АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ХИМЕРНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ TNFR:FC Российский патент 2018 года по МПК A61K38/17 A61K47/02 A61K47/12 A61K47/26 C07K16/24 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к стабильным водным фармацевтическим композициям, не содержащим некоторые отдельные аминокислоты, подходящим для хранения полипептидов, которые содержат TNFR:Fc.

Предшествующий уровень техники

Терапевтические составы полипептидов часто хранят некоторое время перед применением. Однако полипептиды неустойчивы при хранении в водной форме в течение длительного периода времени, особенно в отсутствие стабилизирующего агента, такого как аргинин. Альтернативой хранению в водной форме является приготовление сухой лиофилизированной формы полипептида, хотя восстановление сухого полипептида часто приводит к агрегации или денатурации. Эта агрегация полипептидов нежелательна, поскольку может привести к иммуногенности.

Коммерчески доступная растворимая форма рецептора TNF (фактор некроза опухоли), слитого с доменом Fc (TNFR: Fc), известна как этанерцепт. Этанерцепт (торговое название ENBREL ®) интерферирует с фактором некроза опухоли (TNF), выступая в качестве ингибитора TNF. Это димерный химерный полипептид, состоящий из внеклеточной лиганд-связывающей части человеческого 75 кДа (р75) рецептора фактора некроза опухоли (TNFR), связанного с Fc-частью IgG1 человека в настоящее время объединен в состав вместе с L-аргинином и/или L-цистеином, которые выполняют роль ингибиторов агрегации для предотвращения агрегации полипептида (см. ЕР1478394 В1).

При этом аргинин может вызвать серьезные побочные эффекты у некоторых людей. Тяжелая аллергическая реакция, так называемая анафилаксия, может иметь место после инъекции аргинина, а также дискомфорт в желудке, в том числе тошноту, спазмы желудка или повышенное количество дефекаций. Другие возможные побочные эффекты включают низкое кровяное давление и изменения в различных химических веществах, электролитах и в крови, такие как высокий уровень калия, высокий уровень хлорида, низкий уровень натрия, низкий уровень фосфата, высокий уровень азота мочевины крови и высокий уровень креатинина. Теоретически аргинин может увеличить риск кровотечения, повышение уровня сахара в крови, увеличения уровня калия и может ухудшить симптомы серповидно-клеточной анемии.

Цистеин не является незаменимой аминокислотой, и тесно связан с цистином, а цистин состоит из двух соединенных вместе молекул цистеина. Цистеин является нестабильным питательным веществом и легко преобразуется в цистин. Слишком большое количество цистина в организме может привести к цистинозу, редкому заболеванию, которое может вызвать образование кристаллов цистина в организме и привести к образованию камней в мочевом пузыре и почках. Известно также, что люди, страдающие от диабета и цистинурии, могут иметь побочные эффекты от добавок с цистеином.

В WO 2013/006454 предлагаются не содержащие аргинин полипептидные композиции, в которых аргинин, который используется в похожих композициях, например, таких как описанные в ЕР 1478394 В1, был заменен на соли, которые, согласно указанному примеру, представлены в концентрации 140 мМ (см. пример 1). Отсутствуют упоминания о стабилизации при высоких температурах. Действительно, композиции, раскрытые в них, хранятся в виде жидкости при температуре 2-8°С или замороженными.

Настоящее изобретение решает эти проблемы, предоставляя новый стабильный жидкий состав, который позволяет хранить полипептиды TNFR:Fc. Авторы неожиданно обнаружили, что устойчивые водные композиции, описанные в данном документе, могут быть получены совеем без аргинина и цистеина и обладают высокой стабильностью при высоких температурах.

Сущность изобретения

Первый аспект настоящего изобретения

Первый аспект настоящего изобретения основан на обнаружении того, что некоторое количество соли в водной композиции, включающем выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитого с Fc-доменом человеческого IgG1, может привести к увеличению стабильности белка при высоких температурах, выше 5°С. Более того, выбор концентрации соли таков, что она близка к физиологической концентрации соли в организме.

Таким образом, настоящее изобретение относится к водной композиции, содержащей:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитой с Fc-доменом человеческого IgG1;

соль в концентрации от 80 до 130 мМ; и

наполнитель, выбранный из группы трегалозы и сахарозы и их комбинаций,

и отличающийся тем, что ни аргинин, ни цистеин не присутствуют в композиции. Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана диаграмма, демонстрирующая относительные температуры разворачивания (Т_начал/°С), выявленные для всех образцов с планками погрешностей, определенные с помощью соотношения флуоресценции между 330 и 310 нм.

На фигурах 2А и 2В представлена гистограмма со значениями pH и осмотического давления в начальный момент времени для всех составов.

На фигуре 3А представлены значения концентрации белка (поглощение при 280 нм) для всех временных точек (от 0 до 14 дней) и условий (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 3 циклов замораживания-оттаивания при (-20°С/25°С) и 3 дней перемешивания).

На фигуре 3В представлены значения концентрации белка (поглощение при 280 нм) вплоть до 6 месяцев (0, 1, 3 и 6) при t=0 и t=3 месяца и условиях (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 1, 2 и 4 циклов замораживания-оттаивания при (-20°С/25°С)) для состава F3.

На Фигуре 4А представлены значения мутности (поглощение при 330 нм) во все моменты (от 0 до 14 дней) и в условиях (-20°С, 2-8°С, 25°С, 3 циклов замораживания/оттаивания (-20°С/25°С) и 3-х дневного перемешивания).

На Фигуре 4В(1) представлены значения мутности (поглощение при 330 нм) во все моменты времени вплоть до 6 месяцев и в условиях (-20°С, 2-8°С, 25°С, 1, 2 и 4 цикла замораживания/оттаивания (-20°С/25°С)) для состава F3.

На Фигуре 4В(2) представлены значения мутности (поглощение при 1 нм) на момент времени вплоть до 3 месяцев (0, 1 и 3) и в условиях (-20°С, 2-8°С, 25°С, и, 2 и 4 цикла замораживания/оттаивания (-20°С/25°С)) для составов F1, F5, F6 и F8 по сравнению с Innovator (t=0 и 3 месяца и при температуре 25°С).

На фигуре 5А представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC для F1, F2, F3 и F4 (1, 2, 3 и 4), проведенный для всех состояний: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратного замораживания/оттаивания (-20°С/25°С) и 3-х дневного перемешивания с использованием Standards-Duke Scientific Count Cal.

На фигуре 5В представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, для состава F3 измеренный при t=0, 1 и 3 месяца, при температуре -20°С, 2-8°С, 25°С, с 1 и 2 замораживаниями/оттаиваниями (Ix и 2х замор/оттаив при -20°С/25°С) с помощью Standards-Duke Scientific Count Cal.

На фигуре 5С(1) представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, проведенный для составов F1, F3, F5, F6, F8 и, при t=0, 1 и 3 месяца, а также F3 при t=6 месяцев, при температуре -20°С и 2-8°С, с помощью Standards-Duke Scientific Count Cal.

На фигуре 5С(2) представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC проведенный для составов F1, F3, F5, F6, и F8, при t=0, 1 и 3 месяца, a F3 также при t=6 месяцев при 25°С, и замораживании/оттаивании (1х, 2х, 4х (1, 2, 4)) при -20°С/25°С для F1, F3, F5, F6 и F8.

На фигуре 6А представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, инкубированные при всех условиях: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (-20°С/25°С) и 3 дневное перемешивание в моменты времени 0 и 14 дней. В (А) образец F1, в (В) образец F2, в (С) образец F3 и в (D) образец F4.

На фигуре 6В представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, для состава F3 при t=3 месяца, инкубированного при всех условиях: -20°С, 2-8°С, 25°С, 2 кратном замораживании/оттаивании при -20°С/25°С.

На фигуре 6В представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, для состава F3 при t=6 месяца, инкубированным при всех условиях: -20°С, 2-8°С, 25°С, 4 кратном замораживании/оттаивании при -20°С/25°С.

На фигуре 6С представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F5, F6 и F7 и Innovator (контроль) при t=0 после 1 кратного замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

На фигуре 6D представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F8, F9 и F1 и Innovator (контроль) при t=0 после 1 кратного замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

На фигуре 6Е(1) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F1 и F5 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

На фигуре 6Е(2) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F1 и F5 при t=3 месяца при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 4 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

На фигуре 6F(1) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F6 и F8 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

На фигуре 6F(2) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F6 и F8 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 4 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Фигуры 7A-7D демонстрируют хроматограммы эксклюзионной ВЭЖХ всех составов при всех условиях: -20°С (7А), 25°С (7В), 50°С (7С), 3 кратном замораживании/оттаивании и 3 днях перемешивания (7D) во всех временных точках. Проценты пиков были измерены и представлены в таблицах.

На фигуре 7Е(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=3 месяцев при -20°С, 2-8°С, 25°С и 2 кратном замораживании/оттаивании (2xFxTh) при -20°С/25°С.

На фигуре 7Е(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=6 месяцев при -20°С, 2-8°С, 25°С и 4 кратном замораживании/оттаивании (2xFxTh) при -20°С/25°С.

На фигуре 7F представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=0, 1, 3 и 6 месяцев при 25°С и для Innovator при t=3 месяца и 25°С.

На фигуре 7G(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=0 и 3 месяца при 25°С и в сравнении с Innovator (контроль) при t=0.

На фигуре 7G(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ состава Innovator при t=0 и 3 месяца при 25°С.

На фигуре 7Н представлены табличные результаты для длительного исследования с эксклюзионной ВЭЖХ в составе F3 для t=0, 1 и 3 месяца при -20°С, 2-8°С, 25°С и 1 и 2 кратном замораживании/оттаивании (1х и 2xFxTh) при -20°С/25°С.

На фигуре 71 представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F7, F8, F9 и Innovator (контроль) при t=0.

На фигуре 7J представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F7, F8, F9 и Innovator после 1 цикла замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

На фигуре 7K(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8, для t=1 месяц при -20°С.

На фигуре 7К(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6 и F8, для t=3 месяца при температуре -20°С.

На фигуре 7L(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F8, для t=1 месяц при 2-8°С.

На фигуре 7L(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6 и F8, для t=3 месяца при температуре 2-8°С.

На фигуре 7М(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F8, для t=1 месяц при 25°С.

На фигуре 7М(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8 и Innovator для t=3 месяца при 25°С.

На фигуре 7N(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5 и F8, для t=1 месяц при температуре 25°С.

На фигуре 7N(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F8 и Innovator для t=3 месяца при 25°С.

На фигуре 70 представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5 и F8, для t=1 месяц при температуре 25°С.

На фигуре 7Р представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6 и F8 после-2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Фигуры 7Q, 7R и 7S демонстрируют графическую сводку хроматограмм эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6 и F8 для условий: -20°С (Фигура 7Q), 2-8°С (7R) и 25°С (7S) во временных точках вплоть до 6 месяцев для состава F3 и вплоть до 3 месяцев для составов F1, F5, F6 и F8. Пиковые проценты были измерены и представлены (% пре-пика, % основного пика и % пост-пика).

На фигуре 7Т представлена графическая сводка хроматограмм эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6 и F8 при t=0 и после 1 и 2 циклов замораживания/оттаивания (1х и 2х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С. Пиковые проценты были измерены и представлены (% пре-пика, % основного пика и % пост-пика). Планки указаны в следующем порядке составов: F1, F3, F5, F6 и F8 для каждого условия (т.е. t=0, 1х замор/ оттаив или 2х замор/оттаив).

На фигуре 7U представлена графическая сводка хроматограмм эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=0, 1, 3 и 6 месяцев в условиях хранения при -20°С, 2-8°С и 25°С.

На фигуре 8A-8D показан график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% от относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) для всех составов при всех условиях: 20°С (8А), 25°С (8В), 50°С (8С), 3 кратном замораживании/оттаивании (-20°С/25°С) и 3 дневном перемешивании (8D) во всех временных точках.

На фигуре 8Е показан график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% от относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) состава F3 для следующих условий: -20°С, 2-8°С, 25°С в период времени 0, 1, 3 и 6 месяцев, и после 1х, 2х и 4х замораживания/оттаивания при -20°С/25°С. Таблица данных также представлена после фигуры.

На фигуре 8F показан график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% от относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) в составах F1, F3, F5, F6 и F8 после 3 месяцев (и F3 и через 6 месяцев) при -20°С, 2-8°С, 25°С и после 4х замораживания/оттаивания при -20°С/25°С, по сравнению с Innovator через 3 месяца при 25°С. Таблица данных также представлена после фигуры.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к водной композиции, содержащей: выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей

частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитой с Fc-доменом

человеческого IgG1;

соль в концентрации от 80 до 130 мМ; и

наполнитель, выбранный из группы, состоящей из трегалозы и сахарозы и их комбинаций,

отличающийся тем, что ни аргинин, ни цистеин не присутствуют в композиции.

Предпочтительно, если композиция дополнительно характеризуется тем, что в ней отсутствуют свободные аминокислоты. Например, композиция не содержат ни аргинин, ни цистеин, ни пролин, ни глицин, ни метионин, ни гистидин, ни серии, ни валин ни лизин, ни глутамат.

При использовании в данном документе, термин «композиция» или «композиции» может относиться к составу(ам), включающим полипептид, полученный таким образом, что он подходит для инъекции и/или введения индивидууму, нуждающемуся в этом. «Композиция» также может относиться к «фармацевтической композиции». В некоторых воплощениях композиции, представленные в данном документе, являются, по существу стерильными и не содержат каких-либо агентов, которые являются чрезмерно токсичными или инфекционными по отношению к реципиенту. Кроме того, при использовании в данном документе, раствор или водная композиция может означать жидкий состав (жидкость), который содержит один или несколько химических веществ, растворенных в подходящем растворителе (например, воде и/или другом растворителе, например, органическом растворителе) или смеси взаимно смешивающихся растворителей. Кроме того, при использовании в данном документе, термин «около» означает указанную величину ±2% от ее значения, предпочтительно термин «около» означает именно указанное значение (±0%).

Отметим, что хотя композиция по настоящему изобретению не содержит аргинин или цистеин (и, предпочтительно, любую другую аминокислоту, такую как пролин, глицин, метионин, гистидин, серии, валин, лизин, глутамат) отдельно или добавленными в композиции, сам полипептид может содержать аминокислотные остатки аргинина или цистеина (или любой другой аминокислоты, такой как глицин, пролин, метионин, гистидин, серии, валин, лизин, глутамат) в своей цепи.

В некоторых воплощениях, экспрессированный полипептид, содержащий Fc-домен, очищают любым стандартным способом. Когда полипептид, содержащий Fc-домен продуцируется внутриклеточно, содержащий частицы дебрис удаляется, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если данный полипептид секретируется в среду, то надосадочную жидкость из таких экспрессирующих систем вначале можно сконцентрировать с помощью стандартных фильтров для концентрирования полипептидов. Также могут быть добавлены протеазные ингибиторы для ингибирования протеолиза, и могут быть включены антибиотики для предотвращения роста микроорганизмов. В некоторых воплощениях полипептид, содержащий Fc-домен очищают с использованием, например, гидроксиапатитовой хроматографии, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, и/или любой комбинации способов очистки, известных или тех, которые еще будут придуманы. Например, может быть использован протеин А для очистки полипептидов, содержащих Fc-домен, которые основаны на человеческих гамма 1, гамма 2, или гамма-4 тяжелых цепях (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13).

Другие способы очистки полипептида, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарине SEPHAROSET™, хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, ДСН-ПААГ, и осаждение сульфатом аммония также могут быть использованы в зависимости от потребностей. Могут быть использованы другие способы очистки полипептидов.

В предпочтительном воплощении концентрация соли составляет от 80 до 130 мМ, предпочтительно от 90 до 130 мМ, например, от 105 до 130 мМ, например, около 90 мМ, 100 мМ или 125 мМ. Независимо от концентрации солью предпочтительно является хлорид натрия, хотя другие соли, такие как хлорид калия, цитрат натрия, сульфат магния, хлорид кальция, гипохлорит натрия, нитрата натрия, сульфида ртути, хромат натрия и диоксида магния, также могут быть использованы. Этот конкретный диапазон концентраций солей позволяет получить композицию в соответствии с настоящим изобретением, которая является стабильной при высоких температурах, вплоть до 50°С. Кроме того, значения в данном диапазоне ближе к физиологической осмоляльности в организме человека, чем значения, используемые в предшествующем уровне техники (например 140 мМ), что приводит к более подходящим композициям, которые могут использоваться, например, в подкожном введении.

В другом предпочтительном воплощении выделенный полипептид представляет собой этанерцепт. Fc-компонент этанерцепта содержит константный тяжелый 2 (СН2) домен, константный тяжелый 3 (СН3) домен и шарнирную область, но не содержит константный тяжелый 1 (CH1) домен человеческого IgG1. Этанерцепт может быть получен технологией рекомбинантных ДНК в экспрессирующей системе на основе клеток яичника китайского хомячка (СНО). Он состоит из 934 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу около 150 килодальтон (Physicians' Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

Концентрация выделенного полипептида, предпочтительно составляет от 10 до 100 мг/мл, более предпочтительно между 20 и 60 мг/мл, а еще более предпочтительно концентрация составляет около 25 мг/мл или около 50 мг/мл. Предпочтительно концентрация составляет около 50 мг/мл.

В другом предпочтительном воплощении наполнителем является трегалоза, которая присутствует в концентрации от 10 до 80 мг/мл, предпочтительно от 30 до 65 мг/мл и более предпочтительно в концентрации 60 мг/мл, трегалозы и в виде дигидрата трегалозы. В другом предпочтительном воплощении наполнитель является сахарозой в концентрации от 5 до 80 мг/мл, предпочтительно сахарозой, присутствующей в диапазоне от 10 до 40 мг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация сахарозы составляет 10 мг/мл. В другом предпочтительном воплощении концентрация сахарозы составляет 34 мг/мл. В другом предпочтительном воплощении, наполнитель представляет собой комбинацию сахарозы и трегалозы, где концентрации находятся в диапазоне от 5 до 80 мг/мл и 10 до 80 мг/мл, соответственно. Предпочтительно, если наполнитель представляет собой сахарозу в концентрации около 34 мг/мл. Более предпочтительно, наполнитель представляет собой сахарозу в концентрации около 10 мг/мл.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать водный буфер. Предпочтительно, указанный водный буфер представляет собой фосфата натрия, фосфат калия, цитрат натрия или калия, малеиновую кислоту, ацетат аммония, трис (гидроксиметил) - аминометан (TRIS), ацетат, сукцинат, диэтаноламин, гистидин или их комбинацию. В более предпочтительном воплощении указанный водный буфер представляет собой фосфат натрия. В другом предпочтительном воплощении указанный водный буфер представляет собой сукцинат. В другом предпочтительном воплощении указанный водный буфер представляет собой гистидин. Независимо от буфера, используемого в композиции, отдельно или в комбинации, его концентрация составляет предпочтительно от 15 мм до 100 мМ, предпочтительно, в диапазоне от 20 мМ до 30 мМ. В предпочтительном воплощении указанная концентрация предпочтительно составляет от 20 мМ до 100 мМ, предпочтительно в диапазоне от 25 мМ до 50 мМ. В более предпочтительном воплощении указанная концентрация составляет от около 22 мМ или около 25 мМ. В другом предпочтительном воплощении указанная концентрация составляет около 50 мМ. Предпочтительными буферами являются натрий-фосфатный и сукцинатный буферы, при этом наиболее предочтительным является последний (сукцинатный буфер) в концентрации около 22 мМ.

В другом воплощении, независимо от отсутствия или наличия водного буфера, композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать один или несколько наполнителей, в дополнение к уже представленным в композиции (трегалозе и/или сахарозе). В некоторых воплощениях концентрация одного или нескольких наполнителей в композиции, описанной в настоящем документе, составляет от около 0,001 до 5 массовых процентов, в то время как в других воплощениях, концентрация одного или нескольких наполнителей составляет от около 0,1 до 2 массовых процентов. Наполнители (эксципиенты) хорошо известны в данной области и производятся с помощью известных методов, а также доступны от коммерческих поставщиков. Предпочтительно, указанный наполнитель представляет собой лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозит, глюкоза, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека (SA), рекомбинантный гемагглютинин (НА), декстран, поливиниловый спирт (PVA), гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлоз\у (НЕС), полиэтиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), пролин, L-серин, глутаминовую кислоту, аланин, глицин, лизин, саркозин, гамма аминомасляную кислоту, полисорбат 20, полисорбат 80, додецилсульфат натрия (SDS), полисорбат, полиоксиэтилен сополимер, фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин N-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы меди, ионы кальция, ионы марганца, ионы магния, 3-[(3-холамидепропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфат(CHAPS), монолаурат сахарозы или их комбинацию. В более предпочтительном воплощении наполнитель представляет собой полисорбат 20, а в еще более предпочтительном воплощении полисорбат 20 присутствует в концентрации 0,1%. В другом более предпочтительном воплощении наполнитель представляет собой глицин и в еще более предпочтительном воплощении глицин присутствует в концентрации 0,5%.

В другом предпочтительном воплощении, pH композиции составляет от pH 6,0 до pH 7,0, причем pH-либо выбран из 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 и 6,9. В более предпочтительном воплощении, pH композиции составляет около 6,3.

В конкретном воплощении композиция в соответствии с настоящим изобретением включает 50 мг/мл в этанерцепта, 25 мМ натрий-фосфатного буфера, 10 мг/мл сахарозы, 125 мМ хлорида натрия, и отличается тем, что pH композиции составляет 6,3.

В другом конкретном воплощении композиция по настоящему изобретению содержит 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ натрий-фосфатного буфера, 10 мг/мл сахарозы, 100 мМ хлорида натрия, и отличается тем, что pH композиции составляет 6,3.

В другом конкретном воплощении композиция по настоящему изобретению включает 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, 0,1% полисорбат 20, и отличается тем, что pH композиции составляет около pH 6,2.

В другом конкретном воплощении композиция по настоящему изобретению включает 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 34 мг/мл сахарозы, 90 мМ хлорида натрия, и отличается тем, что pH композиции составляет 6,3.

В другом конкретном воплощении композиция по настоящему изобретению содержит 50 мг/мл этанерцепт, 25 мМ фосфата натрия, 10 мг/мл сахарозы, 90 мМ хлорида натрия, 0,5% глицин, и отличается тем, что pH композиции составляет 6,3.

В другом конкретном воплощении композиция по настоящему изобретению содержит 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ сукцината, 10 мг/мл сахарозы, 90 мМ хлорида натрия, и отличается тем, что pH композиции составляет 6,3. Предпочтительно, если эта композиция не содержит дополнительных аминокислот (кроме тех, которые содержатся в ' этанерцепте). Предпочтительно, если эта композиция не включает аргинин, цистеин, лизин, пролин, глутамат, серии или метионин.

Композиции, раскрытые в данном документе, могут быть введены парентерально, например, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрецереброспинально, внутрисуставно, интрасиновиально и/или интратекально.

Терапевтические эффекты выделенного полипептида, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, известны в данной области и включают, без ограничения перечисленным, лечение ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, гранулематоза, болезни Крона, хроническая обструктивная болезнь легких Крона В, гепатит С, эндометриоз, астмы, кахексии, псориаза или атопического дерматита, или другого воспалительного или аутоиммунного заболевания, связанного с расстройством или состоянием. Композиции могут быть введены в количестве, достаточном для лечения (облегчения симптомов, остановки или замедления прогрессирования) расстройства (например, терапевтически эффективном количестве).

Следующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Примеры

Получение композиций

Следующие композиции получали простым смешиванием:

Исходный материал:

Материал тестового прогона, содержащий 62,5 мг/мл этанерцепта, 1,2 мг/мл Триса, 40 мг/мл Маннита 10 мг/мл Сахарозы, pH 7,4. Хранили при -20°С.

Лот коммерческого состава ENBREL® использовали в качестве контрольного образца (обозначенного в данном документе как «Enbrel» или «Innovator»). Коммерческий состав Enbrel содержит 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 25 мМ аргинина, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл Сахарозы, рН-6,3).

Этанерцепт в том же составе в виде композиции Enbrel® использовали в качестве внутреннего контроля (50,9 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 25 мМ аргинина, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,3). Данный состав назвали F1.

Кандидатные составы:

F2: Этанерцепт в водной композиции (49,4 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,3)

F2: Этанерцепт в водной композиции (49,5 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфат натрия, 125 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,3)

F4: Этанерцепт в водной композиции (50,9 мг/мл этанерцепта, 50 мМ фосфата натрия, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, pH 6,2, 0,1% полисорбата 20)

F5: Этанерцепт в водной композиции (50,0 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 90 мМ NaCl, 34 мг/мл Сахароза, pH 6,3)'

F6: Этанерцепт в водной композиции (50,0 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, 0,5% (5 мг/мл) глицина, pH 6,3)

F7: Этанерцепт в водной композиции (50,0 мг/мл этанерцепта, 28 мМ гистидина/HCl, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл Сахарозы, 6 мг/мл глицина, pH 6,3)

F8: Этанерцепт в водной композиции (50,0 мг/мл этанерцепта, 22 мМ гистидина/HCl, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл Сахарозы, pH 6,3) Сукцинатный буфер готовили с помощью 22 мМ янтарной кислоты, NaOH добавляли для доведения pH до 6,3.

Пример 1

Характерные спектры эмиссии флуоресценции белка и статического светорассеяния

Были получены характерные спектры эмиссии флуоресценции белка, возбужденной при 266 нм, а также данные статического светорассеяния как при 266 нм, так и при 473 нм.

Каждый образец был загружен в массив микрокювет (МСА) и помещен в Optim 1000 для выяснения различий в коллоидной и конформационной стабильностях. В этом исследовании температура для экспериментов с линейно изменяющимся нагревом возрастала с 15 до 95°С с шагом 1°С, а образцы выдерживали при каждой температуре в течение 60 секунд для установления теплового равновесия. В изотермическом эксперименте, температуру поддерживали при 62°С, а измерения образцов проводили с 200 повторами с 60 секундным удержанием между измерениями.

Время, в течение которого образец облучается лазерными источниками при 266 и 473 нм, упоминается как время экспозиции. Выбор времени экспозиции зависит от нескольких факторов, например, насколько сильна флуоресценция и как восприимчив образец к фотообесцвечиванию. В случае всех этих образцов использованное время экспозиции составляет 1 секунду.

Наряду с изменением времени экспозиции можно изменить размер физического щели, которая контролирует количество света, попадающее в детектор. Увеличение размера этого отверстия увеличивает измеряемый сигнал флуоресценции, но снижает спектральное разрешение прибора.

Анализы, проведенные с помощью Optim 1000 включают два последовательных уровня, первичный и вторичный. Программное обеспечение Optim 1000 обеспечивает автоматизированный первичный и вторичный анализ. Как и с любым программным обеспечением для согласования данных, для обеспечения того, что входящие данные имеют хорошее качество необходима разумная тщательность, так чтобы автоматические функции возвращали надежные результаты. Все результаты были проверены вручную обученным аналитиком.

Первичный анализ извлекает спектральные параметры из исходных данных флуоресценции и светорассеяния:

- Optim может использовать математические функции для обеспечения первичной информации, такой как ожидаемая длина волны (также известной как барицентрическое среднее), которая становится все более широко используемой в научной литературе. Представляет собой среднее длины волны излучения (или центр массы), и является хорошим подходом, для сглаживания любого шума в спектральных данных.

- Интенсивность светорассеяния рассчитывали по интегральной интенсивности между 260 и 270 нм (релеевское рассеяние УФ-света возбуждения). Эффективность рассеяния сильно зависит от длины волны, так что чем короче длина волны, тем эффективнее свет рассеивается молекулами в растворе. Рассеяние 266 нм лазера является очень чувствительным зондом для небольших изменений в средней молекулярной массе.

В этом исследовании соотношение интенсивности флуоресценции между 350 и 330 нм было использовано для изучения термического разворачивания антител, а интенсивности светорассеяния от 266 нм и 473 нм лазеров использовали для измерения термически индуцированной агрегации образцов.

Вторичный анализ принимает параметры из первичных анализов и определяет температуру плавления «Tm» и температуру начала агрегации «Тагг» образца, если они существуют. Температура плавления определяется как точка перегиба в первичных данных в виде функции от температуры.

Наступление температуры агрегации определяется как температура, при которой интенсивность светорассеяния возрастает выше порогового значения по отношению к шуму в данных. Из самой низкой измеренной температуры каждое значение светорассеяния добавляется к набору данных всех ранее измеренных значений. В каждой точке, по ходу анализа применяется линейная аппроксимация и определяется добротность подгонки. Если данные значительно отклоняются от прямой линии (где значимость определяется шумом в данных), то это изменение определяется как температура начала агрегации. Если нет, то алгоритм переходит к следующей точке в наборе данных и еще раз тестирует эти отклонения. Этот способ был испытан на различных белках и условиях и является надежным. В экстремальных ситуациях, когда образуются и осаждаются крупные агрегаты, сигнал светорассеяния действительно может упасть, если частицы в суспензии покидают фокусный объем падающего лазера. Тем не менее, начальное возникновение детектируется воспроизводимо, несмотря на любые осадки, которые имеют место быть позже.

В случае всех данных статического светорассеяния, все точки были включены независимо от того, осаждался ли образец в растворе. Тот же образец в различных повторных экспериментах иногда будет выпадать в осадок, а иногда нет, но в каждом случае начало процесса агрегации воспроизводимо.

Выводы

Данные как Т_агг, так и Т_начал между всеми образцами были очень похожими.

- В буфере F1 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,7±0,3°С и Т_агг - 66,8±0,3°С.

- В буфере F2 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,2±0,1°С и Т_агг - 65,9±0,1°С,

- В буфере F3 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,4±0,3°С и Т_агг - 65,6±0,4°С.

- В буфере F4 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,3±0,1°С и Т_агг из 64,8±0,1°С.

- В буфере F5 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 64,5±0,4°С и Т_агг - 63,0±0,6°С.

- В буфере F6 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,9±0,5°С и Т_агг - 65,4±0,2°С.

- В буфере F7 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 61,0±0,7°С и Т_агг из 63,6±0,1°С.

- В буфере F8 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 64,0±0,0°С и Т_агг из 66,2±0,8°С.

- Было обнаружено, что Enbrel innovator имел Т_начал флуоресценции 63,4±0,1°С и Т_агг - 65,6±0,1°С.

Данные, следовательно, указывают на высокую степень сходства как коллоидальной, так и конформационной стабильности между всеми образцами.

На Фигуре 1 показаны результаты для составов F1, F5, F6, F7, F8 и Innovator (контроль), где тенденцией является F5>F8>F6>Fl>Энбрел>F7.

После эксперимента с линейным нагревом проводили изотермический эксперимент. После анализа и обзора результатов линейного нагрева, оказалось, что все образцы имели значение Т_агг равное ~ 64°С, и по этой причине для изотермического эксперимента была выбрана температура 62°С, т.е. чуть ниже Т_агг, но достаточно близко к той, при которой образцы подвергаются конформационным и коллоидальным изменениям в пределах разумного периода времени.

Значения Т_начал, обнаруженные для флуоресценции составяли от 63,2 до 63,7°С со средним 63,4°С и относительно низким стандартным отклонением 0.3°С, указывающим на высокую степень сопоставимости между пятью образцами (F1-F4 и жидким составом Enbrel).

Стабильность всех образцов может рассматриваться как фактически сравнимая.

Пример 2

Исследование стабильности при краткосрочном стрессе

Подход

Краткосрочное (2 недельное) исследование стабильности проводили для оценки возможных составов до проведения долгосрочного исследования. Кроме того, изучение долгосрочной стабильности вплоть до 6 месяцев была осуществлена для состава F3 и вплоть до 3 месяцев для составов F5, F6 и F8.

Были протестированы девять составов:

Оценивали стабильность каждой композиции при t=0, 3, 7 и 14 дней, после воздействия двух повышенных температур (25°С и 50°С) и одной температуре в режиме реального времени, в дополнение к стрессу перемешиванием и замораживанием-оттаиванием.

В случае состава F3, стабильность оценивали после воздействия трех температур (2-8°С, -20°С и 25°С) во временных точках 0, 1, 3 и 6 месяцев в дополнение к к стрессу замораживанию-оттаиванию с 1, 2 и 4 циклами замораживания-оттаивания при замораживании при -20°С/ и оттаивании при 25°С.

В случае составов F5, F6 и F8, стабильность оценивали после воздействия трех температур (2-8°С, -20°С и 25°С) во временных точках 0, 1 и 3 месяцев в дополнение к стрессу замораживанию-оттаиванию с 1, 2 и 4 циклами замораживания-оттаивания при замораживании при -20°С/ и оттаивании при 25°С.

Панель 8 аналитических тестов использовали для оценки стабильности каждого состава.

pH (t=0 исключительно)

Осмоляльность (t=0 исключительно)

Концентрация белка (А280 нм)

Мутность (A330 нм)

HIAC

восстанавливающий ДСН-ПААГ (окрашивание Кумасси синим)

эксклюзионная ВЭЖХ (SE-HPLC)

Основанный на клетках анализ эффективности

pH и осмолярность

На фигурах 2А и 2В представлена гистограмма со значениями pH и осмотического давления в начальный момент времени. Эти измеренные значения для всех составов находились в пределах диапазона целевого pH или теоретической осмоляльности до помещения образцов в каждое из условий.

Концентрация белка/А280

На фигуре 3А представлены значения концентрации белка (поглощение при 280 нм) для всех временных точек (от 0 до 14 дней) и условий (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 3 циклов замораживания-оттаивания при (-20°С/25°С) и 3 днях перемешивания). Полученные данные остались в пределах диапазона целевого значения и с вариабельностью анализа для всех образцов во всех временных точках и при всех условиях.

На фигуре 3В представлены значения концентрации белка для состава F3 (поглощение при 280 нм) для временных точек 0, 1, 3 и 6 месяцев и условий (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 1,2 и 4 циклов замораживания-оттаивания (1х, 2х и 4х замор/оттаив)). Наблюдалось незначительное увеличение концентрации белка из мишени (50 мг/мл), но значение все оставалось в пределах вариабельности анализа для всех состояний вплоть до 3 месяцев. Данные для построения указанной Фигуры 3В приведены в следующей таблице:

В следующей таблице обобщены данные, полученные для составов F1, F5, F6, F8 и Innovator (контроль, только 25°С t=0 и t=3) при t=0 и t=3 месяца при -20°С, 2-8°С и 25°С, и после 4 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С. Концентрацию белка была равной или близкой к концентрации мишени (50 мг/мл) для всех составов.

Значения концентрации белка для составов F5, F6 и F8 (поглощение при 280 нм) в момент времени = 3 месяца оставались на уровне целевого значения для всех составов, в дополнение к F1, при всех условиях (Фигура не представлена).

Мутностъ/А330 нм

На Фигуре 4А представлены значения мутности (поглощение при 330 нм) во все моменты (от 0 до 14 дней) и при всех условиях (-20°С, 2-8°С, 25°С, 3 циклов замораживания/оттаивания (-20°С/25°С) и 3-х дневного перемешивания). Согласно результатам, значимое увеличение мутности детектировали при 50°С, при этом F3 демонстрировал наименьшее увеличение с течением времени. Отсутствуют существенные изменения для любого состава при -20°С, 25°С, замораживании-оттаивании или перемешивании.

На фигуре 4В(1) представлены значения мутности для состава F3 (поглощение при 330 нм) для временных точек t=0, 1 и 3 месяца и условий (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 1 кратного замораживания-оттаивания (1х и 2х замор/оттаив (-20/25°С)). Как можно видеть на Фигуре 4В(1), незначительно увеличение мутности наблюдали для образцов, подвергнутых 3 месяцам хранения при 25°С. Отсутствуют изменения после 3 месяцев для всех образцов, которые хранили при -20°С, 2-8°С и подвергали 2-м циклам замораживания-оттаивания. Данные для построения указанной Фигуры 4В(1) приведены в следующей таблице:

В следующей таблице приведены данные мутности, полученные для составов F1, F5, F6, F7, F8, F9 при t=0 и t=3 месяца и после 1, 2 и 4 циклов замораживания-оттаивания при -20°С/25°С и Innovator (контроль) при t=0 и 25°С. Составы F1, F5 и F8 не демонстрировали каких-либо существенных изменений мутности. F6 демонстрировал наивысшее изменение мутности при хранении при 25°С.

Как указано выше, никакого значимого дальнейшего увеличения мутности не наблюдалось для составов F5, F8 или F1 после 1 или 3 месяцев во всех условиях и по сравнению с t=0 (Фигура 4В(2)).

HIAC (счетчик частый в жидкости)

Способ:

Для экспериментов использовали систему для подсчета частиц в жидкости HIAC 9703. HIAC состоит из пробоотборника, счетчика частиц и датчика Royco. Датчик Royco способен измерять размеры и подсчитывать частицы от 2 мкм до 100 мкм. Прибор может считать частицы <10000 отсчетов/мл.

Объем пробы (мл): 0,2

Расход мл/мин: 10

- Количество прогонов (на образец): 4 (первый прогон отбрасывается)

Процедура:

Первоначально образцы анализировали без разбавления, но из-за высокой вязкости образца было определено, что их необходимо развести для получения более точного результата.

- Образцы доводили до комнатной температуры в течение 1 часа.

- Пробы разводили 1:3 в подходящем составе-буфере, дегазировали (1,5 ч) и тщательно смешивали перед измерением.

Стандарты-Duke Scientific Count Cal: Проверки соответствия системы осуществляли с помощью стандартов контроля размера частиц EZY-Cal 5 мкм и 15 мкм. Контрольные стандарты анализировали в начале для проверки разрешения сенсора.

На фигуре 5А представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, измеренный для всех состояний: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (3х замор/оттаив) и 3 дня перемешивания с использованием Standards-Duke Scientific Count Cal.

Как можно видеть на Фигуре 5А, никаких существенных изменений в количестве довидимых частиц при 50°С не наблюдалось для F1, F2 и F4, a F2 демонстрирует наивысшее увеличение уже через 7 дней.

Отсутствуют существенные изменения для любого состава при -20°С, 25°С, 3х замор/оттаив или после 3-х дневного перемешивания при комнатной температуре. Состав F3 не продемонстрировал изменений по довидимым частицам по сравнению с t=0 контролем после хранения для всех условий и всех временных точек.

На фигуре 5В представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, для состава F3 измеренный при t=0, 1 и 3 месяца, при температуре -20°С, 2-8°С, 25°С, с 1 и 2 замораживаниями/оттаиваниями (1х и 2х замор/оттаив при -20°С/25°С) с помощью Standards-Duke Scientific Count Cal. Как можно видеть на Фигуре 5В, никаких существенных изменений в количестве довидимых частиц не наблюдалось при 25°С для временной точки 3 месяца. Условие -20°С демонстрирует наибольшее увеличение по довидимым частицам через 3 месяца. Никаких изменений не наблюдалось для t=0 при 2-8°С временной точки после 3 месяцев или после 2 циклов замораживания-оттаивания. Незначительное дальнейшее увеличение в количестве довидимых частиц при -20°С наблюдали через 1 месяц.

Данные для построения указанной Фигуры 5В приведены в следующей таблице:

На фигуре 5С (1 и 2) представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, для составов F1, F3, F5, F6 и F8 измеренный при t=0, 1 и 3 месяца, при температуре -20°С, 2-8°С (Фигура 5С(1)), 25°С, с 1, 2, 3 и 4 кратными замораживаниями/оттаиваниями (1х, 2х, 3х и 4х замор/оттаив при -20°С/25°С) (Фигура 5С(2)) с помощью Standards-Duke Scientific Count Cal.,

Данные для построения указанной Фигуры 5С(1) приведены в следующей таблице:

На фигуре 5С(2) представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, для составов F1, F5, F6 и F8, измеренный при t=0, t=1 месяц и t=3 месяца, с 1, 2 и 4 кратными замораживаниями/оттаиваниями (1х, 2х и 4х замор/оттаив) пи -20°С/25°С, с помощью Standards-Duke Scientific Count Cal.

Данные для построения Фигуры 5С(2) приведены в следующей таблице.

Как можно видеть на Фигуре 5С, никаких существенных изменений в количестве довидимых частиц не наблюдалось для F1, F3, F5, F6 и F8 для t=0 при 2-8°С для временной точки после 3 месяцев. Кроме того, F1 и F6, измеренные подобным образом при 25°С, показали увеличение довидимых частиц с течением времени вплоть до 3 месяцев. Отсутствуют существенные изменения в F8 с течением времени при 25°С, что свидетельствует о стабильности этого состава.

Никаких существенных изменений в количестве довидимых частиц не наблюдалось в контрольной выборке (Innovator) после 3 месяцев при 25°С. Продукт Innovator продемонстрировал наивысшее количество частиц с течением времени по сравнению с F1, F3, F5, F6 и F8 (см таблицу ниже).

ДСН-ПААГ

На фигуре 6А представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, инкубированные при всех условиях: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (-20°С/25°С) и 3 дневное перемешивание в моменты времени 0 и 14 дней. В (А), образец F1, в (В) образец F2, в (С) образец F3 и в (D) образец F4.

При 50°С значимые изменения наблюдали во всех составах, во всех временных точках, при этом образцы 14 дней демонстрировали вероятные ковалентно-модифицированные высокомолекулярные (HMW) типы, что доказано наличием дополнительных HMW полос (>-250 кДа) и низкомолекулярных (LMW) продуктов распада (<50 кДа), которые присутствовали начиная с 3 дней при 50°С в случае всех составов.

Никаких изменений не наблюдали в каком-либо составе во всех других условиях и временных точках по сравнению с эталонным стандартом.

На фигуре 6В(1) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, для состава F3 при t=3 месяца, инкубированным при всех условиях: -20°С, 2-8°С, 25°С, 2 кратном замораживании/оттаивании при -20°С/25°С.

Изменения наблюдали через 3 месяца при 25°С, с появлением дополнительных полос на уровне ~100 кДа и ~140 кДа и увеличение интенсивности LMW (низкомолекулярных) полос продуктов распада при ~50 кДа и ~30 кДа.

Изменения наблюдали после 2 циклов замораживания-оттаивания (-20°С/25°С) с потемнением ~30 кДа и ~50 кДа полос.

На фигуре 6В(2) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, для состава F3 при t=6 месяца, инкубированным при всех условиях: -20°С, 2-8°С, 25°С, 4 кратном замораживании/оттаивании при -20°С/25°С.

Изменения для F3 наблюдали через 6 месяцев при 25°С, с появлением дополнительных полос на уровне ~100 кДа и увеличение интенсивности LMW (низкомолекулярных) полос продуктов распада при ~50 кДа и ~30 кДа.

На фигуре 6С представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F5, F6 и F7 и Innovator (контроль) при t=0 после 1 кратного замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Составы F5, F6, F7 и Innovator (контроль) при t=0 сравнимы с эталонным стандартом.

Составы F5, F6, F7 после 1 цикла замораживания-оттаивания при -20°С/25°С сравнимы с эталонным стандартом.

На фигуре 6D представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F8, F9 и F1 и Innovator (контроль) при t=0 после 1 кратного замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Составы F8, F9, F1 при t=0 и после 1 цикла замораживания-оттаивания при -20°С/25°С сравнимы с эталонным стандартом.

На фигуре 6Е(1) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F1 и F5 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Составы F1 и F5 при всех условиях во временной точке 1 месяц сравнимы с эталонным стандартом.

Незначительные доказательства существования дополнительной ~100 кДа полосы для состава F5 показаны после 1 месяца при 25°С.

На фигуре 6Е(2) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F1 и F5 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 4 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Слабое доказательство появления очень нечетких полос при 100 кДа, 50 кДа и 30 кДа для F5 после 3 месяцев при 25°С и по сравнению с F1 после 3 месяцев при 25°С, который также демонстрировал эти дополнительные полосы.

На фигуре 6F(1) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F6 и F8 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Составы F6 и F8 при -20°С и 2-8°С после 1 месяца, включая 2 цикла замораживания/оттаивания при -20°С/25°С сравнимы с эталонным стандартом.

Состав F6 после 1 месяца при температуре 25°С демонстрирует почти полную потерю основной полосы с появлением нескольких дополнительных низкомолекулярных полос.

На фигуре 6F(2) представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси для составов F6 и F8 при t=1 месяц при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Значительные изменения наблюдаются для F6 после 3 месяцев при 25°С, с исчезновением полосы 150 кДа и появлением нескольких низкомолекулярных полос распада. Только небольшое свидетельство появления очень слабых полос при ~50 кДа и ~30 кДа показано для F6 и F8.

Эксклюзионная ВЭЖХ

Условия:

- Колонка: TSKgel SuperSW3000 4. 6×300 мм, 4 мкм (Тосох, 18675) CV=2,5 мл

- Температура колонки: 25°С

- Подвижная фаза: 0,2 М фосфатный буфер, pH 6,8

- Скорость потока: 1 мл/мин

- Продолжительность: 20 мин.

- Загрузка образца: 37,6 мкг

- Температура автосемплера: 4°С.

На фигуре 7 представлены хроматограммы эксклюзионной ВЭЖХ всех составов для всех условий: - 20°С (7А), 25°С (7В), 50°С (7С), 3 кратном замораживании/оттаивании и 3 днях перемешивания (7D) во всех временных точках. Проценты пиков были измерены и представлены в таблицах.

Значимые изменения наблюдали во всех составах при 50°С во всех временных точках, с F2, демонстрирующим наихудший результат выраженный в виде значительного увеличение препиковых агрегатов уже через 3 дня (26,3% и 22,7%, соответственно). Fin F3 демонстрировали сравнительно более умеренное увеличение препиковой агрегации после 3 дней при 50°С (11,9% и 9,3%, соответственно), но увеличение до >50% препиковых агрегатов для всех четырех составов после 14 дней.

При 25°С также произошли незначительные изменения во всех составах, как в % площади основного пика, так и в % препика после 7 дней, с дальнейшим ростом на 14 день, при этом F4 продемонстрировал наивысший рост препиковых агрегатов (0,5%), a F3 продемонстрировал самый слабый рост агрегации вообще при данном условии.

Не наблюдали существенных изменений для любого состава при экспонировании условиям перемешивания и замораживания-оттаивания или хранения при -20°С вплоть до 14 дней.

На фигуре 7Е(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=3 месяцев при -20°С, 2-8°С, 25°С и 2 кратном замораживании/оттаивании (2xFxTh) при -20°С/25°С.

Значимую препиковую агрегацию и постпикововую деградацию наблюдали для данного состава, подвергнутого воздействию 25°С в течение 3 месяцев по сравнению с другими условиями.

На фигуре 7Е(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=6 месяцев при -20°С, 2-8°С, 25°С и 4 кратном замораживании/оттаивании (2х замор-оттаив) при -20°С/25°С.

Значимую препиковую агрегацию и постпикововую деградацию наблюдали для данного состава, подвергнутого воздействию 25°С в течение 6 месяцев и после 4 циклов замораживания/оттаивания.

На фигуре 7F представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=0, 1, 3 и 6 месяцев при 25°С и для Innovator при t=3 месяца и 25°С после 3 месяцев.

Состав F3 демонстрирует дополнительное увеличение препиковых агрегатов и постпиковых агрегатов при сравнении временных точек 1 и 3 месяца.

Innovator при 25°С в течение 3 месяцев демонстрирует наивысшие % пре-пика в целом и по сравнению с F3 во всех других протестированных условиях, включая 25°С в течение 6 месяцев.

На фигуре 7G(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ для состава F3 для t=0 и 3 месяца при 25°С и в сравнении с Innovator (контроль) при t=0.

Innovator (контроль) при t=0 демонстрирует значимо более высокий % пре-пиковых агрегатов в целом, но меньше постпиковьгх деградантов, чем F3 после 3 месяцев при 25°С.

На фигуре 7G(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ состава Innovator при t=0 и 3 месяца при 25°С.

Увеличение как препиковых аггрегатов и постпиковых деградантов наблюдали после 3 месяцев при 25°С для Innovator по сравнению с Innovator при t=0.

На фигуре 7Н представлены табличные результаты для длительного исследования с эксклюзионной ВЭЖХ в составе F3 для t=0 при -20°С, 2-8°С, 25°С и 1 и 2 кратном замораживании/оттаивании (1х и 2xFxTh) при -20°С/25°С.

Состав F3 демонстрирует дополнительное увеличение препиковых агрегатов (0,9% после t=1 месяц при 25°С) и незначительное увеличение постпиковых агрегатов (0,1% дополнительное увеличение пика LMW-1 после 1 месяца).

На фигуре 71 представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F7, F8, F9 и Innovator (контроль) при t=0.

Все эти составы демонстрируют при t=0 сопоставимые хроматографические профили.

Состав F9 при t=0 демонстрирует значимо более высокий препик, чем F1, F6, F6, F7 и F8.

Innovator (контроль) при t=0 демонстрирует значимо более высокий % пре-пика и пост-пика по сравнению F1, F5, F6, F7, F8 и F9 при t=0.

На фигуре 7J представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F7, F8 и F9 после 1 цикла замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Составы F1, F5, F6, F7 и F8 сравнимы после 1 замораживания-оттаивания, с F9 демонстрирующим значительно более высокий % пре-пика (однако без дополнительного увеличения t=0).

В таблице ниже приведены результаты долгосрочного исследования с помощью эксклюзионной ВЭЖХ в составах F1, F5, F6, F7, F8 и F9 и Innovator (контроль) при t=0 и после 1 цикла замораживания/оттаивания (1х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С.

Контроль (innovator) демонстрирует самый высокий % пре-пиковых агрегатов по сравнению с F1, F5, F6, F7, F8 и F9 при t=0.

На фигуре 7K(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8, для t=1 месяц при -20°С.

Показано отсутствие различий между составами через 1 месяц в условиях хранения при температуре - 20°С. Только для состава F5 наблюдался незначительный пост-пик.

На фигуре 7K(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8, для t=3 месяца при -20°С.

Для F1, F5, F6 и F8 в условиях хранения при - 20°С после 3 месяцев не было показано никаких значимых различий. Более высокий пред- и пост-пик наблюдался для F3 через 3 месяца при -20°С по сравнению со всеми другими составами.

На фигуре 7L(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F8, для t=1 месяц при 2-8°С.

Показано отсутствие различий между составами через 1 месяц в условиях хранения при температуре 2-8°С. Незначительный пост-пик наблюдается для состава F5.

На фигуре 7L(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8, для t=3 месяца при 2-8°С.

Показано отсутствие различий между составами через 3 месяца в условиях хранения при температуре 2-8°С. Более высокий пре- и пост-пик наблюдался для F3 после 3 месяцев при 2-8°С, и по сравнению со всеми другими составами.

На фигуре 7М(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6, F8, для t=1 месяц при 2-8°С.

Значительные изменения наблюдаются в F6 после 1 месяца при температуре 25°С, с полной потерей основного пика, приводящей к деградации пост-пика. Никаких существенных изменений во всех других композициях (F1, F5, F8) через 1 месяц при температуре 25°С не было отмечено.

На фигуре 7М(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8 и Innovator для t=3 месяцев при 25°С.

Никаких существенных различий между составами не показаны для F1, F3, F5, F6, F8 после 3 месяцев при 25°С, с несколько меньшим наблюдаемым пиком для F5. Innovator демонстрирует наивысшие пре- и пост-пик, наблюдаемые для F3 через 3 месяца при 25°С. F6 демонстрирует значительное изменение профиля, с полной потерей основного пика.

На фигуре 7N(1) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5 и F8, для t=1 месяц при температуре 25°С.

На фигуре 7N(2) представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6, F8 и Innovator для t=3 месяца при 25°С.

Не показано различие между составами F1, F3, F5 и F8 в условиях хранения в течение 3 месяцев при 25°С. Innovator демонстрирует значительные пре-пиковые агрегаты и пост-пик продукты распада по сравнению со всеми другими составами.

На фигуре 70 представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5 и F8, для t=1 месяц при температуре 25°С.

Состав F3 демонстрирует наибольший % агрегатов пре-пика после 1 месяца при 25°С.

На фигуре 7Р представлена хроматограмма эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F5, F6 и F8 после 2 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С.

Показано отсутствие различий между составами через 2 цикла замораживания-оттаивания при -20°С/25°С. Только для состава F5 наблюдался незначительный пост-пик.

В следующей таблице приведены результаты долгосрочного исследования эксклюзионной ВЭЖХ состава F1 для t=0, 1 и 3 месяцев в условиях хранения при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 1, 2 и 4 циклов замораживания/оттаивания (1х, 2х и 4х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С.

В следующей таблице приведены результаты долгосрочного исследования эксклюзионной ВЭЖХ состава F5 для t=0, 1 и 3 месяцев в условиях хранения при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 1, 2 и 4 циклов замораживания/оттаивания (1х, 2х и 4х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С.

В следующей таблице приведены результаты долгосрочного исследования эксклюзионной ВЭЖХ состава F6 для t=0, 1 и 3 месяцев в условиях хранения при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 1, 2 и 4 циклов замораживания/оттаивания (1х, 2х и 4х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С.

В следующей таблице приведены результаты долгосрочного исследования эксклюзионной ВЭЖХ состава F8 для t=0, 1 и 3 месяцев в условиях хранения при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 1, 2 и 4 циклов замораживания/оттаивания (1х, 2х и 4х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С.

На фигурах 7Q, 7R и 7S представлена графическая сводка хроматограмм эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6 и F8 для условий: -20°С (Фигура 7Q), 2-8°С (7R) и 25°С (7S) во временных точках вплоть до 6 месяцев для состава F3 и вплоть до 3 месяцев для составов F1, F5, F6 и F8. Пиковые проценты были измерены и представлены (% пре-пика, % основного пика и % пост-пика).

На фигуре 7Т представлена графическая сводка хроматограмм эксклюзионной ВЭЖХ составов F1, F3, F5, F6 и F8 при t=0 и после 1 и 2 циклов замораживания/оттаивания (1х и 2х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С. Пиковые проценты были измерены и представлены (% пре-пика, % основного пика и % пост-пика). Столбики указаны в следующем порядке составов: F1, F3, F5, F6 и F8 для каждого условия (т.е. t=0, 1х замор/оттаив или 2х замор/оттаив).

В следующей таблице приведены результаты долгосрочного исследования эксклюзионной ВЭЖХ состава Innovator при t=0 в условиях хранения 25°С.

В следующей таблице приведены результаты долгосрочного исследования эксклюзионной ВЭЖХ состава F3 для t=0, 1, 3 и 6 месяцев в условиях хранения при -20°С, 2-8°С и 25°С и после 1, 2 и 4 циклов замораживания/оттаивания (1х, 2х и 4х замор/оттаив) в условиях -20°С/25°С.

Результаты представлены на Фигуре 7U. F3 демонстрирует дополнительное увеличение препиковых агрегатов через 6 месяцев (1,1% увеличение после t=3 месяца при 25°С) и незначительное увеличение постпиковых агрегатов (2,1% дополнительное увеличение пост-пика после 3 месяцев).

Основанный на клетках Анализ эффективности

Подход:

- Для менее длительных временных точек (0, 3, 7 и 14 дней)

Образцы испытывали двумя партиями (временные точки после t=0 и t=3 дней (D) и после t=7 и t=14 дней).

Все образцы были испытаны в биотесте единовременно одним аналитиком, за исключением контрольного образца, который был протестирован в каждый из шести (6) дней тестирования.

Измерения оптической плотности при А280 нм были осуществлены для определения точной концентрации первичных разведений и последующего разбавления образца.

Общая производительность теста была приемлемой. Три (3) из 106 кривых доза-ответ (с 53 планшетов), необходимых для того, чтобы было по одной лунке вплоть до 2 различных концентраций, скрытых для соответствия критериям теста вариабельности от лунки к лунке

- Вариабельность от лунки к лунке %CV<20%

- Окно анализа (D/A)>6

- R²≥0.98

Относительную эффективность 47 тестируемых образцов измеряли единожды, а контроль измеряли в шесть (6) различных периодов времени. Средняя относительная эффективность контроля составила 100,2% с 95% CI от 96,9% до 103,6%.

Вариабельность анализа (% GCV) для шести независимых измерений контроля составила 3,2%. Низкая вариабельность анализа этого метода продемонстрировала, что относительные величины эффективности тестируемых образцов, полученных в одиночном измерении, были приемлемыми.

На основании одиночных измерений, большинство испытуемых образцов имели относительные эффективности близкие к 100% (сравнимые с эталонным стандартом).

Тестовые образцы начинали терять эффективность при хранении при повышенной температуре (50°С) в течение трех (3) дней, а эффективность снижалась в более поздние временные точки.

- для более длительных временных точек (3 и 6 месяцев)

Образцы были протестированы в одной партии (включая t=6 месяцев (F3) и t=3 месяца (для всех остальных образцов и условий).

Все образцы были протестированы в биоанализе единовременно одним аналитиком. Используемым эталоном являлся Е16 ADS Lot DC-4168-85.

Измерения оптической плотности при А280 нм были осуществлены для определения точной концентрации первичных разведений и последующего разбавления образца.

Общая производительность теста была приемлемой. Все кривые доза-ответ (12 кривых доза-ответ из 6 планшетов) отвечали критериям теста вариабельности от лунки к лунке без маскировки каких-либо лунок. Критерии приемлемости анализа, указанные в ТМЕ 0498-01 были следующие:

- Вариабельность от лунки к лунке %CV≤20%

Окно анализа (D/A)>6

- R²≥0,98

Окно анализа кривых доза-ответ в тесте находилось в диапазоне от ~4 до 4,5. Все основные параметры (А, В, С и D) кривых доза-эффект находятся в пределах нормального диапазона исторических данных. Ранее было показано, что более мелкое окно анализа (>3) не будет охватывать точность анализа и, поэтому, результаты этого анализа были приняты.

В этом случае данные были проанализированы с использованием Softmax Pro V5.2, для проверки критерия приемлемости анализа и, при необходимости, для маскировки лунок.

Результаты клеточного анализа эффективности:

На фигуре 8 показан график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) для всех составов при всех условиях: -20°С (8А), 25°С (8В), 50°С (8С), 3 кратном замораживани/оттаивании и 3 дневном перемешивании (8D) во всех временных точках.

Различия в эффективности (по сравнению с эффективностью эталонного стандарта) детектировали во всех составах при 50°С, при этом все тестовые образцы теряли эффективность уже через 3 дня, при этом потеря значительно ускорялась при хранении в течении 14 дней при 50°С.

F3 демонстрирует наивысшую эффективность через 14 дней при 50°С, с 42,2% сохраняющейся относительной эффективностью.

Относительные эффективности для всех составов сохранялись близкими к 100% при -20°С, 25°С and 50°С в дополнение к условиям замораживания-оттаивания и перемешивания при КТ.

На фигуре 8Е показан график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% от относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) состава F3 для следующих условий: -20°С, 2-8°С, 25°С во временных точках t=0, t=1 месяц, t=3 месяца и t=6 месяцев, и после 1х, 2х и 4х замораживания/оттаивания при -20°С/25°С. Таблица данных также представлена после фигуры.

Состав F3 во всех условиях вплоть до 6 месяцев и после 4 циклов замораживания/оттаивания при -20°С/25°С демонстрировал % относительных эффективностей, которые сравнимы с эталонным стандартом и остаются в пределах вариабельности анализа (<20%). Наименьшее значение % относительной эффективности (89,5%) измеряли для F3 через 3 месяца при 25°С.

На фигуре 8F показан график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% от относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) в составах F1, F3, F5, F6 и F8 после 3 месяцев (и F3 и через 6 месяцев) при -20°С, 2-8°С, 25°С и после 4х замораживания/оттаивания при -20°С/25°С, по сравнению с Innovator через 3 месяца при 25°С. Таблица данных также представлена после фигуры.

Не наблюдали никаких существенных различий в % относительной активности между F1, F3, F5 и F8 по сравнению с Innovator при любых условиях. Все образцы имели относительные эффективности, которые были сравнимы со стандартным эталоном. F6 после 3 месяцев при 25°С не обладал остаточной эффективностью.

Все образцы имели относительные эффективности, которые были сравнимы со стандартным эталоном.

Общее резюме

Составы F5 (50 мМ Na фосфат, 90 мМ NaCl, 34 мг/мл сахарозы, pH 6.3) и F8 (50 мМ сукцинат/NaOH, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6.3) были определены как лучшие составы на основании общей наивысшей стабильности и относительной эффективности осуществленного «анализа, и как показано в таблице выше, F8 функционирует сравнимо или лучше, чем F1 (жидкий состав Innovator), и также лучше, чем составы F3 и F6.

ЭЛЕМЕНТЫ

1. Водная композиция, содержащая:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитой с Fc-доменом человеческого IgG1;

соль в концентрации от 90 до 130 мМ; и

наполнитель, выбранный из группы трегалозы и сахарозы или их комбинации, отличающийся тем, что ни аргинин, ни цистеин не присутствуют в композиции.

2. Композиция по элементу 1, где концентрация соли составляет 105-130 мМ.

3. Композиция по любому из элементов 1 или 2, где концентрация соли составляет 12 мМ.

4. Композиция по любому из элементов 1-3, где соль является хлоридом натрия.

5. Композиция по любому из элементов 1-4, где выделенный полипептид является этанерцептом.

6. Композиция по любому из элементов 1-5, где наполнитель является трегалозой в концентрации от 20 до 80 мг/мл.

7. Композиция по любому из элементов 1-6, где наполнитель является сахарозой в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

8. Композиция по любому из элементов 1-7, где композиция дополнительно включает водный буфер.

9. Композиция по элементу 8, где водный буфер представляет собой фосфата натрия, фосфат калия, цитрат натрия или калия, малеиновую кислоту, ацетат аммония, трис (гидроксиметил) - аминометан (TRIS), ацетат, сукцинат, диэтаноламин, гистидин или их комбинацию.

10. Композиция по любому из элементов 8 или 9, где водный буфер представлен в концентрации от 20 мМ до 100 мМ.

11. Композиция по любому из элементов 1-10 дополнительно включающая один или несколько наполнителей.

12. Композиция по элементу 11, отличающаяся тем, что наполнитель представляет собой лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозит, глюкозу, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека, рекомбинантный гемагглютинин, декстран, поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), полиэтиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамид (DMF), пролин, L-серин, глутаминовую кислоту, аланин, глицин, лизин, саркозин, гамма-аминомасляную кислоту, полисорбат-20, полисорбат-80, додецилсульфат натрия, полисорбат, полиоксиэтилен сополимер, фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин N-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы меди, ионы кальция, ионы марганца, ионы магния, 3-[(3-холамиддепропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфат, монолаурат сахарозы или их сочетание.

13. Композиция по любому из элементов 1-12, отличающаяся тем, что pH композиции составляет от pH 6,0 до pH 7,0.

14. Композиция по любому из элементов 1-13, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ натрий-фосфатный буфер, 10 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что pH композиции составляет 6,3.

15. Композиция по любому из элементов 1-13, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, 0,1% полисорбат 20, и отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,2.

16. Композиция по любому из элементов 1-13, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 90 мМ хлорида натрия, 24 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,3.

17. Композиция по любому из элементов 1-13, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 90 мМ хлорида натрия, 10 мг/мл сахарозы, 5 мг/мл глицина, отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,3.

18. Композиция по любому из элементов 1-13, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 22 мМ сукцината, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что pH композиции составляет pH 6,3.

Второй аспект настоящего изобретения

Второй аспект настоящего изобретения относится к стабильным водным фармацевтическим композициям, не содержащим некоторые отдельные аминокислоты и некоторые отдельные соли, которые подходят для хранения полипептидов, включая TNFR:Fc.

Второй аспект настоящего изобретения основан на обнаружении того, что водный состав чьи технические признаки раскрыты ниже, может привести к увеличению стабильности белка при высоких температурах, выше 5°С.

Таким образом, второй аспект настоящего изобретения относится к водной композиции, содержащей:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитой с Fc-доменом человеческого IgG1;

моносахарид или дисахарид;

водный буфер,

характеризуемой тем, что указанная композиция не содержит аргинин или цистеин, или соли, выбранные из числа хлорида калия, цитрата натрия, сульфата магния, хлорида кальция, гипохлорита натрия, нитрата натрия, сульфида ртути, хромата натрия и диоксида магния.

Краткое описание чертежей

На фигуре 9 представлена гистограмма со значениями pH и осмотического давления в начальный момент времени.

На фигуре 10 представлены значения концентрации белка (поглощение при 280 нм) для всех временных точек (от 0 до 14 дней) и условий (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 3 циклов замораживания/оттаивания (3х замор/оттаив) и 3-х дневного перемешивания).

На Фигуре 11 представлены значения мутности (поглощение при 330 нм) во все моменты (от 0 до 14 дней) и при всех условиях (-20°С, 2-8°С, 25°С, 3 циклах замораживания/оттаивания (-20°С/25°С) и 3-х дневного перемешивания).

На фигуре 12 представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, измеренный для всех состояний: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (3х замор/оттаив) и 3 дня перемешивания с использованием Standards-Duke Scientific Count Cal.

На фигуре 13 представлены изображения гелей ДСН-ПААГ, окрашенных Кумасси, инкубированных при всех условиях: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (-20°С/25°С) и 3 дневное перемешивание в моменты времени 0 и 14 дней. В (А) образец F1, а в (В) образец F4.

На фигуре 14 представлены хроматограммы эксклюзионной ВЭЖХ всех составов при всех условиях: - 20°С (14А), 25°С (14В), 3 кратном замораживании/оттаивании и 3-х дневном перемешивании (14С) во всех временных точках. Проценты пиков были измерены и представлены в таблицах.

На фигуре 15 представлен график, включающий основанный на клетках анализ эффективности (% относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) для всех составов при всех условиях: -20°С (15А), 25°С (15В), 3 кратном замораживании/оттаивании и 3 дневном перемешивании (8D) во всех временных точках.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к водной композиции, содержащей:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитой с Fc-доменом человеческого IgG1;

моносахарид или дисахарид;

водный буфер,

характеризуемой тем, что указанная композиция не содержит аргинин или цистеин, или соли, выбранные из числа хлорида калия, цитрата натрия, сульфата магния, хлорида кальция, гипохлорита натрия, нитрата натрия, сульфида ртути, хромата натрия и диоксида магния.

При использовании в данном втором аспекте настоящего изобретения, термин «композиция» или «композиции» может относиться к составу(ам), включающим полипептид, полученный таким образом, что он подходит для инъекции и/или введения индивидууму, нуждающемуся в этом. «Композиция» также может относиться к «фармацевтической композиции». В некоторых воплощениях композиции, представленные в данном документе, являются, по существу стерильными и не содержат каких-либо агентов, которые являются чрезмерно токсичными или инфекционными по отношению к реципиенту.

Кроме того, при использовании в данном втором аспекте настоящего изобретения, раствор или водная композиция может означать жидкий состав (жидкость), который содержит одно или несколько химических веществ, растворенных в подходящем растворителе (например, воде и/или другом растворителе, например, органическом растворителе) или смеси взаимно смешивающихся растворителей. Кроме того, при использовании в данном документе, термин «около» означает указанную величину ±5% от ее значения, предпочтительно термин «около» означает именно указанное значение (±0%).

Отметим, что хотя композиция по настоящему изобретению не содержит аргинин или цистеин отдельно или добавленными в композиции, сам полипептид может содержать аминокислотные остатки аргинина или цистеина в своей цепи.

В некоторых воплощениях, экспрессированный полипептид, содержащий Fc-домен, очищают любым стандартным способом. Когда полипептид, содержащий Fc-домен продуцируется внутриклеточно, содержащий частицы дебрис удаляется, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если же данный полипептид секретируется в среду, то надосадочную жидкость из таких экспрессирующих систем вначале можно сконцентрировать с помощью стандартных фильтров для концентрации полипептидов. Также могут быть добавлены протеазные ингибиторы для ингибирования протеолиза, и могут быть включены антибиотики для предотвращения роста микроорганизмов. В некоторых воплощениях полипептид, содержащий Fc-домен очищают с использованием, например, гидроксиапатитовой хроматографии, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, и/или любой комбинации способов очистки, известных или тех, которые еще будут придуманы. Например, может быть использован протеин А для очистки полипептидов, содержащих Fc-домен, которые основаны на человеческих гамма 1, гамма 2, или гамма-4 тяжелых цепях (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13).

Другие способы очистки полипептида, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарине SEPHAROSET™, хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, ДСН-ПААГ, и осаждение сульфатом аммония также могут быть использованы в зависимости от потребностей. Могут быть использованы другие способы очистки полипептидов.

В предпочтительном воплощении данного второго аспекта настоящего изобретения, выделенный полипептид является этанерцептом. Fc-компонент этанерцепта содержит константный тяжелый 2 (СН2) домен, константный тяжелый 3 (СНЗ) домен и шарнирную область, но не содержит константный тяжелый 1 (СН1) домен человеческого IgG1.

Этанерцепт может быть получен технологией рекомбинантных ДНК в экспрессирующей системе на основе клеток яичника китайского хомячка (СНО). Этанерцепт состоит из 934 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу около 150 килодальтон (Physicians' Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

Концентрация выделенного полипептида, предпочтительно составляет от 10 до 100 мг/мл, более предпочтительно между 20 и 60 мг/мл, а еще более предпочтительно концентрация составляет около 25 мг/мл или около 50 мг/мл.

В другом предпочтительном воплощении данного второго аспекта настоящего изобретения, моносахарид или дисахарид выбирают из трегалозы и сахарозы. Предпочтительно, если трегалоза присутствует в концентрации от 20 до 80 мг/мл, более педпочтительно - от 40 до 60 мг/мл, а еще более предпочтительно 60 мг/мл, и предпочтительно в форме дигидрата трегалозы. Предпочтительно, сахароза присутствует в концентрации от 10 до 80 мг/мл, например, от 40 до 60 мг/мл, а более предпочтительно 60 мг/мл. В другом предпочтительном воплощении данного второго аспекта настоящего изобретения, наполнитель является комбинацией между сахарозой и трегалозой.

В другом предпочтительном воплощении второго аспекта настоящего изобретения, водный буфер настоящей композиции выбирают из фосфата натрия, фосфата калия, цитрата натрия или калия, малеиновой кислоты, ацетата аммония, трис (гидроксиметил) - аминометан (TRIS), ацетата, диэтаноламина, гистидина или их комбинации. Независимо от буфера, используемого в композиции, отдельно или в комбинации, его концентрация составляет предпочтительно от 20 мм до 150 мМ, более предпочтительно концентрация составляет около 50 мМ, а еще более предпочтительно водным буфером является фосфат натрия.

В другом воплощении данного второго аспекта настоящего изобретения, композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать один или несколько наполнителей. В некоторых воплощениях данного второго аспекта настоящего изобретения, концентрация одного или нескольких наполнителей в композиции, описанной в настоящем документе, составляет от около 0,001 до 5 массовых процентов, в то время как в других воплощениях данного второго аспекта настоящего изобретения, концентрация одного или нескольких наполнителей составляет от около 0,1 до 2 массовых процентов. Наполнители хорошо известны в данной области и производятся с помощью известных способов, а также доступны от коммерческих поставщиков. Предпочтительно, указанный наполнитель представляет собой лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозит, глюкозу, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека (SA), рекомбинантный гемагглютинин (НА), декстран, поливиниловый спирт (PVA), гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), полиэтиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), пролин, L-серин, глутаминовую кислоту, аланин, глицин, лизин, саркозин, гамма аминомасляную кислоту, полисорбат 20, полисорбат 80, додецилсульфат натрия (SDS), полисорбат, полиоксиэтилен сополимер, фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин N-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы меди, ионы кальция, ионы марганца, ионы магния, 3-[(3-холамидепропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфат(CHAPS), монолаурат сахарозы или их комбинацию. В более предпочтительном воплощении наполнитель представляет собой полисорбат 20, а в еще более предпочтительном воплощении полисорбат 20 присутствует в концентрации 0,1%.

В другом предпочтительном воплощении данного второго аспекта настоящего изобретения, pH композиции составляет от pH 6,0 до pH 7,0, причем любое возможное значение pH выбирается из 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 и 6,9. В более предпочтительном воплощении, pH композиции составляет около 6,2.

В особом воплощении композиция по настоящему изобретению включает 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, 0,1% полисорбата 20, и отличается тем, что pH композиции составляет pH 6,2.

В особом воплощении композиция по настоящему изобретению включает 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, и отличается тем, что pH композиции составляет pH 6,2.

В особом воплощении композиция по настоящему изобретению включает 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл сахарозы, и отличается тем, что pH композиции составляет pH 6,2.

В особом воплощении композиция по настоящему изобретению включает 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл сахарозы, 0,1% полисорбата 20, и отличается тем, что pH композиции составляет pH 6,2.

Композиции, раскрытые во втором аспекте настоящего изобретения могут быть введены парентерально, например, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, интрецереброспинально, внутрисуставно, интрасиновиально и/или интратекально.

Терапевтические эффекты выделенного полипептида, содержащегося в композиции по второму аспекту настоящего изобретения, известны в данной области и включают, без ограничения перечисленным, лечение ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, гранулематоза, болезни Крона, хронической обструктивной болезни, легких, гепатита С, эндометриоза, астмы, кахексии, псориаза или атопического дерматита, или другого воспалительного или аутоиммунного заболевания, связанного с расстройством или состоянием. Композиции могут быть введены в количестве, достаточном для лечения (облегчения симптомов, остановки или замедления прогрессирования) расстройства (например, в терапевтически эффективном количестве).

Следующие примеры служат для иллюстрации второго аспекта настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Примеры данного второго аспекта настоящего изобретения

Получение композиций

Следующие композиции получали простым смешиванием:

Исходный материал:

Материал тестового прогона, содержащий 62,5 мг/мл этанерцепта, 1,2 мг/мл Триса, 40 мг/мл Маннита 10 мг/мл Сахарозы, pH 7,4. Хранили при -20°С.

Эталонный состав (называемый в данном документе «Enbrel»):

Лот коммерческого состава ENBREL® использовали в качестве контрольного образца. Коммерческий состав содержит 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 25 мМ аргинина, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл Сахарозы, pH 6,3).

Кандидатные составы:

Этанерцепт в том же составе в виде композиции Enbrel® использовали в качестве внутреннего контроля (50,9 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфата натрия, 25 мМ аргинина, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,3).

F2: Этанерцепт в водной композиции (49,5 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,3)

F2: Этанерцепт в водной композиции (49,5 мг/мл этанерцепта, 25 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,3)

F4: Этанерцепт в водной композиции (50,9 мг/мл этанерцепта, 50 мМ фосфата натрия, 60 мг/мл трегалозы дигидрат, pH 6,2, 0,1% полисорбата 20)

В некоторых экспериментах в качестве эталона также был использован коммерческий лот Enbrel^® (см. выше).

Пример 1

Характерные спектры эмиссии флуоресценции белка и статического светорассеяния

Были получены характерные спектры эмиссии флуоресценции белка, возбужденной при 266 нм, а также данные статического светорассеяния в как при 266 нм, так и при 473 нм.

Каждый образец был загружен в массив микрокювет (МСА) и помещен в Optim 1000 для выяснения различий в коллоидной и конформационной стабильностях. В этом исследовании температура для экспериментов с линейно изменяющимся нагревом возрастала с 15 до 95°С с шагом 1°С, а образцы выдерживали при каждой температуре в течение 60 секунд для установления теплового равновесия. В изотермическом эксперименте, температуру поддерживали при 62°С, а измерения образцов проводили с 200 повторами с 60 секундным удержанием между измерениями.

Время, в течение которого образец облучается лазерными источниками при 266 и 473 нм, упоминается как время экспозиции. Выбор времени экспозиции зависит от нескольких факторов, например, насколько сильна флуоресценция и как восприимчив образец к фотообесцвечиванию. В случае всех этих образцов использованное время экспозиции составляет 1 секунду.

Наряду с изменением времени экспозиции можно изменить размер физического щели, которая контролирует количество света, попадающее в детектор. Увеличение размера этого отверстия увеличивает измеряемый сигнал флуоресценции, но снижает спектральное разрешение прибора.

Анализы, проведенные с помощью Optim 1000 включают два последовательных уровня, первичный и вторичный. Программное обеспечение Optim 1000 обеспечивает автоматизированный первичный и вторичный анализ. Как и с любым программным обеспечением для согласования данных, для обеспечения того, чтобы входящие данные имели хорошее качество необходима разумная тщательность, так чтобы автоматические функции возвращали надежные результаты. Все результаты были проверены вручную обученным аналитиком.

Первичный анализ извлекает спектральные параметры из исходных данных флуоресценции и светорассеяния:

- Optim может использовать математические функции для обеспечения первичной информации, такой как ожидаемая длина волны (также известной как барицентрическое среднее), которая становится все более широко используемой в научной литературе. Представляет собой среднее длины волны излучения (или центр массы), и является хорошим подходом, для сглаживания любого шума в спектральных данных.

- Интенсивность светорассеяния рассчитывали по интегральной интенсивности между 260 и 270 нм (релеевское рассеяние УФ-света возбуждения). Эффективность рассеяния сильно зависит от длины волны, так что чем короче длина волны, тем эффективнее свет рассеивается молекулами в растворе. Рассеяние 266 нм лазера является очень чувствительным зондом для небольших изменений в средней молекулярной массе.

В этом исследовании соотношение интенсивности флуоресценции между 350 и 330 нм было использовано для изучения термического разворачивания антител, а интенсивности светорассеяния от 266 нм и 473 нм лазеров использовали для измерения термически индуцированной агрегации образцов.

Вторичный анализ принимает параметры из первичных анализов и определяет температуру плавления «Tm» и температуру начала агрегации «Тагг» образца, если они существуют. Температура плавления определяется как точка перегиба в первичных данных в виде функции от температуры.

Наступление температуры агрегации определяется как температура, при которой интенсивность светорассеяния возрастает выше порогового значения по отношению к шуму в данных. Из самой низкой измеренной температуры каждое значение светорассеяния добавляется к набору данных всех ранее измеренных значений. В каждой точке, по ходу анализа применяется линейная аппроксимация и определяется добротность подгонки. Если данные значительно отклоняются от прямой линии (где значимость определяется шумом в данных), то это изменение определяется как температура начала агрегации. Если нет, то алгоритм переходит к следующей точке в наборе данных и еще раз тестирует эти отклонения. Этот способ был испытан на различных белках и условиях и является надежным. В экстремальных ситуациях, когда образуются и осаждаются крупные агрегаты, сигнал светорассеяния действительно может упасть, если частицы в суспензии покидают фокусный объем падающего лазера. Тем не менее, начальное возникновение детектируется воспроизводимо, несмотря на любые осадки, которые имеют место быть позже.

В случае всех данных статического светорассеяния, все точки были включены независимо от того, осаждался ли образец в растворе. Тот же образец в различных повторных экспериментах иногда будет выпадать в осадок, а иногда нет, но в каждом случае начало процесса агрегации воспроизводимо.

Выводы

Данные как Т_агг, так и Т_начал между всеми образцами были очень похожими.

- В буфере F1 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,7±0,3°С и Т_агг - 66,8±0,3°С.

- В буфере F2 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,2±0,1°С и Т_агг - 65,9±0,1°С.

- В буфере F3 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,4±0,3°С и Т_агг - 65,6±0,4°С.

- В буфере F4 было установлено, что продукт имеет Т_начал флуоресценции 63,3±0,1°С и Т_агг из 64,8±0,1°С.

- Было обнаружено, что Enbrel innovator имел Т_начал флуоресценции 63,4±0,1°С и Т_агг - 65,6±0,1°С.

Данные, следовательно, указывают на высокую степень сходства как коллоидальной так и конформационной стабильности между всеми образцами.

Значения Т_начал обнаруженные для флуоресценции были между 63,2 и 63,7°С со средним 63,4°С и относительно низким стандартным отклонением 0.3°С, указывающим на высокую степень сопоставимости между пятью образцами (F1-F4 и жидким составом Enbrel).

Состав F4, как показано во всех экспериментах, по всей видимости очень похож по показателям конформационной и коллоидальной стабильности на жидкий состав Enbrel. Пример 2

Исследование стабильности при краткосрочном стрессе

Подход

Краткосрочное (2 недельное) исследование стабильности проводили для оценки возможных составов до проведения долгосрочного исследования. Были протестированы четыре состава;

Оценивали стабильность каждой композиции при t=0, 3, 7 и 14 дней, после воздействия двух повышенных температур (25°С и 50°С) и одной температуре в режиме реального времени, в дополнение к стрессу перемешиванием и замораживанием-оттаиванием.

Панель 8 аналитических тестов использовали для оценки стабильности каждого состава.

pH (t=0 исключительно)

Осмоляльность (t=0 исключительно)

Концентрация белка (А280 нм)

Мутность (A3 30 нм)

HIAC

восстанавливающий ДСН-ПААГ (окрашивание Кумасси синим)

эксклюзионная ВЭЖХ (SE-HPLC)

Основанный на клетках Анализ эффективности

pH и осмолярность

На фигуре 9 представлена гистограмма со значениями pH и осмотического давления в начальный момент времени. Эти измеренные значения для всех составов находились в пределах диапазона целевого pH или теоретической осмоляльности до помещения образцов в каждое из условий.

Концентрация белка/А280

На фигуре 10 представлены значения концентрации белка (поглощение при 280 нм) для всех временных точек (от 0 до 14 дней) и условий (-20°С, 2-8°С и 25°С, и после 3 циклов замораживания/оттаивания (3х замор/оттаив) и 3х дневного перемешивания). Полученные данные остались в пределах диапазона целевого значения и с вариабельностью анализа для всех образцов во всех временных точках и при всех условиях.

Мутностъ/А330 нм

На Фигуре 11 представлены значения мутности (поглощение при 330 нм) во все моменты (от 0 до 14 дней) и при всех условиях (-20°С, 2-8°С, 25°С, 3 циклов замораживания/оттаивания (-20°С/25°С) и 3-х дневного перемешивания). Согласно результатам, значимое увеличение мутности детектировали при 50°С, при этом F3 демонстрировал наименьшее увеличение с течением времени. Не наблюдали существенных изменений для любого состава при -20°С, 25°С, замораживании-оттаивании или перемешивании.

HIAC (счетчик частиц в жидкости)

Способ:

Для экспериментов использовали систему для подсчета частиц в жидкости HIAC 9703. HIAC состоит из пробоотборника, счетчика частиц и датчика Royco. Датчик Royco способен измерять размеры и подсчитывать частицы от 2 мкм до 100 мкм. Прибор может считать частицы <10000 отсчетов/мл.

Процедура:

- Первоначально образцы анализировали без разбавления, но из-за высокой вязкости образца было определено, что их необходимо развести для получения более точного результата.

- Образцы доводили до комнатной температуры в течение 1 часа.

- Пробы разводили 1:3 в подходящем составе-буфере, дегазировали (1,5 ч) и тщательно смешивали перед измерением.

Стандарты-Duke Scientific Count Cal: Проверки соответствия системы осуществляли с помощью стандартов контроля размера частиц EZY-Cal 5 мкм и 15 мкм. Контрольные стандарты анализировали в начале для проверки разрешения сенсора.

На фигуре 12 представлен анализ довидимых частиц с помощью HIAC, измеренный для всех состояний: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (3х замор/оттаив) и 3 дня перемешивания с использованием Standards-Duke Scientific Count Cal.

Значимые увеличения количеств довидимых частиц измеряли при 50°С для F1, F2 и F4, с F2, демонстрирующим наивысшее увеличение уже через 7 дней.

Отсутствуют существенные изменения в для любого состава при -20°С, 25°С, 3х замор/оттаив или после 3-х дневного перемешивания при комнатной температуре.

Состав F4 не продемонстрировал изменений по довидимым частицам по сравнению с t=0 контролем после хранения для всех условий и всех временных точек.

ДСН-ПААГ

На фигуре 13 представлены гели ДСН-ПААГ, окрашенные Кумасси, инкубированные при всех условиях: -20°С, 25°С, 50°С, 3 кратное замораживание/оттаивание (-20°С/25°С) и 3 дневное перемешивание в моменты времени 0 и 14 дней. В (А) образец F1, а в (D) образец F4.

При 50°С значимые изменения наблюдали во всех составах, во всех временных точках, при этом образцы 14 дней демонстрировали вероятные ковалентно-модифицированные высокомолекулярные (HMW) типы, что доказано наличием дополнительных HMW полос (>~250 кДа) и низкомолекулярных (LMW) продуктов распада (<50 кДа), которые присутствовали начиная с 3 дней при 50°С в случае всех составов.

Никаких изменений не наблюдали в каком-либо составе во всех других условиях и временных точках по сравнению с эталонным стандартом.

Эксклюзионная ВЭЖХ

Условия:

- Колонка: TSKgel SuperSW3000 4. 6×300 мм, 4 мкм (Тосох, 18675) CV=2,5 мл

- Температура колонки: 25°С

- Подвижная фаза: 0,2 М фосфатный буфер, pH 6,8

- Скорость потока: 1 мл/мин

- Продолжительность: 20 мин.

- загрузка образца: 37,6 мкг

- Температура автосемплера: 4°С.

На фигуре 14 представлены хроматограммы эксклюзионной ВЭЖХ всех составов для всех условий: - 20°С (14А), 25°С (14В), 3 кратном замораживании/оттаивании и 3 днях перемешивания (14С) во всех временных точках. Проценты пиков были измерены и представлены в таблицах.

При 25°С также произошли незначительные изменения во всех составах как в % площади основного пика, так и в % препика после 7 дней, с дальнейшим ростом на 14 день, при этом F4 продемонстрировал наивысшый рост препиковых агрегатов (0,5%), но это увеличение незначительно, чтобы его учитывать.

Не наблюдали существенных изменений для любого состава при экспонировании условиям перемешивания и замораживания-оттаивания или хранения при -20°С вплоть до 14 дней.

Клеточный Анализ эффективности

Подход:

- Образцы испытывали двумя партиями (временные точки после t=0 и t=3 дней и после t=7 и t=14 дней).

Все образцы были испытаны в биотесте единовременно одним аналитиком, за исключением контрольного образца, который был протестирован в каждый из шести (6) дней тестирования.

Измерения оптической плотности при А280 нм были осуществлены для определения точной концентрации первичных разведений и последующего разбавления образца.

Общая производительность теста была приемлемой. Три (3) из 106 кривых доза-ответ (с 53 планшетов), необходимых для того, чтобы было по одной лунке вплоть до 2 различных концентраций, скрытых для соответствия критериям теста вариабельности от лунки к лунке

Вариабельность от лунки к лунке %CV<20%

Окно анализа (D/A)>6

- R²≥0.98

Относительную эффективность 47 тестируемых образцов измеряли единожды, а контроль измеряли в шесть (6) различных периодов времени. Средняя относительная эффективность контроля составила 100,2% с 95% CI от 96,9% до 103,6%.

Вариабельность анализа (% GCV) для шести независимых измерений контроля составила 3,2%. Низкая вариабельность анализа этого метода продемонстрировала, что относительные величины эффективности тестируемых образцов, полученных в одиночном измерении, были приемлемыми.

На оснований одиночных измерений, большинство испытуемых образцов имели относительные эффективности близкие к 100% (сравнимые с эталонным стандартом).

Результаты клеточного анализа эффективности:

На фигуре 15 показан график, включающий анализ теста эффективности на клеточной основе (% относительной эффективности по сравнению с эффективностью эталона) для всех составов при всех условиях: -20°С (15А), 25°С (15В), 3 кратном замораживании/оттаивании и 3-х дневном перемешивании (8D) во всех временных точках.

Как видно из Фигуры 15, относительные эффективности для всех составов остаются близкими к 100% при -20°С в дополнение к условиям замораживания-оттаивания и перемешивания при КТ.

Элементы второго аспекта настоящего изобретения

1. Водная композиция, содержащая:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли р75, слитой с Fc-доменом человеческого IgG1;

моносахарид или дисахарид;

водный буфер,

характеризуемая тем, что не содержит аргинин или цистеин, или соли, выбранные из числа хлорида калия, цитрата натрия, сульфата магния, хлорида кальция, гипохлорита натрия, нитрата натрия, сульфида ртути, хромата натрия и диоксида магния.

2. Композиция по элементу 1, отличающаяся тем, что выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

3. Композиция по любому из элементов 1 или 2, в котором моносахарид или дисахарид выбирают из трегалозы и сахарозы и их комбинации.

4. Композиция по элементу 3, в котором трегалоза присутствует в концентрации от 20 до 80 мг/мл.

5. Композиция по элементу 3, в котором сахароза присутствует в концентрации от 10 до 80 мг/мл.

6. Композиция по любому из элементов 1-5, где водный буфер представляет собой фосфата натрия, фосфат калия, цитрат натрия или калия, малеиновую кислоту, ацетат аммония, трис (гидроксиметил)-аминометан (TRIS), ацетат, диэтаноламин, гистидин или их комбинацию.

7. Композиция по элементу 6, отличающаяся тем, что водный буфер присутствует в концентрации от 20 до 150 мМ.

8. Композиция по любому из элементов 1-7 дополнительно включающий один или несколько наполнителей.

9. Композиция по элементу 8, отличающаяся тем, что наполнитель представляет собой лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозит, глюкозу, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека, рекомбинантный гемагглютинин, декстран, поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), полиэтиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамид (DMF), пролин, L-серин, глутаминовую кислоту, аланин, глицин, лизин, саркозин, гамма-аминомасляную кислоту, полисорбат-20, полисорбат-80, додецилсульфат натрия, полисорбат, полиоксиэтилен сополимер, фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин N-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы меди, ионы кальция, ионы марганца, ионы магния, 3-[(3-холамиддепропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфат, монолаурат сахарозы или их сочетание.

10. Композиция по любому из элементов 1-12, отличающаяся тем, что pH композиции составляет от pH 6,0 до pH 7,0.

11. Композиция по любому из элементов 1-10, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, и отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,2.

12. Композиция по любому из элементов 1-10, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл сахарозы, и отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,2.

13. Композиция по любому из элементов 1-10, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл дигидрата трегалозы, 0,1% полисорбат 20, и отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,2.

14. Композиция по любому из элементов 1-10, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, 60 мг/мл сахарозы, 0,1% полисорбата 20, и отличающаяся тем, что pH композиции составляет около pH 6,2.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена водная композиция, обладающая ингибирующим эффектом в отношении TNF (варианты). В первом варианте водная композиция содержит выделенный полипептид, соль в концентрации от 80 до 130 мМ, водный буфер в концентрации 20-30 мМ и сахарозу в концентрации 34-80 мг/мл. В указанной композиции не присутствуют аргинин и цистеин. Во втором варианте водная композиция содержит выделенный полипептид, соль в концентрации от 80 до 130 мМ, где соль не присутствует в концентрации 100 мМ, сукцинатный буфер и выбранный из трегалозы и сахарозы или их комбинации наполнитель. В указанной композиции не присутствуют свободные аминокислоты. Причём выделенный полипептид в каждой композиции является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли p75, слитого с Fc-доменом человеческого IgG1. Изобретения обеспечивают получение обладающей высокой стабильностью при высоких температурах водной композиции без аргинина и цистеина. 2 н. и 39 з.п. ф-лы, 15 ил.

1. Водная композиция, обладающая ингибирующим эффектом в отношении TNF, содержащая:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли p75, слитого с Fc-доменом человеческого IgG1;

соль в концентрации от 80 до 130 мМ;

водный буфер, где водный буфер представляет собой натриевый и/или калиевый фосфатный буфер и где водный буфер присутствует в концентрации 20-30 мМ; и

наполнитель, который является сахарозой, где концентрация сахарозы составляет 34-80 мг/мл,

отличающаяся тем, что ни аргинин, ни цистеин не присутствуют в композиции.

2. Композиция по п. 1, где концентрация соли составляет 90 мМ.

3. Композиция по п. 1, где соль является хлоридом натрия.

4. Композиция по п. 2, где соль является хлоридом натрия.

5. Композиция по п. 1, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

6. Композиция по п. 2, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

7. Композиция по п. 3, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

8. Композиция по п. 4, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

9. Водная композиция, обладающая ингибирующим эффектом в отношении TNF, содержащая:

выделенный полипептид, который является внеклеточной лиганд-связывающей частью человеческого рецептора фактора некроза опухоли p75, слитого с Fc-доменом человеческого IgG1;

соль в концентрации от 80 до 130 мМ, где соль не присутствует в концентрации 100 мМ;

водный буфер, где водный буфер является сукцинатным буфером; и

наполнитель, выбранный из группы трегалозы и сахарозы или их комбинации,

отличающаяся тем, что свободные аминокислоты не присутствуют в композиции.

10. Композиция по п. 9, где концентрация соли составляет 90 мМ.

11. Композиция по п. 9, где соль является хлоридом натрия.

12. Композиция по п. 10, где соль является хлоридом натрия.

13. Композиция по п. 9, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

14. Композиция по п. 10, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

15. Композиция по п. 11, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

16. Композиция по п. 12, где выделенный полипептид представляет собой этанерцепт.

17. Композиция по п. 9, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

18. Композиция по п. 10, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

19. Композиция по п. 11, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

20. Композиция по п. 12, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

21. Композиция по п. 13, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

22. Композиция по п. 14, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

23. Композиция по п. 15, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

24. Композиция по п. 16, где наполнитель является сахарозой, представленной в концентрации от 5 до 80 мг/мл.

25. Композиция по любому из пп. 9-24, где водный буфер представлен в концентрации от 15 до 100 мМ.

26. Композиция по п. 25, где водный буфер присутствует в концентрации от 20 до 30 мМ.

27. Композиция по п. 25, где водный буфер присутствует в концентрации 50 мМ.

28. Композиция по любому из пп. 1-24, 26 или 27, дополнительно содержащая один или несколько наполнителей.

29. Композиция по п. 25, дополнительно содержащая один или несколько наполнителей.

30. Композиция по п. 28, отличающаяся тем, что наполнитель представляет собой лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозит, глюкозу, альбумин бычьей сыворотки, альбумин человеческой сыворотки, рекомбинантный гемагглютинин, декстран, поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), полиэтиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамид (DMF), пролин, L-серин, глутаминовую кислоту, аланин, глицин, лизин, саркозин, гамма-аминомасляную кислоту, полисорбат-20, полисорбат-80, додецилсульфат натрия, полисорбат, полиоксиэтилен сополимер, фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин N-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы меди, ионы кальция, ионы марганца, ионы магния, 3-[(3-холамиддепропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфат, монолаурат сахарозы или их сочетание.

31. Композиция по п. 29, отличающаяся тем, что наполнитель представляет собой лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозит, глюкозу, альбумин бычьей сыворотки, альбумин человеческой сыворотки, рекомбинантный гемагглютинин, декстран, поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), полиэтиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамид (DMF), пролин, L-серин, глутаминовую кислоту, аланин, глицин, лизин, саркозин, гамма-аминомасляную кислоту, полисорбат-20, полисорбат-80, додецилсульфат натрия, полисорбат, полиоксиэтилен сополимер, фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин N-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы меди, ионы кальция, ионы марганца, ионы магния, 3-[(3-холамиддепропил)-диметиламмонио] -1-пропансульфат, монолаурат сахарозы или их сочетание.

32. Композиция по любому из пп. 1-24, 26, 27, 29, 30 или 31, отличающаяся тем, что pН композиции составляет от 6,0 до 7,0.

33. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что pН композиции составляет от 6,0 до 7,0.

34. Композиция по п. 28, отличающаяся тем, что pН композиции составляет от 6,0 до 7,0.

35. Композиция по любому из пп. 9-24, 26, 27, 29, 30, 31, 33 или 34, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 22 мМ сукцината, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет 6,3.

36. Композиция по п. 25, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 22 мМ сукцината, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет 6,3.

37. Композиция по п. 28, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 22 мМ сукцината, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет 6,3.

38. Композиция по п. 32, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 22 мМ сукцината, 90 мМ NaCl, 10 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет рН 6,3.

39. Композиция по любому из пп. 1-8, 29, 30, 31, 33, 34, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ натрий-фосфатного буфера, 90 мМ хлорида натрия, 34 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет 6,3.

40. Композиция по п. 28, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ натрий-фосфатного буфера, 90 мМ хлорида натрия, 34 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет 6,3.

41. Композиция по п. 32, включающая 50 мг/мл этанерцепта, 25 мМ натрий-фосфатного буфера, 90 мМ хлорида натрия, 34 мг/мл сахарозы, отличающаяся тем, что рН композиции составляет 6,3.