребность в эффективной альтернативе.

В последнее время внимание авторов привлекло применение бактериофагов в качестве нового способа лечения бактериальных инфекций. В частности, причиной повышенного интереса авторов к бактериофагам является то, что лечение, основанное на применении бактериофагов, является способом, дружественным к окружающей среде. Бактериофаги представляют собой чрезвычайно маленькие инфицирующие бактерии микроорганизмы, сокращенно называемые фагами. Как только бактериофаг инфицирует бактерию, бактериофаг пролиферирует внутри бактериальной клетки. После полной пролиферации потомки уничтожают бактериальную клеточную стенку, чтобы выйти из хозяина, что указывает на то, что бактериофаги обладают способностью уничтожать бактерии. Инфицирование бактериофагами характеризуется высокой специфичностью, так что конкретный бактериофаг инфицирует только определенную бактерию. То есть, число бактерий, которые могут быть инфицированы конкретным бактериофагом, ограничено, что указывает на то, что бактериофаг способен уничтожать только определенную бактерию, и не может нанести вред другим бактериям.

Бактериофаг был впервые обнаружен английским бактериологом Туортом в 1915 г., когда он заметил, что колонии Micrococcus под воздействием чего-то неизвестного стали плавиться и становиться прозрачными. В 1917 г. французский бактериолог Д' Эрелль обнаружил, что Shigella disentriae в фильтрате кала больного дизентерией расплавилась под воздействием чего-то, и впоследствии исследовал этот феномен. В результате он независимо обнаружил бактериофаг, и назвал его «бактериофагом», что означает «пожиратель бактерий». После этого были обнаружены бактериофаги, обладающие специфическим антибактериальным действием против таких патогенных бактерий, как Shigella, Salmonella Typhi и Vibrio cholerae.

По причине их уникальной способности уничтожать бактерии, бактериофаги исследовали и прогнозировали как более совершенный способ для лечения бактериальных инфекций. Однако после открытия пенициллина Флемингом исследования бактериофагов продолжились только в ряде западноевропейских стран и бывшем Советском Союзе по причине универсализации антибиотиков. После 2000 года достоинства общепринятых антибиотиков померкли по причине увеличения числа бактерий, устойчивых к антибиотикам. Таким образом, бактериофаги вновь оказались в центре внимания как новый антибактериальный агент, способный заменить общепринятые антибиотики.

Более того, недавнее регулирование использования антибиотиков поддерживается правительствами по всему миру. Интерес к бактериофагам все больше повышается, а также постоянно открываются их промышленные применения.

Таким образом, в настоящем изобретении реализована попытка разработать композицию, подходящую для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с помощью бактериофага, выделенного из природы и способного селективно уничтожать Clostridium perfringens, и дополнительно обеспечить способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием композиции. В результате, авторы выделили бактериофаги, подходящие для этой цели, и установили нуклеотидную последовательность генома, позволяющую отличить бактериофаг по настоящему изобретению от других бактериофагов. Затем авторы разработали композицию, содержащую выделенный бактериофаг в качестве активного ингредиента, и подтвердили, что эта композиция может эффективно применяться для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, что привело к созданию настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение миовирусного бактериофага Clo-PEP-1, выделенного из природы и способного специфически уничтожать клетки Clostridium perfringens, имеющего геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KCTC 12664BP).

Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиции, подходящей для предупреждения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, содержащей бактериофаг Clo-РЕР-1, способный инфицировать и уничтожать клетки Clostridium perfringens, в качестве активного ингредиента, и способа предупреждения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиции, подходящей для лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, содержащей бактериофаг Clo-РЕР-1, способный инфицировать и уничтожать клетки Clostridium perfringens, в качестве активного ингредиента, и способа лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение дезинфицирующего средства для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение добавки для питьевой воды для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием указанной композиции.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение пищевой добавки, эффективной в сельском хозяйстве, для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием указанной композиции.

Для достижения вышеуказанных целей в настоящем изобретении предложен миовирусный бактериофаг Clo-РЕР-1, выделенный из природы и способный специфически уничтожать клетки Clostridium perfringens, имеющий геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (Accession NO: КСТС 12664BP), и способ предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием композиции, содержащей бактериофаг в качестве активного ингредиента.

Бактериофаг Clo-РЕР-1 был выделен авторами настоящего изобретения и затем депонирован в Корейской коллекции типовых культур Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии 21 августа 2014 г. (регистрационный №: KCTC 12664BP). В настоящем изобретении также предложены дезинфицирующее средство, добавка для питьевой воды и пищевая добавка, подходящие для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, содержащие бактериофаг Clo-РЕР-1 в качестве активного ингредиента.

Поскольку бактериофаг Clo-РЕР-1, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, эффективно уничтожает клетки Clostridium perfringens, его следует считать эффективным для предупреждения или лечения различных заболеваний, вызываемых Clostridium perfringens. Следовательно, композиция по настоящему изобретению может применяться для предупреждения и лечения заболеваний (инфекций), вызываемых Clostridium perfringens.

В настоящем описании термин «лечение» или «лечить» обозначает (i) подавление заболеваний, вызываемых клетками Clostridium perfringens; и (ii) облегчение заболеваний, вызываемых клетками Clostridium perfringens.

В настоящем описании термин «выделение» или «выделенный» обозначает все действия для отделения бактериофага с помощью различных экспериментальных техник, и для определения характеристик, позволяющих отличить данный бактериофаг от других, и дополнительно включает действие пролиферации бактериофага посредством биоинженерных технологий с тем, чтобы сделать его полезным.

Фармацевтически примемлемый носитель, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, представляет собой носитель, обычно используемый для получения фармацевтического состава, примерами которого являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, вода, сироп, метилцеллюлоза, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не всегда ограничиваясь перечисленным. Композиция по настоящему изобретению помимо вышеуказанных ингредиентов может дополнительно включать смазывающие вещества, смачивающие агенты, подсластители, вкусовые добавки, эмульгаторы, суспендирующие агенты и консерванты.

Бактериофаг Clo-РЕР-1 включен в состав композиции согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. При этом бактериофаг Clo-PEP-1 включен в концентрации от 1×10¹ БОЕ/мл до 1×10³⁰ БОЕ/мл, или от 1×10¹ БОЕ/г до 1×10³⁰ БОЕ/г, и предпочтительно в концентрации от 1×10⁴ БОЕ/мл до 1×10¹⁵ БОЕ/мл, или от 1×10⁴ БОЕ/г до 1×10¹⁵ БОЕ/г.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена способом, осуществляемым специалистами в данной области, с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента, в форме контейнера для однократной дозы или многократных доз. Состав может быть представлен в форме раствора, суспензии или эмульсии в масле или водорастворимой среде, экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы. При этом может быть дополнительно включен диспергирующий агент или стабилизатор.

Композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в виде дезинфицирующего средства, добавки для питьевой воды или пищевой добавки, в зависимости от цели использования, но не всегда ограничиваясь перечисленным.

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ ЭФФЕКТ

Способ предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, с использованием композиции, содержащей бактериофаг Clo-РЕР-1 в качестве активного ингредиента, обладает преимуществом высокой специфичности к Clostridium perfringens по сравнению с общепринятыми способами, основанными на химических веществах, включая общепринятые антибиотики. Это означает, что композиция по настоящему изобретению может специфически применяться для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, не оказывая воздействия на другие имеющиеся полезные бактерии, и, соответственно, имеет меньше побочных эффектов. В общем, при использовании химических веществ, таких как антибиотики, основные имеющиеся бактерии также повреждаются, что приводит к ослаблению иммунитета у животных с различными сопутствующими побочными эффектами. В то же время, в композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента используется бактериофаг, выделенный из природы, что является очень дружественным к окружающей среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Применение предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения более понятно со ссылкой на прилагаемые чертежи, где:

Фиг. 1 представляет собой снимок, полученный при помощи электронного микроскопа, демонстрирующий морфологию бактериофага Clo-РЕР-1.

Фиг. 2 представляет собой фотографию, иллюстрирующую способность бактериофага Clo-РЕР-1 уничтожать клетки Clostridium perfringens. Прозрачный участок на чашке представляет собой бляшки, образованные в результате лизиса бактериальных клеток.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Практические и предпочтительные в настоящий момент варианты осуществления настоящего изобретения являются иллюстративными, как показано в следующих Примерах.

Тем не менее, следует понимать, что специалисты в данной области с учетом настоящего описания могут создавать модификации и улучшения, оставаясь в рамках сущности и объема настоящего изобретения.

Пример 1: Выделение бактериофага, способного уничтожать клетки Clostridium perfringens

Образцы отбирали из природы для отбора бактериофага, способного уничтожать клетки Clostridium perfringens. Клетки Clostridium perfringens, использованные здесь для выделения бактериофага, представляли собой клетки, выделенные авторами настоящего изобретения и ранее идентифицированные как Clostridium perfringens.

Процедура выделения бактериофага подробно описана далее. Собранный образец добавляли к TSB (триптиказо-соевый бульон) среде (панкреатический гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат соевых бобов, 3 г/л; декстроза, 2,5 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; дикалийфосфат, 2,5 г/л), инокулированной клетками Clostridium perfringens в соотношении 1/1000, с последующим культивированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 12 часов. После завершения культивирования осуществляли центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут, и собирали супернатант. Собранный супернатант инокулировали культурой Clostridium perfringens в соотношении 1/1000, с последующим культивированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 12 часов. Когда образец содержал эффективный бактериофаг, для увеличения титра бактериофага вышеуказанную процедуру повторяли в общей сложности 5 раз. После повторения процедуры 5 раз культуральный раствор подвергали центрифугированию при 8000 об/мин в течение 20 минут и собирали полученный супернатант. Собранный супернатант фильтровали с использованием 0,45 мкм фильтра. Полученный фильтрат использовали в капельном анализе для исследования наличия способности бактериофага уничтожать клетки Clostridium perfringens.

Капельный анализ проводили следующим образом; среду TSB инокулировали клетками Clostridium perfringens cells в соотношении 1/1000 с последующим культивированием в анаэробных условиях при 37°C в течение ночи. 3 мл (OD₆₀₀=2,0) культурального бульона Clostridium perfringens, полученного ранее, распределяли по пластинке с TSA (триптиказо-соевый агар; панкреатический гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат соевых бобов, 3 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; агар, 15 г/л). Пластинка находилась в анаэробной камере в течение приблизительно 30 минут для высыхания. После высыхания 10 мкл полученного фильтрата точечно наносили непосредственно на поверхность газонов Clostridium perfringens и сушили в течение приблизительно 30 минут. После сушки планшет инкубировали при 37°C в анаэробных условиях в течение суток, и затем исследовали образование прозрачных участков на поверхности газонов бактерий. Если прозрачный участок был образован в том месте, куда капали фильтрат, можно было сделать вывод, что в фильтрате находился бактериофаг, способный уничтожать клетки Clostridium perfringens. Фильтрат, содержащий бактериофаг, способный уничтожать клетки Clostridium perfringens, можно получать посредством вышеуказанного способа.

После чего бактериофаг выделяли из фильтрата, для которого ранее было подтверждено, что фильтрат содержит бактериофаг, способный уничтожать клетки Clostridium perfringens. Для выделения чистых бактериофагов использовали общепринятый анализ бляшкообразования. А именно, бляшки, образованные в ходе анализа бляшкообразования, собирали с использованием стерилизованного наконечника, и затем добавляли в культуральный раствор Clostridium perfringens, с последующим культивированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 12 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супренатанта. Собранный супернатант инокулировали культурой Clostridium perfringens в соотношении 1/50, с последующим культивированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 12 часов. Для увеличения титра бактериофага вышеуказанную процедуру повторяли по меньшей мере 5 раз. Затем проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. С полученным супернатантом проводили анализ бляшкообразования. В общем, выделение чистого бактериофага не завершается однократной процедурой, поэтому вышеуказанную процедуру повторяли с использованием бляшек, образованных ранее. После повторения процедуры по меньшей мере 5 раз получали раствор, содержащий чистый бактериофаг. Процедуру выделения чистого бактериофага обычно повторяли до тех пор, пока образуемые бляшки не обладали схожими размерами и морфологиями. И последнее выделение чистого бактериофага подтверждали путем наблюдения с помощью электронного микроскопа. Вышеуказанную процедуру выполняли до тех пор, пока выделение чистого бактериофага не подтверждалось при помощи электронного микроскопа. Наблюдение при помощи электронного микроскопа проводили общепринятым способом. Вкратце, раствор, содержащий чистый бактериофаг, наносили на медную сетку с последующим негативным окрашиванием 2% уранилацетатом. После его сушки исследовали морфологию с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Полученный при помощи электронного микроскопа снимок бактериофага, выделенного в настоящем изобретении, представлен на Фиг. 1. В результате морфологического исследования выделенный выше бактериофаг идентифицировали как принадлежащий к семейству миовирусов.

Раствор, содержащий чистый бактериофаг, подтвержденный ранее, подвергали очистке. Культуральный бульон клеток Clostridium perfringens добавляли к раствору, содержащему чистый бактериофаг, в объемном соотношении 1/50 от общего объема раствора бактериофага, затем вновь культивировали в течение 12 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. Эту процедуру повторяли 5 раз до получения раствора, содержащего достаточное количество бактериофага. Супернатант, полученный после последнего центрифугирования, фильтровали через 0,45 мкм фильтр, с последующим общепринятым осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ). В частности, ПЭГ и NaCl добавляли к 100 мл фильтрата до достижения 10% ПЭГ 8000/0,5 М NaCl, который выдерживали при 4°C в течение от 2 до 3 часов. Затем проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 30 минут с получением преципитата бактериофага. Полученный преципитат бактериофага ресуспендировали в 5 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO₄, 0,1% желатина, pH 8,0). Этот раствор называли суспензией бактериофага или раствором бактериофага.

В результате чистый бактериофаг, очищенный ранее, собирали, называли бактериофагом Clo-РЕР-1 и затем депонировали в Корейской коллекции типовых культур Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии 21 августа 2014 г. (регистрационный №: КСТС 12664BP).

Пример 2: Выделение и секвенирование генома бактериофага Clo-РЕР-1

Геном бактериофага Clo-РЕР-1 выделяли следующим образом. Геном выделяли из суспензии бактериофага, полученной в Примере 1. Сначала для того, чтобы устранить ДНК и РНК клеток Clostridium perfringens, содержащихся в суспензии, добавляли ДНКазу I и РНКазу А по 200 Е каждая к 10 мл суспензии бактериофага, которую затем инкубировали при 37°C в течение 30 минут. 30 минут спустя для удаления активности ДНКазы I и РНКазы А к ней добавляли 500 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и затем ее инкубировали в течение 10 минут. Суспензию дополнительно инкубировали при 65°C в течение 10 минут, и затем к ней добавляли 100 мкл протеиназы K (20 мг/мл) для разрыва внешней стенки бактериофага, с последующим инкубированием при 37°C в течение 20 минут. Затем к ней добавляли 500 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия (SDS) с последующим инкубированием при 65°C в течение 1 часа. К ней добавляли 10 мл смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, затем хорошо перемешивали. Смесь центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут для разделения всех слоев. Получали верхний слой, к которому добавляли изопропиловый спирт в 1,5-кратном объеме по отношению к объему верхнего слоя с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для осаждения генома бактериофага. После сбора преципитата к нему добавляли 70% этанол с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для промывки преципитата. Промытый преципитат собирали, сушили в вакууме и затем растворяли в 100 мкл воды. Эту процедуру повторяли с получением достаточного количества генома бактериофага Clo-РЕР-1.

Нуклеотидную последовательность генома бактериофага Clo-РЕР-1, полученного выше, анализировали по технологии Секвенирования нового поколения (NGS) с помощью устройства Mi-Seq от illumina в Национальном инструментальном центре Экологического управления Национального университета Сеула. В результате было предположено, что конечный геном бактериофага Clo-РЕР-1 имеет размер 50401 п. н., и нуклеотидная последовательность полного генома имеет SEQ ID NO: 1.

Схожесть геномной последовательности бактериофага Clo-РЕР-1, полученной выше, с ранее описанными геномными последовательностями бактериофагов была исследована с помощью BLAST, доступного из Интернет (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Из результатов BLAST оказалось затруднительным обнаружить последовательности бактериофагов, гомологичные более чем на 50% с последовательностью настоящего бактериофага. На основании этого результата заключили, что бактериофаг Clo-РЕР-1 должен быть новым бактериофагом, не описанным ранее.

Пример 3: Исследование способности бактериофага Clo-PEP-1 уничтожать Clostridium perfringens

Исследовали способность выделенного бактериофага Clo-РЕР-1 уничтожать Clostridium perfringens. Для этого наблюдали за образованием прозрачного участка посредством капельного анализа, таким же образом, как описано в Примере 1. Клетки Clostridium perfringens, использованные для этого исследования, составляли 15 штаммов, ранее выделенных и идентифицированных авторами настоящего изобретения как Clostridium perfringens. Бактериофаг Clo-PEP-1 демонстрировал способность уничтожать 12 штаммов клеток Clostridium perfringens, использованных в данном эксперименте. Показательный результат исследования способности к уничтожению представлен на Фиг. 2. В то же время, также исследовали активность бактериофага Clo-PEP-1 в отношении уничтожения Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus suis, Streptococcus uberis и Pseudomonas aeruginosa. В результате было решено, что бактериофаг Clo-PEP-1 не обладал активностью в отношении уничтожения этих микроорганизмов.

Следовательно, было подтверждено, что бактериофаг Clo-PEP-1 обладает специфической способностью уничтожать клетки Clostridium perfringens и широким антибактериальным спектром против Clostridium perfringens, указывая на то, что бактериофаг Clo-PEP-1 по настоящему изобретению мог бы применяться в качестве активного ингредиента композиции для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens.

Пример 4: Эффект бактериофага Clo-PEP-1 в отношении предупреждения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens

100 мкл раствора бактериофага Clo-PEP-1 в концентрации 1×10⁹ БОЕ/мл добавляли в пробирку, содержащую 9 мл TSB. В другую пробирку, содержащую 9 мл TSB, добавляли такой же объем только TSB. Затем в каждую пробирку добавляли культуру Clostridium perfringens с получением бактериальной суспензии с OD₆₀₀, равной 0,5. После чего пробирки переносили в анаэробный инкубатор при 37°C с последующим культивированием, во время которого наблюдали рост клеток Clostridium perfringens. Как представлено в Таблице 1, рост клеток Clostridium perfringens ингибировался в пробирке, в которую был добавлен раствор бактериофага Clo-PEP-1, тогда как в пробирке, не содержащей раствор бактериофага Clo-PEP-1, рост клеток Clostridium perfringens не ингибировался.

Вышеприведенные результаты указывают на то, что бактериофаг Clo-PEP-1 не только ингибировал рост клеток Clostridium perfringens, но также способен их уничтожать. Следовательно, бактериофаг Clo-PEP-1 может применяться в качестве активного ингредиента в композиции для предупреждения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens.

Пример 5: Терапевтический эффект бактериофага Clo-PEP-1 в отношении инфекций, вызываемых Clostridium perfringens

Исследовали терапевтический эффект бактериофага Clo-PEP-1 на животных, пораженных клетками Clostridium perfringens. 40 цыплятам в возрасте 2 дней перорально вводили 1×10⁷ КОЕ клеток Clostridium perfringens для инфицирования животных. Их случайным образом разделяли на 2 группы. Одну экспериментальную группу кормили смесью, содержащей 1×10⁸ БОЕ бактериофага Clo-PEP-1 на 1 г корма. Другую контрольную группу кормили таким же образом, но без бактериофага Clo-PEP-1. После 2 дней исследования измеряли число клеток Clostridium perfringens в содержимом кала и слепой кишки животных. В этом измерении для того, чтобы избежать вмешательства других инфицирующих бактерий, использовали среду (TSC (триптоза-сульфит-циклосерин) агаровая пластинка: OXOID), селективную для клеток Clostridium perfringens. В результате было продемонстрировано, что для экспериментальной группы, получавшей бактериофаг Clo-PEP-1 с кормом, количество клеток Clostridium perfringens должно уменьшиться в содержимом кала более чем в 500 раз, и в содержимом слепой кишки - более чем в 300 раз, по сравнению с контрольной группой, не получавшей бактериофаг Clo-PEP-1. Исходя из вышеприведенных результатов было подтверждено, что бактериофаг Clo-PEP-1 по настоящему изобретению мог бы быть очень эффективным в лечении инфекционных заболеваний, вызываемых Clostridium perfringens.

Пример 6: Получение кормовых добавок и кормов

Кормовую добавку, содержащую бактериофаг Clo-PEP-1 в концентрации 1×10⁸ БОЕ/г, получали, используя раствор бактериофага Clo-PEP-1. Способ ее получения представлял собой следующий: мальтодекстрин (40%, w/v) добавляли к раствору бактериофага, и затем добавляли трегалозу до конечной концентрации 10%. После хорошего перемешивания смесь лиофилизировали. Наконец, лиофилизированную смесь размалывали в мелкие порошки. Вышеуказанный процесс лиофилизации может быть заменен сушкой в вакууме, сушкой при повышенной температуре или сушкой при комнатной температуре. Для получения контрольной кормовой добавки для сравнения получали кормовую добавку, не содержавшую бактериофаг, а содержавшую только буфер (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO₄, 0,1% желатина, pH 8,0).

Два вышеуказанных типа кормовых добавок смешивали с 1000-кратным объемом корма для куроводства, соответственно, с получением двух типов конечных кормов.

Пример 7: Получение добавок для питьевой воды и дезинфицирующих средств Добавка для питьевой воды и дезинфицирующее средство различаются по своему назначению, однако имеют аналогичный состав, поэтому их получали аналогичным образом. Добавку для питьевой воды (или дезинфицирующее средство), содержащую бактериофаг Clo-PEP-1 в концентрации 1×10⁸ БОЕ/мл, получали, используя раствор бактериофага Clo-PEP-1. В частности, для получения добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), раствор бактериофага Clo-PEP-1 добавляли к буферному раствору до достижения концентрации 1×10⁸ БОЕ/мл, который хорошо перемешивали. Для сравнения, вышеуказанный буферный раствор сам по себе использовали в качестве добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), не содержащей бактериофаг.

Полученные два типа добавок для питьевой воды (или дезинфицирующих средств) разбавляли водой в соотношении 1:1000, и затем использовали как питьевую воду или дезинфицирующее средство.

Пример 8: Эффект в куроводстве

Исследовали эффект кормов, питьевой воды и дезинфицирующего средства, полученных в Примере 6 и Примере 7, в куроводстве. В частности, исследование фокусировалось на смертности. Всего 120 цыплят в возрасте 2 дней делили на три группы, и в каждой группе было по 40 цыплят (группа А: группа исследования корма, группа В: группа исследования питьевой воды; и группа С: группа исследование дезинфицирующего средства). Исследование проводили в течение 4 недель. Каждую группу делили на две подгруппы, каждая из которых содержала по 20 цыплят. Подгруппы делили в соответствии с тем, проводили ли лечение бактериофагом Clo-PEP-1, или нет (: подвергалась лечению бактериофагом Clo-PEP-1; и : не подвергалась лечению бактериофагом Clo-РЕР-1). Цыплят, использованных в данном эксперименте, распределяли в каждую подгруппу и выращивали в отдельных помещениях, расположенных на достаточном расстоянии друг от друга. Каждую подгруппу разделяли и называли, как показано в Таблице 2.

Корма предоставляли в соответствии с общепринятым способом кормления, как представлено в Таблице 2, с кормами, полученными в Примере 6. Питьевую воду предоставляли в соответствии с традиционным способом снабжения водой, как представлено в Таблице 2, с питьевой водой, полученной в Примере 7. Обработку цыплят дезинфицирующим средством проводили трижды в неделю, по очереди с общепринятым дезинфицирующим средством. То есть, в день, когда распыляли дезинфицирующее средство по настоящему изобретению, не производили обработку общепринятым дезинфицирующим средством. Результаты представлены в Таблице 3.

Вышеприведенные результаты подтвердили, что корма, питьевая вода и дезинфицирующее средство, полученные согласно настоящему изобретению, были эффективны в снижении смертности животных. Следовательно, можно сделать вывод, что композиция по настоящему изобретению может эффективно применяться для улучшения продуктивности животноводства.

Специалистам в данной области понятно, что концепции и конкретные варианты осуществления, раскрытые в вышеизложенном описании, могут быть без труда использованы в качестве основы для модификации или разработки других вариантов осуществления для достижения тех же целей, которые достигаются в настоящем изобретении. Специалистам в данной области также понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не отступают от сущности и объема настоящего изобретения, как представлено в прилагаемой формуле изобретения.

Представленные изобретения относятся, в частности, к миовирусному бактериофагу Clo-РЕР-1, выделенному из природы и имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ. ID. NO: 1 (регистрационный №: KCTC 12664 BP). Изобретения также относятся к способу предупреждения или лечения инфекций, вызываемых клетками Clostridium perfringens, с использованием композиции, содержащей указанный бактериофаг в качестве активного ингредиента. Изобретения позволяют использовать заявленный бактериофаг, который способен специфически уничтожать клетки Clostridium perfringens, и могут быть использованы в медицинской промышленности. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 8 пр.

1. Миовирусный бактериофаг Clo-РЕР-1 (регистрационный №: KСТС 12664 ВР), выделенный из природы и способный специфически уничтожать Clostridium perfringens, имеющий геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ. ID. NO: 1.

2. Композиция для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, содержащая от 1×10¹ БОЕ/мл до 1×10³⁰ БОЕ/мл или от 1×10¹ БОЕ/г до 1×10³⁰ БОЕ/г бактериофага Clo-РЕР-1 по п. 1 в качестве активного ингредиента.

3. Композиция для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых Clostridium perfringens, по п. 2, где указанную композицию используют для получения кормовой добавки, добавки для питьевой воды или дезинфицирующего средства.

4. Способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых клетками Clostridium perfringens, включающий стадию введения субъекту композиции по п. 2 или 3, содержащей бактериофаг Clo-РЕР-1 в качестве активного ингредиента.

5. Способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых клетками Clostridium perfringens, по п. 4, где композицию вводят субъекту в форме кормовой добавки, добавки для питьевой воды или дезинфицирующего средства.