ПРИМЕНЕНИЕ РАСТВОРА ЦИТРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ CRP С ПОМОЩЬЮ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОСФОХОЛИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 2018 года по МПК C07K1/22 C07K14/47 B01D15/38 B01J20/32 

Настоящее изобретение относится к применению раствора цитрата для удаления С-реактивного белка (CRP) с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированным с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

Уровень техники

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) около 17 миллионов людей умерли от сердечно-сосудистых заболеваний в 2008 году. Таким образом, сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной смерти среди неинфекционных заболеваний и несут ответственность за приблизительно одну треть всех случаев смерти во всем мире. По оценкам, это число возрастет до примерно 23 млн. человек в год к 2030 году.

Таким образом, сердечно-сосудистые заболевания являются не только основной причиной смерти во всем мире, но также вызывают огромные расходы на медицинское обслуживание для национальных систем здравоохранения и фондов медицинского страхования. Два из наиболее распространенных и наиболее пагубных проявлений сердечно-сосудистых заболеваний представляют собой возникновение атеросклероза и тромбоза, которые, в свою очередь, отвечают, среди прочего, за сердечные приступы и инсульты.

В последние годы были достигнуты значительные успехи в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Такой прогресс стал возможен не только благодаря новым знаниям относительно механизмов индукции заболевания, но и благодаря ранней идентификации пациентов риска. На самом деле, идентификация рисков заболеваний и их своевременное лечение являются важными характеристиками современной медицинской практики. За последние 25 лет было идентифицировано множество факторов и клинических параметров, которые коррелируют либо с текущим состоянием заболевания, или с вероятностью сердечно-сосудистых заболеваний в будущем. Такие факторы риска могут представлять собой измеряемые биохимические или физиологические параметры, такие как, уровень холестерина в сыворотке, уровень HDL, LDL и фибриногена, а также поведенческие модели, такие как избыточный вес и курение. В тех случаях, когда фактор риска является не только признаком заболевания или его развития, но фактически причинно вовлечен в его развитии, терапевтическое влияние на этот фактор риска может повлиять на течение заболевания или уменьшить риск его развития.

С-реактивный белок (CRP) в качестве белка острой фазы является частью врожденной иммунной системы и формируется в печени в процессе воспалительных реакций и высвобождается в кровь. Образование CRP в основном индуцируется цитокинами, которые экспрессируются в контексте острой или хронической воспалительной реакции. Самым мощным стимулом для формирования CRP является интерлейкин-6 (IL-6). Таким образом, уровни CRP, а также IL-6 в крови являются индикаторами локального или системного воспалительного ответа. Предполагается, что хроническое воспаление является одним из основных и вспомогательных патологических проявлений сердечно-сосудистых заболеваний. Все чаще считается, что CRP является не только фактором прогноза для сердечно-сосудистого заболевания, но также причинно вовлечен в его развитие или может влиять на его ход.

Yeh (Clin Cardiol., 2005, 28, 408-412) продемонстрировали, что уровень CRP может быть использован для прогнозирования риска сердечно-сосудистых заболеваний, CRP также является индикатором воспалительных реакций, и что воспаление стимулирует все стадии атеросклероза. Zoccali et al., (Semin. Nephrol. 2005, 25, 358-362), продемонстрировали, что уровень CRP является фактором прогноза риска сердечно-сосудистой смертности у пациентов с почечной недостаточностью в терминальной стадии. Согласно Nurmohamed et al., (Neth. J. Med. 2005, 63, 376-381), уровень CRP является фактором прогноза сердечно-сосудистого риска смертности у пациентов, находящихся на гемодиализе.

Sola et al. (J. Card. Fail. 2005, 11, 607-612) продемонстрировали, что терапия статинами может быть использована для уменьшения количества CRP и, тем самым, для снижения смертности и заболеваемости, вызванных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Однако эта форма терапии не приводит к существенному снижению высокого уровня С-реактивного белка (до 1000-раз выше нормальных значений) в результате инфаркта миокарда или высоких уровней CRP в крови пациентов на диализе.

Нормальное значение для CRP в крови человека варьируется от человека к человеку, но в среднем составляет приблизительно 0,8 мг CRP на литр крови, но может доходить в случае острых или хронических воспалительных реакций (например, бактериальные инфекции, атеросклероз, после сердечного приступа) до уровня, по существу, выше 100 мг CRP на литр крови. Поскольку период полужизни CRP в крови (прибл. 19 часов) является постоянным и, таким образом, не зависит от состояния здоровья пациента, скорость синтеза CRP индивидуально отвечает за регуляцию уровня CRP в крови (Pepys & Hirschfield, J. Clin. Invest. 2003, 11, 1805-1812). Таким образом, значительно увеличивающийся синтез CRP при острых патологических состояниях предъявляет особые требования в отношении терапевтических подходов для удаления CRP пациентов (пациенты риска или экстренные пациенты), поскольку значительное количество CRP должно быть удалено для снижения уровня CRP до стандартного уровня в крови.

Следовательно, нарастает интерес к терапевтическим процедурам для снижения уровня CRP в крови пациентов. Благодаря клинической значимость CRP имеется также интерес к эффективным методам очистки CRP, для того, чтобы использовать очищенный CRP в дальнейших экспериментах, например, для дальнейшего исследования его молекулярной функции.

В WO 2004/076486 раскрыт способ ингибирования иммунологических, воспалительных и/или патофизиологических реакций путем введения CRP-связывающих молекул пациентам с повышенным уровнем CRP. Однако не раскрыта экстракорпоральная обработка биологических жидкостей для удаления CRP из указанных биологических жидкостей.

В WO 90/12632 раскрыт способ и устройство для экстракорпоральной обработки биологических жидкостей с целью удаления CRP, а также антитела к фосфохолину из этих биологических жидкостей для лечения злокачественного новообразования. Фосфохолин-содержащая матрица, используемая для этой цели, может состоять, например, из диоксида кремния, сефарозы, акриловых гранул или агарозы, где как CRP, так и антитела к фосфохолину связаны посредством содержащегося фосфохолина.

В US 2007/225226 А1 раскрыты специфические пептиды, которые связываются с CRP и, следовательно, могут быть использованы в качестве материала функциональной колонки в аферезе CRP. Это связывание происходит независимо от кальция. Кроме того, описаны некоторые экстракорпоральные устройства для очистки крови, использующие этот материал колонки для афереза CRP, включая системы для удаления эндотоксинов с использованием цитрата в качестве антикоагулянта. CRP представляет собой пентамер, где каждая из его субъединиц ассоциирована с двумя ионами Са²⁺, который связывается с лигандами, используемыми в данном изобретении. Так как цитрат связывает ионы Са²⁺ с высокой аффинностью, то до сих пор предполагали, что при использовании Са²⁺-зависимых лигандов цитрат оказывает негативное влияние на способность колонок связывать CRP. Однако авторы настоящей заявки продемонстрировали, что способность выше для используемых лигандов. CRP представляет собой опсонин и может активировать систему комплемента через C1q в связанной форме. Однако неожиданно было продемонстрировано, что цитрат предотвращает активацию комплемента, что еще больше увеличивает способность, так что цитрат дополнительно увеличивает способность используемых лигандов. Этот эффект, проявляющийся с Са²⁺-зависимыми лигандами, также оказался полностью неожиданным в свете US 2007/225226 A1.

В WO 2007/076844 раскрыт способ экстракорпорального удаления CRP из плазмы крови посредством афереза для уменьшения риска для пациента (вызванного повышенным уровнем CRP в крови). Согласно изобретению используют колонку, содержащую матрицу, с которой связываются производные фосфохолина для связывания CRP и удаления его из плазмы, таким образом, подвергая лечению и/или предотвращая аутоиммунные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, диабет и почечную недостаточность.

Slagman et al. (Blood Purif. 2011, 31, 9) продемонстрировали на модели свиньи успешное снижение уровня CRP в крови путем экстракорпорального афереза после сердечного приступа.

Проблема, которая возникает при экстракорпоральном использовании крови и плазмы крови, будь то аналитические или препаративные применения, а также диализ или аферез, является началом свертывания крови, которое препятствует или самому использованию, или делает его невозможным, но также закупоривает, а также загрязняет используемые устройства. По этой причине антикоагулирующие агенты (так называемые антикоагулянты) непосредственно добавляют в кровь или в плазму крови после удаления из организма человека или животного.

Одна из возможностей для ингибирования коагуляции крови представляет собой введение Ca²⁺-хелаторов, таких как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), щавелевая кислота и цитраты. Кальций необходим в качестве кофактора ряда факторов коагуляции в процессе свертывания крови. Са²⁺-хелаторы используются для удаления кальция из крови или плазмы крови, ингибируя таким образом коагуляцию. Однако это является серьезной проблемой для аффинных хроматографических методов для удаления CRP с помощью фосфохолина или фосфоэтаноламина или производных фосфохолина или фосфоэтаноламина. Поскольку для связывания CRP с фосфохолином или с его производными требуется Са²⁺ (Black et al., Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 48487, Thompson et al., Structure 1999, 7 (2), 169 -177), то единодушное мнение предшествующего уровня техники состояло в том, что следует абсолютно избегать введения Ca²⁺-хелаторов при связывании CRP с фосфохолином (см., например, WO 90/12632). Таким образом, согласно предшествующему уровню техники, использование цитрат-содержащих связывающих буферов во время аффинно-хроматографического связывания CRP с фосфохолином совершенно неприемлемо. Однако цитрат-содержащие растворы (сходные с введением ЭДТА) были пригодны в качестве элюирующих буферов, то есть, для удаления связанного CRP из фосфохолина.

Один из возможных вариантов для Са²⁺-независимой антикоагуляции заключаются во введении гепарина. Гепарин является эндогенным веществом, которое вырабатывается тучными клетками и оказывает ингибирующее действие на каскад коагуляции. Путем связывания гепарина с антитромбином II, ингибитор протеазы, циркулирующий в крови, который может инактивировать активированные факторы коагуляции крови, такие как тромбин и фактор Ха, инициирует конформационное изменение антитромбина II. Это ускоряет антитромбин II-опосредованную инактивацию факторов коагуляции крови в 2000 раз. Свертывание крови прекращается. Соответственно, в методах удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из крови или плазмы крови с помощью фосфохолина и производных фосфохолина или фосфоэтаноламина и производных фосфоэтаноламина, исключительно гепарин до сих пор используется в качестве антикоагулянта.

Однако это имеет некоторые недостатки, так как гепарин, особенно в случае нефракционированного гепарина, может привести к иммунной реакции, гепарин-индуцированной тромбоцитопении (HIT) в дополнение к кровотечению. Таким образом, гепарин индуцирует венозные и артериальные тромбозы. У пациентов, перенесших инсульт, для которых использование CRP афереза также возможно, риск HIT при приеме нефракционированного гепарина составляет приблизительно 3%. Кроме того, гепарин не одобрен для использования с центрифужными сепараторами клеток, которые часто используются для разделения крови на клеточные компоненты и плазму крови.

Целью настоящего изобретения является создание антикоагулянта для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии, что позволяет избежать проблем настоящего уровня техники, связанных с гепарином, и дополнительно не ухудшает Са²⁺-зависимое связывание CRP с фосфохолином или фосфоэтаноламином и их производными.

Эта цель достигается с помощью раскрытия независимых пунктов формулы изобретения. Другие предпочтительные воплощения очевидны из описания, примеров и зависимых пунктов формулы изобретения.

Неожиданно смогли установить, что применение раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с использованием материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп не только неожиданно достигает эффективного удаления CRP из биологических жидкостей, но также решает проблемы предшествующего уровня техники.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с использованием материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

Термин «CRP», используемый в настоящем документе, эквивалентен «С-реактивному белку». В данном документе он предпочтительно относится к человеческому С-реактивному белку.

Термин «удаление CRP с помощью аффинной хроматографии», используемый в настоящем документе, означает, что удаление CRP происходит через специфическое связывание между CRP и компонентами средств для удаления CRP. В этом контексте, это также можно отнести к «удалению CRP с помощью аффинной хроматографии» или «селективному удалению CRP». Такое специфическое связывание между CRP и функционализированным соответствующим образом материалом колонки основано на структурных свойствах белка CRP и может включать в себя, например, характерное связывание CRP с фосфохолином или связывание CRP с антителами, направленными против эпитопа CRP. Селективное или молекулярно-специфическое удаление CRP включает в себя, что CRP связывается с более высокой аффинностью с функционализированным материалом колонки, чем с другими компонентами биологических жидкостей. Таким образом, термин «селективный» в отношении удаления CRP, как используется в настоящем документе, означает, что отношение удаленного CRP к количеству CRP, содержащемуся в биологической жидкости, по меньшей мере, в три раза выше, чем соответствующее отношение других удаленных веществ к количеству вещества, содержащегося в биологической жидкости. Однако, термин «селективный» в отношении удаления CRP, как используется в настоящем документе, не означает, что удаляется только CRP. Здесь специалисту в данной области техники очевидно, что с использованием такого удаления CRP до некоторой степени с помощью аффинной хроматографии, другие вещества (непреднамеренно) могут неизбежно связываться с материалом колонки и, таким образом, также удаляются в определенной степени. Если существует структурное соответствие со структурой CRP, ответственной за специфическое связывание с группами ω-фосфонооксиалкиламмония, и/или с ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппами, как например, в белке, то этот структурно сходный белок также будет связываться в определенной степени. Примером могут служить антитела, направленные против фосфохолина и, следовательно, они также смогут связываться с материалом колонки, который был функционализирован с помощью фосфохолина. Другой возможностью является то, что невозможно полностью избежать неспецифического связывания компонентов биологической жидкости, например, с материалами субстрата матрицы.

Как уже упоминалось, связывание CRP с фосфохолином или с его производными или с фосфоэтаноламином или с его производными зависит от наличия Ca²⁺ и, таким образом, также связывание CRP с группами ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппами, которые были иммобилизованы внутри или на материале колонки, также зависит от присутствия Ca²⁺.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированным с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

Конечно, применение в соответствии с изобретением раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированным с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, означает, что перед удалением CRP раствор цитрата смешивают с биологической жидкостью, из которой CRP должен быть удален. Раствор цитрата, таким образом, присутствует во время целевого связывания CRP с группами ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппами материала колонки. Следовательно, можно также утверждать на основе технических условий аффинной хроматографии, что раствор цитрата используют в качестве «связывающего буфера».

Однако это не означает, что раствор цитрата используют в качестве «элюирующего раствора» (или в качестве «элюирующего буфера») и, таким образом, используют для удаления CRP из материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, т.е. для регенерации материала колонки.

Термин «связывающий буфер» (также называемый «связывающим раствором»), при использовании в настоящем документе, в случае метода аффинной хроматографии для удаления вещества (в данном документе для селективного и Са²⁺-зависимого удаления CRP) из образца (здесь биологические жидкости, такие как кровь или плазма крови), относится к раствору, который добавляют к образцу, а затем наносят вместе с образцом на материал колонки (здесь материал колонки, функционализированный с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп) для удаления вещества. Связывающий буфер должен обеспечивать адекватные условия для специфического связывания удаляемого вещества с материалом колонки.

Термин «элюирующий буфер» (также называемый «элюирующий раствор»), при использовании в настоящем документе, в случае метода аффинной хроматографии для удаления вещества (здесь селективное и Са²⁺-зависимое удаление CRP) из образца (здесь биологические жидкости, такие как кровь или плазма крови), относится к раствору, который применяется после нанесения образца на материал колонки и после осуществления специфического связывания удаляемого вещества с материалом колонки для того, чтобы разорвать специфическое связывание снова и, таким образом, открепить удаляемое вещество от материала колонки (или элюировать). Следовательно, в отличие от связывающего буфера, в материале колонки должны быть созданы условия с помощью элюирующего буфера, которые не позволяют связывание удаляемого вещества, а наоборот предотвращают его.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированным с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония, и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата служит в качестве связывающего буфера (или связывающего раствора) для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей.

Термин «биологическая жидкость», используемый в данном документе, относится к водным растворам, которые встречаются у млекопитающих и человека, предпочтительно, такие как спинно-мозговая жидкость, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость, асцитическая жидкость, кровь, плазмы крови, экстракты печень и межклеточная жидкость. Настоящее изобретение, конечно, относится к биологическим жидкостям, содержащим CRP.

Поэтому настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где биологические жидкости представляют собой кровь или плазму крови.

Другими словами, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из крови и/или плазмы крови с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

Растворы цитрата

Термин «цитрат», используемый в настоящем документе, относится к цитрат-аниону или к соли лимонной кислоты или, другими словами, к органическому трикарбоксилату следующей химической формулы:

Цитрат может существовать в различных формах (или соединениях), как например, в виде лимонной кислоты (в однократно или трехкратно протонированной форме), в виде соли лимонной кислоты в комбинации с другими (кроме Н⁺) неорганическими катионами (как например, соль металла вместе с катионами металлов или как соли аммония вместе с ионами аммония), но также и в виде неполного сложного эфира лимонной кислоты. В этом контексте, термин «соединение цитрата» также используется в настоящем документе.

Если соль лимонной кислоты, т.е. цитрат-анион, образует комплекс с неорганическим катионом, то термин «соль цитрата» также упоминается в настоящем документе как специфическая форма соединения цитрата.

При использовании в настоящем документе, термин «раствор цитрата», таким образом, включает водные растворы, содержащие, по меньшей мере, одно соединение цитрата. Более подробная информация о составе раствора цитрата приведена ниже.

Однако согласно изобретению, предпочтительно, если концентрация цитрата в цитратном растворе составляет не менее чем 1 мМ, предпочтительно не менее чем 1,1 мМ, предпочтительно не менее чем 1,2 мМ, более предпочтительно не менее чем 1,3 мМ, еще более предпочтительно, не менее чем 1,4 мМ и наиболее предпочтительно не менее чем 1,5 мМ.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, является предпочтительным, если цитратное соединение(соединения) является существенным компонентом раствора цитрата согласно изобретению. Здесь, «существенный компонент» означает, что сумма молярных концентраций всех цитратных соединения в растворе цитрата по сравнению с другими соединениями в пределах раствора цитрата, но за исключением воды, является одной из трех самых высоких концентраций, присутствующих в цитратном растворе.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата содержит по меньшей мере одно из цитратных соединений из группы, содержащей или состоящей из лимонной кислоты, дигидроцитрата натрия, гидроцитрата натрия, цитрата натрия, дигидрата цитрата натрия, дигидроцитрата калия, гидроцитрата калия, цитрата калия, дигидроцитрата лития, гидроцитрата лития, цитрата лития, дигидроцитрата аммония, гидроцитрата аммония, цитрата аммония, цитрата кальция (цитрата кальция), цитрата магния (цитрата магния) и/или неполных сложных эфиров лимонной кислоты.

Согласно настоящему изобретению, также возможно, чтобы раствор цитрата содержал смесь нескольких соединений цитрата, перечисленных выше.

Термин «цитратное соединение», используемый в настоящем документе, включает в себя как лимонную кислоту, так и ее соли.

Если общий термин «цитрат натрия» используются в данной заявке, то этот термин включает в себя различные протонированные формы цитрата натрия, т.е. непротонированную (цитрат натрия), однократно протонированную (гидроцитрат натрия) или дважды протонированную форму (дигидроцитрат натрия).

Если в настоящей заявке используется общий термин «цитрат калия», то этот термин включает в себя различные протонированные формы цитрата калия, т.е. непротонированную форму (цитрат калия), однократно протонированную (гидроцитрат калия) или дважды протонированную форму (дигидроцитрат калия).

Если в настоящей заявке используется общий термин «цитрат лития», то этот термин включает в себя различные протонированные формы цитрата лития, т.е. непротонированную форму (цитрат лития), однократно протонированную (гидроцитрат лития) или дважды протонированную форму (дигидроцитрат лития).

Если в настоящей заявке используется общий термин «цитрат аммония», то этот термин включает в себя различные протонированные формы цитрата аммония, т.е. непротонированную форму (цитрат аммония), однократно протонированную (гидроцитрат аммония) или дважды протонированную форму (дигидроцитрат аммония).

Термин «неполный сложный эфир лимонной кислоты», используемый в настоящем документе, относится к сложному эфиру лимонной кислоты, однако, не все три карбоксильные групп (т.е. -СОО^-) цитрата этерифицированы, (т.е. -COOR, где R представляет собой органический остаток), но не более чем две из трех карбоксильных групп цитрата, но предпочтительно не более чем одна из трех карбоксильных групп цитрата этерифицирована. В дополнении к одной или двум сложноэфирным группам, неполный эфир лимонной кислоты также содержит один или два физиологически приемлемых неорганических катиона (например, катионы металлов, такие как Na⁺, K⁺), которые образуют комплекс с одной или двумя неэтерифицированными карбоксильными группами цитрата.

Таким образом, предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата содержит, по меньшей мере, одно из цитратных соединений из группы, содержащей или состоящей из лимонной кислоты, дигидроцитрата натрия, гидроцитрата натрия, цитрата натрия, дигидрата цитрата натрия, дигидроцитрата калия, гидроцитрата калия, цитрата калия, дигидроцитрата лития, гидроцитрата лития, цитрата лития, дигидроцитрата аммония, гидроцитрата аммония, цитрата аммония, цитрата кальция (цитрата кальция), цитрата магния (цитрата магния) и/или неполных сложных эфиров лимонной кислоты, где, по меньшей мере, одно цитратное соединение выбирают из лимонной кислоты и солей цитрата с катионами одновалентных металлов.

Согласно изобретению предпочтительно, если раствор цитрата не содержит цитрата железа (II). Более предпочтительно, раствор цитрата не содержит цитрата железа (III). Кроме того, предпочтительно, согласно изобретению, если раствор цитрата не содержит цитрата меди (II) (трикупрум дицитрат) и не содержит цитрата алюминия.

В других предпочтительных воплощениях настоящего изобретения, раствор цитрата не содержит цитрата кальция (также известного как трикальций дицитрат).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения, раствор цитрата не содержит цитрата магния (также известного как тримагний дицитрат) или цитрата магния в концентрации не более 1 мМ.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения, раствор цитрата не содержит цитрат кальция и цитрат магния или цитрат магния в концентрации не более 1 мМ.

Когда в настоящей заявке упоминается, что раствор не содержит определенное вещество, то это означает, что данный раствор не содержит вещество совсем или, по меньшей мере, не содержит более чем 0,01% по массе этого вещества, чтобы учесть возможные неизбежные примеси.

Поэтому особенно предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата содержит, по меньшей мере, одно из цитратных соединений из группы, содержащей или состоящей из лимонной кислоты, дигидроцитрата натрия, гидроцитрата натрия, цитрата натрия, дигидрата цитрата натрия, дигидроцитрата калия, гидроцитрата калия, цитрата калия, дигидроцитрата лития, гидроцитрата лития, и/или цитрата лития. Однако еще более предпочтительными являются лимонная кислота, дигидроцитрат натрия, гидроцитрат натрия, цитрат натрия, дигидрат цитрата натрия, дигидроцитрат калия, гидроцитрат калия и/или цитрат калия. Однако наиболее предпочтительными являются лимонная кислота, дигидроцитрат натрия, гидроцитрат натрия, цитрат натрия и дигидрат цитрата натрия.

Кроме того, согласно изобретению предпочтительно, если раствор цитрата не содержит, помимо указанного цитратного соединения или указанных цитратных соединений цитрата, никаких дополнительных веществ, то есть дополнительных веществ не на основе цитрата, которые хелатируют Са²⁺ (так называемые Са²⁺-хелаторы).

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата не содержит Ca²⁺-хелаторов, которые по химическим свойствам не относятся к цитратным соединениям. Возможные примеры Са²⁺-хелаторов, которые по своим химическим свойствам не относятся к соединениям цитрата и, таким образом, не являются предпочтительными, представляют собой ЭДТА (этилендиамин тетрауксусная кислота), EGTA (этиленгликоль-бис(аминоэтиловый эфир)-Ν,Ν,Ν',Ν'-этилендиаминтетрауксусная кислота), ВАРТА (1,2-бис(О-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-этилендиаминтетрауксусная кислоту) и оксалаты.

Таким образом, предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата содержит, по меньшей мере, одно из цитратных соединений из группы, содержащей или состоящей из лимонной кислоты, дигидроцитрата натрия, гидроцитрата натрия, цитрата натрия, дигидрата цитрата натрия, дигидроцитрата калия, гидроцитрата калия, цитрата калия, дигидроцитрата лития, гидроцитрата лития, цитрата лития, дигидроцитрата аммония, гидроцитрат аммония, цитрата аммония, цитрата кальция (цитрат кальция), цитрата магния (цитрат магния) и/или неполных сложных эфиров лимонной кислоты, где раствор цитрата не содержит дополнительных Ca²⁺-хелаторов помимо цитратного соединения(й).

Таким образом, согласно изобретению, еще более предпочтительно, если раствор цитрата не содержит EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), EGTA (этиленгликоль-бис (аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-этилендиаминтетрауксусной кислоты), ВАРТА (1,2-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-этилендиаминтетрауксусная кислота) или оксалат.

В дополнение к цитратным соединениям, перечисленным выше, раствор цитрата может содержать дополнительные вещества, которые, однако, не имеют каких-либо хелатирующих свойств. Например, дополнительные вещества возможны в качестве добавок, способствующих тому, чтобы осмоляльность раствора цитрата была равна приблизительно осмоляльности биологической жидкости, то есть, например, крови или плазмы крови. Такие вещества для регуляции осмоляльности включают неорганические соли, такие как, например, хлорид натрия, хлорид калия, а также сахара, такие как глюкоза, декстроза (D-глюкоза), фруктоза и сахароза или гепарин. Термины декстроза и Д-глюкоза эквивалентны, и, следовательно, могут быть использованы как синонимы в настоящем документе.

Кроме того, другие вещества возможны в качестве добавок, которые служат для регуляции значения рН раствора цитрата до заданного значения, например, значения рН биологической жидкости (как например крови или плазмы крови). Так например, возможно, что дополнительное вещество, содержащееся вместе с соединением цитрата, образует буферную систему, с помощью которой значение рН раствора цитрата можно регулировать, и небольшие колебания значения рН могут быть компенсированы. Если раствор цитрата содержит буферную систему цитратного соединения и не-цитратного буферного вещества, то также используется термин «цитрат-содержащий буфер». Возможные примеры добавленных буферных веществ, которые не являются цитратными соединениями (т.е. не нецитратные буферные вещества), включают гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, дигидрофосфат калия, лактат и ацетат.

Возможные примеры буферных систем из цитратного соединения и не-цитратного буферного вещества, т.е. раствор цитрата согласно настоящему изобретению в виде цитрат-содержащего буфера, представляет собой комбинацию лимонной кислоты с гидрофосфатом натрия, дигидрофосфатом натрия, гидрофосфатом калия или дигидрофосфатом калия. Однако комбинация лимонной кислоты с гидрофосфатом натрия является особенно предпочтительной.

Однако если растворы цитрата содержат два различных цитратных соединения, которые вместе также образуют буферную систему, то также используется термин «цитратный буфер».

Возможные примеры буферных систем из двух различных цитратных соединений, т.е. раствор цитрата согласно настоящему изобретению в виде цитратного буфера, представляет собой комбинацию лимонной кислоты с цитратом натрия, гидроцитратом натрия, цитратом натрия, дигидроцитратом калия, гидроцитратом калия или цитратом калия;

комбинацию дигидроцитрата натрия с гидроцитратом натрия, цитратом натрия, гидроцитратом калия или цитратом калия;

комбинацию дигидроцитрата калия с гидроцитратом натрия, цитратом натрия, гидроцитратом калия или цитратом калия;

комбинацию гидроцитрата натрия с цитратом натрия или цитратом калия; комбинацию гидроцитрата калия с цитратом натрия или цитратом калия.

Однако комбинация лимонной кислоты с цитратом натрия в качестве раствора цитрата в форме цитратного буфера является особенно предпочтительной.

Конечно, также возможно добавление дополнительных веществ в раствор цитрата, содержащий два различных цитратных соединения (т.е. цитратный буфер) для регуляции осмоляльности.

Согласно изобретению, предпочтительно, если раствор цитрата состоит только из воды, одного или нескольких из указанных выше цитратных соединений, а также, необязательно, одного или нескольких из указанных выше соединений для регуляции осмоляльности (также называемых как «осмолитики») и/или, необязательно, одного или нескольких из указанных выше не-цитратных буферных веществ.

Еще одно воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата состоит из воды и по меньшей мере одного из цитратных соединений из группы, содержащей или состоящей из лимонной кислоты, дигидроцитрата натрия, гидроцитрата натрия, цитрата натрия, дигидрата цитрата натрия, цитрата калия, гидроцитрата натрия, цитрата калия, дигидроцитрата лития, гидроцитрата лития, цитрата лития, дигидроцитрата аммония, гидроцитрата аммония, цитрата аммония, цитрата кальция (цитрат кальция), цитрата магния (цитрат магния), и/или неполного сложного эфира лимонной кислоты; и (необязательно), по меньшей мере, одного из соединений из группы, содержащей или состоящей из хлорида натрия, хлорида калия, глюкозы, фруктозы и сахарозы, и/или (необязательно), по меньшей мере, одного из соединений из группы, содержащей или состоящей из гидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата калия, дигидрофосфата калия, лактата и ацетата.

Поэтому еще одно предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата состоит из лимонной кислоты, цитрата натрия и воды.

Особенно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор содержит 38 мМ лимонную кислоту, 74,8 мМ цитрат натрия и воду.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония, и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата состоит из лимонной кислоты, цитрата натрия, D-глюкозы и воды.

Раствор цитрата, состоящий из лимонной кислоты, цитрата натрия, D-глюкозы и воды, также упоминается как «раствор-кислоты-цитрата-декстрозы (ACD-раствор).

Предпочтительные варианты раствора цитрата, используемые согласно настоящему изобретению, относятся к ACD-растворам, которые содержат от 22,9 мМ до 38,0 мМ лимонной кислоты, от 44,9 мМ до 74,8 мМ цитрата натрия, от 74,2 мМ до 123,6 мМ D-глюкозы и воду.

Особенно предпочтительный вариант раствора цитрата, используемого согласно настоящему изобретению, относится к ACD-раствору, содержащему 38 мМ лимонной кислоты, 74,8 мМ цитрата натрия, 123,6 мМ D-глюкозы и воду. Он также упоминается как «ACD-A раствор».

Особенно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор содержит 38 мМ лимонной кислоты, 74,8 мМ цитрата натрия, 123,6 мМ D-глюкозы и воду.

Еще одно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата состоит из лимонной кислоты, цитрата натрия, гидрофосфата натрия, D-глюкозы и воды.

Раствор цитрата, состоящий из лимонной кислоты, цитрата натрия, гидрофосфата натрия, D-глюкозы и воды, также упоминается как «раствор-цитрата-фосфата-декстрозы (CPD)».

Предпочтительный вариант раствора цитрата, используемого согласно настоящему изобретению, относится к CPD-раствору, содержащему 15,6 мМ лимонной кислоты, 89,4 мМ цитрата натрия, 128,7 мМ D-глюкозы, 16,1 мМ фосфата натрия и воды.

Особенно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор содержит 15,6 мМ лимонной кислоты, 89,4 мМ цитрата натрия, 128,7 мМ D-глюкозы, 16,1 мМ фосфата натрия и воду.

Еще одно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата состоит из лимонной кислоты, цитрата натрия, гидрофосфата натрия, D-глюкозы, аденина и воды.

Раствор цитрата, состоящий из лимонной кислоты, цитрата натрия, гидрофосфата натрия, D-глюкозы, аденина и воды, также упоминается как «раствор-цитрата-фосфата-декстрозы с аденином (CPDA)».

Предпочтительный вариант раствора цитрата, используемого согласно изобретению, таким образом, относится к CPDA-раствору, содержащему 15,6 мМ лимонной кислоты, 89,4 мМ цитрата натрия, от 128,7 мМ до 160,9 мМ D-глюкозы, 16,1 мМ гидрофосфата натрия, 2 мМ аденин и воду. Еще одно предпочтительное воплощение раствора цитрата, используемого согласно настоящему изобретению, относится к CPDA-раствору, содержащему 15,6 мМ лимонной кислоты, 89,4 мМ цитрата натрия, 128,7 мМ D-глюкозы, 16,1 мМ фосфата натрия, 2 мМ аденина и воду. Особенно предпочтительный вариант раствора цитрата, используемый согласно настоящему изобретению, относится к CPDA-раствору, содержащему 15,6 мМ лимонной кислоты, 89,4 мМ цитрата натрия, 160,9 мМ D-глюкозы, 16,1 мМ фосфата натрия, 2 мМ аденина и воду.

Особенно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор содержит 15,6 мМ лимонной кислоты, 89,4 мМ цитрата натрия, от 128,7 мМ до 160,9 мМ D-глюкозы, 16,1 мМ фосфата натрия, 2 мМ аденина и воду.

Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения предпочтительно, если раствор цитрата не содержит соли металлов с мультивалентными, т.е. двухвалентными или трехвалентными катионами. Таким образом, в другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения раствор цитрата не содержит солей кальция. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения раствор цитрата не содержит соли магния или, по меньшей мере, соль магния в концентрации не более 1 мМ.

Другими словами, согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения предпочтительно, если раствор цитрата содержит только соли металлов с одновалентными катионами.

Концентрация цитрата и разбавление с помощью биологической жидкости

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата имеет суммарную концентрацию цитрата в диапазоне от 50 мМ до 200 мМ, предпочтительно от 60 мМ до 150 мМ, более предпочтительно от 70 мМ до 120 мМ, более предпочтительно от 75 мМ до 115 мМ, и наиболее предпочтительно, от 74,8 мМ до 113 мМ.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится также к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата имеет суммарную концентрацию цитрата, составляющую предпочтительно 50 мМ, 150 мМ, 200 мМ, более предпочтительно 60 мМ, более предпочтительно 120 мМ, более предпочтительно 115 мМ, более предпочтительно 70 мМ, более предпочтительно 75 мМ, более предпочтительно 74,8 мМ, и наиболее предпочтительно 113 мМ.

Конечно, не только концентрация цитрата в существующем растворе цитрата имеет важное значение, но, прежде всего, конечная концентрация в смеси раствора цитрата и биологической жидкости, т.е., например, крови или плазмы крови. Таким образом, разбавление используемого раствора цитрата также имеет важное значение.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония, и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где биологическую жидкость смешивают с раствором цитрата перед удалением CRP.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата в качестве связывающего буфера (или связывающего раствора) для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония, и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где биологическую жидкость смешивают с раствором цитрата перед удалением CRP.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, в котором удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, и где биологическую жидкость смешивают с раствором цитрата перед удалением CRP.

После перемешивания раствора цитрата с биологической жидкостью (т.е., например, кровью или плазмой крови) смесь раствора цитрата и биологической жидкости наносят на материал колонки, который был функционализирован с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, так что происходит (Са²⁺-зависимое) связывание CRP с функционализированным материалом колонки.

Настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где цитрат раствор разбавляют в диапазоне от 1:50 до 1: 5, предпочтительно от 1:40 до 1:10, предпочтительно от 1:30 до 1:20, предпочтительно от 1:20 до 1:15, предпочтительно от 1:15 до 1:10 с биологической жидкостью.

Настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата разбавляют с помощью биологической жидкости в соотношении 1:50, предпочтительно, 1:45, более предпочтительно 1:40, предпочтительно 1:35, более предпочтительными 1:30, предпочтительно 1:25, более предпочтительно 1:20, более предпочтительно 1:15, более предпочтительно 1:10, предпочтительно 1:5.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп в разведении с помощью биологической жидкости в диапазоне от 1:50 до 1: 5.

Предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится также к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата имеют суммарную концентрацию цитрата в диапазоне от 50 мМ до 200 мМ, предпочтительно от 60 мМ до 150 мМ, более предпочтительно от 70 мМ до 120 мМ, более предпочтительно от 75 мМ до 115 мМ, и наиболее предпочтительно, от 74,8 мм до 113 мм; и где раствор цитрата разбавляют с помощью биологической жидкости в диапазоне от 1:50 до 1:5, предпочтительно от 1:40 до 1:10, предпочтительно от 1:30 до 1:20, предпочтительно от 1:20 до 1:15, предпочтительно от 1:15 до 1:10.

Еще одно предпочтительное воплощение настоящего изобретения, таким образом, относится также к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата имеет суммарную концентрацию цитрата в диапазоне от 70 мМ до 120 мМ; и где раствор цитрата разбавляют с помощью биологической жидкости в диапазоне от 1:50 до 1:5.

Конечно, также возможно, чтобы использовались растворы цитрата, содержащие более низкую или более высокую концентрацию цитрата, чем те, что описаны в предыдущих параграфах. Соответственно, конечно, степень разбавления биологической жидкостью должна быть соответственно уменьшена (при более низких концентрациях цитрата) или увеличена (при более высоких концентрациях цитрата). Однако концентрации цитрата и разведение, описанные в предыдущих параграфах, как оказалось, особенно предпочтительны в сочетании с использованием в соответствии с изобретением раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей.

Поскольку рН раствора оказывает существенное влияние на диссоциацию кислот и оснований (как например, лимонной кислоты), и, таким образом, также влияют на связывание Са²⁺ в данном случае, значение рН используемого раствора цитрата является важным аспектом настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата имеет значение рН в диапазоне от рН 4 до рН 7, предпочтительно от рН 4,5 до рН 6,5, более предпочтительно от рН 4,7 до рН 6,0, более предпочтительно от рН 4,9 до рН 5,8, более предпочтительно от рН 5 до рН 5,6 и наиболее предпочтительно от рН 5 до рН 5,5.

Са²⁺-зависимые лиганды для CRP

Как уже упоминалось несколько раз, для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, например, из крови или плазмы крови, используют материал колонки, который содержит фосфохолин и/или фосфоэтаноламин или его производные, в результате чего возможно Са²⁺-зависимое связывание CRP с указанным функционализированным материалом колонки.

Для этой цели, фосфохолин, фосфоэтаноламин или его производные иммобилизуют на материал колонки. Обычно это происходит с помощью органической линкерной группы, посредством которой фосфохолин, фосфоэтаноламин или их производные связываются с материалом колонки с помощью адсорбции или даже более предпочтительно с помощью ковалентной связи. Это приводит к получению так называемого «функционализированного материала колонки», где химическая группа, отвечающая за Са²⁺-зависимое связывание CRP, подвергается воздействию извне, так что CRP, который расположен в биологической жидкости, также имеет доступ к указанной химической группе.

Другими слова, термин «функционализированный материал колонки», используемый здесь, относится к материалу колонки для аффинной хроматографии, который обеспечен функциональной химической группой. В этом случае, функциональная химическая группа может быть соединена с материалом колонки посредством адсорбционных или ионных взаимодействий, но предпочтительно посредством ковалентной связи. Это, конечно, важно, что функциональная химическая группа связана с материалом колонки таким образом, что функциональная группа является активной и подвергаются воздействию таким образом, что ее функциональность сохраняется. В результате, для группы (здесь: группа ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппа), прикрепленной к материалу колонки, есть возможность взаимодействовать с лигандом (здесь: CRP) из образца (здесь: биологическая жидкость, такая как кровь или плазма крови) или связываться с ним.

В зависимости от того, связывается ли с материалом колонки фосфохолин, фосфоэтаноламин или их производное с помощью органического линкера, с помощью группы аммония или посредством фосфатной группы, проводится различие между материалом колонки, который был функционализирован с помощью группы ω-фосфонооксиалкиламмония (связь с помощью группы аммония), и материалом колонки, функционализированным с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы (связь с помощью фосфатной группы).

Связь с материалом колонки (необязательно с помощью органического линкера) показана в формулах (I) и (II), приведенных ниже, с помощью пунктирной линии или на атоме азота группы аммония или на атоме кислорода фосфатной группы.

Термин «группа ω-фосфонооксиалкиламмония», используемый в настоящем документе, может быть использован аналогично тому, как «омега-фосфонооксиалкиламмоний» и описывает соединения следующей общей формулы (I)

(I)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹ и R² независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикл, выбранный из:

где один или несколько атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

Настоящее изобретение, таким образом, также относится к использованию раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где ω-фосфонооксиалкил аммониевые группы имеют следующую общую формулу (I):

(I)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹ и R² независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

где один или несколько атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

Предпочтительные ω-фосфонооксиалкил аммониевые группы включают соединения общей формулы (I):

(I)

где

n=2 или 3;

R¹ и R² независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

Особенно предпочтительные ω-фосфонооксиалкил аммониевые группы включают соединения общей формулы (I):

(I)

где

n равно 2;

R¹ и R² выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, и особенно предпочтительно из -CH₃, и -C₂H₅, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

Предпочтительные соединения, содержащие ω-фосфонооксиалкил аммониевые группы, как описано выше, и которые подходят для функционализации соответствующего материала колонок, содержат, например:

2-[2-(2-аминоэтокси)этил-диэтил-аммонио]этилгидрофосфат, 2-[4-[2-(2-аминоэтокси)этил]морфолин-4-иум-4-ил]этилгидрофосфат, 2-[1-[2-(2-аминоэтокси)этил]пиперидин-1-иум-1-ил]этил-гидрофосфат, 2-[2-(2-аминоэтокси)этил-диметил-аммонио]этилгидрофосфат, 2-[3-аминопропил-(диметил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[диметил(4-сульфанилбутил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[4-азидобутил(диметил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[диметил(пент-4-инил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[3-(6-аминогексаноиламино)пропилдиэти-аммонио]этилгидрофосфат, 2-[1-[2-[2-(6-аминогексаноиламино)этокси]этил]пиперидин-1-иум-1-ил]этилгидрофосфат, 2-[4-[2-[2-[3-(6-аминогексаноиламино)пропаноиламино]этокси]этил]морфолин-4-иум-4-ил]этилгидрофосфат, 2-[1-[2-[2-[6-(6-аминогексаноиламино)гексаноиламино]этокси]этил]пирролидин-1-иум-1-ил]этилгидрофосфат, 2-[2-аллилоксиэтил(диметил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[2-аллилоксиэтил(диэтил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[4-(2-аллилоксиэтил)морфолин-4-иум-4-ил]этилгидрофосфат, 2-[1-(2-аллилоксиэтил)пиперидин-1-иум-1-ил]этилгидрофосфат, 2-[2-[2-(6-аминогексаноиламино)этокси]этилдиметиламмонио]этилгидрофосфат, 2-[2-[2-[3-(6-аминогексаноиламино)пропаноиламино]этокси]этилдиметиламмонио] этилгидрофосфат, 2-[3-азидопропил(диметил)аммонио]этилгидрофосфат, 2-[диметил-[2-[2-(проп-2-иноксикабониламино)этокси]этил]аммонио]этилгидрофосфат, 2-[2-[2-(аллилоксикарбониламин)этокси]этилдиметиламмонио]этилгидрофосфат, 2-[2-[2-[6-(аллилоксикарбониламино)гексаноиламино]этокси]этилдиметиламмонио]этилгидрофосфат, 2-[2-(6-аминогексаноиламино)этилдиметиламмонио]этилгидрофосфат, 2- [диметил-[3-[6-(проп-2-иноксикарбониламино)гексаноиламин]пропил]аммонио]этилгидрофосфат и 2-[3-(6-аминогексаноиламино)пропилдиметиламмонио]этилгидрофосфат.

Термин «ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы», используемый в настоящем документе, может быть использован аналогично как «омега-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы» и описывает соединения следующей общей формулы (II),

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹, R² и R³ независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

и

R³ выбран из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, и предпочтительно -H; где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

Предпочтительные «ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы» включают соединения общей формулы (II),

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹, R² и R³ независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

и

R³ представляет собой -H.

В рамках настоящего изобретения, особенно предпочтительно, если ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппа представляет собой ω-триалкиламмонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппу.

Таким образом, особенно предпочтительные ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы включают соединения общей формулы (II),

(II)

где

n=2;

и R¹, R² и R³ выбирают из: -H, -CH₃, -C₂H₅, и особенно предпочтительно из -CH₃ и -C₂H₅.

Также особенно предпочтительно, если ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы представляют собой ω-триметиламмонийметоксигидроксифосфорилоксигруппы или ω-триметиламмонийпропоксигидроксифосфорилоксигруппы.

Предпочтительные соединения, содержащие ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппу, как описано выше, и подходящие для функционализации соответствующего материала колонки, включают, например: n-аминофенилфосфохолин (APPC), 4-[[гидрокси[2-(триметиламмоний)этокси]фосфинил]окси]бензолдиазоний(n-диазоний фенилфосфохолин) или n-нитрофенил-6-(O-фосфохолин)гидроксигексаноат.

Настоящее изобретение также относятся к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, отличающееся тем, что ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы имеют следующую общую формулу (II),

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹, R² и R³ независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

и

R³ выбран из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, и предпочтительно -H;

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атомом(ы) фтора.

Настоящее изобретение, таким образом, также относится к использованию раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где ω-фосфонооксиалкил аммониевые группы имеют следующую общую формулу (I)

(I)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹ и R² независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикл, выбранный из:

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атомом(ы) фтора,

и где ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы имеют следующую общую формулу (II),

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹, R² и R³ независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

и

R³ выбран из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, и предпочтительно -H;

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированным с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где ω-фосфонооксиалкиламмониевые группы имеют следующую общую формулу (I)

(I)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹ и R² независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикл, выбранный из:

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

Настоящее изобретение также относятся к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы имеют следующую общую формулу (II),

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹, R² и R³ независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

и

R³ выбран из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, и предпочтительно -H;

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, где удаление CRP с помощью аффинной хроматографии осуществляют путем (Са²⁺-зависимого) связывания CRP с материалом колонки, функционализированным с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где ω-фосфонооксиалкиламмониевые группы имеют следующую общую формулу (I)

(I)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹ и R² независимо выбраны из группы: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора;

и где ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы имеют следующую общую формулу (II),

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R¹, R² и R³ независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R¹ и R² вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из:

и

R³ выбран из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, и предпочтительно -H;

где один или более атомов водорода могут быть заменены на (а) атом(ы) фтора.

В одном возможном воплощении настоящего изобретения, ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппа присоединена через фосфоэфирную связь к гидроксильной группе молекулы глицерина (в качестве органического линкера), где полученный сложный эфир глицерина затем связывается с материалом колонки через вторую гидроксильную группу глицерина. В таком воплощении также возможно, что оставшаяся третья гидроксильная группа глицерина либо этерифицируется с помощью жирной кислоты или этерефицируется с помощью второй ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы. Кроме того, положение соответствующей этерификации на молекуле глицерина может варьировать. Подходящие жирные кислоты являются обычно насыщенными, моноолефиновыми, полиолефиновыми, моноацетиленовыми, ненасыщенными линейными и/или разветвленные жирными кислотами, содержащими от 8 до 28 атомов углерода. Предпочтительные остатки жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, арахидоновую кислоту, оксовалериановую кислоту, глутаровую кислоту, эпоксиизопростан и стеариновую кислоту.

Материал колонки

Для приготовления материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, в принципе, все инертные хроматографические материалы или материалы колонки пригодны в качестве материалов, которые, в частности, не вступают в реакцию с кровью или плазмой крови, или изменяют или загрязняют кровь или плазму крови таким образом, что кровь или плазма крови после контакта с материалом колонки больше не может быть введена в пациенту. Материалы колонки по настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими: Eupergite®, поливинилпирролидон (PVP), полисульфон (PS), полиэфирсульфон (PES), полиарилэфирсульфон (PAES), полиакрилат, метакрилат, метакрилатные смолы, такие как поли (метилметакрилат) (PMMA) и поли(глицидилметакрилат) (PGMA), поли (гидроксиметилметакрилат), полистирол (PS), политетрафторэтилен (PTFE), полиакриламид, полиакролеин, акрилонитрилбутадиенстирол (ABS), полиакрилонитрил (PAN), полиуретан (PU), Сефарозу®, акриловые гранулы, агарозу, целлюлозные матрицы, полиэтиленгликоль (ПЭГ), альгинат, каррагинан, хитин, крахмал, нитроцеллюлозные, керамические матрицы, стеклянные гранулы и/или твердофазный диоксид кремния или смеси и/или производные этих веществ. Твердофазная матрица диоксида кремния может содержать практически любую форму частиц диоксида кремния, в том числе аморфный диоксид кремния, такой как коллоидный диоксид кремния, силикагель, осажденный диоксид кремния, и копченый или пирогенный диоксид кремния; микрокристаллический диоксид кремния, такой как диатомовая земля; и кристаллический диоксид кремния, такой как кварц. Диоксид кремния имеет размер частиц в диапазоне примерно от 45 до 120 меш (приблизительно от 345 мкм до 125 мкм), предпочтительно в интервале от примерно 45 до 60 меш (приблизительно от 345 мкм до 212 мкм).

Часто для функционализации с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп используется материал колонки, который уже был «предварительно функционализирован», т.е. был обеспечен химической группой, которая затем, в свою очередь, позволяет ковалентное присоединение групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

Такая «пре-функционализация» материала колонки достигается с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области (Chin.J, Chem. 2012, 30, 2473, Polym. Int. 2013, 62, 991). Кроме того, некоторые уже «предварительно» функционализованные материалы колонки являются коммерчески доступными, такие как Toyopearl® AF-эпоксидная смола, Toyopearl® AF-амина, Toyopearl® АФ-тресил, TSKgel® тресил, эпокси-активированная Сефароза® 6В (GE Healthcare Life Sciences ), CNBr-активированная Сефароза ® 4 fast flow (GE Healthcare Life Sciences), ECH Сефароза ® 4B (GE Healthcare Life Sciences), NHS-активированная Сефароза ® 4 fast flow (GE Healthcare Life Sciences), активированная по концевому винилсульфону Сефароза ® 4 fast flow (Affiland), альдегид Separopore® (агароза) 4B, ECH Separopore® (агароза) 4B (Separopore), агароза от Sterogene Bioseparations, Inc., например, эпокси-UltraFlow-4 агароза (Sterogene Bioseparations, Inc.), эпоксид-UltraFlow-6 агароза (Sterogene Bioseparations, Inc), агароза из emp Biotech GmbH, эпокси-UltraFlow-4 агароза (EMP Biotech GmbH), эпокси-UltraFlow-6 агароза (EMP Biotech GmbH), активированные агарозы с любой степенью сшивки.

Применение в соответствии с изобретением раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп особенно подходит для экстракорпорального удаления CRP из крови или плазмы крови для реанимации после остановки сердца, а также для профилактики и/или лечения сердечно-сосудистых заболеваний, где сердечно-сосудистые заболевания представляют собой, в частности, сердечный приступ (миокардиальный инфаркт), инсульт и легочную эмболию. Также согласно изобретению подходит применение цитрата раствора для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп для экстракорпорального удаления CRP из крови или плазмы крови для профилактики и/или лечения слишком острого реагирования иммунной системы, где слишком острое реагирование иммунной системы выбрано из группы, состоящей из хронического воспаления, реакций отторжения трансплантатов и состояний во время аллергических реакций. Поэтому применение раствора цитрата согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходит для экстракорпорального удаления CRP из крови или плазмы крови для профилактики и/или лечения хронических воспалений, выбранных из следующей группы: подагра, остеоартрит, рассеянный склероз, хронические воспалительные кишечные заболевания, такие как болезнь Крона, язвенный колит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, миастения, болезнь Грейвса, аутоиммунный тиреоидит, такой как тиреоидит Хашимото и тиреоидит Орды, псориаз, анкилозирующий спондилит (болезнь Бехтерева), синдром Гудпасчера и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), системная красная волчанка, склеродермия, синдром Шегрена, гранулематоз Вегенера (болезнь Вегенера), полимиозит и дерматомиозит. Среди вышеупомянутых хронических воспалений существуют некоторые заболевания, которые подпадают под общий термин ревматоидных заболеваний, такие как ревматоидный артрит, псориатический артрит, миастения, диффузный токсический зоб, Хашимото-тиреоидит, тиреоидит Орда, псориаз, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), красная волчанка, склеродермия, синдром Шегрена, гранулематоз Вегенера (болезнь Вегенера), васкулит, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит.

Цитрат является хорошим антикоагулянтом, поскольку он предотвращает агрегацию тромбоцитов крови, а также активацию комплемента. В частности, это важно при использовании плазменных центрифуг. Им требуется цитрат, так как в противном случае происходит коагуляции. Это не представляется возможным при помощи чистой антикоагуляции с использованием гепарина. Кроме того, цитрат быстро метаболизируется в печени в цитратном цикле. Поэтому пациентов дополнительно не подвергают системной антикоагуляции. Это представляет большой интерес, особенно для пациентов с инфарктом, так как они уже подвергнуты сильной антикоагуляции в процессе стандартной терапии инфаркта миокарда (например, с помощью ацетилсалициловой кислоты, клопидогреля). Дополнительная антикоагуляция повышает риск кровотечения, что имеет решающее значение. Кроме того, плазменная центрифуга позволяет достигать значительно меньшего потока крови, чем система первичной сепарации на основе мембраны (фильтр). Обычный или желаемый поток плазмы составляет примерно 30 мл/мин. Мембранная система первичной сепарации требует потока крови приблизительно от 150 до 200 мл/мин (эффективность составляет примерно 17%). Плазменной центрифуге достаточно ≤ 60 мл/мин потока крови (КПД прибл.87%). Меньшие скорости потока крови намного легче реализовать, особенно у пожилых пациентов или у ослабленных пациентов.

Кроме того, для системы первичной сепарации на основе мембраны, требуется центральный доступ (например, катетер), который является очень инвазивным и опасным для пациентов, подвергнутых антикоагуляции, из-за риска кровотечений, в то время как, когда используется плазменная центрифуга, как правило, достаточно периферического доступа, например, через большую инъекционную канюлю, которая не имеет проблемы кровотечения.

Описание чертежей

Фиг. 1: Представлены результаты нескольких хроматографических прогонов для очистки CRP, истощение CRP в % представлено в зависимости от объема матрицы в полу-логарифмическом представлении. Раствор цитрата добавляли к плазме крови человека с концентрацией CRP 50 мг/л, 1: 5, 1:10, 1:20 или 1:50, и наносили на хроматографическую колонку, содержащую 0,5 г APPC-эпокси-соединенной UltraFlow-4 агарозы (Sterogen) в качестве матрицы. Образец без добавления цитрата служил в качестве контроля. Прогон колонки собирали при скорости потока, составляющей 5, 10, 25, 50 и 75 объемов матрицы в 1 мл фракций. Концентрацию CRP во фракциях затем определяли, и истощение CRP в % определяли на основе исходной концентрации CRP (перед применением). Точки данных представляют собой средние значения из, по меньшей мере, двух независимых экспериментов.

Фиг. 2: Гистограмма показывает истощенное количество CRP в плазме крови, очищенной с помощью аффинной хроматографии в присутствии и без добавления цитрата с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

На Фиг. 3: представлен гель SDS, применяемый к плазме крови, которую очищают в три различных дня с добавлением и без добавления цитрата с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, с помощью аффинной хроматографии. Стрелка показывает полосу C1q. Эта полоса содержит меньше белка в элюате из плазмы крови, которую смешивали с ACD-A.

Примеры

Термин «объем матрицы» (также сокращенно MV), используемый в настоящем документе, относится к объему материала колонки, используемого в соответствующей аффинной хроматографии.

Пример 1. Сравнительное исследование влияния добавления раствора цитрата на очистку CRP из плазмы крови с помощью аффинной хроматографии

В качестве исходного материала плазму крови человека с концентрацией CRP приблизительно 50 мг/л фильтровали с использованием фильтра 35 мкм и добавляли при необходимости раствор цитрата (смотри ниже).

Общая методика аффинной хроматографии

Для хроматографии использовали систему хроматографии низкого давления (LP Система BioLogic™, Bio-Rad, Мюнхен Германия, каталожный номер 731-8300) вместе с колонкой (Mobicol «Classic», Mobitec GmbH, Геттинген, Германия, номер продукта M1002) с фильтром 35мкм (Mobitec GmbH, номер продукта M523515), которая была оснащена 0,5 г APPC-конденсированной агарозы (эпокси-UltraFlow-4 агароза, Sterogene) в качестве материала колонки (1,6 мг APPC/мл), т.е. материал колонки с сефарозной матрицей, к которой присоединяли фосфохолиновое производное, n-аминофенилфосфохолин (APPC). Колонку уравновешивала 3 объемами матрицы (MV) промывочного буфера (0,1 М Трис, 0,2 М NaCl, 2 мМ CaCl2, рН 8), и поток отбрасывал.

Образец затем наносили на колонку. Поток колонки разделяли на фракции по 1 мл каждая с помощью коллектора фракций (коллектор фракций BioFrac™, Bio-Rad, номер по каталогу 741-0002), присоединенного внизу колонки. Собирали 1 мл фракций (также называемых фракции потока) при скорости потока 5 MV, 10 MV, 25 MV, 50 MV, 75 MV и 100 MV, тогда как остальные фракции объединяли, чтобы сформировать так называемый «поточный пул».

Затем колонку промывали 25 MV промывочного буфера после нанесения образца. За этим следовало элюирование CRP, связанного с колонкой, путем нанесения 7,5 MV элюирующего буфера 1 (0,1 М Трис 0,2 М NaCl, 2 мМ ЭДТА, рН 8).Здесь элюат фракционировали и собирали только тогда, когда УФ-поглощение составляло выше 0,01.

Затем использовали 5MV элюирующего буфера 2 (глициновый буфер рН 2,8) для регенерации колонки. Если элюирование с помощью элюирующего буфера было не полным, то белки и, в частности, CRP также могли присутствовать в этой фракции. Нейтрализующий буфер (3,5 М Трис, рН 9,0) добавляли к этому элюату, так что CRP не денатурирует при кислом рН 2,8 элюирующего буфера 2. Наконец, колонку промывали снова с помощью 20 MV промывочного буфера.

Содержание CRP отфильтрованного исходного материала из поточного пула и собранных фракций определяли с помощью конкурентного и специфичного для человека иммуноанализа (см., например, пример 2).

Начиная от средней концентрации CRP (также называемой средним значением [CRP]) в исходном материале, истощение процента CRP затем определяли для каждой фракции в соответствии со следующим уравнением.

CRP-истощение (в%)=100-((среднее [CRP] в фракции X)/( среднее [CRP] в исходном материале))Х100.

Таким образом, были сделаны выводы о сохранении CRP при прохождении через колонку с помощью концентрации CRP во фракции, т.е. поток из колонки, принимая во внимание также определенную аналогичным образом концентрацию CRP в исходном материале.

Общее количество CRP, оставшееся на колонке, можно вычислить путем вычитания общего количества CRP поточного пула и отдельных фракций из общего количества CRP в исходном материале.

Влияние цитрата

Для исследования влияния цитрата на очистку CRP из биологических жидкостей с помощью аффинной хроматографии, например, из плазмы крови, с помощью материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, плазму крови человека смешивали с раствором цитрата в различных соотношениях смешивания. Используемый раствор цитрата был следующим: 7,3 г лимонной кислоты (безводной) на литр (т.е. 38 мМ лимонной кислоты), 22 г дигидрата цитрата натрия на литр (то есть, 74,8 мМ дигидрата цитрата натрия), доводили до 1 л с помощью воды. Эксперименты, в которых раствор цитрата дополнительно содержал 24,5 г декстрозы (моногидрата) на литр (т.е. 123,6 мМ декстрозы моногидрата), давали идентичные результаты. Исследовали следующие пропорции смешивания:

Следующие пропорции смешивания были исследованы:

1:50 т.е. 1 Часть раствора цитрата+49 частей плазмы крови

1:20 т.е. 1 часть раствора цитрата+19 частей плазмы крови

1:10 т.e. 1 Часть раствора цитрата+9 частей плазмы крови

1:5 т.e. 1 Часть раствор цитрата+4 части плазмы крови

Человеческая плазма крови без добавления цитрата служила в качестве эталонного образца. Раствор цитрата добавляли к плазме крови человека до колонки с использованием градиентного смесителя.

Для эталонного образца (без добавления цитрата) и для каждой концентрации цитрата осуществляли два независимых прогона аффинной хроматографии.

Результаты

Можно увидеть на ФИГ. 1, что эффективное истощение CRP из крови имело место во время эталонного измерения (т.е. без цитрата). Процент истощения в начале нанесения образца на колонку составил более 90% (см. ФИГ. 5 GV), а затем незначительно снижался до уровня ниже 50% в дальнейшем ходе нанесения образца. Такое падение может быть объяснено тем фактом, что используемая колонка связывала все больше и больше CRP при непрерывном нанесении образца и, таким образом, становилась все более и более насыщенной.

Однако удивительно, что при соотношении смешивания 1:50-1:5 было обнаружено истощение CRP, соответствующее производительности истощения при стандартных условиях (смотри также Фиг. 1). Вопреки всем ожиданиям, эффективное удаление CRP из плазмы крови при использовании в соответствии с изобретением раствора цитрата для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей может быть осуществлено с помощью материала колонки, функционализированного с помощью ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп.

Пример 2. hu-CRP ИФА для определения концентрации CRP в образцах

Для того чтобы определить эффективность очистки CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей, например, плазмы крови, концентрацию человеческого CRP (hu-CRP) в соответствующих образцах определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА, твердофазный иммуноферментный анализ),

С этой целью лунки микропланшета сначала покрывали антителом, направленным против человеческого CRP, путем добавления 100 Мкл раствора кроличьих поликлональных антител против человеческого CRP (Дако, Hamburg, Германия, номер продукта Q0329), разведенных 1:500 в буфере для покрытия (0,1 М NaHCO₃), инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки промывали четыре раза с помощью, по меньшей мере, 250 мкл PBST (0,1% Tween 20 в PBS).

Для определения концентрации использовали буфер для образцов (5 мМ EDTA в PBST) в качестве нулевой калибровки и стандартные серии с концентрациями 300, 200, 100, 50, 30, 15 и 8,3 нг CRP/мл (в буфере для образцов). Для стандартных серий, коммерчески доступный стандарт CRP (человеческий сывороточный С-реактивный белок калибратор, 162 мг CRP/л, Dako, номер продукта X0923) соответствующим образом разбавляли буфером для образцов.

Кроме того, эталонный образец с высокой концентрацией CRP (человеческий сывороточный С-реактивный белок «Высокий контроль», Dako, номер продукта X0926), разбавленный 1:600 и 1:1500 с буфером для образцов, и эталонный образец с низкой концентрацией CRP (человеческий сывороточный С-реактивный белок «Низкий контроль», Dako, номер продукта X0925), разбавленный 1:250 и 1:1000 с буфером для образцов, использовали в качестве дополнительных контрольных образцов для ИФА. Фактические образцы для измерения (т.е. исходный материал, поточный пул, поточные фракции) наносили на микропланшет в трех разведениях (в буфере для образца).

Для каждой лунки микропланшета, 100 мкл каждого наносили, инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре и перемешивании на шейкере (600 оборотов в минуту), а затем промывали четыре раза с помощью, по меньшей мере, 250 мкл PBST.

Для детектирования последовательно добавляли антитело, меченное пероксидазой (POD) (кроличьи конъюгированные антитела к человеческому CRP, huCRP-POD, 20 мкг/мл исходного раствора, разведенного 1:1000), и конкурентное поликлональное антитело против человеческого CRP из кроликов (Dako, номер продукта Q0329, разведенное 1:2000) в блокирующем растворе (1% казеин, 0,9% NaCl, 0,001% тиомерсал). Снова наносили 100 мкл на лунку, инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре и перемешивали на шейкере (600 оборотов в минуту), а затем снова промывали четыре раза с помощью, по меньшей мере, 250 мкл PBST.

Затем добавляли субстрат для реакции детектирования. Раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, 25 мг/мл в ДМСО и EtOH) разбавляли в буфере для субстрата (0,01% Н₂О₂ в 0,2 М лимонной кислоте, рН 3,95), и 100 мкл его пипетировали в каждую лунку. После инкубации в течение 10-15 минут в темноте реакцию детектирования останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора на лунку. Затем проводили фотометрическое детектирование с помощью ридера для микропланшетов (BioRad 680 XR, BioRad, Мюнхен, Германия) путем определения оптической плотности при 450 нм (эталон 655 нм). Двойное определение каждого микропланшета проводили в каждом конкретном случае с целью устранения погрешности измерения, вызванной устройством. Кроме того, каждый эксперимент повторяли три раза для увеличения воспроизводимости результатов.

В предварительных экспериментах было исключено влияние используемых концентраций цитрата на достоверность hu-CRP-ИФА.

Здесь следует отметить, что, конечно, и другие методы определения CRP могут быть также использованы для определения концентрации CRP в исследуемых образцах.

Пример 3. Истощение CRP при использовании цитрата

Плазму крови с определенной концентрацией CRP (38,8 мг/л) делили по 12,5 мл каждая. Одну половину разбавляли добавлением цитрата (раствор-кислоты-цитрата-декстрозы А (ACD-A) -раствор 1:15), пропускали через колонку аффинной хроматографии (0,5 мл объема матрицы агарозы конденсированной с 4-аминофенилфосфохолином), а другую половину пропускали без ACD-A на идентичной колонке. Содержание CRP определяли до и после афереза. Исходя из этого было рассчитано примерное количество CRP. Было обнаружено, что после добавления цитрара, больше CRP связывалось с колонкой и удалялось. Результаты представлены на Фигуре 2.

Элюаты также наносили на SDS-гель, фотография которого показана на Фигуре 3. Было представлено, что при аферезе с цитратом (ACD-A) удалялось меньше белка комплемента (C1q), чем в аферезе без раствора цитрата.

Увеличение способности колонки благодаря цитрату объясняется авторами настоящего изобретения, не настаивая на правильности, следующим образом. Белок комплемента связывается с CRP, связанным с группой ω-фосфонооксиалкиламмония или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппой. Представляется, что в присутствии цитрата активируется меньше белка комплемента и связывается меньше комплексов C1q/C1r/C1s. Если комплексы С1-4/C1r/Cs связываются прямо или косвенно с материалом колонки, то имеет место меньше пространственных затруднений связи CRP из-за этих довольно крупных комплексов.

В целом, добавление раствора цитрата в биологическую жидкость, подлежащую очистке, приводит к увеличению способности материала колонки, функционализированного посредством групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп. Кроме того, комплемент активируется в меньшей степени. В сравнении с пептидными лигандами это увеличение способности не наблюдалось при использовании цитрата.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено применение раствора цитрата для удаления С-реактивного белка (CRP) с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей. CRP удаляют с помощью аффинной хроматографии с использованием материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфоноксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп. Изобретение обеспечивает селективное и Са²⁺-зависимое связывание CRP с материалом колонки и увеличивает связывающую способность заявляемых лигандов. Применение раствора цитрата подходит для экстракорпорального удаления CRP из крови или плазмы крови для реанимации после остановки сердца, а также для профилактики и/или лечения сердечно-сосудистых заболеваний. 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 пр.

1. Применение раствора цитрата для удаления C-реактивного белка (CRP) с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей с использованием материала колонки, функционализированного с помощью групп ω-фосфонооксиалкиламмония и/или с помощью ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигрупп, где раствор цитрата служит в качестве связывающего буфера для удаления CRP с помощью аффинной хроматографии из биологических жидкостей.

2. Применение раствора цитрата по п.1, отличающееся тем, что группы ω-фосфонооксиалкиламмония имеют следующую общую формулу (I):

(I)

где

n выбирают из 2 и 3;

R1 и R2 независимо выбирают из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из

где один или более атомов водорода могут быть заменены на атом(ы) фтора.

3. Применение раствора цитрата по п.1 или 2, отличающееся тем, что ω-аммонийалкоксигидроксифосфорилоксигруппы имеют следующую общую формулу (II):

(II)

где

n выбирают из 2 и 3;

R1, R2 и R3 независимо выбраны из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, или R1 и R2 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероцикл, выбранный из

и

R3 выбран из: -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, и предпочтительно -H;

где один или более атомов водорода могут быть заменены на атом(ы) фтора.

4. Применение раствора цитрата по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что раствор цитрата содержит по меньшей мере одно из соединений цитрата из группы, содержащей или состоящей из лимонной кислоты, дигидроцитрата натрия, гидроцитрата натрия, цитрата натрия, дигидрата цитрата натрия, дигидроцитрата калия, гидроцитрата калия, цитрата калия, дигидроцитрата лития, гидроцитрата лития, цитрата лития, дигидроцитрата аммония, гидроцитрата аммония, цитрата аммония, цитрата кальция, цитрата магния и/или неполных сложных эфиров лимонной кислоты.

5. Применение раствора цитрата по п.4, отличающееся тем, что по меньшей мере одно соединение цитрата выбирают из лимонной кислоты и солей цитрата с катионами одновалентных металлов.

6. Применение раствора цитрата по п.4 или 5, отличающееся тем, что раствор цитрата не содержит дополнительных Са²⁺-хелаторов помимо соединения(ий) цитрата.

7. Применение раствора цитрата по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что раствор цитрата состоит из лимонной кислоты, цитрата натрия, D-глюкозы и воды.

8. Применение раствора цитрата по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что раствор цитрата имеет суммарную концентрацию цитрата в диапазоне от 50 мМ до 200 мМ.

9. Применение раствора цитрата по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что раствор цитрата имеет значение рН в диапазоне от рН 4 до рН 7.

10. Применение раствора цитрата по любому из пп.1-9 в разведении в диапазоне от 1:50 до 1:5 с использованием биологической жидкости.

11. Применение раствора цитрата по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что биологические жидкости представляют собой кровь или плазму крови.