ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI SEROVAR O26:H11, ПРОДУЦЕНТ ШИГАПОДОБНОГО ТОКСИНА, ДЕПОНИРОВАННЫЙ В ГОСУДАРСТВЕННОЙ КОЛЛЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР "ГКПМ-ОБОЛЕНСК" ПОД НОМЕРОМ B-8034 Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/19 

Изобретение относится к областям: медицинской микробиологии, а именно к разделу изучения биологических свойств микроорганизмов, включая культуральные и молекулярные методы, включая серологическую идентификацию штаммов Escherichia coli, детекцию детерминант вирулентности и патогенности; эпидемиологии, а именно молекулярно-генетический мониторинг инфекций пищевого происхождения, вызванных штаммами Escherichia coli, способными к широкому эпидемическому распространению.

Согласно, МУ 04-723/3 по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями, штаммы Е. coli O26 относятся к группе энтеропатогенных Е. coli (ЕРЕС), вызывающих острые кишечные инфекции (ОКИ) у детей раннего возраста. В 2011 после крупной вспышки ОКИ возникшей в Германии, в РФ были внедрены МУК 4.2.2963-11 по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Е. coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах, в которых указано, что штаммы Е. coli O26 нередко могут быть продуцентами шигаподобного токсина (Stx), вызывать тяжелые заболевания.

По литературным данным известно, что популяция Е. coli O26 неоднородна по серологическим, ферментативным свойствам, патогенности и наличию комплекса факторов вирулентности, которые определяют клиническое, эпидемиологическое и экологическое значение Е. coli этой серологической группы. По наличию Н-антигена известны четыре серологических варианта: Е. coli O26:2, O26:8, O26:11 и O26:34. Известно, что штаммы Е. coli O26:2, O26:8, O26:34 относятся к ЕРЕС, а Е. coli O26:11 в пределах одного серологического варианта, в зависимости от детерминант вирулентности могут быть представлены штаммами ЕРЕС и STEC.

STEC являются частой причиной заболеваний желудочно-кишечного тракта человека, вызывают диарею, геморрагический колит и, нередко, развитие осложнения угрожающего жизни - гемолитико-уремического синдрома (ГУС). В патогруппу STEC включены штаммы E. coli, продуцирующие Stx, которые делятся на две группы, Stx1 и Stx2, кодируемые генами stx1 и stx2 соответственно. Жвачные животные, в частности, крупный рогатый скот, являются основными резервуарами STEC. Заболевания у человека возникают в результате употребления контаминированных возбудителями STEC-инфекций пищевых продуктов (мясные и молочные продукты), нередко при непосредственном контакте человека с животными. В последние годы серовар E. coli O26:Н11 является вторым по распространенности STEC после E. coli O157:Н7. Широкое международное распространение получили штаммы E. coli O26:Н11 двух сиквенс-типов ST21 и ST29, которые обнаруживали в Японии, США, Австралии и многих европейских странах, где ведется надзор за STEC-инфекцией. По данным отчетов Европейского агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) и Центра по профилактике и контролю заболеваний (ECDC) Е. coli O26:Н11 часто выделяют из проб пищевых продуктов. Штаммы Е. coli O26:Н11 клональной линии ST21, продуцирующие Stx1a, преобладали в клинических образцах, пробах пищевых продуктов и у КРС. Недавно в Европе как причина ГУС был идентифицирован высоковирулентный stx2a-позитивный клон ST29 Е. coli O26:Н11 (так называемый «новый европейский клон»), что вызывает серьезную обеспокоенность во многих странах.

Важнейшим критерием дифференциации патогенных Е. coli при лабораторной диагностике ОКИ служат антигенные свойства (О-, Н-антигены), а также наличие или отсутствие генов, кодирующих факторы патогенности и вирулентности. На территории РФ в рутинной практике клинических диагностических лабораторий Е. coli O26 без определения Н-антигена и продукции Stx, регистрируют как ЕРЕС.

В РФ набор агглютинирующих диагностических эшерихиозных сывороток не полный, тем не менее позволяет установить О-серогруппу 26, а отсутствие диагностических Н-сывороток снижает достоверную идентификацию выделенного штамма Е. coli. В России, зарегистрированная отечественная ПЦР-тест система для детекции ДНК диареегенных Е. coli «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL», гарантирует достоверную идентификацию известных патогрупп диареегенных Е. coli (ЕРЕС, ETEC, STEC, EIEC, EAgEC), однако не позволяет дифференцировать типичные и атипичные варианты ЕРЕС, типы и субтипы продуцируемых токсинов у ЕТЕС и STEC, а также проводить видовую дифференциацию EIEC от Shigella (по современной классификации они принадлежат к одному «геновиду»). Зарубежными исследованиями многих стран установлена циркуляция Е. coli O26 двух сиквенс-типов ST21 и ST29. Штаммы двух генетических линий по культуральным, ферментативным и антигенным свойствам очень близки, но они значительно отличаются по вирулентности и эпидемической значимости, поэтому определение принадлежности штамма Е. coli O26 к тому или иному ST имеет важное значение в эпидемиологическом надзоре за инфекциями, передающимися с пищевыми продуктами.

Отсутствие к настоящему времени контрольных тест-штаммов для фенотипических и молекулярных исследований штаммов Escherichia coli, принадлежащих к серологическому варианту O26:Н11, обусловило необходимость депонирования штамма Е. coli O26:Н11 В-8034, продуцента шигаподобного токсин Stx1a, относящегося к международному клону высокого риска эпидемического распространения ST 21.

Полная антигенная характеристика, детекция генов и факторов патогенности и вирулентности, принадлежность к клональным линиям штаммов Е. coli, является необходимым условием правильности интерпретации лабораторного анализа и эпидемиологических заключений, от которых зависит адекватная эффективность профилактических и противоэпидемических мероприятий. Предложенный штамм Escherichia coli serovar O26:Н11 В-8034, характеризующийся наличием генов rfb₂₆, fliC₁₁, определяющих серотиповую принадлежность, гена stx1a, ответственного за синтез шигаподобного токсина Stx, субтипа 1а, относящегося к ST 21, может быть использован в качестве контрольного тест-штамма.

Задача изобретения: обеспечение лабораторных работников клинико-диагностических лабораторий, Центров гигиены и эпидемиологии, контрольным тест-штаммом Escherichia coli serovar O26:Н11 В-8034, необходимым для адекватного проведения бактериологических и молекулярно-генетических исследований, предъявляемых СП 3.1.1.3108-13 «Профилактика острых кишечных инфекций». Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала средств, используемых при лабораторной диагностики Escherichia coli серологической группы O26.

Сущность изобретения: заключается в том, что получен контрольный тест-штамм для лабораторной и эпидемиологической диагностики шигатоксин-продуцирующего штамма Escherichia coli O26:Н11, принадлежащего к международному клону высокого риска эпидемического распространения сиквенс-типу ST 21.

Способ получения: Заявляемый штамм выделен от взрослого жителя Санкт-Петербурга с диарейным синдромом, осложненным гемоколитом, обследованного по клиническим показаниям. Идентифицирован до вида Escherichia coli серогруппы O26 бактериологическим и серологическим методами. Полная антигенная характеристика штамма Escherichia coli O26:Н11 установлена методом ПЦР «молекулярное серотипирование» при детекции генов rfb₂₆ и fliC₁₁, кодирующих синтез O26 и Н11 антигенов соответственно и подтверждена при анализе данных полногеномного секвенирования на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeqReagentKit v2 и Nextera XT (Illumina, США) с использованием платформы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org). Генетические детерминанты, ответственные за синтез шигаподобного токсина (Stx), с последующим субтипированием токсина, выявляли в ПЦР со специфическими праймерами и подтверждали при анализе данных полногеномного секвенирования, с использованием платформы VirulenceFinder (http://www.genomicepidemiology.org). Продукция токсина Stx1 была подтверждена в иммунохроматографическом тесте Duopath® Verotoxins (Merck, Германия) согласно инструкции производителя. Принадлежность к ST21 установлена при анализе данных полногеномного секвенирования, с использованием платформы MLST-1.8 Server (http://www.genomicepidemiology.org).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8034.

Характеристика штамма Escherichia coli serovar O26:Н11 В-8034.

Морфологические признаки: подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образуют спор, капсулу и пигмент.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, III группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: факультативный анаэроб, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, не прихотлив к питательным средам. Температурный оптимум 37°С при рН 7,2-7,4. На жидких средах дает обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легко разбивающийся. Пристеночное кольцо и пленку на поверхности среды не образует. На плотных питательных средах (МПА, Эндо, Плоскирева, Левина) колонии круглые выпуклые, средней величины влажные с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем, цвета, соответствующего окраске среды.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм имеет О-антиген 26, Н-антиген 11. Полная антигенная формула Escherichia coli O26:Н11.

Основные свойства штамма:

- по морфологическим и ферментативным свойствам относится биохимически активному варианту Escherichia coli (подвижный, ферментирует до молочной кислоты и газа глюкозу, лактозу, сахарозу, арабинозу, мальтозу, ксилозу, рамнозу, утилизирует маннит, дульцит, сорбит и салицин, декарбоксилирует орнитин, лизин и аргинин;

- наличие Н-антигена 11;

- продуцирует шигаподобный токсин 1 типа;

- имеет гены stx1 и stx1a;

- относится к сиквенс-типу 21;

- является возбудителем острой кишечной инфекции.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Детекция генов, кодирующих синтез антигенов O26 и H11 методом ПЦР.

Выделение бактериальной ДНК для использования в ПЦР с последующим анализом амплификации в агарозном геле проводили набором «InstaGene™Matrix» (BioRad, США) согласно прилагаемой инструкции. Для подтверждения О-антигена 26, идентифицированного бактериологическим (серологическим) методом с использованием О-агглютинирующих сывороток, и детекции гена (fliC), кодирующего Н-антиген 11, использовали ПЦР с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации с заимствованными опубликованными последовательностями праймеров. Стабильность наличия генов rfb₂₆ и fliC₁₁, кодирующих синтез антигенов O26 и Н11 в геноме Escherichia coli O26:Н11 В-8034 подтверждалась повторным проведением «молекулярного серотипирования».

Пример 2. Детекция генов, кодирующих синтез антигенов O26 и H11 на основе анализа полногеномного секвенирования.

Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli O26:Н11 В-8034 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле. Количество ДНК (длина волны 260 нм) титровали с помощью спектрофотометра QIAxpert. Подготовку геномных библиотек для полногеномного секвенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Для установления серотиповой принадлежности штаммов, полученные нуклеотидные последовательности были анализированы с использованием веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org).

Стабильность генов rfb₂₆ и fliC₁₁, кодирующего продукцию О- и Н-антигенов в геноме Escherichia coli O26:Н11 В-8034 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидных последовательностей генов.

Пример 3. Выявление продукции шигаподобных токсинов.

Продукцию шигаподобных токсинов определяли в иммунохроматографическом (ИХ) экспресс-тесте Duopath® Verotoxins (Merck, Германия) согласно инструкции производителя и Методическим указаниям МУК 4.2.2963-11 «Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Е. coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры) и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах» (2011 г.) Суточную культуру штамма Escherichia coli O26:Н11 В-8034 ресуспендировали в 1 мл CAYE-бульона (индуктора синтеза шигаподобного токсина). После инкубации в течение 6 часов при 37°С к 180 мкл культуральной жидкости добавляли 20 мкл раствора полимиксина В. Через десять минут после инкубации при 37°С 150 мкл охлажденной до комнатной температуры культуральной жидкости вносили в лунку ИХ-теста. Результат учитывали только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут. Штамм Escherichia coli O26:Н11 В-8034 давал положительный результат в тестовой зоне (Stx1) и отрицательный - в зоне (Stx2). Стабильность продукции шигаподобного токсина 1 типа штамма Escherichia coli O26:Н11 В-8034 подтверждалась повторным проведением иммунохроматографического теста.

Пример 4. Детекция генов stx1 и stx1a, кодирующих синтез шигаподобного токсина 1 типа и его субтип 1а.

Генетические детерминанты stx1 и stx1a выявляли в ПЦР со специфическими праймерами указанными в опубликованном протоколе ВОЗ. Выделение ДНК штаммов Escherichia coli O26:Н11 (отрицательный результат в ИХ-тесте), EDL933 (положительный результат Stx2 в ИХ-тесте) и контрольного тест-штамма Escherichia coli O26:Н11 В-8034 (положительный результат Stx1 в ИХ-тесте) проводили с использованием наборов «InstaGeneMatrix» (BioRad, США), «АмплиПраймРИБО-преп» (НексБио, Россия) согласно инструкциям производителей и методом кипячения. Гены stx1 и stx1a амплифицировали с помощью специфических праймеров указанных в опубликованном протоколе ВОЗ, синтезируемых ЗАО «Евроген», (Россия). В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 10 мкл Taq MasterMix («ThermoFisher», США), по 1 мкл каждого праймера, 9 мкл Н₂O и 2 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С -15 мин; затем 35 циклов: 95°С -15 сек, 58°С -20 сек; финальная элонгация - 72°С -3 мин. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярного веса использовали GeneRuler 100 bp DNALadder «Fermentas», (Литва). Исследуемые штаммы Escherichia coli O26:Н11 давший отрицательный результат в ИХ-тесте и EDL933 давший положительный результат Stx2 в ИХ-тесте не имели генов stx1 и stx1a. Контрольный тест-штамм Escherichia coli O26:Н11 В-8034 характеризовался присутствием двух генов stx1 и stx1a.

Установлено, что штамм Escherichia coli O26:Н11 В-8034 давал стабильные повторные результаты независимо от способа выделения ДНК и состава реакционной смеси.

Пример 5. Детекция сиквенс-типа ST21 методом анализа полногеномного секвенирования.

Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli O26:Н11 В-8034 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле. Количество ДНК (длина волны 260 нм) титровали с помощью спектрофотометра QIAxpert. Подготовку геномных библиотек для полногеномного секвенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Принадлежность к ST21 установлена при анализе данных полногеномного секвенирования, с использованием платформы MLST-1.8 Server (http://www.genomicepidemiology.org).

Полногеномное секвенирование штаммов, использование стандартизованных методов анализа и международных баз данных, содержащих подробную информацию о генетической характеристике возбудителей, позволяют легко проводить детекцию международных клонов высокого риска, а также оценивать их эволюцию и географическое распространение вследствие международной торговли пищевыми продуктами, сельскохозяйственными животными и кормами, выявлять конкретные факторы передачи.

В рамках глобальной стратегии ВОЗ, направленной на уменьшение бремени заболеваний, передающихся с пищевыми продуктами, в каждой стране должны быть разработаны научно обоснованные меры профилактики, позволяющие ограничить «завоз» и распространение штаммов международных клонов высокого риска.

Изобретение относится к области микробиологии и эпидемиологии. Предложен штамм бактерий Escherichia coli O26:H11, продуцент шигаподобного токсина, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8034. Указанный штамм может быть использован в качестве контрольного тест-штамма для детекции E. coli серологического варианта O26:Н11, генов вирулентности stx1 и stx1a (1 типа) и сравнительного изучения родства штаммов данного серологического варианта. 5 пр.

Штамм бактерий Escherichia coli O26:H11, продуцент шигаподобного токсина, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8034, используемый в качестве контрольного тест-штамма для детекции E. coli серологического варианта O26:Н11, генов вирулентности stx1 и stx1a (1 типа) и сравнительного изучения родства штаммов данного серологического варианта.