ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ШИГАПОДОБНОГО ТОКСИНА 2 (Stx2) Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/19 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к разделу изучения биологических свойств микроорганизмов, включая морфологические, культуральные и молекулярные методы, серологическую идентификацию, определение вирулентности штаммов Escherichia coli и касается нового штамма Escherichia coli, продуцирующего шигаподобный токсин Stx2 и содержащего генетические детерминаты Stx2 и ST, который может быть использован для производства биопрепаратов (вакцин и диагностикумов), а также для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов для ветеринарного применения.

Энтерогеморрагические E.coli (EHEC) - в международной литературе для их обозначения используют синонимические аббревиатуры: EHEC (enterohemorrhagic E.coli), VTEC (verotoxin- или verocytotoxin producing E.coli; веротоксин- или вероцитотоксин- продуцирующие E.coli) и STEC (shiga-like toxinproducing или shigatoxin-producing E.coli: шигаподобные токсин-продуцирующие или шигатоксин-продуцирующие E.coli). Эта группа характеризуется наличием плазмиды вирулентности размером 60 Mda и секрецией шигаподобного токсина. Описаны два основных типа токсинов: шигатоксин 1 (Stx1), высоко гомологичный цитотоксину или нейротоксину S.dysenteriae 1, и шигатоксин 2 (Stx2), который имеет около 60,0% гомологии с Stx1. Оба токсина являются цитотоксическими, вызывают цитотоксическое действие в культуре клеток Vero in vitro, накопление жидкости в изолированной петле кишечника кролика, паралич и смерть мышей и кроликов. Шигатоксин II типа вызывает геморрагический колит у взрослых кроликов. На клетки макроорганизма шигаподобные токсины оказывают энтеротоксическое и цитотоксическое действие, причем первое превышает второе в 10000 раз. Известно, что способность продуцировать токсины кодируется генами, которые переносятся конвертирующими бактериофагами [1-3].

Энтерогеморрагические штаммы эшерихий являются причиной тяжелых желудочно-кишечных заболеваний у людей. Клиническая картина болезни варьирует в широких пределах от бессимптомной инфекции и легкой диареи до геморрагического колита, гемолитико-уремического синдрома и тромботической тромбоцитопенической пурпуры, нередко завершающихся летальным исходом в результате острой почечной недостаточности [4].

У животных эшерихии, вырабатывающие шигаподобные токсины, могут вызывать диарею и дизентериеподобные синдромы (телята) и диарею и отечную болезнь (поросята). Действие токсинов основано на цитотоксическом и нейротоксическом эффекте. Причем, последний обусловлен не столько прямым действием на нейроны, сколько воздействием на сосуды и гематоэнцефалический барьер, проницаемость которого увеличивается при интоксикации в 2 раза [5-7].

Известно изобретение «Непатогенный штамм F18 Е. coli и его применение», используемый в качестве живого вакцинного штамма для предотвращения интестинальной инфекции F18 патогенной E. coli у свиньи, внесенный в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получивший номер доступа 200613-01. Идентификация штамма осуществлена с применением системы API. Серотипирование штамма выявило серотип 0141:K94:H-. Виротипирование штамма осуществлено гибридизацией колоний и/или полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Результаты виротипирования показали, что штамм являлся позитивным к F18 и AIDA и негативным в отношении следующих токсинов: STa, STb, LT, EAST1, Stx1, Stx2, CNF, F4, F5, F6, F17, F41, P, AFA, Eae, Paa, Tsh, гены Aerobactin. Таким образом, данный штамм E. coli является непатогенным [9].

Известно изобретение «Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI в качестве контрольного тест-штамма для фенотипических и молекулярных исследований эшерихий серологической группы О144», характеризующийся отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичных для Shigella spp. и энтероинвазивных E. coli (EIEC) - плазмидных (ipaH) и хромосомных (ial) генов инвазивности, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8656. Штамм Escherichia coli O144:Н45 может использоваться в качестве контрольного штамма для качественного проведения бактериологических и молекулярно-генетических исследований, необходимых для подтверждения этиологической значимости штаммов, предъявляемых СП 3.1.1.3108-13 «Профилактика острых кишечных инфекций», однако он не содержит генов вирулентности stx2 и ST, как предлагаемый штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П [10].

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм бактерий Escherichia coli serovar O26:H11, продуцент шигаподобного токсина, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8034, используемый в качестве контрольного тест-штамма для детекции E. coli серологического варианта O26:Н11, генов вирулентности stx1 и stx1a (1 типа) и сравнительного изучения родства штаммов данного серологического варианта, однако он не содержит генов вирулентности stx2 и ST, как предлагаемый штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П [8].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента штаммов Escherichia coli, пригодных для изготовления вакцин, диагностикумов, гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов против колибактериоза, кроме того заявленный штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П является более активным и стабильным (по сравнению с известными аналогами).

Указанный технический результат изобретения достигается выделением штамма Escherichia coli продуцента шигаподобного токсина 2 (Stx2) для оценки возможности его использования с целью создания профилактических, диагностических и лечебных препаратов против колибактериоза, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-277П, содержащего генетические детерминаты Stx2 и ST.

Штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П эпизоотический, выделен из патологического материала поросенка при осуществлении мониторинга заболеваемости колибактериозом в Центральном федеральном округе Российской Федерации.

Выделение ДНК проводили набором «Рибо-преп» (Amplisens, ФБУН ЦНИИЭ) согласно инструкции по применению. Определение патотипа Escherichia coli проводили методом ПЦР. Для проведения молекулярного анализа Escherichia coli использовали 14 пар праймеров. Последовательности праймеров для амплификации генов ST, LT, eae, aggR, invE, DaaD указаны в [11], для шига-токсинов stx1 и stx2 в [12]. Первоначально все праймеры были проверены отдельно в моноплексных реакциях. Амплификацию генов, кодирующих факторы вирулентности (ФВ), проводили в процессе двух мультиплексных (ST, LT, DaaD; aggR, invE, eae) и двух моноплексных ПЦР (stx1/2). Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «Тер- цик». Детекцию продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в агарозном геле. Результаты представлены в таблице 1.

*О наличии гена судили по соответствующей полосе амплификации на электрофореграмме.

Характеристика штамма:

По современным представлениям вид Escherichia coli относится к роду Escherichia, семейству Enterobacteriaceae, порядку Enterobacteriales, классу Gamma proteobacteria, типу Proteobacteria, царство- бактерии.

Морфологические, культуральные, антигенные, ферментативные свойства штамма изучали согласно методических указаний по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных (утверждены Министерством сельского хозяйства Российской Федерации 27.07.2000 № 13-7-2/2117).

Морфологические свойства штамма - мелкая полиморфная грамотрицательная палочка с закругленными концами, спор и капсул не образует, неподвижная.

Культуральные свойства - факультативный анаэроб, каталазоположительный, оксидазоотрицательный, не прихотлив к питательным средам. Температурный оптимум 37°С при рН 7,2-7,4. На МПБ дает равномерное помутнение среды, небольшой легко разбивающийся аморфный осадок; на МПА в чашках Петри - формирует средние размером 2-4 мм, серовато-белые, круглые, выпуклые непрозрачные колонии с гладкой поверхностью и ровными краями в “S”-форме, проба кипячения по Бернгофу отрицательная; в ПЖА - рост по уколу (неподвижный).

Антигенная структура: по результатам серологического исследования штамм имеет О-антиген 138, К-антиген 81. Полная антигенная формула Escherichia coli O138:К81.

Ферментативные и протеолитические свойства: вырабатывает β-галактозидазу, лизиндекрбоксилазу, орнитиндекарбоксилаза, образует индол, сбраживает глюкозу, маннит, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиоза, арабинозу; не вырабатывает аргининдигидролазу, триптофандеаминазу, желатиназу, не утилизирует цитраты, не образует сероводород, уреазу, ацетоин, не сбраживает инозит, амигдалин.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, III группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Вирулентные свойства: ЛД50 для белых мышей при внутрибрюшинном введении - 1,77 х 10⁸ микробных клеток.

Стабильность морфологических, культуральных и ферментативных свойств штамма Escherichia coli ВКШМ-Б-277П проверяли путем трехкратного пассажа на питательных средах различных производителей: ФБУН ГНЦ ПМБ (Россия), НИЦФ (Россия), Oxoid (Великобритания), HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), BioMerieux (Франция), Merck (Германия). Установлено, что штамм давал стабильные результаты на питательных средах всех производителей.

Выросшие на плотной питательной среде колонии были исследованы с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF Biotyper Microflex. Для этого проводили экстракцию белков посредством последовательной обработки микробной взвеси этиловым спиртом, 70% муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. На чистую MALDI-мишень наносили 1 мкл супернатанта с последующим подсушиванием образцов в ламинарном боксе при комнатной температуре и нанесением по 1 мкл масс-спектрометрической матрицы НССА (a-циано-4-гидроксикоричная кислота, 99%), также с подсушиванием. Анализ осуществлялся в автоматическом режиме. Полученные результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения по величине логарифмического роста показатель подобия был больше 2,0 - что соответствует достоверному результату идентификации микроорганизма.

Проведенные исследования позволяют заключить, что исследуемый штамм был идентифицирован как Escherichia coli с высокой степенью достоверности и не содержит примеси других бактериальных культур.

Основные свойства штамма:

- по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам относится к биохимически активному варианту Escherichia coli;

- содержит гены stx2 и ST;

- высокий уровень продукции шигаподобного токсина II типа;

- способность к выработке антитоксических антител у иммунизированных животных;

- стабильность - сохраняет свойства при культивировании на питательных средах;

- является возбудителем острой кишечной инфекции.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1.

Количественное определение способности штамма Escherichia coli ВКШМ-Б-277П продуцировать шигаподобные токсины Stx1 (VT1) и Stx2 (VT2) проводили путем непрямой пассивной латекс агглютинации, используя латексный диагностикум VTEC-RPLA фирмы «Oxoid» (Великобритания), в сравнении со штаммами продуцентами Stx1 (VT1) и Stx2 (VT2), взятыми из «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ».

С этой целью исследуемые штаммы культивировали на агаре Brain Heart Infusion Agar (Oxoid CM375) при температуре 37°С в течение 18-20 часов, смывали 0,85% раствором натрия хлорида, содержащим 5000 ЕД/мл полимиксина В, доводили концентрацию микробных клеток до 10 млрд/мл, экстрагировали вероцитотоксины в течение 30 мин при 37°С, периодически помешивая, и затем центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин при 4°С.

Обработка клеток эшерихий полимиксином В вызывала нарушение целостности мембраны микроорганизмов путем адсорбции на фосфолипидах мембраны и повышения ее проницаемости с последующим лизисом бактерий и выходом бактериальных белков из периплазматического пространства, что приводило к появлению в бесклеточных субстратах шигаподобных токсинов.

Надосадочные жидкости отобранных штаммов исследовали с латексными диагностикумами VT1 и VT2 фирмы «Oxoid». Для этого каждую надосадочную жидкость разводили в микропланшете разбавителем, входящим в состав диагностикума, от 1:25 до 1:3200 и добавляли аналогичное количество тестируемого латекса VT1 или VT2.

Микропланшет инкубировали при комнатной температуре в течение 20-24 часов, затем каждую лунку исследовали на предмет агглютинации на черном фоне.

Учет результатов. Результаты, классифицированные как (+), (++) и (+++), считаются положительными. Результаты, классифицированные как (±) и (-), считаются отрицательными. Чувствительность теста составляет от 1 до 2 нг/мл вероцитотоксина E.coli. Поэтому вероцитотоксин, присутствующий в концентрациях ниже этой, дает отрицательные результаты.

Результаты представлены в таблице 2.

Согласно указанным в таблице 2 данным, исследуемый штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П синтезировал VT2 (Stx2) токсин, тестируемый в реакции непрямой пассивной латекс-агглютинации, в титре 1:3200, тогда как аналогичные штаммы, взятые из «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» давали реакцию латекс-агглютинации в титре от 1:200 до 1:800. Токсин VT1 (Stx1) исследуемые штаммы не продуцировали.

Пример 2.

Определение антигенной активности штамма Escherichia coli ВКШМ-Б-277П в отношении к Stx2 (VT2) токсину проводили в сравнении со штаммами продуцентами Stx2 (VT2), взятыми из «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» в реакции диффузной преципитации в агаровом геле. С этой целью использовали инактивированные надосадочные жидкости отобранных штаммов, полученные как описано в примере 1. Для этого к надосадочной жидкости каждого штамма, содержащей Stx2 (VT2) токсин, добавляли формалин до 0,3%-ной концентрации и выдерживали в термостате при температуре (37 ± 1)°С периодически помешивая. Через каждые 5-7 суток отбирали пробы надосадочной жидкости и вводили 5 белым мышам внутрибрюшинно в дозе 0,3 см³ с целью определения полноты инактивации Stx2 (VT2) токсина.

Установлено, что полная инактивация токсина наступала на 17 сутки с момента добавления формалина, что необходимо учитывать при получении анатоксина для гипериммунизации кроликов.

Инактивированный Stx2 (VT2) токсин отобранных штаммов использовали для гипериммунизации кроликов. Животным вводили анатоксин каждого штамма в возрастающих дозах с интервалом 4 суток в течение 24 дней, используя по 5 кроликов. Через 28 суток после первой иммунизации у кроликов из ушной вены отбирали 5-8 см³ крови, выдерживали в термостате 2-3 ч при температуре (37 ± 1)°С и, после образования плотного сгустка, отделяли сыворотку. Каждую пробу сыворотки разводили стерильным физиологическим раствором с 1:2, 1:4 и т.д. до титра 1:32 и равные объемы (0,05 см³) каждого разведения вносили в лунки диаметром 3-4 мм, сделанные в слое агарового геля в чашках Петри, и расположенные по периферии. Центральную лунку заполняли супернатантом, содержащим Stx2 (VT2) токсин отобранных штаммов в объеме 0,05 см³. Параллельно ставили контроль: испытуемый антиген + нормальная сыворотка крови кролика. Чашки Петри выдерживали при температуре (22 ± 1)°С в течение 72 часов.

Учет и оценку реакции диффузной преципитации в агаровом геле проводили по степени выраженности преципитационных полос, а именно: отсутствие полос - отрицательная реакция (-), едва видимые полосы (+), слабовыраженные полосы (++), отчетливо видимые полосы (+++) и резко выраженные полосы (++++), при этом положительной реакцией считали с оценкой на (+++) и (++++). Величина титра служила количественной характеристикой антигенной активности штамма продуцента Stx2 (VT2) токсина.

Результаты опыта представлены в таблице 3.

Согласно представленным в таблице 3 данным, исследуемый штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П обладал высокой антигенной активностью и вызывал образование специфических антител в сыворотке крови кроликов к Stx2 (VT2) токсину в титре 1:16 в реакции диффузной преципитации в агаровом геле, тогда как аналогичные штаммы взятые из «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ» обеспечивали образование специфических антител в сыворотке крови кроликов к Stx2 (VT2) токсину в титре от 1:2 до 1:8.

Полученные результаты показывают, что штамм Escherichia coli ВКШМ-Б-277П является более активным и стабильным (по сравнению с известными) продуцентом шигаподобного токсина Stx2 и может быть использован в производстве средств специфической профилактики, терапии и диагностики колибактериоза животных.

Литературные источники

1. Макарова, М.А Использование современных методов диагностики энтерогеморрагических Escherichia coli / М.А. Макарова, Л.А. Кафтырева, Т.А. Коновалова // Мат. междунар. конф. «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». - Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3, № 2. - С. 151-152.

2. Макарова, М.А. Взаимосвязь внутривидового разнообразия и генетических детерминант патогенности Escherichia coli / М.А. Макарова, Л.А. Кафтырева // Всерос. науч.-практ. конф. с международ. уч. «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения: актуальные проблемы и решения»: сб. трудов / под ред. Е.И. Ефимова. - Нижний Новгород: Ремедиум Приволжье. - 2019. - С. 230-236.

3. Поболелова Ю.И. Идентификация патотипов и генов антибиотикорезистентности музейных штаммов диареегенных E.coli / Ю.И. Поболелова, С.П. Яцентюк // Труды ВИЭВ, т. 80.- ч. I.-2018.- С. 284-290. DOI 10.30917/ATT-PRINT-2018-1.

4. Онищенко, Г.Г. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсин продуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в СанктПетербурге в 2013 году / Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, Н.В. Воложанцев, В.А. Баннов, Н.Н. Карцев, В.Н. Борзенков, Н.К. Фурсова, И.Г. Шемякин, А.Г. Богун, А.А. Кисличкина, А.В. Попова, В.П. Мякинина, М.Г. Теймуразов, О.В. Полосенко, Л.А. Кафтырева, М.А. Макарова, З.Н. Матвеева, Т.А. Гречанинова, Н.С. Григорьева, Е.В. Кича, Г.В. Забалуева, Т.Б. Кутасова, Ю.Н. Коржаев, Н.С. Башкетова, О.Н. Бушманова, А.В. Сталевская, И.Г. Чхинджерия, А.Б. Жебрун // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 2015. - № 1. - С. 70-81. Doi: 10.15690/vramn.v70i1.1234.

5. Кузнецова M.В., Поспелова Ю.С., Артамонова О.А., Старчич Э. М. Способ оценки патотипа и эпидемической/эпизоотической значимости штаммов Escherichia coli, выделенных в условиях сельскохозяйственного предприятия // Патент на изобретение 2779827 C1, 13.09.2022. Заявка №2021134849 от 26.11.2021.

6. Забровская, А.В. Энтерогеморрагические эшерихии у животных и человека / А. В. Забровская, М.А. Макарова, С.А. Егорова, Л.А. Кафтырева, Л.И.Смирнова // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2012. - № 1. - С.22- 25.

7. Andrea Luppi. Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance / Porcine Health Management. 2017, pp. 16, Volume 3, Issue 1. DOI: 10.1186/s40813-017-0063-4.

8. Макарова М. А., Кафтырева Л. А. Штамм бактерий Escherichia coli serovar O26:H11, продуцент шигаподобного токсина, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8034 // Патент на изобретение 2756980 C1, 07.10.2021. Заявка №2020134009 от 15.10.2020.

9. Фэйрбразер Д. М., Надо Э., Дезотель К. Непатогенный штамм F18 Е. coli и его применение // Патент на изобретение 2670882 С9, 11.12.2018. Заявка № 2015105738 от 18.07.2013.

10. Макарова М. А., Кафтырева Л. А. Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI в качестве контрольного тест-штамма для фенотипических и молекулярных исследований эшерихий серологической группы О144 // Патент на изобретение 2707640 C1, 28.11.2019. Заявка № 2019101944 от 24.01.2019.

11. Salmani H., Azarnezhad A., Fayazi M.R., Hosseini A. Pathotypic and Phylogenetic Study of Diarrheagenic Escherichia coli and Uropathogenic E. coli Using Multiplex Polymerase Chain Reaction // Jundishapur J Microbiol. 2016. 9(2):e28331.

12. Miri S.T., Dashti A., Mostaan S., Kazemi F., Bouzari S. Identification of different Escherichia coli pathotypes in north and north-west provinces of Iran // Iran J Microbiol. 2017, 9(1):33-37.

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии, в частности к штамму Escherichia coli, выделенному из патологического материала поросенка при осуществлении мониторинга заболеваемости колибактериозом в Центральном федеральном округе Российской Федерации, депонированному во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-277П. Штамм продуцирует шигаподобный токсин Stx2 и содержит генетические детерминаты Stx2 и ST и может быть использован в качестве производственного штамма для изготовления биопрепаратов (вакцин и диагностикумов), а также при получении гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов для ветеринарного применения. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Escherichia coli продуцент шигаподобного токсина 2 (Stx2), используемый в качестве производственного штамма с целью создания профилактических, диагностических и лечебных препаратов против колибактериоза, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-277П.